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Neuroscience

Induktion und Bewertung von Levodopa-induzierten Dyskinesien in einem Rattenmodell der Parkinson-Krankheit

Published: October 14, 2021 doi: 10.3791/62970
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Translational Neuroscience, College of Human Medicine, Michigan State University, 2Hauenstein Neuroscience Center, Mercy Health Saint Mary's

Summary

Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Induktion und Bewertung von Levodopa-induzierten Dyskinesien in einem Rattenmodell der Parkinson-Krankheit. Das Protokoll bietet detaillierte Informationen über die Intensität und Häufigkeit einer Reihe von dyskinetischen Verhaltensweisen, sowohl dystonisch als auch hyperkinetisch, und bietet ein zuverlässiges Werkzeug zum Testen von Behandlungen, die auf diesen ungedeckten medizinischen Bedarf abzielen.

Abstract

Levodopa (L-DOPA) bleibt die Goldstandard-Therapie zur Behandlung der motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit (PD). Unerwünschte unwillkürliche Bewegungen, die als L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LIDs) bekannt sind, entwickeln sich jedoch bei längerem Gebrauch dieses Dopaminvorläufers. Es wird geschätzt, dass die Inzidenz von LIDs innerhalb von 10-15 Jahren nach der Behandlung auf etwa 90% der Personen mit Parkinson eskaliert. Das Verständnis der Mechanismen dieser Krankheit und die Entwicklung sowohl neuartiger als auch wirksamer Anti-Dyskinesie-Behandlungen erfordert eine konsistente und genaue Modellierung für präklinische Tests therapeutischer Interventionen. Eine detaillierte Methode zur zuverlässigen Induktion und umfassenden Bewertung von LIDs nach 6-OHDA-induzierter nigraler Läsion in einem Rattenmodell von PD wird hier vorgestellt. Die zuverlässige LID-Bewertung bei Ratten bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, das in allen Labors eingesetzt werden kann, um neue Therapien zu testen, die sich auf die Verringerung oder Beseitigung dieser häufigen behandlungsinduzierten Belastung für Personen mit Parkinson konzentrieren.

Introduction

Obwohl es mehr als 50 Jahre her ist, seit Levodopa (L-DOPA) zum ersten Mal als Behandlung für Personen mit PD1,2 eingeführt wurde, bleibt es bemerkenswerterweise die effektivste Therapie für parkinsonische motorische Symptome. Die mit PD assoziierten klinischen motorischen Symptome stammen aus dem Verlust von Dopamin (DA) -Neuronen in der Substantia nigra (SN) Pars compacta, was zu einer dramatischen Abnahme des verfügbaren Dopamins im Striatum führt. L-DOPA stellt die striatalen DA-Spiegel effektiv wieder her, was zu einem motorischen Nutzen zu einem frühen Zeitpunkt der Erkrankungführt 3,4. Unpassenderweise entwickeln die meisten Menschen mit PD bei Langzeitbehandlung L-DOPA-induzierte Dyskinesien (LID), einschließlich Chorea, Dystonie und Athetose, die sich oft erheblich auf die Aktivitäten des täglichen Lebensauswirken 5,6,7.

Während mehrere Verhaltensmodelle von LID bei Nagetieren existieren, haben Unterschiede in der Modellierung und Verhaltensbewertung von LIDs die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zwischen Labors sowie die Zuverlässigkeit dieser experimentellen Werkzeuge für die präklinische PD-Forschung in Frage gestellt. Das aktuelle Protokoll, das in Zusammenarbeit mit einem Spezialisten für klinische Bewegungsstörungen8 entwickelt wurde, ist eine einfache Methode für die LID-Induktion und -Bewertung und eignet sich für die Verwendung in einem Rattenmodell von PD unter Verwendung von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-induzierter einseitiger nigraler Läsion 9,10. Die hier bereitgestellte LID-Bewertungsskala umfasst sowohl die Intensität als auch die Häufigkeit des dyskinetischen Verhaltens in verschiedenen einzelnen Körperteilen. Einschlägige Informationen zur Workflow-Optimierung von Experimenten und zur sachgerechten Pflege und Handhabung von Parkinson- und dyskinetischen Tieren werden ebenfalls bereitgestellt.

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Protocol

Die hier vorgestellten Tiere wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien gepflegt und behandelt. Alle Tierverfahren wurden vom Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit den Bundes- und Landesvorschriften genehmigt.

1. Arzneimittelfreie Bestätigung des 6-OHDA-Läsionsstatus

  1. Haltungsschwanz Hang Test11,12,13
    HINWEIS: Beurteilen Sie den Läsionsstatus mindestens 1 Woche nach der 6-OHDA-Läsionsinduktion (siehe 9,10,35 für Details zur Läsion) bei Versuchspersonen (z. B. männlich oder weiblich, erwachsene Sprague Dawley oder Fisher 344 Ratten).
    1. Hängen Sie die Ratte etwa 6 cm über ihrem Käfig auf und halten Sie sie fest an der Basis des Schwanzes, für ~ 5 s.
    2. Notieren Sie die Richtung der Körperverrenkung als + für eine erfolgreich läsionierte Tierverdrehung kontralateral zur läsionierten Seite und - für das Fehlen von Verdrehung oder Verdrehung in beide Richtungen.
    3. HINWEIS: Diese Tests sind optional, werden aber empfohlen. Siehe14,15,16,17 für weitere drogenfreie Testoptionen/-variationen.
  2. Schritteinstellungs-Schlepptest (angepasst ab16)
    HINWEIS: Beurteilen Sie den Läsionsstatus mindestens 1 Woche nach einseitiger 6-OHDA-Läsionsinduktion bei Versuchspersonen (z. B. männlich oder weiblich, erwachsene Sprague Dawley oder Fisher 344 Ratten).
    1. Halten Sie die Ratte an der Basis ihres Schwanzes und heben Sie die Hinterfüße um ~ 6 cm von der Oberfläche ab; Ziehen Sie rückwärts über eine flache, glatte, aber nicht rutschige Oberfläche, ~ 75 cm, über 5-10 s.
    2. Beobachten und zeichnen Sie die Anzahl der Klopf- / Schrittanpassungsbewegungen jeder Vorderpfote über drei wiederholte Tests auf.
    3. Bewerten Sie das Subjekt als + für eine erfolgreiche einseitige Läsion, wenn 0-2 Vorderpfoten-Taps kontralateral zur läsionierten Seite beobachtet werden, zusammen mit schnellem Klopfen (~ 10 Taps) von der Vorderpfote ipsilateral zur läsionierten Seite (z. B. zeigen Tiere, die einseitig auf der linken Seite läsioniert sind, ein Klopfdefizit (0-2 Taps) mit der kontralateralen rechten Vorderpfote).
    4. Umgekehrt erhalten Sie ein moderates bis schnelles Klopfen (5-10 Taps) von beiden Vorderpfoten als - um einen unvollständigen oder unbekannten Läsionsstatus anzuzeigen.
      HINWEIS: Ein ängstliches Tier kann auch bei erfolgreicher Läsion ein schnelles Klopfen / Stufenanpassung zeigen. Wenn dies vermutet wird, legen Sie die Ratte zurück in ihren Hauskäfig und testen Sie ≥ 30 Minuten später erneut.

2. Herstellung von Reagenzien und Verbrauchsmaterialien

  1. Bestimmung der L-3,4-Dihydroxyphenylalaninmethylesterhydrochlorid (Levodopa oder L-DOPA) und des Benserazidhydrochlorids, eines peripheren Decarboxylaseinhibitors (siehe Materialverzeichnis), der Dosis, der Ratinghäufigkeit und des experimentellen Zeitplans, der für die Prüffrage12,18,19,20 angemessen ist (Abbildung 1).
    HINWEIS: Prüffragen können gestellt werden, um eine beliebige Anzahl von Fragen zu stellen, die von der Frage reichen, ob eine bestimmte Therapie das bestehende LID reduzieren oder die Induktion von LID verhindern könnte. Sie können auch untersuchen, ob die therapeutische Wirksamkeit von der Dosis von Levodopa abhängt oder ob die LID-Expression und / oder die therapeutische Wirksamkeit je nach Geschlecht, Spezies und Alter des Probanden variieren.

Figure 1
Abbildung 1: Beispiel für einen Behandlungszeitplan. Beispiel L-DOPA-Dosiseskalationszeitleiste von insgesamt 12 Wochen, wobei 8 Wochen L-DOPA-Injektionen 3 Wochen nach 6-OHDA-Läsion und 4 Wochen nach experimenteller Behandlung beginnen. In diesem Beispiel wird L-DOPA subkutan 5x pro Woche (Montag bis Freitag) ungefähr zur gleichen Tageszeit für 2 Wochen bei jeder verschriebenen L-DOPA-Dosis (3, 6, 9 und 12 mg / kg) injiziert. Verhaltens-LID-Bewertungen finden an den Tagen 1, 6 und 10 jeder L-DOPA-Dosierungsstufe statt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Wiegen Sie die Ratten wöchentlich, um die geeignete Arzneimittelmenge basierend auf den laufenden Gewichtsänderungen während der Studie zu berechnen.
    HINWEIS: Aufgrund der erhöhten Aktivität bei LID+-Ratten besteht die Möglichkeit einer Gewichtsabnahme mit langfristigen L-DOPA-Behandlungen. Wenn Gewichtsverlust auftritt, versorgen Sie Ratten nach L-DOPA-Injektionen mit ernährungsphysiologisch vollständigen, sehr schmackhaften Leckereien (siehe Materialtabelle).
  2. Berechnen Sie die Menge an L-DOPA und Benserazid, die für jede wöchentliche Konzentration benötigt wird, wiegen Sie lyophilisierte Aliquots für jeden Injektionstag aus und lagern Sie in Kombination für 1-2 Wochen bei -20 ° C in bernsteinfarbenen Glasfläschchen bis zum Tag der Behandlung.
    HINWEIS: Die Zieldosis beträgt 12 mg/kg oder 12 mg L-DOPA/1000 g Körpergewicht. Ein Beispiel für Berechnungen zur Bestimmung der Menge an L-DOPA und Kochsalzlösung, die für jeden Wochentag benötigt wird, unter Verwendung von 12 mg L-DOPA/kg Körpergewicht bei einem Injektionsvolumen von 1 cc/kg Rattengewicht ist in der Ergänzungsdatei 1 enthalten.

3. Einrichtung von Raum und Käfig

  1. Am ersten Tag der L-DOPA-Behandlung 3-4 Wochen nach der 6-OHDA-Läsionsoperation werden die Ratten in ein einzelnes Gehäuse verlegt, einschließlich der IACUC-zugelassenen Anreicherung.
  2. Pflegen Sie während der gesamten Studie in einem einzigen Gehäuse, um Störungen durch Gleichaltrige bei Verhaltensbewertungen zu vermeiden.
  3. Stellen Sie an LID-Bewertungstagen die Hauskäfige auf ein Stahldrahtgestell, das in einem Winkel von etwa 45 ° gedreht ist, um die Ratte optimal zu betrachten (Abbildung 2A). Drehen Sie die Identifikationsetiketten (Abbildung 2B) nach oben und entfernen Sie Wasserflaschen, Lebensmittelregale und alle Arten der Anreicherung im Käfig (Abbildung 2C), um Interferenzen mit Verhaltensbewertungen zu vermeiden.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für den Käfig, der für LID-Ratings großer Rattenexperimente eingerichtet wurde. (A) Mehrere Käfige können für die LID-Bewertung mit großen Metallgestellen eingerichtet werden, die eine optimale Betrachtung jedes Tieres ermöglichen. Die Käfige sollten in einem Winkel von 45 ° auseinander gespreizt werden, wobei die Ausweise nach oben gedreht werden (B), Futter, Wasserflaschen, Nistmaterial und andere Anreicherungen entfernt werden, um die visuelle Dunkelheit der Ratte und die Ablenkung der Ratte zu begrenzen, während das dyskinetische Verhalten untersucht wird (C). Die Metallgestelle müssen einige Meter von jeder Wand entfernt sein, damit der Bewerter die Ratte bei Bedarf an der Vorder- oder Rückseite des Käfigs untersuchen kann. Es ist wichtig, Anreicherungsapparate (z.B. C-rote Ratten-Exerzitienhäuser) mit individuellen Tierausweisen zu kennzeichnen, um sie in demselben Käfig zu ersetzen, aus dem sie kamen. Dies ist besonders wichtig, wenn Tiere unterschiedlichen Geschlechts verwendet werden, um den Stress für die Versuchspersonen nicht zu erhöhen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Levodopa-Injektionen und Dyskinesie-Bewertung

  1. Subkutane Injektionen von L-DOPA21,22
    1. Unmittelbar vor der täglichen Injektion von L-DOPA wird das entsprechende Volumen steriler Kochsalzlösung in die vorgewogene lyophilisierte L-DOPA- und Benserazidmischung in der bernsteinfarbenen Durchstechflasche gegeben und 10 s gut schüttelt (Schritt 2.3).
      HINWEIS: Das angestrebte Injektionsvolumen beträgt 1 ml/1000 g Körpergewicht (mit 12 mg L-DOPA pro ml). Das Volumen der sterilen Kochsalzlösung hängt von der Anzahl der Tiere pro Studie ab.
    2. Füllen Sie einzelne Spritzen (z. B. 1,0 oder 0,5 ml mit 26 G Nadel) mit dem erforderlichen Volumen für jedes Tier (1 ml/kg Rattengewicht) und kennzeichnen Sie jede Spritze mit einer individuellen Tierkennzeichnung.
      HINWEIS: Bewahren Sie die gefüllten Spritzen bis zum Zeitpunkt der Injektion lichtgeschützt in sterilen Beuteln auf. L-DOPA oxidiert schnell in Gegenwart von Sauerstoff und Licht in einer wässrigen Umgebung23,24,25,26.
    3. Bringen Sie den ersten Käfig auf die Injektionsbank.
    4. Entfernen Sie die Ratte aus ihrem Käfig und legen Sie sie auf die Injektionsoberfläche.
    5. Halten Sie den Kopf und die Schultern vorsichtig an die Oberfläche zurück, auf der die Ratte mit der Handfläche der nicht dominanten Hand ruht.
    6. Schäumen Sie vorsichtig die Haut auf dem Rücken, der die Schulterblätter überzieht, mit Daumen und Zeigefinger der nicht dominanten Hand, injizieren Sie L-DOPA-Volumen mit der dominanten Hand in den subkutanen Raum zwischen / unter den Fingern und halten Sie die Nadel so parallel wie möglich zum Körper, um eine intramuskuläre Injektion zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Ratten werden vor der Injektion nicht betäubt.
    7. Entsorgen Sie jede gebrauchte einzelne Spritze in einem scharfen Behälter.
    8. Ersetzen Sie die Ratte in ihrem individuellen Käfig und fügen Sie ernährungsphysiologisch vollständige Leckereien hinzu, außer an LID-Bewertungstagen, um Interferenzen mit Verhaltensbewertungen zu vermeiden, bis die Bewertungen abgeschlossen sind.
    9. Stellen Sie den Timer auf 1–2 Minuten ein, abhängig von der gewünschten Einstufungszeit und der Anzahl der Ratten in der Studie an Bewertungstagen. Holen Sie sich den nächsten Käfig und injizieren Sie die nächste Ratte, wenn der Timer dies anzeigt.
    10. Wiederholen Sie dies und injizieren Sie alle 1-2 Minuten eine Ratte, bis alle Ratten injiziert sind.
  2. Levodopa-induzierte Dyskinesie-Bewertung nach der Injektion
    1. Bewerten Sie die Intensität (Tabelle 1) und Häufigkeit (Tabelle 2) von dytonischen und hyperkinetischen Dyskinesiebewegungen an der gewünschten Anzahl von Zeitpunkten, die den anfänglichen Beginn des LID-Verhaltens, das Spitzenverhalten und die Phase des Rückgangs umfassen sollten (siehe Ergänzende Datei 2 für ein Beispiel für ein LID-Bewertungsprotokollblatt).
    2. Für männliche und weibliche erwachsene Sprague Dawley oder Fisher 344 Ratten und eine Stichprobengröße von N = 40 Ratten beginnen die Dyskinesie-Bewertungen 20 Minuten nach der ersten L-DOPA-Injektion und dann in 50-minütigen Intervallen bis 220 oder 270 min nach der Injektion, je nachdem, wann das LID-Verhalten bei 90% -100% der Ratten abgebrochen wurde.
    3. Wenn Sie 1-minütige Bewertungsintervalle verwenden, stellen Sie einen Timer auf 1 Minute ein. Bewerten Sie die erste Ratte für eine Minute. Gehen Sie zur nächsten Ratte und bewerten Sie sie für 1 Minute. Fahren Sie mit allen Ratten fort, Bewertung für 1-minütige Intervalle.
    4. Lassen Sie einen Timer sichtbar neben dem Käfig positionieren, so dass die LID-Verhaltensintensität (Tabelle 1) beobachtet werden kann, während die Häufigkeit eines bestimmten Verhaltens (Tabelle 2) während des Bewertungszeitraums geschätzt wird.
    5. Nachdem die Bewertungen für den ersten Zeitpunkt abgeschlossen sind, beginnen Sie am nächsten Zeitpunkt (z. B. 70 Minuten nach der Injektion) erneut mit der ersten Ratte und fahren Sie im gewünschten Intervall (z. B. alle 50 Minuten) fort, bis alle Zeitpunkte abgeschlossen sind.
      HINWEIS: Aufgrund der Überschneidung von L-DOPA-Injektions- und LID-Rating-Aufgaben werden an den Rating-Tagen zwei Personen benötigt, eine für die Injektion und eine für die Verhaltensbewertung.

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Representative Results

LIDs bei Parkinson-Ratten können sich als eine Reihe von abnormalen unwillkürlichen Bewegungen (AIMs) manifestieren, einschließlich dystonischer, hyperkinetischer und stereotyper Verhaltensweisen. LID-Bewertungskriterien für solche Verhaltensweisen werden hier vorgestellt, um sowohl die Intensität (Tabelle 1) als auch die Häufigkeit (Tabelle 2) zu umfassen. Dies liefert einen Gesamtwert für den LID-Schweregrad für jede Ratte, der sowohl die Qualität (Intensität) als auch die Quantität der Zeit widerspiegelt, die mit diesen Verhaltensweisen zu jedem Bewertungszeitpunkt verbracht wurde. Der endgültige LID-Schweregrad wird berechnet, indem der Intensitätswert mit dem Frequenzwert für jede Verhaltenskomponente multipliziert wird. Bewertungskriterien für einzelne Attribute von LID-Verhalten werden hier als schriftliche Beschreibungen (Tabelle 1–2) bereitgestellt, und Beispiele werden als Standbilder mit detaillierten Berichten (Abbildung 3) und als Videos (animierte Videos 1–4) dargestellt. Zusätzliche beschreibende Informationen zu einzelnen Bewegungen und Wertungen finden Sie in den Figurenlegenden.

Eine umfassende Bewertung der Auswirkungen einer Behandlung auf die Verbesserung des LID-Verhaltens im Laufe der Zeit kann mit einem L-DOPA-Dosiseskalationsansatz beobachtet werden, der insgesamt 12 Wochen dauert, mit 8 Wochen L-DOPA-Injektionen nach 6-OHDA-Läsion (Abbildung 1). In diesem Szenario wird L-DOPA 5x pro Woche (Montag bis Freitag) für 2 Wochen bei jeder verschriebenen L-DOPA-Dosis verabreicht. Verhaltensbewertungen, die an den Tagen 1, 6 und 10 jeder L-DOPA-Dosis stattfinden, bieten einen robusten Ansatz für die Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung (Abbildung 1). Forscher können jedoch feststellen, dass veränderte Zeitpläne und Dosierungsschemata ihre experimentellen Fragen besser beantworten. Tatsächlich kann die Dosis von L-DOPA und Benserazid, dem peripheren Decarboxylase-Hemmer, je nach den Erfahrungen des Prüfarztes mit den Dosen und/oder den zu testenden Hypothesen variieren. Es ist bemerkenswert, dass die häufigsten Dosen von Benserazid zwischen 10-15 mg / kg liegen, was durch den Bericht von Tayarani-Binazir et al. (2012) 20 unterstützt wird, der zeigt, dass optimale Verhaltenseffekte von L-DOPA mit 10 mg / kg Benserazid gefunden werden, ohne zusätzlichen Nutzen bei 15 mg / kg.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, LID-Daten zu präsentieren und zu analysieren, wenn festgestellt wird, ob eine bestimmte Behandlung einen signifikanten Einfluss auf die Verbesserung dieses abweichenden Verhaltens hat. Abbildung 4A zeigt ein Beispiel für Daten, die als Spitzendosis-LID über die gesamte experimentelle Zeitachse dargestellt werden. Die Spitzendosis LID kann als der Zeitpunkt definiert werden, zu dem der durchschnittliche LID-Wert der Gruppe am höchsten ist. Alternativ kann man einen "absoluten Peak" melden, der der maximale Peak-LID-Score für ein Tier ist, unabhängig davon, wann er während eines Bewertungszeitraums auftritt. Darüber hinaus können LID-Bewertungsdaten über jeden täglichen Bewertungszeitverlauf untersucht und entweder als experimentelle Gruppendaten dargestellt und/oder so dargestellt werden, dass der LID-Schweregrad des einzelnen Probanden zu jedem Zeitpunkt angezeigt wird (Abbildung 4B) 19. Dieser letztere Ansatz ermöglicht die Beurteilung, ob einige Behandlungen beispielsweise die Gesamtzeit, die ein Proband LID aufweist, reduzieren können, aber nicht unbedingt die Schwere der Spitzendosis. Schließlich kann man die Gesamtwerte des LID-Schweregrads über die gesamte Bewertungssitzung quantifizieren. Für ein bestimmtes Thema wird der LID-Schweregrad für jeden Zeitpunkt summiert, um eine Gesamtpunktzahl für diesen Bewertungszeitraum zu erhalten. Dieser Ansatz emuliert die Fläche unter den Kurvenschätzungen, die ebenfalls berechnet werden können.

Es ist wichtig zu verstehen, dass LID/AIMs-Bewertungsdaten, die mit Bewertungsskalen für die Zuweisung von Werten zum Schweregrad und/oder der Dauer der Dyskinesie erstellt wurden (Tabellen 1 und 2), ordinale Daten sind. Daher sind die am besten geeigneten statistischen Tests nicht parametrisch. Während es keinen direkten äquivalenten nicht-parametrischen Test für die bidirektionale Varianzanalyse gibt, können LID-Daten mit nicht-parametrischen Alternativen zum unidirektionalen ANOVA analysiert werden. Insbesondere wird der Kruskal-Wallis-Test für Vergleiche zwischen Probanden von zwei oder mehr unabhängigen Gruppen verwendet. Der Friedman-Test ist eine nicht-parametrische Alternative zu einer Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen, die für Vergleiche innerhalb von Probanden verwendet werden. Beide werden mit Post-hoc-Tests (d. H. Dunn oder Dunn-Bonferroni) nach einem signifikanten Kruskal-Wallis- oder Friedman-Test verwendet. Um zu untersuchen, ob es signifikante Unterschiede zwischen zwei unabhängigen Gruppen gibt, wird der Mann-Whitney-U-Test als das nicht-parametrische Äquivalent des unabhängigen t-Tests 28,29 angesehen.

Figure 3
Abbildung 3: Standbildbilder, die Beispiele für die LID-Intensitätsbewertung bei Parkinson-Ratten zeigen. (A) Repräsentatives Bild einer nicht-dyskinetischen Parkinson-Ratte, die die oft typische gebeugte Parkinson-Haltung in Abwesenheit von Dystonie oder Hyperkinesie zeigt. (B) Parkinson-Ratte mit insgesamt leichter LID-Schwere, die auf eine leichte bis mittelschwere Dystonie der rechten Vordergliedmaßen und einen Mangel an Hals-, Rumpf- oder Hinterbeindystonie hinweist; Im begleitenden Video (Animated Video 1) sind Dyskinesie der rechten Vorderpfote mit kleiner Amplitude (RFPD) und orolinguale Bewegungen zu sehen. (C) Parkinson-Ratte mit mäßiger Hals- und Rumpfdystonie (fetter Text entspricht den Richtungspfohlen, die den um 90° Winkel verdrehten Stamm anzeigen). (D) Dyskinetische Parkinson-Ratte mit leichter Hals- und mittelschwerer Rumpfdystonie, mittelschwerer bis schwerer Dystonie der rechten Vordergliedmaßen; im begleitenden Video (Animated Video 3) kann RFPD mit gemischter Amplitude beobachtet werden. (E) Parkinson-Ratte mit mittelschwerer bis schwerer Hals- und schwerer Rumpfdystonie, schwerer rechter Hinterbein und mäßiger Dystonie der rechten Vordergliedmaße (fetter Text entspricht Richtungspfeilen, die anzeigen, dass der Rumpf um ~ 180 ° gedreht ist; dies ist besonders bemerkenswert in Beispiel # 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Beispiel-LID-Daten entsprachen über 8 Wochen LID-Bewertungen mit eskalierender L-DOPA-Dosierung. (A) Schwere der Spitzendosis LID (80 min nach L-DOPA) über Zeit und Dosen. (B) Täglicher Zeitkurs (20–170 min nach L-DOPA). Für jede Dosis und jeden Tag spiegeln die oberen Diagramme den Mittelwert ± REM wider; Die unteren Grafiken zeigen die einzelnen Subjektantworten im Zeitverlauf. Die Statistiken wurden unter Verwendung von Kruskal-Wallis mit Dunns mehreren Vergleichstests (für Tests zwischen Probanden) und Friedman-Tests mit Dunns mehreren Vergleichstests (für Tests innerhalb der Probanden) berechnet. Abkürzungen: Control (Ctr) (n = 7); Behandlung (Tx) (n = 10). Diese Abbildung wird mit Genehmigung von Referenz19 nachgedruckt und angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Punktzahl Beschreibung
Hals-Dystonie 0 nichts
1 leichte Verschiebung des Kopfes, die für beträchtliche Zeit gehalten wird (>10-20 s); kann extrem oder normal sein
1.5 Mischung aus leichter und mittelschwerer Dystonie
2 Kopf mit deutlicherer Verschiebung (ca. 90 ° Winkel zum Körper); Kopf bleibt in Richtung der dystonischen Bewegung gezogen
2.5 Mischung aus mittelschwerer und schwerer Dystonie
3 konstante starke Torsion der Nackenmuskulatur (>100° Winkel zwischen Kopf und Schultern)
Stammdystonie 0 nichts
1 leichte Dystonie/Verdrehung des Rumpfes; 45° Unterschied zwischen Ober- und Unterkörper; für eine nennenswerte Zeit (≥10-20 s) gehalten und nicht vorhersagend für Rotationen
1.5 Mischung aus leichter und mittelschwerer Dystonie
2 mäßige Dystonie / Verdrehung des Rumpfes; 90° Unterschied zwischen Ober- und Unterkörper
2.5 Mischung aus mittelschwerer und schwerer Dystonie
3 konstante schwere Dystonie / Verdrehung, "Korkenzieher"-ähnliche Haltung (Annäherung an 180°; Kopf und Füße in entgegengesetzte Richtungen), unfähig zu gehen und kann in Barrel-Roll-Rotation gehen
Dystonie der Vordergliedmaßen 0 nichts
1 mild; abnormale Haltung des Handgelenks oder der Ziffern; entweder geballte Faust oder starrer Unterarm, aber in der Regel nicht beides gleichzeitig
1.5 Mischung aus leichter und mittelschwerer Dystonie
2 Moderat; geballte Faust und starres Vorderbein ohne nach unten gerichtetes Halten in überdehnter Position
2.5 Mischung aus mittelschwerer und schwerer Dystonie
3 Schwere; geballte Faust und starrer Unterarm mit nach unten gerichteter Hyperextension
Dystonie der Hintergliedmaßen 0 nichts
1 Hinterbein leicht in abnormaler Haltung gehalten; Flexion oder Verlängerung.
1.5 Mischung aus leichter und mittelschwerer Dystonie
2 moderate starre Streckung oder Beugung der Hinterbeine; ohne Sprießen der Ziffern
2.5 Mischung aus mittelschwerer und schwerer Dystonie
3 schwere starre Haltung der Gliedmaße mit abnormaler Hyperextension +/- Spreizung der Ziffern
Rechte Vorderpfoten-Dyskinesie (RFPD) 0 abwesend
1 kleine Amplitudenbewegungen, einfache sich wiederholende Seite an Seite oder Auf- und Abwischen im Bereich des Gesichts oder Mundes; oder Klopfen an der Käfigwand oder Einstreu
1.5 Mischung aus kleinen und großen Amplitudenbewegungen; geläufigste
2 große Amplituden, sich wiederholende Auf- und Abwärtsbewegungen mit starker Streckung der rechten Vorderbeine, zieht nach unten und gegenüber dem Hals
Orolingual 0 nichts
1 grundsätzlich geschlossener Mund leeres (zweckloses) Kauen, Zähneknirschen
1.5 Leeres Kauen, es kann zu Zungenvorsprüngen kommen, wiederholtes Beißen am Wurf
2 Prominenter wiederholter Zungenvorsprung mit prominentem Kauen des offenen Mundes
Kopfwippen/Zittern 0 nichts
1 vorhanden (wiederholtes und rhythmisches Wippen des Kopfes (ca. 4hz))
Ständiges Kauen von Einstreu (CCL) 0 nichts
1 vorhanden (ständiges Kauen von Würfen; zielgerichtetes obsessives Beißen oder Kauen von Würfen, wiederholtes Aufheben, Kauen, Fallenlassen, Aufheben, Kauen, Fallen von Würfen)

Tabelle 1: LID-Bewertungskriterien für Intensität dystonischen oder hyperkinetischen Verhaltens bei Parkinson-Ratten. Diese Bewertungskriterien bieten eine Reihe von Intensitätsmaßen, die sich auf die Qualität / Schwere der abnormalen unwillkürlichen Haltungen und / oder Bewegungen der Ratte beziehen. Spezifische Attribute, die für Haltungen und Verhaltensweisen beschrieben werden, werden im Allgemeinen als leicht, mäßig oder schwer klassifiziert, wobei hier spezifische Deskriptoren angegeben werden. Ein endgültiger Schweregrad wird als Produkt aus Intensität x Frequenz ermittelt (Tabelle 2).

Punktzahl Beschreibung
0 Abwesend
1 Intermittierend, < 50% des Beobachtungszeitraums
2 Intermittierend, ≥ 50% des Beobachtungszeitraums
3 Persistent während des gesamten Beobachtungszeitraums und nicht unterbrochen durch Klopfen auf den Käfig

Tabelle 2: LID-Bewertungskriterien für die Häufigkeit dystonischer oder hyperkinetischer Verhaltensweisen. Diese Kriterien liefern ein Quantifizierungsmaß für die Geschwindigkeit, mit der ein bestimmtes Verhalten während des Beobachtungszeitraums auftritt oder wiederholt wird. Dies ist wichtig für die Beurteilung des Gesamtschweregrads, da seltenes Verhalten eine weniger schwere Punktzahl rechtfertigt als eine anhaltende. Ein Endwert für den Schweregrad wird als Produkt aus Intensität (Tabelle 1) x Häufigkeit bestimmt.

Animiertes Video 1: Mildes LID mit RFPD mit geringer Amplitude und Kauen der linken Vorderpfote. Dyskinetische Parkinson-Ratte ohne nennenswerte Hals- oder Rumpfdystonie, aber moderate rechte Vorderpfotendystonie, kleine Amplituden-RFPD, die als schnelle wiederholte flackernde Bewegung der rechten Vorderpfote bemerkt wird. Diese Ratte zeigt auch ein orolinguales Verhalten mit leerem Kauen, das auf die linke Vorderpfote gerichtet ist. L-DOPA-Dosis: 12 mg/kg; Video aufgenommen ~ 70 min nach der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Animiertes Video 2: Moderate Rumpf- und Nackendystonie. Dyskinetische Parkinson-Ratte mit mäßiger Rumpf- und Halsdystonie veranschaulicht durch den 90°-Unterschied in der Position der Vorder- und Hinterbeine (siehe Diagramm in Abbildung 2C). Diese Ratte zeigt auch prominentes stereotypes Schnüffeln und gelegentliches leeres Beißen an der Einstreu. L-DOPA-Dosis: 12 mg/kg; Video aufgenommen ~ 70 min nach der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Animiertes Video 3: Mittelschwere bis schwere rechte Vorderpfotendystonie mit gemischter Amplitude RFPD. Dyskinetische Parkinson-Ratte mit leichter Hals- und mittelschwerer Rumpfdystonie, mittelschwerer bis schwerer rechter Vorderpfotendystonie, RFPD mit gemischter Amplitude als kleinere Wischbewegungen in der Nähe des Mundes gemischt mit größerer Amplitude nach unten ziehend der rechten Vorderpfote. Diese Ratte hat auch ein häufiges Rotationsverhalten, das zusätzlich zu LID-Profilen quantifiziert werden kann. L-DOPA-Dosis: 12 mg/kg; Video aufgenommen ~ 70 min nach der Injektion. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Animiertes Video 4: Kopfbob und orolinguale Bewegungen mit Zungenvorsprüngen. Dyskinetische Parkinson-Ratte mit schwerer Rumpf- und Vorderpfotendystonie (Hinterbeindystonie nicht sichtbar), mittelschwerer bis schwerer Halsdystonie und einem konstanten Kopfsprung mit anhaltenden Zungenvorsprüngen. Der Kopfbob ähnelt dem 4-Hz-Tremor, der in PD zu sehen ist; Bei Ratten wird es jedoch nur bei dyskinetischen Parkinson-Ratten nach L-DOPA-Verabreichung festgestellt. Diese Ratte hat auch gemischte Amplituden-RFPD, die zu Beginn des Videos als signifikantere Amplitudenbewegungen angesehen werden, und kleine wischähnliche Bewegungen in der Nähe des Gesichts, charakteristisch für RFPD mit kleiner Amplitude, die später gesehen wird. Zu Beginn des Videos wurden leichte Bewegungen an den stark dystonischen/verlängerten Vordergliedmaßen beobachtet; Dies hängt jedoch mit der Kopf- und Halstremoraktivität zusammen und würde nicht als RFPD mit geringer Amplitude klassifiziert werden. Wenn der Beobachter stark auf den Käfig tippt, sind diese LID-Verhaltensweisen nicht unterbrechbar, was darauf hindeutet, dass es sich um ein schweres LID handelt, das nicht mit einem Schrecken überwunden werden kann. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: Beispiel für die Berechnung der Menge an L-DOPA. Beispiel für Berechnungen zur Bestimmung der Menge an L-DOPA und Kochsalzlösung, die für jeden Tag einer Woche benötigt wird, unter Verwendung von 12 mg L-DOPA/kg Körpergewicht bei einem Injektionsvolumen von 1 cc/kg Rattengewicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Beispiel für ein LID-Bewertungsprotokollblatt. Dieses Blatt kann verwendet oder angepasst werden, um LID-Intensitäts- und Frequenzwerte während der Bewertungssitzungen zu protokollieren. Die endgültige Bewertung des Schweregrads wird als Produkt aus Intensität (Tabelle 1) x Häufigkeit (Tabelle 2) bestimmt. Diese Bewertungsskalen können auch zur Quantifizierung von LID in Mäusen30 verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Hier werden Details zur reproduzierbaren Induktion und Bewertung von LIDs in einem Parkinson-Rattenmodell nach einseitiger 6-OHDA-Läsion des nigrostriatalen DA-Systems vorgestellt. Während einst angenommen wurde, dass Nagetiere kein LID entwickelt haben und dass Rotationsasymmetrie das Analogon von LID bei Ratten31 sein könnte, wurden Ratten- und Mausmodelle in den letzten zwei Jahrzehnten charakterisiert und sind ein gut akzeptiertes Werkzeug für die LID-Forschung 15,32,33,34. Das hier vorgestellte Protokoll ist besonders hilfreich für größere experimentelle Designs18,19. Es enthält Details zur Bewertung der Intensität und Häufigkeit einer Reihe von dyskinetischen Verhaltensweisen, sowohl dystonisch als auch hyperkinetisch. Insbesondere Bilder und Videos mit entsprechenden detaillierten Notizen und Bewertungen des dystonischen und hyperkinetischen LID-Verhaltens unterstützen die Beurteilung des Experimentators nach der Verabreichung von L-DOPA. Während kein Beispiel für jedes mögliche AIM angegeben wird, wird eine Reihe von Verhaltensweisen, die von leicht über mittelschwer bis schwer reichen, als Rahmen für die LID-Bewertung angeboten. Dieses Protokoll wurde dokumentiert, um verschiedene Therapien bei Parkinson-Ratten 19,35,36,37 zu bewerten. Es ergänzt andere veröffentlichte Nagetierbewertungsskalen, die sich hauptsächlich auf die Dauer des vorgeschriebenen LID-Verhaltens konzentrieren33,38,39. Darüber hinaus zielt das skizzierte Verfahren darauf ab, die Scoring-Methoden in einem Ratten-PD-Modell mit den aktuellen Praktiken zur Bewertung von LIDs bei nicht-menschlichen Primaten (NHPs) in Einklang zu bringen, dem Benchmark-PD-Modell40,41.

Häufig in der Parkinson-Nagetierliteratur zu finden sind LID- oder AIM-Bewertungsskalen, bei denen ausschließlich das Auftreten oder die Häufigkeit von (1) Gliedmaßendyskinesien untersucht wird (z. B. rhythmische Ruckler der Vordergliedmaßen, die der Läsion33 entgegengesetzt sind, oder schnelle, zwecklose Bewegung der Vordergliedmaße, die von der läsionierten Hemisphäre39 kontrolliert wird); (2) axiale Dyskinesien (z. B. Torsion der axialen Muskeln, die Hals, Rumpf und Schwanz betreffen33, oder dystonische Verdrehung von Hals und Rumpf kontralateral zur läsionierten Hemisphäre39); und (3) orolinguale Dyskinesien (z. B. Kaubewegungen des leeren Mundes mit Zungenvorsprüngen33 oder wiederholtes Kauen oder Zungenvorsprünge, wenn der Mund der Ratte leer war und nicht mit einem Gegenstand in Berührung kam39). Diese drei Verhaltenskategorien erhalten einen Schweregrad, der auf ihrer Häufigkeit während des Beobachtungszeitraums basiert. Der Schweregrad, der die Zeit darstellt, die ein Tier damit verbracht hat, diese Verhaltensweisen zu zeigen, häufig ohne Charakterisierung der Verhaltensqualität, wird dann zum endgültigen ALO-Wert (axial, limb und orolingual) kombiniert.

Im Gegensatz dazu bietet das aktuelle Protokoll eine detailliertere Skala, die nicht nur die Bewertung globaler AIMs ermöglicht, sondern auch die Untersuchung von AIMs in unabhängigen Körperteilen (d. H. Hals, Rumpf, Vordergliedmaße, Hinterbein und Mund), die Intensität / Qualität des zu bewertenden AIM, die Unterscheidung von Dystonie von hyperkinetischem Verhalten und, wie bei anderen Skalen, die Häufigkeit des Auftretens eines bestimmten AIM einbezieht. Das übergeordnete Ziel ist es, eine umfassende Bewertung des in jedem Fach ausgedrückten LID-Verhaltens zu ermöglichen. Zum Beispiel unterscheidet sich für die einzelne Verhaltensanzeige der Rumpfdystonie eine Ratte, die über einen gesamten Beobachtungszeitraum eine leichte Rumpfdystonie aufweist (d. h. 45 ° Unterschied zwischen oberem und unterem Rumpf, die das Drehverhalten nicht vorhersagt), sehr von einer Ratte, die eine schwere Rumpfdystonie aufweist (d. H. Konstante schwere Dystonie / Verdrehung, korkenzieherartige Haltung, die sich 180 ° nähert; Kopf und Füße in entgegengesetzte Richtungen, B. nicht in der Lage, zu gehen) für die gesamte Beobachtung. Darüber hinaus kann angesichts der topographischen Darstellung des Rattenkörpers im Striatum die Unterscheidung einzelner Attribute von LIDs informativsein 36.

Eine weitere Komponente dieses Protokolls, die sorgfältig zu berücksichtigen ist, ist das experimentelle Design einer eskalierenden L-DOPA-Dosierung über einen längeren (z. B. 8-wöchigen) Behandlungszeitverlauf (Abbildung 1). Eine Studie, in der nur niedrige Dosen von L-DOPA (z. B. 3–6 mg/kg) verwendet und/oder die Dosis der Wahl für einen kurzen Zeitraum (z. B. 2–4 Wochen) verabreicht wird, kann Hinweise auf eine Linderung der LID mit therapeutischer Intervention bei Parkinson-Ratten zeigen; Die Relevanz dieser Studien für Personen mit Parkinson, bei denen häufig eine chronische Verabreichung und Dosiseskalation erforderlich sind, ist jedoch fraglich. Solche divergierenden Behandlungsprotokolle zwischen präklinischen und klinischen Studien könnten darauf hindeuten, dass sie der mangelnden Wirksamkeit in klinischen Studien mit Medikamenten zugrunde liegen, die in präklinischen Nagetierstudien vielversprechend waren.

Während das hier vorgestellte Protokoll Anweisungen zu einem umfassenden Ansatz zur Bewertung von LID bei Parkinson-Ratten enthält und das Rattenmodell von LID als zuverlässiges Modell für klinische LID 3,15,38,42,43 etabliert wurde, gibt es inhärente Einschränkungen für jedes Modell. Tiermodelle sind Werkzeuge, die nützlich sind, um bestimmte Attribute menschlicher Krankheiten nachzuahmen und beispielsweise Vorhersagen über die Auswirkungen zu treffen, die therapeutische Interventionen auf eine Reihe von Krankheitsmerkmalen haben könnten. Ein Merkmal präklinischer LID-Modelle, die häufig als mögliche Einschränkung diskutiert werden, ist, dass Ratten eine signifikante DA-Erschöpfung benötigen, um LID zu exprimieren. Darüber hinaus wird oft zitiert, dass sich LID in Nagetier- und NHP-Modellen schneller entwickelt als bei Patienten und somit spiegeln diese Modelleigenschaften nicht die klinische LID wider. Es wird jedoch oft unterschätzt, dass unabhängig von der Spezies (dh Mensch, nicht-menschlicher Primat oder Nagetier) im Allgemeinen ein nahezu vollständiger Verlust der striatalen DA-Innervation erforderlich ist, damit sich LID manifestieren kann. Sobald L-DOPA Probanden mit schwerer striataler DA-Erschöpfung verabreicht wird, wird LID 1,19,38,44,45,46 induziert. Ein zweites Merkmal, das die Skepsis gegenüber Nagetiermodellen von LID gefördert hat, kommt von der Erwartung, dass die neurologischen Anzeichen von LID den physischen Manifestationen von LID ähneln sollten, die bei Primaten (dh menschlich und nicht-menschlich) beobachtet werden. Tatsächlich unterscheidet sich das Auftreten der abnormalen Bewegungen, die bei Ratten als LIDs klassifiziert werden, in den Merkmalen von denen bei Primaten (z. B. Choreoathetose bei Primaten vs. Stereotypie/Hyperkinesie bei Nagetieren). Während es über diesen Artikel hinausgeht, dieses Thema umfassend zu behandeln, basieren solche Unterschiede in den Anzeichen zwischen den Arten auf der Tatsache, dass Menschen gewohnheitsmäßig zweibeinig, Nicht-Primaten häufig zweibeinig und Nagetiere vierbeinig sind43,46. So haben verschiedene Arten spezifische Repertoires an Verhaltensweisen, die sich durch spezifische osteoartikuläre und muskuläre Strukturen manifestieren und durch artspezifische neuronale Systeme moduliertwerden 43. Dementsprechend sollte die Tiermodellierung menschenähnlicher Symptome in erster Linie auf der Erwartung einer funktionellen Ähnlichkeit und nicht auf der physischen Identität basieren43. Die Interpretation von Erkenntnissen aus Tiermodellen mit der gebotenen Vorsicht hat und wird weiterhin wertvolle Vorhersagen für die Behandlung von Krankheiten liefern.

Während es derzeit ein von der FDA zugelassenes Medikament zur Behandlung von LID bei PD, Amantadin, gibt und der chirurgische Eingriff von DBS LID verbessern kann, sind die Wirksamkeit und Verträglichkeit nicht optimal, und nicht alle Patienten qualifizieren sich für eine DBS-Operation. Wie von Cenci und Kollegen47 eloquent überprüft, gibt es eine von einigen geäußerte Vorstellung, dass Personen, die an PD leiden, lieber ON (dh den motorischen Nutzen von L-DOPA erleben) mit Dyskinesien als OFF sein würden. Wie diese Autoren ergreifend feststellen: "Die tiefere Wahrheit ist, dass Patienten es vorziehen würden, ohne Dyskinesie ON zu sein. Als Forscher und Kliniker sollten wir danach streben, dieses Ziel Wirklichkeit werden zu lassen. Zu diesem Zweck soll die translationale Forschung zu LID gefördert und beharrlich vorangetrieben werden." Um dieses Ziel zu verfolgen, stellen wir unsere Methode der Induktion und Bewertung von LID vor. Unsere Bewertungsskala wurde entwickelt, um eine Reihe von Intensitätsmaßen in Bezug auf die Qualität / den Schweregrad der AIM zu kombinieren und zeigt an, wie lange eine Vielzahl von Attributen der Dyskinesie angezeigt werden. Die Absicht dieses Modells ist es, die Bestimmung eines numerischen Wertes zu ermöglichen, der den LID-Schweregrad genau widerspiegelt und gleichzeitig sowohl die Intensität als auch die Häufigkeit berücksichtigt. Darüber hinaus zeigt dieser Wert den LID-Schweregrad nicht nur systemisch, sondern auch in Bezug auf bestimmte Karosserieteile an. Mit diesem Modell wollen wir sicherstellen, dass experimentelle Therapeutika rigoros auf ihre Fähigkeit getestet werden können, Levodopa-induzierte Dyskinesies zu modifizieren.

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Disclosures

Es wurden keine Interessenkonflikte gemeldet.

Acknowledgments

Wir möchten die Kämpfe aller Menschen mit Parkinson-Krankheit und die Stärke und Widerstandsfähigkeit, die sie jeden Tag zeigen, anerkennen, insbesondere des geliebten Vaters von KSC, Mark Steece. Die hier vertretene Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS090107, NS110398) und dem Parkinson Disease Foundation International Research Grant Program, jetzt Parkinson Foundation, unterstützt. Wir danken auch Molly VanderWerp für ihre hervorragende redaktionelle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 100 Minutes Digital Timer Staples 1111764
 Compass CX Compact Scale Ohaus 30428202
5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide Cayman Chemicals 25330 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents.
Allentown cages Allentown, LLC Rat900 Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides.
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle BD BD 305540 For subcutaneous L-DOPA injections
Benserazide hydrochloride Sigma-Aldrich B7283 Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD.
Glass amber scintillation vials Thermo Scientific B7921 Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline.
L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride Sigma-Aldrich D1507 L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents.
Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils Staples 107250
Rodent nutritionally complete enrichment treats Bio-Serv F05478
Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L Corning 432129
Standard Plastic Clipboard Staples 1227770
Steel wired 6' long movable shelving units Uline H9488 Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment
Sterile Saline 0.9% Covidien/Argyle 1020 For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections.

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