Summary
Este artigo descreve métodos para induzir e avaliar dyskinesias induzidas por levodopa em um modelo de rato da doença de Parkinson. O protocolo oferece informações detalhadas sobre a intensidade e frequência de uma série de comportamentos discinéticos, tanto disstônicos quanto hipercinéticos, fornecendo uma ferramenta confiável para testar tratamentos voltados a essa necessidade médica não atendida.
Abstract
Levodopa (L-DOPA) continua sendo a terapia padrão-ouro usada para tratar sintomas motores da doença de Parkinson (DP). No entanto, movimentos involuntários indesejados conhecidos como dyskinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) desenvolvem-se com o uso prolongado deste precursor de dopamina. Estima-se que a incidência de LIDs aumente para aproximadamente 90% dos indivíduos com DP dentro de 10 a 15 anos de tratamento. Compreender os mecanismos dessa doença e desenvolver tratamentos anti-dycinesesia novos e eficazes requer modelagem consistente e precisa para testes pré-clínicos de intervenções terapêuticas. Um método detalhado para indução confiável e classificação abrangente de LIDs após lesões nigrais induzidas por 6-OHDA em um modelo de rato de DP é apresentado aqui. A avaliação confiável da LID em ratos fornece uma ferramenta poderosa que pode ser facilmente utilizada em laboratórios para testar terapias emergentes focadas em reduzir ou eliminar essa carga comum induzida pelo tratamento para indivíduos com DP.
Introduction
Embora já se passaram mais de 50 anos desde que levodopa (L-DOPA) foi introduzido pela primeira vez como um tratamento para indivíduos com DP 1,2, continua a ser a terapia mais eficaz para sintomas motores parkinsonianos. Os sintomas motores clínicos associados à DP decorrem da perda de neurônios de dopamina (DA) na substantia nigra (SN) pars compacta, resultando na diminuição dramática da dopamina disponível no estriado. O L-DOPA restaura efetivamente os níveis de DA striatal, resultando em benefício motor no início da doença 3,4. Inoportunamente, com tratamento de longo prazo, a maioria dos indivíduos com DP desenvolverá dyskinesias induzidas por L-DOPA (LID), incluindo corea, distonia e ateu, que muitas vezes impactam significativamente as atividades de vida diária 5,6,7.
Embora existam vários modelos comportamentais de LID em roedores, existem diferenças na modelagem e avaliação comportamental dos LIDs têm colocado em questão a reprodutibilidade dos resultados entre os laboratórios, bem como a confiabilidade dessas ferramentas experimentais para pesquisas pré-clínicas de DP. Desenvolvido em associação com um especialista em transtorno de movimento clínico8, o protocolo atual é um método simples para indução e classificação de LID e é apropriado para uso em um modelo de rato de DP utilizando 6-hidroxidopamina (6-OHDA)-induzida lesão nigral unilateral 9,10. A escala de classificação LID fornecida aqui inclui pontuação tanto para a intensidade quanto para a frequência do comportamento discinético em várias partes individuais do corpo. Informações pertinentes sobre a otimização do fluxo de trabalho dos experimentos e o cuidado e manuseio adequados de animais parkinsonianos e discinéticos também são fornecidas.
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Protocol
Os animais aqui apresentados foram mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Estadual de Michigan (IACUC) em conformidade com as regulamentações federais e estaduais.
1. Confirmação sem drogas do estado da lesão 6-OHDA
- Teste de hang tail postural 11,12,13
NOTA: Avalie o estado da lesão pelo menos 1 semana após a indução da lesão 6-OHDA (Ver 9,10,35 para detalhes sobre lesões) em indivíduos experimentais (por exemplo, masculino ou feminino, adulto Sprague Dawley ou Fisher 344 ratos).- Suspenda o rato aproximadamente 6 cm acima de sua gaiola, firmemente segurando na base da cauda, por ~5 s.
- Registo a direção da contorção corporal como + para um animal com sucesso torcendo contralateral para o lado lesionado e - por falta de torção ou torção em ambas as direções.
- NOTA: Estes testes são opcionais, mas recomendados. Consulte 14,15,16,17 para obter opções/variações adicionais de teste sem drogas.
- Teste de arrasto de ajuste de etapas (adaptado a partir de16)
NOTA: Avalie o estado da lesão pelo menos 1 semana após a indução unilateral da lesão 6-OHDA em indivíduos experimentais (por exemplo, masculino ou feminino, adulto Sprague Dawley ou Fisher 344 ratos).- Segure o rato pela base de sua cauda, elevando os pés traseiros da superfície em ~6 cm; arraste para trás através de uma superfície plana, lisa, mas não escorregadia, ~75 cm, acima de 5-10 s.
- Observe e regise o número de movimentos de ajuste de toque/passo de cada pré-selecionado ao longo de três testes repetidos.
- Escore o sujeito como + para lesão unilateral bem sucedida quando toques de 0-2 forepaw são observados contralateral para o lado lesionado, juntamente com toques rápidos (~10 toques) da previ ipsilateral para o lado lesado (por exemplo, animais unilateralmente lesados no lado esquerdo mostram déficit de toques (0-2 toques) com a forepaw direita contralalateral).
- Por outro lado, marque toques moderados a rápidos (5-10 toques) de ambas as paralelepípedos como - para indicar estado de lesão incompleto ou desconhecido.
NOTA: Um animal ansioso pode mostrar ajuste rápido de toque/passo, mesmo se lesionado com sucesso. Se isso for suspeito, coloque o rato de volta em sua gaiola e reteste ≥30 minutos depois.
2. Preparação de reagentes e suprimentos
- Determine l-3,4-dihidroxyfenylalanina metil ester cloridrato (levodopa ou L-DOPA) e hidrocloroide benserazida, um inibidor de decarboxilase periférico (ver Tabela de Materiais), frequência de classificação e cronograma experimental apropriado para a questão investigativa 12,18,19,20 (Figura 1).
NOTA: Questões investigacionais podem ser colocadas para buscar qualquer número de perguntas que vão desde perguntar se uma terapia específica pode reduzir a LID existente ou evitar a indução do LID. Eles também podem explorar se a eficácia terapêutica depende da dose de levodopa ou se a expressão lid e/ou eficácia terapêutica varia dependendo do sexo, espécie e idade do sujeito.
Figura 1: Exemplo do cronograma do tratamento. Exemplo L-DOPA linha do tempo de escalada de 12 semanas de comprimento total, com 8 semanas de injeções L-DOPA começando 3 semanas após 6-OHDA lesionação e 4 semanas após o tratamento experimental. Neste exemplo, l-DOPA é subcutâneamente injetado 5x por semana (segunda-feira a sexta-feira) aproximadamente ao mesmo tempo todos os dias, por 2 semanas em cada dose L-DOPA prescrita (3, 6, 9 e 12 mg/kg). As classificações de LID comportamental ocorrem nos dias 1, 6 e 10 de cada nível de dosagem L-DOPA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Pesar ratos semanalmente para calcular a quantidade de droga apropriada com base nas mudanças de peso contínuas durante o estudo.
NOTA: Devido ao aumento da atividade em ratos LID+, há potencial para perda de peso com tratamentos L-DOPA de longo prazo. Se ocorrer perda de peso, forneça aos ratos guloseimas nutricionalmente completas e altamente palatáveis (ver Tabela de Materiais) após as injeções L-DOPA. - Calcule a quantidade de L-DOPA e benserazida necessária para cada concentração semanal, pesando alíquotas linófilas para cada dia de injeção e armazenando em combinação por 1-2 semanas a -20 °C em frascos de âmbar de vidro até o dia do tratamento.
NOTA: A dose alvo é de 12 mg/kg ou 12 mg L-DOPA/1000 g de peso corporal. Exemplo de cálculos para determinar a quantidade de L-DOPA e soro fisiológico necessários para cada dia de uma semana usando 12 mg de L-DOPA/kg de peso corporal a um volume de injeção de 1 cc/kg de peso de rato é dado no Arquivo Suplementar 1.
3. Sala e gaiola montada
- No primeiro dia de tratamento L-DOPA 3-4 semanas após a cirurgia de lesão 6-OHDA, transfira ratos para uma única moradia, incluindo o enriquecimento aprovado pela IACUC.
- Manter em habitação única durante todo o estudo para evitar interferências de pares com avaliações comportamentais.
- Nos dias de classificação do LID, coloque as gaiolas domésticas em um rack de arame de aço, virado em um ângulo de aproximadamente 45° para uma visão ideal do rato (Figura 2A). Vire as etiquetas de identificação (Figura 2B) para cima e remova garrafas de água, racks de alimentos e todos os tipos de enriquecimento na gaiola (Figura 2C) para evitar interferências com avaliações comportamentais.
Figura 2: Exemplo da gaiola configurada para classificações LID de experimentos de ratos em larga escala. (A) Várias gaiolas podem ser configuradas para classificação LID usando grandes racks de metal que permitem uma visualização ideal de cada animal. As gaiolas devem ser espalhadas em um ângulo de 45° com cartões de identificação virados para cima (B), alimentos, garrafas de água, materiais de aninhamento e outros enriquecimentos removidos para limitar a obscurecimento visual do rato e distrações ao rato enquanto examina comportamentos discinéticos (C). Os racks de metal precisam estar a poucos metros de qualquer parede para permitir que o avaliador examine o rato na frente ou atrás da gaiola, conforme necessário. É essencial rotular aparelhos de enriquecimento (por exemplo, casas de retiro de ratos vermelhos c- c) com identidades individuais de animais para substituí-los na mesma gaiola de onde vieram. Isso é particularmente importante quando se usa animais de diferentes sexos para não aumentar o estresse aos sujeitos experimentais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Injeção de levodopa e classificação de dyskinesia
- Injeções subcutâneas de L-DOPA21,22
- Imediatamente antes da injeção diária de L-DOPA, adicione o volume apropriado de soro fisiológico estéril à mistura l-dopa e benserazida pré-ponderada no frasco âmbar e agite bem por 10 s (passo 2.3).
NOTA: O volume de injeção de alvo é de 1 mL/1000 g de peso corporal (com 12 mg L-DOPA por mL). O volume do soro fisiológico estéril dependerá do número de animais por estudo. - Encha as seringas individuais (por exemplo, 1,0 ou 0,5 mL com agulha de 26 G) com o volume necessário para cada animal (1 mL/kg de peso de rato) e rotule cada seringa com identificação individual animal.
NOTA: Mantenha as seringas cheias protegidas da luz em bolsas estéreis até o momento da injeção. L-DOPA oxida rapidamente na presença de oxigênio e luz em um ambiente aquoso 23,24,25,26. - Traga a primeira gaiola para o banco de injeção.
- Remova o rato de sua gaiola e coloque-o na superfície de injeção.
- Contenha suavemente a cabeça e os ombros contra a superfície em que o rato está descansando com a palma da mão não dominante.
- Suavemente, escroto a pele nas costas sobrevoando a escápula com o polegar e o indicador da mão não dominante, injete o volume L-DOPA com a mão dominante no espaço subcutâneo entre/abaixo dos dedos, mantendo a agulha o mais paralela possível ao corpo para evitar a injeção intramuscular.
NOTA: Os ratos não são anestesiados antes da injeção. - Descarte cada seringa individual usada em um recipiente afiado.
- Substitua o rato em sua gaiola individual e adicione guloseimas nutricionalmente completas, exceto nos dias de classificação LID para evitar interferências com avaliações comportamentais até que as classificações estejam completas.
- Defina o temporizador para 1-2 min, dependendo do tempo de classificação desejado e do número de ratos no estudo em dias de classificação. Recupere a próxima gaiola e injete o próximo rato quando o temporizador indicar.
- Repita isso, injetando um rato a cada 1-2 minutos, até que todos os ratos sejam injetados.
- Imediatamente antes da injeção diária de L-DOPA, adicione o volume apropriado de soro fisiológico estéril à mistura l-dopa e benserazida pré-ponderada no frasco âmbar e agite bem por 10 s (passo 2.3).
- Classificação de dyskinesia induzida por Levodopa pós-injeção
- Classifique a intensidade (Tabela 1) e a frequência (Tabela 2) dos movimentos de dystônica e hipercinética da diskinesia no número desejado de pontos de tempo, o que deve incluir o início inicial do comportamento do LID, o comportamento de pico e a fase de declínio (ver Arquivo Suplementar 2 para um exemplo da folha de registro de classificação LID).
- Para o adulto masculino e feminino Sprague Dawley ou Fisher 344 ratos, e um tamanho amostral de N = 40 ratos, comece as classificações de dyskinesia 20 minutos após a primeira injeção L-DOPA, e depois em intervalos de 50 minutos até 220 ou 270 min pós-injeção, dependendo de quando os comportamentos lid tenham descontinuado em 90%-100% dos ratos.
- Se usar intervalos de classificação de 1 min, defina um temporizador para 1 min. Avalie o primeiro rato por um minuto. Mova-se para o próximo rato e classifique-o por 1 min. Continue por todos os ratos, classificando para intervalos de 1 min.
- Tenha um temporizador posicionado ao lado da gaiola visivelmente para que a intensidade de comportamento lid (Tabela 1) possa ser observada enquanto estima a frequência de qualquer comportamento dado (Tabela 2) durante o período de classificação.
- Após a classificação para o primeiro ponto ser completado comece novamente com o primeiro rato no ponto da próxima vez (por exemplo; 70 min pós-injeção) e continue no intervalo desejado (por exemplo, a cada 50 minutos) até que todos os pontos de tempo sejam concluídos.
NOTA: Devido à sobreposição das tarefas de injeção L-DOPA e classificação LID, duas pessoas são necessárias nos dias de classificação, uma para injeção e outra para classificações comportamentais.
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Representative Results
Lids em ratos parkinsonianos podem manifestar-se como uma série de movimentos involuntários anormais (AIMs), incluindo comportamentos disstônicos, hipercinéticos e estereotipados. Os critérios de classificação LID para tais comportamentos são apresentados aqui para incluir tanto a intensidade (Tabela 1) quanto a frequência (Tabela 2). Isso fornece uma pontuação geral de gravidade LID para cada rato que reflete tanto a qualidade (intensidade) quanto a quantidade de tempo gasto engajando (frequência) nesses comportamentos em cada ponto de tempo de classificação. O escore final de gravidade do LID é calculado multiplicando-se o escore de intensidade pelo escore de frequência de cada componente comportamental. Os critérios de pontuação para atributos individuais de comportamentos LID são fornecidos aqui como descrições escritas (Tabela 1-2), e exemplos são mostrados como imagens estádas com relatórios detalhados (Figura 3) e como vídeos (Vídeos animados 1-4). Informações descritivas adicionais sobre movimentos individuais e pontuação são fornecidas nas lendas da figura.
Uma avaliação abrangente do impacto de qualquer tratamento na amenização dos comportamentos de LID ao longo do tempo pode ser observada usando uma abordagem de dose-escalonamento L-DOPA, 12 semanas de comprimento total, com 8 semanas de injeções L-DOPA após lesão 6-OHDA (Figura 1). Neste cenário, o L-DOPA recebe 5x por semana (segunda a sexta-feira) por 2 semanas em cada dose L-DOPA prescrita. As classificações comportamentais que ocorrem nos dias 1, 6 e 10 de cada dose L-DOPA fornecem uma abordagem robusta para avaliação da eficácia do tratamento (Figura 1). No entanto, os pesquisadores podem achar que os cronogramas alterados e os esquemas de dosagem respondem melhor às suas perguntas experimentais. De fato, a dose de L-DOPA e benserazida, o inibidor periférico de decarboxilase, pode variar dependendo da experiência do pesquisador com doses e/ou hipóteses a serem testadas. Nota-se que as doses mais comuns de benserazida estão entre 10-15 mg/kg, o que é suportado pelo relatório de Tayarani-Binazir et al. (2012)20 mostrando que os efeitos comportamentais ideais do L-DOPA são encontrados com 10 mg/kg de benserazida, sem nenhum benefício adicional em 15 mg/kg.
Existem várias maneiras de apresentar e analisar os dados do LID ao determinar se um determinado tratamento tem um impacto significativo na amenização desse comportamento aberrante. A Figura 4A fornece exemplo de dados apresentados como lid de dose máxima em toda a linha de tempo experimental. A dose de pico LID pode ser definida como o ponto de tempo em que a pontuação lid média do grupo é a maior. Alternativamente, pode-se relatar o "pico absoluto", que é o pico máximo de pontuação lid para um animal, independentemente de quando ocorre durante um período de classificação. Além disso, os dados de classificação LID podem ser examinados em cada curso de tempo de classificação diária e apresentados como dados de grupo experimentais e/ou plotados para mostrar a gravidade do LID de cada indivíduo em cada ponto de tempo (Figura 4B)19. Esta última abordagem permite avaliar se alguns tratamentos podem reduzir, por exemplo, a quantidade total de tempo que um sujeito exibe LID, mas não necessariamente impactar a gravidade da dose máxima. Finalmente, pode-se quantificar as pontuações totais de gravidade do LID durante toda a sessão de classificação. Para um determinado assunto, a pontuação de gravidade do LID para cada ponto de tempo é somada para produzir uma pontuação total para esse período de classificação. Esta abordagem emula a área sob as estimativas da curva, que também pode ser calculada.
É essencial perceber que os dados de pontuação LID/AIMs, criados usando escalas de classificação para atribuir valores à gravidade e/ou duração da disquinesia (Tabelas 1 e 2), são dados ordinais. Assim, os testes estatísticos mais adequados são não paramétricos. Embora não haja um teste não paramétrico equivalente direto para análise bidirecional de variância, os dados LID podem ser analisados com alternativas não paramétricas à ANOVA unidirecional. Especificamente, o teste Kruskal-Wallis é usado para comparações entre sujeitos de dois ou mais grupos independentes. O teste de Friedman é uma alternativa não paramétrica a uma ANOVA unidirecional com medidas repetidas utilizadas para comparações dentro dos sujeitos. Ambos são usados com testes pós-hoc (ou seja, Dunn ou Dunn-Bonferroni) após um teste significativo de Kruskal-Wallis ou Friedman. Para examinar se há diferenças significativas entre dois grupos independentes, o teste Mann-Whitney U é considerado o equivalente não paramétrico do teste t independente28,29.
Figura 3: Imagens de quadro congelado que mostram exemplos de pontuação de intensidade de LID em ratos parkinsonianos. (A) Imagem representativa de um rato de parkinsoniano não-discinético exibindo a postura parkinsoniana curvada frequentemente típica na ausência de distonia ou hiperkinesia. (B) Rato parkinsoniano com gravidade geral leve da LID, indicando distonia de membros dianteiros leves a moderados direito e falta de tônia do pescoço, tronco ou de limão traseiro; no vídeo que acompanha (Vídeo Animado 1), pode-se ver diskinesia de pequena amplitude direita para a diskinesia (RFPD) e movimentos orolinguais. (C) Rato parkinsoniano com distonia moderada do pescoço e tronco (texto em negrito corresponde a setas direcionais indicando tronco torcido no ângulo de 90°). (D) Rato de parkinsoniano discinético com pescoço leve e distonia moderada do tronco, distonia de membros dianteiros direito moderado a grave; no vídeo que acompanha (Vídeo Animado 3), pode-se observar amplitude mista RFPD. (E) Rato parkinsoniano com pescoço moderado a grave e distonia severa do tronco, limão traseiro direito grave e distonia de membro dianteiro direito moderado (texto em negrito corresponde a setas direcionais indicando que o tronco está torcido ~180°; isso é especialmente notável no exemplo #2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de dados LID cumpridos ao longo de 8 semanas de classificações LID com a escalada da dosagem L-DOPA. (A) Severidade da lid de dose de pico (80 min pós-L-DOPA) através do tempo e das doses. (B) Curso de tempo diário (20-170 min pós-L-DOPA). Para cada dose e dia, os gráficos superiores refletem média ± SEM; os gráficos inferiores mostram respostas individuais de sujeitos ao longo do tempo. As estatísticas foram calculadas usando Kruskal-Wallis com os múltiplos testes de comparação de Dunn (para testes entre sujeitos) e testes de Friedman com os múltiplos testes de comparação de Dunn (para testes de subjetivos). Abreviaturas: Controle (Ctr) (n = 7); Tratamento (Tx) (n = 10). Esta figura é reimpressa e adaptada com permissão da Referência19. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pontuação | Descrição | |
| Dystonia do Pescoço | 0 | nenhum |
| 1 | leve deslocamento de cabeça, mantido por tempo considerável (>10-20 s); pode ser extremo de normal | |
| 1.5 | mistura de distonia leve e moderada | |
| 2 | cabeça com deslocamento mais notável (aproximadamente 90° ângulo para corpo); cabeça permanece puxado na direção do movimento tástico | |
| 2.5 | mistura de distonia moderada e grave | |
| 3 | torção severa constante da musculatura do pescoço (ângulo >100° entre cabeça e ombros) | |
| Dystonia tronco | 0 | nenhum |
| 1 | distonia leve/torção do tronco; Diferença de 45° entre tronco superior e inferior; mantido por tempo considerável (≥10-20 s) e não preditivo de rotações | |
| 1.5 | mistura de distonia leve e moderada | |
| 2 | distonia moderada/torção do tronco; Diferença de 90° entre tronco superior e inferior | |
| 2.5 | mistura de distonia moderada e grave | |
| 3 | distonia/torção severa constante, postura semelhante a "saca-rolhas" (aproximando-se de 180°; cabeça e pés em direções opostas), incapaz de ambbular e pode entrar na rotação do rolo do barril | |
| Distonia forelimb | 0 | nenhum |
| 1 | leve; postura anormal de pulso ou dígitos; ou punho cerrado ou antebraço rígido, mas não geralmente ambos simultaneamente | |
| 1.5 | mistura de distonia leve e moderada | |
| 2 | Moderado; punho cerrado e membro dianteiro rígido sem segurando para baixo em posição hiperextended | |
| 2.5 | mistura de distonia moderada e grave | |
| 3 | Grave; punho cerrado e antebraço rígido com hiperextensão para baixo | |
| Distonia hindlimb | 0 | nenhum |
| 1 | hindlimb levemente realizada em postura anormal; flexão ou extensão. | |
| 1.5 | mistura de distonia leve e moderada | |
| 2 | extensão rígida moderada ou flexão de subida traseira; w/o splaying dos dígitos | |
| 2.5 | mistura de distonia moderada e grave | |
| 3 | postura rígida grave do membro com hiperextensão anormal +/- reprodução de dígitos | |
| Diskinesia dianteira direita (RFPD) | 0 | ausente |
| 1 | pequenos movimentos de amplitude, simples lado a lado repetitivo, ou para cima e para baixo limpando na região da face ou boca; ou batendo na parede da gaiola ou lixo | |
| 1.5 | mistura de movimentos de amplitude pequeno e grande; mais comum | |
| 2 | grandes movimentos repetitivos para cima e para baixo envolvendo extensão severa do membro dianteiro direito, puxa para baixo e oposto do pescoço | |
| Orolingual | 0 | nenhum |
| 1 | principalmente boca fechada vazia (sem propósito) mastigação, ranger de dentes | |
| 1.5 | mastigação vazia, pode haver alguma saliência língua, mordida repetida na ninhada | |
| 2 | proeminente saliência língua repetida com proeminente boca aberta mastigando | |
| Cabeça balançando/tremor | 0 | nenhum |
| 1 | presente (bobing repetitivo e rítmico da cabeça (aproximadamente 4hz)) | |
| Mastigação constante de lixo (CCL) | 0 | nenhum |
| 1 | presente (mastigação constante de lixo; objetivo direcionado obsessivo mordendo ou mastigando lixo, repetidamente pegando, mastigando, caindo, pegando, mastigando, caindo de lixo) |
Tabela 1: Critérios de classificação LID para Intensidade de comportamentos disstônicos ou hipercinéticos em ratos parkinsonianos. Esses critérios de classificação fornecem uma gama de medidas de intensidade relacionadas à qualidade/gravidade das posturas e/ou movimentos involuntários anormais do rato. Atributos específicos descritos para posturas e comportamentos são geralmente classificados como leves, moderados ou graves, com descritores específicos aqui fornecidos. Uma pontuação final de gravidade é determinada como produto de Intensidade x Frequência (Tabela 2).
| Pontuação | Descrição |
| 0 | Ausente |
| 1 | Intermitente, < 50% do período de observação |
| 2 | Intermitente, ≥ 50% do período de observação |
| 3 | Persistente durante todo o período de observação e não interrompido por toques na gaiola |
Tabela 2: Critérios de classificação LID para frequência de comportamentos disstônicos ou hipercinéticos. Esses critérios fornecem uma medida de quantificação para a taxa em que qualquer comportamento ocorre ou é repetido durante o período de observação. Isso é importante para avaliar a gravidade geral, dado que o comportamento pouco frequente justifica um escore menos grave do que um persistente. Uma pontuação final de gravidade é determinada como produto de Intensidade (Tabela 1) x Frequência.
Vídeo animado 1: TAMPA leve com pequena amplitude RFPD e mastigação da anteriora esquerda. Rato de parkinsoniano discinético sem decote ou distonia do tronco, mas direito moderado previu distonia, pequena amplitude RFPD observou como movimento rápido repetido piscando da frente direita. Este rato também apresenta comportamento orolingual envolvendo mastigação vazia direcionada à forepaw esquerda. Dose L-DOPA: 12 mg/kg; vídeo gravado ~70 min pós-injeção. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo animado 2: Distonia moderada do tronco e pescoço. Rato de parkinsoniano discinético com distonia moderada do tronco e pescoço exemplificada pela diferença de 90° na posição dos membros dianteiros e traseiros (ver diagrama na Figura 2C). Este rato também exibe cheiro estereotipado proeminente e ocasionalmente mordidas vazias na ninhada. Dose L-DOPA: 12 mg/kg; vídeo gravado ~70 min pós-injeção. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo animado 3: Distonia direita moderada a severa previu com rfpd de amplitude mista. Rato de parkinsoniano discinético com pescoço leve e distonia moderada do tronco, distonia de previ direito moderada a grave, amplitude mista RFPD vista como movimentos menores de limpeza perto da boca misturados com maior amplitude para baixo puxando para baixo da pata dianteira direita. Este rato também tem comportamento rotacional frequente que pode ser quantificado, além de perfis LID. Dose L-DOPA: 12 mg/kg; vídeo gravado ~70 min pós-injeção. Clique aqui para baixar este vídeo.
Vídeo animado 4: Head bob e movimentos orolingual com saliências de língua. Rato de parkinsoniano discinético com tronco severo e distonia de pata dianteira (distonia de limão traseiro não visível), distonia do pescoço moderada a grave, e um bob cabeça constante com saliências de língua contínuas. O bob da cabeça se assemelha ao tremor de 4 Hz visto em DP; no entanto, em ratos, ele só é notado em ratos de parkinsoniano discinético após a administração L-DOPA. Este rato também tem amplitude mista RFPD, visto como movimentos de amplitude mais significativos no início do vídeo e pequenos movimentos semelhantes a limpeza perto do rosto, característicos de pequena amplitude RFPD vista mais tarde. Um leve movimento foi observado no gravemente dystônico/membro dianteiro no início do vídeo; no entanto, isso está relacionado com a atividade de tremor de cabeça e pescoço e não seria classificado como RFPD de pequena amplitude. Quando o observador toca fortemente na gaiola, esses comportamentos de LID não são interrompíveis, sugerindo que esta é uma LID grave que não pode ser superada com um medo. Clique aqui para baixar este vídeo.
Arquivo complementar 1: Exemplo para calcular a quantidade de L-DOPA. Exemplo de cálculos para determinar a quantidade de L-DOPA e soro fisiológico necessários para cada dia de uma semana usando 12 mg de L-DOPA/kg de peso corporal a um volume de injeção de 1 cc/kg de peso de rato. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Arquivo suplementar 2: Exemplo de folha de registro de classificação LID. Esta folha pode ser usada ou adaptada para registrar intensidade lid e escores de frequência durante as sessões de classificação. O escore final de gravidade é determinado como produto de Intensidade (Tabela 1) x Frequência (Tabela 2). Essas escalas de classificação também podem ser usadas para quantificar LID em camundongos30. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Apresentados aqui estão detalhes para a indução reprodutível e classificação de LIDs em um modelo de rato parkinsoniano após a lesão unilateral 6-OHDA do sistema da DA nigrostriatal. Embora já se pensou que os roedores não desenvolveram LID e que a assimetria rotacional pode ser o analógico da LID em ratos31, os modelos de ratos e camundongos foram caracterizados nas últimas duas décadas e são uma ferramenta bem aceita para a pesquisa lid 15,32,33,34. O protocolo aqui apresentado é especificamente útil para projetos experimentais de maior escala18,19. Ele fornece detalhes para classificar a intensidade e a frequência de uma série de comportamentos discinéticos, tanto disstônicos quanto hipercinéticos. Notavelmente, imagens e vídeos com notas detalhadas correspondentes e pontuação de comportamentos lid disstônicos e hipercinéticos ajudarão a avaliação do experimentador após a administração L-DOPA. Embora não seja fornecido um exemplo de todos os objetivos possíveis, uma série de comportamentos que variam de leve a moderado a grave é oferecido como um quadro para avaliação do LID. Este protocolo foi documentado para ajudar a avaliar várias terapias em ratos parkinsonianos 19,35,36,37. Ele aumenta outras escalas de classificação de roedores publicadas que se concentram principalmente na duração dos comportamentos prescritos do LID 33,38,39. Além disso, o procedimento delineado busca alinhar os métodos de pontuação em um modelo PD de rato com práticas atuais que avaliam LIDs em primatas não humanos (NHPs), o modelo PD de referência40,41.
Comumente encontradas na literatura de roedores parkinsonianos são lid, ou escalas de classificação AIM que envolvem examinar exclusivamente a ocorrência ou frequência de (1) dyskinesias de membros (por exemplo, empurrões rítmicos do contralateral forelimb à lesão33, ou movimento rápido e sem propósito do membro dianteiro controlado pelo hemisfério39 lesado); (2) diskinesias axiais (por exemplo, torção dos músculos axiais que afetam o pescoço, tronco e cauda33, ou torção disstônica do pescoço e torso contralateral ao hemisfério39); e (3) diskinesias orolinguais (por exemplo, movimentos masticatórios da boca vazia com saliênciasde língua 33, ou mastigação repetitiva ou saliências de língua quando a boca do rato estava vazia e não em contato com qualquer objeto39). Essas três categorias comportamentais recebem um escore de gravidade com base em sua frequência durante o período de observação. O escore de gravidade representando o tempo que um animal passou exibindo esses comportamentos, muitas vezes sem caracterização da qualidade do comportamento, é então combinado na pontuação final da ALO (axial, membro e orolingual).
Em contrapartida, o protocolo atual fornece uma escala mais detalhada que permite não apenas a avaliação de AIMs globais, mas também permite o exame de AIMs em partes do corpo independentes (ou seja, pescoço, tronco, forelimb, hindlimb e boca), a intensidade/qualidade do AIM sendo avaliado, diferenciação da distonia de comportamentos hipercinéticos e, como em outras escalas, incorpora a frequência de qualquer ocorrência de AIM. O objetivo geral é permitir uma avaliação abrangente do comportamento lid expresso em cada assunto. Por exemplo, para a leitura única comportamental da distonia do tronco, um rato exibindo distonia leve do tronco (ou seja, diferença de 45° entre torso superior e inferior, não preditivo de comportamento de giro) por um período de observação inteira é muito diferente de um rato exibindo distonia severa do tronco (ou seja, distonia severa/torção constante, postura semelhante a saca-rolhas, aproximando-se de 180°; cabeça e pés opostos na direção, incapaz de ambulação) durante toda a observação. Além disso, dada a representação topográfica do corpo do rato no estriado, diferenciar atributos individuais de LIDs pode ser informativo36.
Outro componente deste protocolo a considerar cuidadosamente é o projeto experimental da escalada da dosagem L-DOPA ao longo de um curso estendido (por exemplo, 8 semanas) de tempo de tratamento (Figura 1). Um estudo que utiliza apenas doses baixas de L-DOPA (por exemplo, 3-6 mg/kg) e/ou administração da dose de escolha por um curto período (por exemplo, 2-4 semanas) pode apresentar evidências de amelieração da LID com intervenção terapêutica em ratos parkinsonianos; no entanto, a relevância desses estudos para indivíduos com DP, onde a administração crônica e a escalada de doses são frequentemente necessárias, é questionável. Tais protocolos de tratamento divergentes entre investigações pré-clínicas e clínicas poderiam ser sugeridos para fundamentar a falta de eficácia observada em ensaios clínicos realizados com medicamentos que se mostraram promissores em estudos pré-clínicos de roedores.
Embora o protocolo aqui apresentado forneça instruções sobre uma abordagem abrangente para classificação LID em ratos parkinsonianos e o modelo de rato da LID tenha sido estabelecido como um modelo confiável de LID clínico 3,15,38,42,43, existem limitações inerentes a qualquer modelo. Modelos animais são ferramentas que são úteis na emulação de atributos particulares da doença humana e em fazer previsões sobre, por exemplo, o impacto que a intervenção terapêutica pode ter em um conjunto de características da doença. Uma característica dos modelos pré-clínicos de LID comumente debatidos como uma limitação potencial é que os ratos requerem esgotamento significativo da DA para expressar LID. Além disso, muitas vezes é citado que a LID se desenvolve mais rapidamente em modelos de roedores e NHP do que em pacientes e, portanto, essas características do modelo não refletem lid clínica. No entanto, muitas vezes é subestimado que, independentemente das espécies (ou seja, primatas humanos, não humanos ou roedores), a perda quase completa da innervação estriatal da DA é geralmente necessária para lid se manifestar. Uma vez que o L-DOPA é administrado a indivíduos com esgotamento estriatal grave da DA, a LID é induzida 1,19,38,44,45,46. Uma segunda característica que tem fomentado o ceticismo em relação aos modelos de roedores da LID vem da expectativa de que os sinais neurológicos da LID devem se assemelhar às manifestações físicas da LID vistas em primatas (ou seja, humanas e não-humanas). De fato, o aparecimento dos movimentos anormais classificados como LIDs em ratos varia em características da vista em primatas (por exemplo, coreoathetose em primatas vs. estereotipo/hiperkinesia em roedores). Embora esteja além deste artigo abordar este tema de forma abrangente, brevemente, tais diferenças nos sinais entre as espécies baseiam-se no fato de que os seres humanos são bipedal habitual, não-primatas frequentes bipedal, e roedores quadrúpedesquadrupedal 43,46. Assim, várias espécies possuem repertórios específicos de comportamentos manifestados por estruturas osteoarticulares e musculares específicas e moduladas por sistemas neurais específicos de espécies43. Assim, a modelagem animal de sintomas semelhantes ao homem deve basear-se principalmente em uma expectativa de similaridade funcional e não na identidade física43. Interpretação dos achados de modelos animais com a devida prudência tem, e continuará fornecendo previsões valiosas para o tratamento da doença.
Embora exista atualmente um medicamento aprovado pela FDA para o tratamento de LID em PD, amantadina, e a intervenção cirúrgica do DBS pode amenizar a LID, a eficácia e a tolerabilidade não são ideais, e nem todos os pacientes se qualificarão para a cirurgia de DBS. Como eloquentemente revisado por Cenci e colegas47, há uma noção expressa por alguns de que indivíduos acometidos por DP preferem estar ON (ou seja, experimentando o benefício motor de L-DOPA) com dyskinesias do que OFF. Como esses autores afirmam: "A verdade mais profunda é que os pacientes preferem muito estar ligados sem disquinesia. Como pesquisadores e médicos, devemos aspirar a tornar esse objetivo realidade. Para isso, a pesquisa translacional sobre lid deve ser incentivada e persistentemente perseguida." Ao perseguir esse objetivo, apresentamos nosso método de indução e classificação de LID. Nossa escala de classificação foi projetada para combinar uma série de medidas de intensidade relacionadas à qualidade/gravidade dos AIMs e indica que a quantidade de tempo que uma variedade de atributos de diskinesia são exibidos. A intenção deste modelo é permitir a determinação de um valor numérico que reflita com precisão a gravidade do LID, ao mesmo tempo em que contabiliza a intensidade e a frequência. Além disso, esse valor indica a gravidade do LID não apenas sistematicamente, mas em referência a partes específicas do corpo. Com este modelo, pretendemos garantir que a terapêutica experimental possa ser rigorosamente testada para sua capacidade de modificar dyskinesias induzidas por levodopa.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses foi declarado.
Acknowledgments
Queremos reconhecer as lutas de todos aqueles com mal de Parkinson e a força e resiliência que eles mostram todos os dias, especialmente o amado pai do KSC, Mark Steece. O trabalho aqui representado foi apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC (NS090107, NS110398) e pelo Programa internacional de bolsas de pesquisa da Parkinson Disease Foundation, agora a Parkinson Foundation. Também gostaríamos de reconhecer Molly VanderWerp por sua excelente assistência editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Minutes Digital Timer | Staples | 1111764 | |
| Compass CX Compact Scale | Ohaus | 30428202 | |
| 5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide | Cayman Chemicals | 25330 | 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents. |
| Allentown cages | Allentown, LLC | Rat900 | Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides. |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | BD | BD 305540 | For subcutaneous L-DOPA injections |
| Benserazide hydrochloride | Sigma-Aldrich | B7283 | Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD. |
| Glass amber scintillation vials | Thermo Scientific | B7921 | Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline. |
| L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1507 | L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents. |
| Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils | Staples | 107250 | |
| Rodent nutritionally complete enrichment treats | Bio-Serv | F05478 | |
| Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L | Corning | 432129 | |
| Standard Plastic Clipboard | Staples | 1227770 | |
| Steel wired 6' long movable shelving units | Uline | H9488 | Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment |
| Sterile Saline 0.9% | Covidien/Argyle | 1020 | For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections. |
References
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