Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Summary

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Abstract

L'arteriogenesi dipende fortemente dal reclutamento di leucociti e piastrine nello spazio perivascolare dei vasi collaterali in crescita. L'approccio standard per l'analisi delle arterie collaterali e dei leucociti nell'arteriogenesi è la metodologia istologica ex vivo (immuno-). Tuttavia, questa tecnica non consente la misurazione di processi dinamici come il flusso sanguigno, lo sforzo di taglio, le interazioni cellula-cellula e la velocità delle particelle. Questo articolo presenta un protocollo per monitorare i processi in vivo nelle arterie collaterali in crescita durante l'arteriogenesi utilizzando l'imaging intravitale. Il metodo qui descritto è uno strumento affidabile per la misurazione dinamica e offre un'analisi ad alto contrasto con fotocitotossicità minima, fornita dalla microscopia ad eccitazione multifotonica. Prima di analizzare le arterie collaterali in crescita, l'arteriogenesi è stata indotta nel muscolo adduttore dei topi mediante legatura unilaterale dell'arteria femorale.

Dopo la legatura, le arterie collaterali preesistenti hanno iniziato a crescere a causa dell'aumento dello stress da taglio. Ventiquattro ore dopo l'intervento, la pelle e il grasso sottocutaneo sopra le arterie collaterali sono stati rimossi, costruendo una tasca per ulteriori analisi. Per visualizzare il flusso sanguigno e le cellule immunitarie durante l'imaging in vivo , gli anticorpi CD41-fluoresceina isotiocianato (FITC) (piastrine) e CD45-ficoeritrina (PE) (leucociti) sono stati iniettati per via endovenosa (e.v.) tramite un catetere posto nella vena della coda di un topo. Questo articolo introduce l'imaging multifotonico intravitale come complemento alternativo o in vivo alle analisi istologiche statiche ex vivo (immuno-) comunemente utilizzate per studiare i processi rilevanti per l'arteriogenesi. In sintesi, questo articolo descrive un nuovo e dinamico metodo in vivo per studiare il traffico di cellule immunitarie, il flusso sanguigno e lo stress da taglio in un modello di arteriogenesi degli arti posteriori, che aumenta notevolmente le possibilità di valutazione.

Introduction

Nonostante l'intenso interesse della ricerca negli ultimi anni, le malattie cardiovascolari, ad esempio la cardiopatia ischemica e l'ictus, sono ancora la principale causa globale di morte¹. I trattamenti attuali per queste malattie sono terapie altamente invasive come l'angioplastica transluminale percutanea, l'angioplastica coronarica transluminale percutanea o la chirurgia di bypass². Pertanto, è urgentemente necessario lo sviluppo di opzioni terapeutiche alternative e non invasive. Il corpo può creare bypass naturali attorno a un vaso stenosed o occluso per reindirizzare il flusso sanguigno interrotto alla parte distale della stenosi. Questo processo è chiamato arteriogenesi². Molti studi recenti hanno dimostrato che l'aumento del taglio dei fluidi influisce sul reclutamento dei leucociti, che svolge un ruolo importante durante l'arteriogenesi³. Le principali opzioni attuali per analizzare il reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi sono le analisi istologiche ex vivo (immuno-) o la metodologia di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)⁴. Per consentire la valutazione della dinamica dei leucociti durante l'arteriogenesi, questo articolo presenta un protocollo di imaging intravitale con microscopia multifotonica.

I leucociti sono le principali cellule del sangue reclutate durante il processo di arteriogenesi³. Questo protocollo utilizza l'imaging multifotonico per mostrare il crawling di leucociti aderenti marcati con anticorpi anti-CD45-PE iniettati nelle arterie collaterali, 24 ore dopo l'induzione dell'arteriogenesi mediante legatura dell'arteria femorale (FAL) impiegando un'ischemia murina degli arti posteriori modello ^5,6. In alternativa, le cellule immunitarie possono essere marcate ex vivo e iniettate con cura nei topi, come mostrato negli studi sull'angiogenesi utilizzando la microscopia intravitale⁷. Il flusso sanguigno all'interno dei vasi e delle arterie può essere visualizzato da CD41-FITC (per etichettare le piastrine), destrano-FITC (plasma) o dalla seconda generazione armonica (SHG), che visualizza il collagene di tipo 1 presente nella membrana basale di alcune parti dell'albero vascolare. SHG è un effetto unico di etichettatura libera dell'eccitazione multifotonica. L'imaging multifotonico consente il tracciamento cellulare a lungo termine senza danneggiare il tessuto e attivando le cellule mediante eccitazione di potenza laser. La microscopia multifotonica è il metodo di imaging scelto per visualizzare cellule e strutture marcate con fluorescenza in animali viventi grazie alla sua capacità di eccitare i fluorofori più in profondità nei tessuti / organi con una fototossicità minima⁸.

L'uso di laser a infrarossi sintonizzati con impulsi erogati entro intervalli di femtosecondi eccita il fluorocromo solo sul piano focale, senza eccitazione sopra e sotto il piano focale⁸. Pertanto, la microscopia multifotonica consente un'elevata risoluzione spazio-temporale, meno foto-danni e una maggiore penetrazione tissutale per lo studio di eventi biologici dinamici all'interno degli organi. È uno strumento di microscopia ideale per l'imaging di animali vivi. Tuttavia, il multifotone e qualsiasi altra arte della microscopia intravitale è limitata dal movimento dei tessuti a causa del battito cardiaco, della respirazione, dei movimenti peristaltici, della tonalità muscolare e di altre funzioni fisiologiche, che disturbano l'acquisizione e l'analisi delle immagini. Poiché questi movimenti compromettono la risoluzione temporale e spaziale e talvolta impediscono persino analisi successive, devono essere affrontati in modo appropriato per consentire un'analisi e un'interpretazione accurate dei dati. Sono state sviluppate diverse strategie per ridurre o prevenire gli artefatti dal movimento dei tessuti. Questo protocollo applica un software di correzione della deriva in situ chiamato VivoFollow⁹ per correggere la deriva del tessuto durante l'acquisizione delle immagini. Questo approccio fornisce la stabilizzazione dell'immagine richiesta, consentendo l'imaging a lungo termine e l'analisi del tracciamento cellulare.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato bavarese per la cura e l'uso degli animali (approvato dal codice etico: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); questi esperimenti sono stati condotti in stretta conformità con le linee guida tedesche sulla legislazione animale.

1. Animali e legatura dell'arteria femorale (FAL)

NOTA: Per indurre infiammazione sterile e arteriogenesi, sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J di 8-10 settimane. Nessuno dei topi è morto o ha sofferto di infezione della ferita o disturbi della guarigione delle ferite durante o post-FAL o finto intervento chirurgico, rispettivamente.

1. Anestesia
   NOTA: Prima dell'iniezione dell'anestesia MMF-mix, si raccomanda di anestetizzare con isoflurano al 5% fino a quando il topo dorme.
   1. Pesare il topo e preparare la miscela MMF con una dose di midazolam 5,0 mg/kg, medetomidina 0,5 mg/kg e fentanil 0,05 mg/kg.
   2. Riempire una siringa da 1 mL con MMF-mix e iniettare un volume finale di 100 μL s.c. utilizzando un ago da 30 G (dopo anestesia con isoflurano al 5%).
   3. Posizionare il mouse su un pad caldo e attendere che il mouse sia completamente anestetizzato. Impostare il timer su 35 min. Dopo questo tempo, iniettare s.c. metà della dose (50 μL) della miscela MMF.
   4. Controllare la profondità dell'anestesia testando il pedale e i riflessi interdigitali (pizzicando il dito fermo) del mouse.
      NOTA: L'assenza di risposta indica un'adeguata profondità di analgesia.
2. Legatura dell'arteria femorale (FAL)
   NOTA: Utilizzare strumenti chirurgici sterili e punti di sutura. Disinfettare la pelle con disinfettante prima dell'apertura e dopo la chiusura.
   1. Posizionare il topo anestetizzato su una piastra riscaldante (35-37 °C) per mantenere la temperatura corporea fisiologica. Applicare la crema per gli occhi (dexpantenolo) su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione degli occhi sotto anestesia.
   2. Trasferire il topo anestetizzato in una camera di imaging laser Doppler (LDI) prima e dopo FAL per controllare il flusso sanguigno e la perfusione (Figura 1A-C).
   3. Rimuovere i capelli, disinfettare la pelle e fare un taglio per accedere all'arteria femorale. Al microscopio chirurgico, ligatare l'arteria femorale destra dell'arto posteriore del topo usando una sutura di seta intrecciata (7-0) ed eseguire un'operazione fittizia sull'arteria femorale sinistra per fungere da controllo interno come precedentemente descritto⁶ (Figura 1D-K).
      NOTA: L'incisione nella pelle è stata fatta con piccole forbici per evitare lesioni dirette ai vasi sanguigni vicino alla pelle.
   4. Chiudere la pelle con una sutura di seta intrecciata (6-0). Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) s.c. ogni 12 ore, iniziando 10 minuti prima di antagonizzare l'anestesia per alleviare il dolore. Osservare l'animale per segnali di dolore, cioè ridotta attività di toelettatura, riluttanza a muoversi o postura curva per 24 ore dopo l'intervento.
   5. Iniettare (s.c.) una combinazione di naloxone (1,2 mg/kg), flumazenile (0,5 mg/kg) e atipamezolo (2,5 mg/kg) per antagonizzare l'anestesia dopo aver terminato il FAL e chiuso la pelle.
   6. Dopo l'intervento chirurgico, tenere il mouse sul pad caldo e monitorare continuamente l'animale fino a quando non può mantenere una postura eretta e iniziare a camminare normalmente intorno alla gabbia.
   7. Quando il topo è completamente sveglio, rimettilo nella gabbia insieme agli altri topi e riporta la gabbia nella stanza di stabulazione degli animali.

2. Preparazione tissutale per imaging intravitale multifotone

1. Iniezione della vena caudale
   NOTA: L'animale deve essere sotto anestesia prima di iniziare la preparazione per l'imaging intravitale. Prima di introdurre l'ago del catetere venoso, si consiglia di applicare un disinfettante cutaneo sulla coda. Questo aiuterà anche a visualizzare le navi.
   1. Preparare un catetere per iniezione della vena caudale utilizzando un ago da 2 x 30 G, 10 cm di un tubo di polietilene a canna fine (diametro interno 0,28 mm e diametro esterno 0,61 mm), una siringa da 1 mL e una colla istoacrilica per fissare il catetere sulla coda del topo per ulteriori iniezioni endovenose durante l'imaging (Figura 2A, B e Figura 2F).
   2. Preparare la soluzione anticorpale per iniezione endovenosa: CD45-PE e CD41-FITC (20 μg/topo) ad un volume finale di 100 μL.
   3. Controllare la coda per le vene della coda posizionate lateralmente e arginare la vena per identificare la vena della coda. Disinfettare la coda, inserire il catetere venoso e fissarlo con colla istoacrilica tissutale (Figura 2B).
   4. Iniettare gli anticorpi prima dell'imaging (almeno 15 minuti prima) e dopo aver terminato la preparazione del tessuto.
2. Preparazione dei tessuti
   NOTA: Utilizzare sempre un tampone caldo e somministrare una goccia di crema per gli occhi (dexpantenolo) in ciascun occhio prima della preparazione dei tessuti. Utilizzare strumenti chirurgici sterili e punti di sutura. Disinfettare la pelle con disinfettante prima dell'apertura e dopo la chiusura.
   1. Posizionare il mouse anestetizzato su un pad stabile e portatile. Fissare il mouse in posizione supina con una fissazione a 4 punti sul pad usando del nastro adesivo (Figura 2B).
   2. Modellare due pezzi di argilla da modellare e posizionare i pezzi sotto l'arto posteriore superiore del topo per garantire una posizione piana del muscolo adduttore (Figura 2B, indicata da frecce rosse).
   3. Per garantire una temperatura corporea stabile di 37 °C del mouse, posizionare il pad con il mouse su una piastra riscaldante al microscopio chirurgico con uno zoom di 0,64-4,0 volte (Figura 1L).
   4. Rimuovere i peli da entrambe le gambe, disinfettare la pelle e tagliare la pelle in un cerchio attorno alla cicatrice della precedente legatura dell'arteria femorale dell'arto posteriore destro (Figura 1M).
   5. Rimuovere la pelle e lo strato di grasso dalla parte superiore della gamba (Figura 1N,O) e tirare da parte la pelle rimanente usando punti di sutura per creare una tasca attorno al muscolo adduttore (Figura 1P,Q).
   6. Rimuovere il grasso sottocutaneo per ottenere una visione chiara del muscolo adduttore e dell'arteria/vena profonda, nonché dei vasi collaterali (Figura 1Q,R).
   7. Iniziare con cautela a rimuovere lo strato muscolare superficiale sopra i vasi collaterali sezionandolo accuratamente con una pinza fine (Figura 1R).
      NOTA: L'arteria collaterale e la vena collaterale sono chiaramente visibili e pronte per l'imaging (Figura 1S).
   8. Riempire la tasca preparata con soluzione salina per evitare l'essiccazione del tessuto e continuare con la stessa procedura per l'arto posteriore sinistro finto operato. Prima dell'imaging, aggiungere gel ad ultrasuoni in entrambe le tasche, che impedisce l'essiccazione e funge da mezzo di immersione per l'accoppiamento ottico con l'obiettivo (Figura 2C e Figura 2F).

3. Microscopia multifotonica intravitale

1. Preparazione
   NOTA: Tenere una siringa con gel ad ultrasuoni all'interno della camera dell'incubatore del microscopio per mantenere una temperatura calda per riempire le tasche durante l'imaging a lungo termine.
   1. Rimuovere la soluzione salina dalle due tasche preparate e sostituirla con gel ad ultrasuoni per coprire i vasi collaterali (Figura 2C).
   2. Iniettare la soluzione anticorpale attraverso il catetere della vena caudale. 15 minuti dopo l'iniezione di anticorpi, trasferire il pad con il mouse fisso nella camera di imaging multifotone riscaldata (Figura 2F).
   3. Dopo aver completato l'acquisizione dell'immagine, eutanasia il topo per dislocazione cervicale sotto narcosi profonda.
2. Acquisizione di immagini al microscopio multifotonico
   NOTA: accendere il microscopio 30 minuti prima dell'imaging per consentire la stabilizzazione laser. Per la migliore stabilità ottica del microscopio, si consiglia di mantenere la camera del microscopio permanentemente riscaldata.
   1. Accendere la chiave della scatola laser Ti:Sapphire, le scatole delle interfacce elettroniche, l'unità di riscaldamento della camera di incubazione, la lampada fluorescente e il computer (Figura 2D,E).
   2. Avviare il software di acquisizione (software Inspector). Impostare la lunghezza d'onda a 800 nm e aprire l'otturatore del microscopio (Figura 3A ii).
   3. Nella finestra di dialogo Misurazione guidata, scegliere la modalità strumento (raggio singolo) e la modalità di misurazione (time-lapse di scansione 3D) (Figura 3A i).
   4. Trasferire il topo anestetizzato nella camera di incubazione preriscaldata del microscopio. Posizionare l'area con il gel ultrasonico (punto 2.2.8) direttamente a contatto con la lente frontale dell'obiettivo (Figura 2F).
   5. Aprire l'otturatore del microscopio a epifluorescenza, scegliere un'impostazione filtro / dicroica adeguata per la visualizzazione FITC (4) per trovare l'area di interesse seguendo il flusso sanguigno sotto l'illuminazione dell'epifluorescenza. Dopo aver portato l'area di interesse nel campo visivo centrale, chiudere l'otturatore del microscopio a epifluorescenza.
   6. Nella finestra di dialogo xy-Scanner, impostare i seguenti parametri: Dimensioni immagine (554x554), Pixel (512x512), Frequenza (400), Media linea (1) (Figura 3A iii). Regolare la potenza del laser (5%) (Figura 3A iv) e impostare il guadagno del fotomoltiplicatore (PMT) per i canali verde (66), rosso (66) e blu (63) (Figura 3A v).
   7. Selezionare un obiettivo adeguato per le impostazioni di imaging intravitale e correzione della deriva (cfr. dettagli in 3.2.11).
      NOTA: Qui, l'obiettivo selezionato era la Nikon LWD 16x (Figura 3A vi).
   8. Definire l'intervallo della pila di immagini avviando la modalità di acquisizione dell'anteprima premendo il pulsante rosso nell'angolo superiore destro della finestra di dialogo Misurazione guidata (Figura 3A i).
   9. Definire l'area e la struttura di interesse concentrandosi per ottenere una buona immagine. Quindi, mentre osservi lo schermo, cambia messa a fuoco spostando l'obiettivo verso l'alto fino a quando l'immagine scompare e impostalo come zero (primo = 0). Modificare la messa a fuoco nella direzione opposta spostando l'obiettivo verso il basso fino a quando l'immagine non scompare nuovamente dallo schermo e impostarla come ultima posizione (fine = 40 μm) nella direzione assiale (Figura 3A vii).
   10. Impostare la dimensione del passo su 2 μm. Fare clic sul pulsante rosso nell'angolo superiore destro della finestra di dialogo Misurazione guidata per interrompere la scansione di anteprima.
       NOTA: Il numero di immagini verrà calcolato e impostato automaticamente (21 immagini), come indicato nella Figura 3A vii.
   11. Se il microscopio è dotato di correzione della deriva dal vivo⁹, avviare il software di correzione della deriva (ad esempio, VivoFollow) e seguire i passaggi descritti di seguito.
       1. Nella finestra di dialogo Misurazione guidata, scegliere l'asse Python (Python Ax) (Figura 3A viii) come primo dispositivo dell'asse; NON attivare la modalità di salvataggio automatico. Selezionare la casella di salvataggio automatico (AS) solo sull'asse temporale (Time Time). Premere l'icona Python nella finestra Dispositivi disponibili (Figura 3A ix) per aprire la finestra di dialogo Python.
       2. Nelle impostazioni dell'asse della finestra di dialogo Python , immettere Da (0 zero) e A (-40). Immettere il numero di passaggi (21) come indicato nella Figura 3A x.
       3. Vai alla finestra di dialogo xyz Stage Z e ingrandisci l'intervallo di scansione di 200 μm su entrambe le estremità: in Start, invio (200 μm) e in Fine, invio (-240 μm), l'intervallo verrà impostato automaticamente (-440 μm). Mantenere la dimensione del passo (2 μm) come mostrato nella Figura 3A xi.
       4. Aprire la finestra di dialogo Frontend VivoFollow e fare clic sulla casella Profilo movimento (Figura 3A xii).
       5. Avviare l'acquisizione dell'immagine premendo la punta della freccia verde nell'angolo superiore sinistro della finestra di dialogo Misurazione guidata del software Inspector (Figura 3A i).
       6. Se si utilizza la correzione della deriva dinamica, cercare una finestra di dialogo per visualizzare la configurazione di correzione della deriva, come mostrato nella Figura 3A xiii. Impostare il canale di acquisizione che verrà utilizzato come riferimento di riferimento immobile (per questo protocollo, scegliere il canale 2, in cui deve essere registrato il segnale del tracciante vascolare). Immettete l'offset di correzione massimo in μm aggiunto alla prima e all'ultima posizione z (qui, 200 μm) e fate clic su OK.
       7. Monitorare l'offset di deriva corrente in x, y e z in tempo reale durante l'acquisizione dell'immagine nella finestra di dialogo frontale di VivoFollow Figura 3A xiv.
       8. Interrompere l'acquisizione di immagini dopo ~ 35 minuti quando è necessario un altro ciclo di re-iniezione di anestesia. Iniettare mezza dose della miscela MMF (50 μl s.c) e riprendere l'acquisizione dell'imaging premendo nuovamente la punta della freccia verde (punto 3.2.11.5).
       9. Ripetere questa procedura fino al termine dell'esperimento.

Representative Results

La microscopia multifotonica offre un'elevata risoluzione spazio-temporale per il tracciamento dei leucociti, in cui le fasi di migrazione cellulare e la velocità possono essere monitorate e monitorate (Figura 4A,B). Tuttavia, il movimento fisiologico del campione rappresenta una sfida, specialmente per le acquisizioni di immagini di microscopia intravitale a lungo termine. Pertanto, una buona preparazione del tessuto e supporti per fissare il tessuto e strumenti, come la correzione dell'imaging in tempo reale per la deriva del tessuto, sono necessari per un'acquisizione di immagini di successo e stabile. Qui, uno strumento di deriva dal vivo, VivoFollow, è stato impiegato per correggere la deriva del tessuto generata durante l'acquisizione di immagini a lungo termine.

L'applicazione di questo strumento consente l'acquisizione di immagini a lungo termine e consente la raccolta di dati di alta qualità, adatti per il tracciamento delle celle per le misurazioni della velocità. Come mostrato nella Figura 3B, senza correzione della deriva, la regione di interesse si allontana progressivamente dalla vista di registrazione, influenzando la capacità di tracciare le celle per l'analisi della velocità. Tuttavia, come mostrato nella Figura 3C, con il software di correzione della deriva, è possibile registrare filmati stabili e tenere traccia di più celle per un lungo periodo. Il software di correzione della deriva può anche fornire una visualizzazione degli offset x, y e z nel tempo corretti dal sistema, come mostrato nella Figura 3D.

Figura 1: Configurazione e preparazione dell'imaging laser Doppler per la legatura dell'arteria femorale e la preparazione del tessuto per l'imaging intravitale. (A) Configurazione dell'imaging LDI. (B) Il mouse viene posizionato all'interno della camera di riscaldamento LDI per l'acquisizione delle immagini. (C) Immagini LDI della gamba destra e sinistra prima (pannello superiore) e dopo FAL (pannello inferiore) per controllare la perfusione degli arti posteriori dopo la legatura. L'arteria femorale destra era legata/occlusa, mentre l'arteria femorale sinistra era finta (Sham) e fungeva da controllo interno. Nella barra dei colori, il blu indica una bassa perfusione sanguigna e il rosso indica una perfusione più elevata. (D-K) Le immagini rappresentano le fasi chirurgiche della legatura arteriosa femorale. Barra della scala = 10 mm. (L-S) Preparazione tissutale per imaging intravitale dopo FAL. L'area da fotografare è indicata dal cerchio nero, dove si trovano i vasi collaterali. Barra scala = 5 mm. Abbreviazioni: LDI = Laser Doppler imaging; FAL = legatura dell'arteria femorale; Occ = occlusione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Configurazione per l'imaging intravitale multifotone. (A) preparazione del catetere venoso; 1-Tubo in polietilene fine di 10 cm, 2: 2x 30 G ago; 3: catetere montato collegato con una siringa da 1 ml; 4: colla istoacrilica tissutale; 5: porta aghi. (B) Il topo posizionato in posizione supina con entrambi gli arti posteriori posti su pezzi di argilla nera da modellazione (frecce rosse) preparati per l'imaging. (C) Arto posteriore destro occluso (Occ) e arto posteriore sinistro, finto operato, pronto per l'imaging. (D) Configurazione del microscopio multifotone che mostra scatole laser, scatola della lampada a fluorescenza, tubi per il riscaldamento della camera dell'incubatore. (E) Camera dell'incubatore del microscopio multifotone. (F) Topo posto all'interno della camera del microscopio con l'obiettivo 16x che tocca il tessuto coperto con gel ad ultrasuoni. Dettaglio che mostra il catetere venoso fissato sulla vena caudale per l'iniezione di anticorpi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Configurazione del software di correzione della deriva VivoFollow. (A) (i-xiv) Fasi di configurazione del software come descritto nella fase del protocollo 3.2.2-3.2.11.9. (B) Immagini rappresentative di serie temporali che mostrano la deriva dell'immagine senza software di correzione della deriva attivato. L'arteria collaterale è delimitata dalle linee bianche dismesse (Video 1 e Video 2). (C) Immagini rappresentative di serie temporali che mostrano la serie temporale stabile quando viene applicata la correzione della deriva in tempo reale durante l'acquisizione dell'imaging. I leucociti sono stati marcati con anticorpi CD45-PE (rosso), le piastrine sono state marcate con anticorpi CD41-FITC (verde) e il collagene di tipo 1 con SGH (blu). L'arteria collaterale è delimitata dalle linee bianche dismesse. (D) Grafico a linee che mostra la correzione in tempo reale lungo le direzioni x, y e z. Abbreviazioni: PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato di fluoresceina; SGH = seconda generazione armonica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi. (A) Velocità dei leucociti misurate nelle arterie collaterali degli arti posteriori operati (Sham) e delle arterie femorali. (B) Le immagini rappresentative mostrano le celle tracciate (magenta) con le tracce codificate a colori. La barra del codice colore rappresenta la velocità della cella con le celle più lente mostrate dalle tracce blu e le celle più veloci con le tracce rosse. I leucociti sono stati marcati con anticorpi CD45-PE iniettati (rosso), le piastrine sono state marcate con anticorpi CD41-FITC iniettati (verde) e il collagene di tipo 1 con SGH (blu). Risultati di tre singoli esperimenti. Barra della scala = 20 μm. Vedere Video 3 e Video 4. Abbreviazioni: Occ= occluded/femore-artery-ligated; PE = ficoeritrina; FITC = isotiocianato di fluoresceina; SGH = seconda generazione armonica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 1: Imaging intravitale multifotone di un'arteria collaterale senza correzione della deriva. Le immagini quadridimensionali sono state registrate con una dimensione dei pixel di 554 x 554 μm, frequenza 600 Hz, un intervallo di 1100 ms / fotogramma, dimensione del passo di 2 μm e gamma di 40 μm. Il video mostra l'immagine alla deriva senza l'applicazione del software di correzione della deriva VivoFollow. L'arteria collaterale è mostrata nella parte inferiore del video e la vena collaterale appare dopo 3 minuti nella parte superiore del film. Barra di scala = 50 μm. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Imaging intravitale multifotone di un'arteria collaterale con correzione della deriva applicata. Le immagini quadridimensionali sono state scattate con una dimensione dei pixel di 554 x 554 μm, frequenza 600 Hz, un intervallo di 1100 ms / fotogramma, dimensione del passo di 2 μm e gamma di 40 μm. Il video è stato registrato con il software di correzione della deriva dal vivo, VivoFollow, e mostra la stabilità dell'immagine promossa applicando il software di correzione della deriva. Barra di scala = 50 μm. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: Imaging di tracciamento cellulare in un'arteria collaterale dopo un'operazione fittizia. I leucociti marcati con anticorpi anti-CD45-PE iniettati sono stati ripresi in un'arteria collaterale a riposo della gamba finta e monitorati utilizzando il software Imaris con il plug-in per il tracciamento delle cellule. Le celle tracciate sono state selezionate e rappresentate dai punti magenta. Le tracce erano codificate a colori in base alla velocità della cella. Le celle più lente sono rappresentate da tracce blu e le celle più veloci da tracce rosse. Barra di scala = 50 μm. Abbreviazione = PE = ficoeritrina. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Imaging di tracciamento cellulare in un'arteria collaterale dopo FAL. I leucociti marcati con anticorpi anti-CD45-PE sono stati visualizzati in un'arteria collaterale in crescita 24 ore dopo l'induzione dell'arteriogenesi da parte di FAL e monitorati utilizzando il software Imaris con il plugin per il tracciamento delle cellule. Le celle tracciate sono state selezionate e rappresentate dai punti magenta. Le tracce erano codificate a colori in base alla velocità della cella. Le celle più lente sono rappresentate da tracce blu e le celle più veloci da tracce rosse. Barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: FAL = legatura dell'arteria femorale; PE = ficoeritrina. Clicca qui per scaricare questo video.

Problemi tecnici	Soluzioni proposte
Nel caso in cui i vasi di coda non siano visibili per l'introduzione del catetere	• Utilizzare un impacco caldo che circonda la coda del topo per 3-5 minuti per promuovere la vasodilatazione locale. Aiuterà a rendere visibile la vena.
Nel caso in cui il catetere di coda non possa essere fissato per l'iniezione di anticorpi	• Utilizzare una siringa da 1 mL con ago da 30 G da introdurre nella vena e iniettare direttamente gli anticorpi e i coloranti prima dell'imaging.
	• In alcuni casi (a seconda degli anticorpi) l'iniezione può essere applicata i.p. 1 h prima dell'imaging.
Quando il movimento del tessuto impedisce la stabilità dell'imaging	• Cercare di riposizionare e rifissare la zampa superiore del mouse per evitare i movimenti addominali fisiologici.
	• Controllare se il tavolo del microscopio ha abbastanza aria per annullare le vibrazioni.
	• Assicurarsi che il topo sia in anestesia profonda e non si svegli.
	• Monitorare la respirazione del mouse. Quando il mouse respira troppo velocemente, può avere un impatto sul movimento dell'immagine.
Quando la qualità dell'immagine inizia a diminuire	• Assicurarsi che il gel ad ultrasuoni non si asciughi.
	• Riempire nuovamente il gel ad ultrasuoni.
	• Assicurarsi che l'obiettivo sia pulito (pulire il gel ad ultrasuoni essiccato sull'obiettivo ogni volta che viene eseguito un nuovo riempimento).
Quando le arterie sono danneggiate durante la preparazione per l'imaging	• In questo caso, non sarà possibile acquisire immagini. Non è possibile eseguire l'esperimento.

Tabella 1: Risoluzione dei problemi.

Discussion

Il metodo descritto di analisi multifotonica in vivo del reclutamento dei leucociti rappresenta un'aggiunta agli strumenti comunemente usati per gli studi di reclutamento dei leucociti come le analisi istologiche (immuno-) o FACS. Con questo metodo di imaging, è possibile visualizzare in modo più dettagliato i processi dinamici nell'aderenza e nello stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi¹⁰. Nonostante il valore aggiunto di questo metodo, il protocollo offerto include alcuni passaggi critici e limitazioni. Vedere la Tabella 1 per ulteriori suggerimenti sulla risoluzione dei problemi. Durante la rimozione dello strato muscolare superficiale sulle arterie collaterali, queste arterie potrebbero essere danneggiate e non saranno utili per l'imaging intravitale. Il catetere deve essere ben fissato per l'iniezione di anticorpi; Altrimenti, lo scivolamento del catetere della vena caudale può causare lo stravaso degli anticorpi nello spazio perivascolare della coda, il che rende la sostituzione e la correzione aggiuntiva per l'iniezione degli anticorpi un compito impegnativo. La corretta identificazione dell'arteria collaterale e della vena collaterale durante la microscopia intravitale rappresenta un altro passaggio critico di questo protocollo.

Dato che il topo non è ventilato meccanicamente durante la microscopia intravitale, il tempo di imaging dinamico è limitato per evitare lesioni fisiche al topo a causa di un'anestesia eccessivamente lunga. Uno dei difetti della microscopia intravitale è il movimento fisiologico del topo, generato dalla respirazione, dal battito cardiaco e dai movimenti peristaltici, che può influire sull'acquisizione delle immagini e, quindi, sulla qualità delle analisi dei dati. Migliorare i supporti dei tessuti, il montaggio e la fissazione sono passaggi che riducono ulteriormente gli effetti del movimento. Oltre al movimento fisiologico, l'imaging a lungo termine può contribuire alla deriva dei tessuti durante l'imaging. Come descritto in questo protocollo, è stato impiegato un software di correzione della deriva tissutale in tempo reale, VivoFollow, per ottenere dati di imaging adatti per il successivo tracciamento cellulare e l'analisi della velocità cellulare. Questo software VivoFollow corregge lo spostamento del campione in x, y e z direttamente durante l'acquisizione dell'immagine. Si basa su una struttura anatomica immobile, ad esempio, quando i vasi vengono visualizzati con traccianti vascolari che fungono da punti di riferimento per la procedura di correzione.

Sebbene siano disponibili altri strumenti di correzione della deriva post-acquisizione, come quelli all'interno di Bitplane Imaris o dei plugin per ImageJ, sono molto limitati nella loro capacità di correzione in quanto non consentono il ripristino della regione di interesse. In linea di principio, non possono correggere compensazioni gravi quando la regione di interesse si sposta fuori dal campo visivo. Tuttavia, questo protocollo può essere applicato anche quando la correzione della deriva dal vivo non è disponibile e diventa necessaria la correzione post-acquisizione. Tuttavia, ciò richiede una frequente formazione del personale nel montaggio e nella fissazione dei tessuti. In conclusione, la microscopia intravitale multifotonica è un utile metodo dinamico che può essere applicato in parallelo a metodi statici consolidati come le analisi istologiche (immuno-) per ottenere un quadro più dettagliato delle componenti dinamiche del reclutamento dei leucociti.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mL Syringe	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	309628	syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0	3M, St. Paul, MN, USA	1538-0	fixation tape
Atipamezole	Zoetis, Berlin, Germany		antagonize anesthesia
Buprenorphine	Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK		antagonize anesthesia
C57/B6J mouse	Charles River, Sulzfeld, Germany		used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab	Biolegend	133904	Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab	Biolegend	368510	Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland	AK64.2	Disinfection
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	5g
Fentanyl	CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany		anesthesia
Flumazenile	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing	Smiths medical	Lot 278316	0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible	BRAUM	1050052	tissue glue
Imaris software	Oxford Instruments	version 9.2	Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument	Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED	Leica, Solms, Germany		light for microscope
Leica M60	Leica, Solms, Germany		microscope for surgery
LEICA MC120 HD	Leica, Solms, Germany		camera for microscope
Medetomidine	Pfizer Pharma, Berlin, Germany		anesthesia
Midazolam	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany		anesthesia
Multiphoton microscope	Lavision	TRIMScope II	WL 820 nm
NaCl 0.9%	Braun, Melsungen, Deutschland	3570310	saline for pocket
Naloxone	Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland		antagonize anesthesia
Needle 30 G	BD Biosciences, San Jose, CA, USA	305128	needle for i.v. catheter
Silk braided suture (7-0)	Pearsalls Ltd., Taunton, UK	SUT-S 103	suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel	SONOSID-ASID BONZ 250 mL	782012	gel for imaging
Vicryl 6.0 suture	Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA	NW-2347	suture to build pocket
VivoFollow drift correction software	Developed by Mykhailo Vladymyrov		Reference 9