Summary
Denna artikel beskriver metoder för att inducera och utvärdera levodopa-inducerade dyskinesier i en råttmodell av Parkinsons sjukdom. Protokollet erbjuder detaljerad information om intensiteten och frekvensen av en rad dyskinetiska beteenden, både dystoniska och hyperkinetiska, vilket ger ett tillförlitligt verktyg för att testa behandlingar som riktar sig mot detta ouppfyllda medicinska behov.
Abstract
Levodopa (L-DOPA) är fortfarande den guldstandardterapi som används för att behandla Parkinsons sjukdom (PD) motoriska symtom. Emellertid, oönskade ofrivilliga rörelser som kallas L-DOPA-inducerade dyskinesier (LIDs) utvecklas med långvarig användning av denna dopamin föregångare. Det uppskattas att incidensen av LIT eskalerar till cirka 90% av individerna med PD inom 10-15 år efter behandlingen. Att förstå mekanismerna för denna sjukdom och utveckla både nya och effektiva anti-dyskinesibehandlingar kräver konsekvent och noggrann modellering för preklinisk testning av terapeutiska ingrepp. En detaljerad metod för tillförlitlig induktion och omfattande klassificering av ED efter 6-OHDA-inducerad nigral lesion i en råttmodell av PD presenteras här. Pålitlig LID-bedömning hos råttor ger ett kraftfullt verktyg som lätt kan användas i laboratorier för att testa nya terapier som fokuserar på att minska eller eliminera denna vanliga behandlingsinducerade börda för individer med PD.
Introduction
Även om det har gått mer än 50 år sedan levodopa (L-DOPA) först introducerades som en behandling för individer med PD 1,2, är det anmärkningsvärt fortfarande den mest effektiva behandlingen för parkinsoniska motoriska symtom. De kliniska motoriska symtomen i samband med PD härrör från förlusten av dopamin (DA) neuroner i substantia nigra (SN) pars compacta, vilket resulterar i den dramatiska minskningen av tillgängligt dopamin i striatum. L-DOPA återställer effektivt striatala DA-nivåer, vilket resulterar i motorisk nytta tidigt i sjukdomen 3,4. Inopportunely, med långvarig behandling, kommer de flesta individer med PD att utveckla L-DOPA-inducerade dyskinesier (LID), inklusive chorea, dystoni och athetos, som ofta signifikant påverkar aktiviteterna i det dagliga livet 5,6,7.
Medan flera beteendemodeller av LID hos gnagare finns, har skillnader i modellering och beteendebedömning av LID ifrågasatt reproducerbarheten av resultat mellan laboratorier samt tillförlitligheten hos dessa experimentella verktyg för preklinisk PD-forskning. Utvecklat i samarbete med en specialist på klinisk rörelsestörning8, är det nuvarande protokollet en enkel metod för LID-induktion och klassificering och är lämplig för användning i en råttmodell av PD med användning av 6-hydroxydopamin (6-OHDA) -inducerad ensidig nigral lesion 9,10. LID-betygsskalan som tillhandahålls här inkluderar poäng för både intensiteten och frekvensen av dyskinetiskt beteende i olika enskilda kroppsdelar. Relevant information om arbetsflödesoptimering av experiment och lämplig vård och hantering av parkinsoniska och dyskinetiska djur tillhandahålls också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De djur som presenterades här upprätthölls och hanterades i enlighet med de institutionella riktlinjerna. Alla djurprocedurer godkändes av Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i enlighet med federala och statliga bestämmelser.
1. Drogfri bekräftelse av 6-OHDA-lesionsstatus
- Posturalt svanshängningstest 11,12,13
OBS: Bedöm lesionsstatus minst 1 vecka efter 6-OHDA-lesionsinduktion (Se 9,10,35 för detaljer om lesion) hos försökspersoner (t.ex. man eller kvinna, vuxna Sprague Dawley eller Fisher 344 råttor).- Häng råttan ca 6 cm över sin bur, håll fast vid svansens botten i ~ 5 s.
- Registrera riktningen för kroppsförvridning som + för ett framgångsrikt lesionerat djur som vrider sig kontralateralt till den lesionerade sidan och - för brist på vridning eller vridning i båda riktningarna.
- OBS: Dessa tester är valfria men rekommenderas. Se 14,15,16,17 för ytterligare drogfria testalternativ/variationer.
- Stegjustering av dragtest (anpassat från16)
OBS: Bedöm lesionsstatus minst 1 vecka efter ensidig 6-OHDA-lesionsinduktion hos försökspersoner (t.ex. man eller kvinna, vuxna Sprague Dawley eller Fisher 344 råttor).- Håll råttan vid svansens botten och lyft bakfötterna från ytan med ~ 6 cm; dra bakåt över en plan, slät men inte hal yta, ~ 75 cm, över 5–10 s.
- Observera och registrera antalet tryck-/stegjusteringsrörelser för varje framtass under tre upprepade tester.
- Poängsätt ämnet som + för framgångsrik ensidig lesion när 0-2 framtasskranar observeras kontralaterala till den lesionerade sidan, tillsammans med snabb tappning (~ 10 kranar) från framtassens ipsilaterala till den lesionerade sidan (t.ex. djur som ensidigt lesioneras på vänster sida visar tappningsunderskott (0-2 kranar) med den kontralaterala högra framtassen).
- Omvänt, poäng måttlig till snabb tappning (5-10 kranar) från båda framtassarna som - för att indikera ofullständig eller okänd lesionsstatus.
OBS: Ett oroligt djur kan visa snabb knackning / stegjustering även om det lyckas skadas. Om detta misstänks, placera råttan tillbaka i sin hembur och testa igen ≥30 minuter senare.
2. Beredning av reagenser och förnödenheter
- Bestäm L-3,4-dihydroxifenylalaninmetylesterhydroklorid (levodopa eller L-DOPA) och benserazidhydroklorid, en perifer dekarboxylashämmare (se materialtabell), klassificeringsfrekvens och experimentell tidslinje som är lämplig för undersökningsfrågan 12,18,19,20 (figur 1).
OBS: Utredningsfrågor kan ställas för att söka valfritt antal frågor som sträcker sig från att fråga om en specifik terapi kan minska befintlig LID eller förhindra induktion av LID. De kan också undersöka om terapeutisk effekt är beroende av dosen levodopa eller om LID-uttryck och / eller terapeutisk effekt varierar beroende på kön, art och ålder hos försökspersonen.
Figur 1: Exempel på behandlingstidslinje. Exempel L-DOPA dosupptrappning tidslinje på 12 veckor i total längd, med 8 veckor av L-DOPA injektioner som börjar 3 veckor efter 6-OHDA lesioner och 4 veckor efter experimentell behandling. I detta exempel injiceras L-DOPA subkutant 5x per vecka (måndag-fredag) vid ungefär samma tidpunkt varje dag, i 2 veckor vid varje föreskriven L-DOPA-dos (3, 6, 9 och 12 mg / kg). Behavioral LID betyg äger rum på dag 1, 6, och 10 av varje L-DOPA doseringsnivå. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Väg råttor varje vecka för att beräkna lämplig läkemedelsmängd baserat på de pågående viktförändringarna under studien.
OBS: På grund av ökad aktivitet hos LID+ råttor finns det potential för viktminskning med långvariga L-DOPA-behandlingar. Om viktminskning inträffar ge råttor näringsmässigt kompletta, mycket välsmakande behandlingar (se Materialtabell) efter L-DOPA injektioner. - Beräkna mängden L-DOPA och benserazid som krävs för varje veckokoncentration, väga ut lyofiliserade alikvoter för varje injektionsdag och lagra i kombination i 1–2 veckor vid -20 °C i bärnstensfärgade glasflaskor fram till behandlingsdagen.
OBS: Måldosen är 12 mg/kg eller 12 mg L-DOPA/1000 g kroppsvikt. Exempel på beräkningar för att bestämma mängden L-DOPA och saltlösning som behövs för varje dag i veckan med användning av 12 mg L-DOPA/kg kroppsvikt vid en injektionsvolym på 1 cc/kg råttvikt ges i tilläggsfil 1.
3. Rum och bur inrättas
- På den första dagen av L-DOPA-behandling 3-4 veckor efter 6-OHDA lesionskirurgi, överför råttor till enstaka bostäder, inklusive IACUC-godkänd anrikning.
- Behåll i enstaka bostäder under hela studien för att undvika peer interferens med beteendebedömningar.
- På LID-klassificeringsdagar, placera hemburarna på ett stålgaller, vridet i cirka 45 ° vinkel för optimal visning av råttan (figur 2A). Vänd identifieringsetiketterna (figur 2B) uppåt och ta bort vattenflaskor, matställ och alla typer av anrikning i buret (figur 2C) för att undvika störningar i beteendebedömningar.
Figur 2: Exempel på buren som inrättats för LID-klassificeringar av storskaliga råttexperiment. (A) Flera burar kan ställas in för LID-klassning med hjälp av stora metallställ som möjliggör optimal visning av varje djur. Burar bör spridas isär i 45 ° vinkel med ID-kort vända uppåt (B), mat, vattenflaskor, häckningsmaterial och annan anrikning avlägsnas för att begränsa råttans visuella dunkelhet och distraktioner för råttan medan man undersöker dyskinetiska beteenden (C). Metallställen måste vara några meter från någon vägg så att ratern kan undersöka råttan på framsidan eller baksidan av buret efter behov. Det är viktigt att märka anrikningsapparater (t.ex. C-röda råtta reträtthus) med enskilda djur-ID för att ersätta dem i samma bur från vilken de kom. Detta är särskilt viktigt när man använder djur av olika kön för att inte öka stressen för försökspersonerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Levodopa-injektioner och dyskinesiklassificering
- Subkutana injektioner av L-DOPA 21,22
- Omedelbart före den dagliga injektionen av L-DOPA, tillsätt lämplig volym steril saltlösning till den förvägda lyofiliserade L-DOPA- och benserazidblandningen i bärnstensflaskan och skaka väl i 10 s (steg 2.3).
OBS: Målinjektionsvolymen är 1 ml / 1000 g kroppsvikt (med 12 mg L-DOPA per ml). Volymen av den sterila saltlösningen beror på antalet djur per studie. - Fyll enskilda sprutor (t.ex. 1,0 eller 0,5 ml med 26 G nål) med önskad volym för varje djur (1 ml/kg råttvikt) och märk varje spruta med individuell djuridentifiering.
OBS: Håll de fyllda sprutorna skyddade från ljus i sterila påsar fram till injektionstillgången. L-DOPA oxiderar snabbt i närvaro av syre och ljus i en vattenhaltig miljö 23,24,25,26. - Ta med den första buren till injektionsbänken.
- Ta bort råttan från buret och placera den på injektionsytan.
- Håll försiktigt huvudet och axlarna mot ytan på vilken råttan vilar med handflatan på den icke-dominerande handen.
- Försiktigt, scruff huden på ryggen över scapulae med tummen och pekfingret på den icke-dominerande handen, injicera L-DOPA volym med den dominerande handen i det subkutana utrymmet mellan / under fingrarna, håll nålen så parallell med kroppen som möjligt för att undvika intramuskulär injektion.
OBS: Råttorna sövs inte före injektion. - Kassera varje använd enskild spruta i en skarp behållare.
- Byt ut råttan i sin individuella bur och tillsätt näringsmässigt kompletta godisar utom på LID-klassificeringsdagar för att undvika störningar i beteendebedömningar tills efter att betygen är klara.
- Ställ in timern på 1–2 min beroende på önskad betygstid och antalet råttor i studien på betygsdagar. Hämta nästa bur och injicera nästa råtta när timern indikerar.
- Upprepa detta, injicera en råtta var 1-2: e minut tills alla råttor injiceras.
- Omedelbart före den dagliga injektionen av L-DOPA, tillsätt lämplig volym steril saltlösning till den förvägda lyofiliserade L-DOPA- och benserazidblandningen i bärnstensflaskan och skaka väl i 10 s (steg 2.3).
- Levodopa-inducerad dyskinesiklassificering efter injektion
- Betygsätt intensiteten (tabell 1) och frekvensen (tabell 2) för dystoniska och hyperkinetiska dyskinesirörelser vid önskat antal tidpunkter, vilket bör inkludera den första starten av LID-beteende, toppbeteende och nedgångsfasen (se kompletterande fil 2 för ett exempel på LID-klassificeringsloggblad).
- För manliga och kvinnliga vuxna Sprague Dawley eller Fisher 344 råttor, och en provstorlek på N = 40 råttor, börja dyskinesi betyg 20 min efter den första L-DOPA injektionen, och sedan med 50 minuters mellanrum fram till 220 eller 270 min efter injektion, beroende på när LID beteenden har upphört hos 90% -100% av råttorna.
- Om du använder 1 min klassificeringsintervall, ställ in en timer på 1 min. Betygsätt den första råttan i en minut. Flytta till nästa råtta och betygsätt den i 1 min. Fortsätt genom alla råttor, betyg för 1 min intervall.
- Ha en timer placerad bredvid buren synligt så att LID-beteendeintensiteten (tabell 1) kan observeras när du uppskattar frekvensen för ett givet beteende (tabell 2) under bedömningsperioden.
- Efter att klassificeringen för den första tidpunkten har slutförts startar du igen med den första råttan vid nästa tidpunkt (t.ex. 70 min efter injektionen) och fortsätter med önskat intervall (t.ex. var 50:e minut) tills alla tidpunkter är klara.
OBS: På grund av överlappningen av L-DOPA-injektion och LID-klassificeringsuppgifter behövs två personer på betygsdagarna, en för injektion och en för beteendebedömningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LIDs hos parkinsoniska råttor kan manifestera sig som en rad onormala ofrivilliga rörelser (AIM), inklusive dystoniska, hyperkinetiska och stereotypa beteenden. LID-klassificeringskriterier för sådana beteenden presenteras här för att inkludera både intensitet (tabell 1) och frekvens (tabell 2). Detta ger en övergripande LID-allvarlighetsgrad för varje råtta som återspeglar både kvaliteten (intensiteten) och mängden tid som spenderas på att engagera sig (frekvens) i dessa beteenden vid varje bedömningstidpunkt. Den slutliga LID-allvarlighetsgraden beräknas genom att multiplicera intensitetspoängen med frekvenspoängen för varje beteendekomponent. Poängkriterier för enskilda attribut för LID-beteenden anges här som skriftliga beskrivningar (tabell 1–2), och exemplen visas som stillbilder med detaljerade rapporter (figur 3) och som videor (animerade videor 1–4). Ytterligare beskrivande information om enskilda rörelser och poängsättning finns i figurförklaringarna.
En omfattande bedömning av effekten av någon behandling på förbättring av LID-beteenden över tid kan observeras med hjälp av en L-DOPA-dosupptrappningsmetod, 12 veckor i total längd, med 8 veckors L-DOPA-injektioner efter 6-OHDA-lesion (Figur 1). I detta scenario ges L-DOPA 5x per vecka (måndag-fredag) i 2 veckor vid varje föreskriven L-DOPA-dos. Beteendemässiga betyg som äger rum på dag 1, 6 och 10 av varje L-DOPA-dos ger ett robust tillvägagångssätt för bedömning av behandlingseffekt (Figur 1). Forskare kan dock upptäcka att förändrade tidslinjer och doseringssystem bättre svarar på deras experimentella frågor. Faktum är att dosen av L-DOPA och benserazid, den perifera dekarboxylashämmaren, kan variera beroende på prövarens erfarenhet av doser och/eller de hypoteser som ska testas. Det är anmärkningsvärt att de vanligaste doserna av benserazid är mellan 10-15 mg / kg, vilket stöds av rapporten från Tayarani-Binazir et al. (2012) 20 som visar att optimala beteendemässiga effekter av L-DOPA finns med 10 mg / kg benserazid, utan ytterligare fördel vid 15 mg / kg.
Det finns flera sätt att presentera och analysera LID-data när man bestämmer om en viss behandling har en meningsfull inverkan för att förbättra detta avvikande beteende. Figur 4A ger exempel på data som presenteras som toppdos LID över hela den experimentella tidslinjen. Toppdos LID kan definieras som den tidpunkt då gruppens genomsnittliga LID-poäng är störst. Alternativt kan man rapportera "absolut topp", vilket är den maximala lid-poängen för ett djur oavsett när det inträffar under en betygsperiod. Dessutom kan LID-klassificeringsdata undersökas över varje daglig betygstidskurs och presenteras antingen som experimentella gruppdata och / eller plottas för att visa enskilda försökspersoners LID-svårighetsgrad vid varje tidpunkt (figur 4B)19. Detta senare tillvägagångssätt gör det möjligt att bedöma om vissa behandlingar kan minska, till exempel, den totala tiden som ett ämne visar LID, men inte nödvändigtvis påverka toppdosens svårighetsgrad. Slutligen kan man kvantifiera totala LID-allvarlighetsgradspoäng över hela betygssessionen. För ett visst ämne summeras LID-allvarlighetsgraden för varje tidpunkt för att ge en total poäng för den bedömningsperioden. Detta tillvägagångssätt emulerar området under kurvuppskattningarna, som också kan beräknas.
Det är viktigt att uppskatta att LID/AIM:s poängsättningsdata, som skapats med hjälp av skattningsskalor för att tilldela värden till dyskinesiens allvarlighetsgrad och/eller varaktighet (tabellerna 1 och 2), är ordinära data. Således är de mest lämpliga statistiska testerna icke-parametriska. Även om det inte finns något direkt ekvivalent icke-parametriskt test för tvåvägsanalys av varians, kan LID-data analyseras med icke-parametriska alternativ till envägs ANOVA. Specifikt används Kruskal-Wallis-testet för jämförelser mellan ämnen av två eller flera oberoende grupper. Friedman-testet är ett icke-parametriskt alternativ till en enkelriktad ANOVA med upprepade mått som används för jämförelser inom ämnen. Båda används med post-hoc-tester (dvs Dunn eller Dunn-Bonferroni) efter ett signifikant Kruskal-Wallis- eller Friedmans test. För att undersöka om det finns meningsfulla skillnader mellan två oberoende grupper anses Mann-Whitney U-testet vara den icke-parametriska motsvarigheten till det oberoende t-testet 28,29.
Figur 3: Frysramsbilder som visar exempel på LID-intensitetspoäng hos parkinsoniska råttor. (A) Representativ bild av en icke-dyskinetisk parkinsonråtta som uppvisar den ofta typiska böjda parkinsoniska hållningen i frånvaro av dystoni eller hyperkinesi. B) Parkinsonråtta med övergripande mild LID-svårighetsgrad, vilket indikerar mild till måttlig dystoni i höger framben och brist på dystoni i nacke, bål eller bakben. i den medföljande videon (animerad video 1) kan små amplitud höger framtass dyskinesi (RFPD) och orolinguala rörelser ses. (C) Parkinsonisk råtta med måttlig hals- och stamdystoni (fet text motsvarar riktningspilar som indikerar stammen vriden i 90 ° vinkel). D) Dyskinetisk parkinsonråtta med mild nacke och måttlig stamdystoni, måttlig till svår dystoni i höger framben. i den medföljande videon (animerad video 3) kan blandad amplitud RFPD observeras. (E) Parkinsonisk råtta med måttlig till svår nacke och svår stamdystoni, svår höger bakben och måttlig höger frambensdystoni (fet text motsvarar riktningspilar som indikerar att stammen är vriden ~ 180 °; detta är särskilt anmärkningsvärt i exempel # 2). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Exempel på LID-data uppfyllde under 8 veckors LID-klassificeringar med eskalerande L-DOPA-dosering. (A) Toppdos LID-svårighetsgrad (80 min efter L-DOPA) över tid och doser. (B) Daglig tidskurs (20–170 min efter L-DOPA). För varje dos och dag återspeglar de översta diagrammen medelvärdet ± SEM; de nedre diagrammen visar enskilda ämnessvar över tid. Statistiken beräknades med Kruskal-Wallis med Dunns flera jämförelsetester (för tester mellan ämnen) och Friedman-tester med Dunns flera jämförelsetester (för tester inom ämnen). Förkortningar: Kontroll (Ctr) (n = 7); Behandling (Tx) (n = 10). Denna siffra är omtryckt och anpassad med tillstånd från referens19. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Tjog | Beskrivning | |
| Nacke Dystoni | 0 | ingen |
| 1 | mild förskjutning av huvudet, hålls under märkbar tid (>10-20 s); kan vara extremt normalt | |
| 1.5 | blandning av mild och måttlig dystoni | |
| 2 | huvud med mer anmärkningsvärd förskjutning (ca 90 ° vinkel mot kroppen); huvudet förblir draget i riktning mot den dystoniska rörelsen | |
| 2.5 | blandning av måttlig och svår dystoni | |
| 3 | konstant svår vridning av nackmuskulaturen (>100 ° vinkel mellan huvud och axlar) | |
| Trunk Dystoni | 0 | ingen |
| 1 | mild dystoni / vridning av stammen; 45 ° skillnad mellan övre och nedre torso; hålls under märkbar tid (≥10-20 s) och inte förutsäger rotationer | |
| 1.5 | blandning av mild och måttlig dystoni | |
| 2 | måttlig dystoni / vridning av stammen; 90° skillnad mellan över- och underkropp | |
| 2.5 | blandning av måttlig och svår dystoni | |
| 3 | konstant svår dystoni/vridning, "korkskruv"-liknande hållning (närmar sig 180°; huvud och fötter i motsatta riktningar), oförmögen att ambulera och kan gå in i tunnvalsrotation | |
| Förbensdystoni | 0 | ingen |
| 1 | mild; onormal sättning av handleden eller siffrorna; antingen knuten näve eller styv underarm men vanligtvis inte båda samtidigt | |
| 1.5 | blandning av mild och måttlig dystoni | |
| 2 | Måttlig; knuten näve och styv framben utan nedåtgående hållning i hyperförtöjt läge | |
| 2.5 | blandning av måttlig och svår dystoni | |
| 3 | Svår; knuten näve och styv underarm med nedåtgående hyperextension | |
| Hindlimb dystoni | 0 | ingen |
| 1 | bakbenet hålls milt i onormal hållning; flexion eller förlängning. | |
| 1.5 | blandning av mild och måttlig dystoni | |
| 2 | måttlig styv förlängning eller flexion av bakbenet; utan uppspelning av siffrorna | |
| 2.5 | blandning av måttlig och svår dystoni | |
| 3 | svår styv böjning av lemmen med onormal hyperextension +/- uppspelning av siffror | |
| Höger framtass dyskinesi (RFPD) | 0 | frånvarande |
| 1 | små amplitudrörelser, enkla repetitiva sida vid sida eller upp och ner torka i ansiktet eller munnen; eller knacka på burväggen eller kullen | |
| 1.5 | blandning av små och stora amplitudrörelser; Vanligaste | |
| 2 | stor amplitud repetitiva upp och ner rörelser som involverar allvarlig förlängning av höger framben, drar nedåt och motsatt nacke | |
| Orolingual | 0 | ingen |
| 1 | huvudsakligen stängd mun tom (meningslös) tuggning, tandgnissling | |
| 1.5 | tom tuggning, det kan finnas något tungutsprång, upprepad bitning på kullen | |
| 2 | framträdande upprepat tungutsprång med framträdande tuggning med öppen mun | |
| Huvud guppande / darrande | 0 | ingen |
| 1 | närvarande (repetitiv och rytmisk guppning av huvudet (ca 4hz)) | |
| Konstant tuggning av kull (CCL) | 0 | ingen |
| 1 | närvarande (konstant tuggning av kull; mål riktad obsessiv bitning eller tuggning av kull, upprepade gånger plocka upp, tugga, släppa, plocka upp, tugga, släppa kull) |
Tabell 1: LID-klassificeringskriterier för Intensitet av dystoniska eller hyperkinetiska beteenden hos parkinsoniska råttor. Dessa klassificeringskriterier ger en rad intensitetsmått relaterade till kvaliteten / svårighetsgraden av råttans onormala ofrivilliga ställningar och / eller rörelser. Specifika attribut som beskrivs för ställningar och beteenden klassificeras i allmänhet som milda, måttliga eller svåra, med specifika beskrivningar som anges här. En slutlig allvarlighetsgrad bestäms som produkten av intensitet x frekvens (tabell 2).
| Tjog | Beskrivning |
| 0 | Frånvarande |
| 1 | Intermittent, < 50% av observationsperioden |
| 2 | Intermittent, ≥ 50% av observationsperioden |
| 3 | Ihållande under hela observationsperioden och inte avbruten genom att knacka på bur |
Tabell 2: LID-klassificeringskriterier för Frekvens av dystoniska eller hyperkinetiska beteenden. Dessa kriterier ger ett kvantifieringsmått för den hastighet med vilken ett visst beteende inträffar eller upprepas under observationsperioden. Detta är viktigt för att bedöma den totala svårighetsgraden, med tanke på att sällsynt beteende motiverar en mindre allvarlig poäng än en ihållande. En slutlig allvarlighetsgrad bestäms som produkten av intensitet (tabell 1) x frekvens.
Animerad video 1: Mild LID med liten amplitud RFPD och tuggning av vänster framtass. Dyskinetisk parkinsonisk råtta utan märkbar nacke eller stamdystoni, men måttlig höger framtassdystoni, liten amplitud RFPD noterad som snabb upprepad flimrande rörelse av höger framtass. Denna råtta visar också orolingualt beteende som involverar tom tuggning riktad mot vänster framtass. L-DOPA dos: 12 mg/kg; video inspelad ~ 70 min efter injektion. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Animerad video 2: Måttlig stam- och nackdystoni. Dyskinetisk parkinsonråtta med måttlig bål- och nackdystoni exemplifieras av 90° skillnaden i frambenens och bakbenens position (se diagram i figur 2C). Denna råtta visar också framträdande stereotyp sniffning och enstaka tomma bitande på kullen. L-DOPA dos: 12 mg/kg; video inspelad ~ 70 min efter injektion. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Animerad video 3: Måttlig till svår höger framtassdystoni med blandad amplitud RFPD. Dyskinetisk parkinsonråtta med mild nacke och måttlig stamdystoni, måttlig till svår höger framtassdystoni, blandad amplitud RFPD ses som mindre torkningsrörelser nära munnen blandat med större amplitud nedåtdragning av höger framtass. Denna råtta har också frekvent rotationsbeteende som kan kvantifieras utöver LID-profiler. L-DOPA dos: 12 mg/kg; video inspelad ~ 70 min efter injektion. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Animerad video 4: Huvudbob och orolinguala rörelser med tungutsprång. Dyskinetisk parkinsonisk råtta med svår stam- och framtassdystoni (bakbensdystoni inte synlig), måttlig till svår nackdystoni och en konstant huvudbob med pågående tungutsprång. Huvudbobben liknar 4 Hz-tremor som ses i PD; Hos råttor noteras det dock endast hos dyskinetiska parkinsonråttor efter administrering av L-DOPA. Denna råtta har också blandad amplitud RFPD, sett som mer signifikanta amplitudrörelser tidigt i videon och små torkningsliknande rörelser nära ansiktet, karakteristiska för liten amplitud RFPD sett senare. Liten rörelse observerades på den allvarligt dystoniska / förlängda frambenet tidigt i videon; Detta är dock relaterat till huvud- och nackskakningsaktiviteten och skulle inte klassificeras som RFPD med liten amplitud. När observatören knackar starkt på buret är dessa LID-beteenden inte avbrytbara, vilket tyder på att detta är en allvarlig LID som inte kan övervinnas med en skrämseln. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil 1: Exempel för beräkning av mängden L-DOPA. Exempel på beräkningar för att bestämma mängden L-DOPA och saltlösning som behövs för varje veckodag med användning av 12 mg L-DOPA/kg kroppsvikt vid en injektionsvolym på 1 cc/kg råttvikt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Exempel på LID-klassificeringsloggblad. Detta ark kan användas eller anpassas för att logga LID-intensitet och frekvenspoäng under betygssessioner. Den slutliga allvarlighetsgraden bestäms som produkten av intensitet (tabell 1) x frekvens (tabell 2). Dessa skattningsskalor kan också användas för att kvantifiera LID hos möss30. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras detaljer för reproducerbar induktion och klassificering av LIP i en parkinsonisk råttmodell efter ensidig 6-OHDA-lesion av det nigrostriatala DA-systemet. Medan man en gång trodde att gnagare inte utvecklade LID och att rotationsasymmetri kan vara analogen till LID hos råttor31, har rått- och musmodeller karakteriserats under de senaste två decennierna och är ett väl accepterat verktyg för LID-forskning 15,32,33,34. Protokollet som presenteras här är särskilt användbart för storskaliga experimentella mönster18,19. Det ger detaljer för att betygsätta intensiteten och frekvensen av en rad dyskinetiska beteenden, både dystoniska och hyperkinetiska. I synnerhet kommer bilder och videor med motsvarande detaljerade anteckningar och poängsättning av dystoniska och hyperkinetiska LID-beteenden att hjälpa experimenterarens bedömning efter L-DOPA-administrering. Även om ett exempel på alla möjliga AIM inte tillhandahålls, erbjuds en rad beteenden som varierar från mild till måttlig till svår som en ram för LID-bedömning. Detta protokoll har dokumenterats för att hjälpa till att utvärdera olika terapier hos parkinsoniska råttor 19,35,36,37. Det förstärker andra publicerade gnagare betygsskalor som främst fokuserar på varaktigheten av föreskrivna LID-beteenden 33,38,39. Vidare syftar det skisserade förfarandet till att anpassa poängsättningsmetoder i en rått-PD-modell med nuvarande praxis som bedömer ED hos icke-mänskliga primater (NHP), riktmärket PD-modell40,41.
Vanligt förekommande i den parkinsoniska gnagarelitteraturen är LID- eller AIM-skattningsskalor som uteslutande innebär att man undersöker förekomsten eller frekvensen av (1) lemdyskisser (t.ex. rytmiska ryck i frambenet kontralateralt till lesionen33, eller snabb, meningslös rörelse av frambenet som styrs av den lesionerade halvklotet39); (2) axiella dyskinesier (t.ex. vridning av axiella muskler som påverkar nacke, bål och svans33, eller dystonisk vridning av nacke och torso kontralateral till den lesionerade halvklotet39); och (3) orolingual dyskinesier (t.ex. tuggrörelser i den tomma munnen med tungutsprång33, eller repetitiva mastications- eller tungutsprång när råttans mun var tom och inte i kontakt med något föremål39). Dessa tre beteendekategorier ges en allvarlighetsgrad baserat på deras frekvens under observationsperioden. Allvarlighetsgraden som representerar hur mycket tid ett djur spenderade på att uppvisa dessa beteenden, ofta utan karakterisering av beteendets kvalitet, kombineras sedan till den slutliga ALO-poängen (axiell, lem och orolingual).
Däremot ger det nuvarande protokollet en mer detaljerad skala som inte bara möjliggör utvärdering av globala AIM, utan också möjliggör undersökning av AIM i oberoende kroppsdelar (dvs. nacke, bål, framben, bakben och mun), intensiteten / kvaliteten på AIM som bedöms, differentiering av dystoni från hyperkinetiska beteenden och, som med andra skalor, införlivar frekvensen av en given AIM: s förekomst. Det övergripande målet är att möjliggöra en omfattande bedömning av LID-beteendet uttryckt i varje ämne. Till exempel, för den enda beteendeavläsningen av stamdystoni, är en råtta som uppvisar mild stamdystoni (dvs. 45 ° skillnad mellan övre och nedre torso, inte prediktiv för vändbeteende) under en hel observationsperiod mycket annorlunda än en råtta som uppvisar svår stamdystoni (dvs. konstant svår dystoni / vridning, korkskruvliknande hållning, närmar sig 180 °; huvud och fötter i motsatta riktningar, oförmögen att ambulera) för hela observationen. Vidare, med tanke på den topografiska representationen av råttans kropp i striatum, kan differentiering av individuella attribut hos LID vara informativ36.
En annan komponent i detta protokoll att noggrant överväga är den experimentella utformningen av eskalerande L-DOPA-dosering över en förlängd (t.ex. 8-veckors) behandlingstidskurs (Figur 1). En studie som endast använder låga doser av L-DOPA (t.ex. 3–6 mg/kg) och/eller administrerar den valda dosen under en kort period (t.ex. 2–4 veckor) kan visa tecken på LID-förbättring med terapeutisk intervention hos parkinsonråttor. Dessa studiers relevans för individer med PD, där kronisk administrering och dosupptrappning ofta är nödvändig, är dock tveksam. Sådana divergerande behandlingsprotokoll mellan prekliniska och kliniska prövningar kan föreslås ligga till grund för den brist på effekt som ses i kliniska prövningar som genomförts med läkemedel som visade sig lovande i prekliniska gnagarstudier.
Medan protokollet som presenteras här ger instruktioner om ett omfattande tillvägagångssätt för klassificering av LID hos parkinsoniska råttor och råttmodellen för LID har fastställts som en tillförlitlig modell av klinisk LID 3,15,38,42,43, finns det inneboende begränsningar för alla modeller. Djurmodeller är verktyg som är användbara för att efterlikna särskilda attribut hos mänsklig sjukdom och göra förutsägelser om till exempel den inverkan som terapeutisk intervention kan ha på en uppsättning sjukdomsegenskaper. En egenskap hos prekliniska LID-modeller som ofta diskuteras som en potentiell begränsning är att råttor kräver betydande DA-utarmning för att uttrycka LID. Dessutom citeras det ofta att LID utvecklas snabbare i gnagare och NHP-modeller än hos patienter och därmed återspeglar dessa modellegenskaper inte klinisk LID. Det är emellertid ofta underskattat att oavsett art (dvs. mänsklig, icke-mänsklig primat eller gnagare) krävs i allmänhet nästan fullständig förlust av striatal DA-innervation för att LID ska manifesteras. När L-DOPA administreras till patienter med svår striatal DA-utarmning induceras LID 1,19,38,44,45,46. En andra egenskap som har främjat skepsis mot gnagaremodeller av LID kommer från förväntan att de neurologiska tecknen på LID ska likna de fysiska manifestationerna av LID som ses hos primater (dvs. mänskliga och icke-mänskliga). Faktum är att utseendet på de onormala rörelserna som klassificeras som LY hos råttor varierar i egenskaper från det som ses hos primater (t.ex. koreoathetos hos primater kontra stereotypi / hyperkinesi hos gnagare). Även om det är bortom denna artikel att omfattande ta itu med detta ämne, kortfattat, är sådana skillnader i tecken mellan arter baserade på det faktum att människor är vanliga bipedala, icke-primater ofta bipedala och gnagare fyrfota43,46. Således har olika arter specifika repertoarer av beteenden som manifesteras av specifika osteoartikulära och muskulära strukturer och moduleras av artspecifika neurala system43. Följaktligen bör djurmodellering av människoliknande symtom i första hand baseras på en förväntan om funktionell likhet snarare än på fysisk identitet43. Tolkning av fynd från djurmodeller med vederbörlig försiktighet har och kommer att fortsätta att ge värdefulla förutsägelser för sjukdomsbehandling.
Även om det för närvarande finns ett FDA-godkänt läkemedel för behandling av LID i PD, amantadin och det kirurgiska ingreppet av DBS kan förbättra LID, är effekten och tolerabiliteten inte optimal, och inte alla patienter kommer att kvalificera sig för DBS-kirurgi. Som vältaligt granskats av Cenci och kollegor47 finns det en uppfattning som uttrycks av vissa att individer som drabbats av PD hellre skulle vara PÅ (dvs uppleva den motoriska fördelen med L-DOPA) med dyskinesier än OFF. Som dessa författare gripande säger: "Den djupare sanningen är att patienter mycket hellre skulle föredra att vara PÅ utan dyskinesi. Som forskare och kliniker bör vi sträva efter att göra det målet till verklighet. För detta ändamål ska translationell forskning om LID uppmuntras och ihärdigt bedrivas. För att uppnå detta mål presenterar vi vår metod för induktion och klassificering av LID. Vår betygsskala är utformad för att kombinera en rad intensitetsmått relaterade till AIM: s kvalitet / svårighetsgrad och anger hur lång tid en mängd olika attribut för dyskinesi visas. Avsikten med denna modell är att möjliggöra bestämning av ett numeriskt värde som exakt återspeglar LID-svårighetsgrad samtidigt som man redovisar både intensitet och frekvens. Dessutom indikerar detta värde LID-svårighetsgrad inte bara systemiskt utan med hänvisning till specifika kroppsdelar. Med denna modell strävar vi efter att säkerställa att experimentella terapier kan testas noggrant för deras förmåga att modifiera levodopa-inducerade dyskinesier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarades.
Acknowledgments
Vi vill erkänna kampen för alla med Parkinsons sjukdom och den styrka och motståndskraft de visar varje dag, särskilt den älskade fadern till KSC, Mark Steece. Arbetet som representeras här stöddes av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS090107, NS110398) och Parkinson Disease Foundation International Research Grant Program, nu Parkinson Foundation. Vi vill också tacka Molly VanderWerp för hennes utmärkta redaktionella hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Minutes Digital Timer | Staples | 1111764 | |
| Compass CX Compact Scale | Ohaus | 30428202 | |
| 5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide | Cayman Chemicals | 25330 | 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents. |
| Allentown cages | Allentown, LLC | Rat900 | Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides. |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | BD | BD 305540 | For subcutaneous L-DOPA injections |
| Benserazide hydrochloride | Sigma-Aldrich | B7283 | Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD. |
| Glass amber scintillation vials | Thermo Scientific | B7921 | Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline. |
| L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1507 | L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents. |
| Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils | Staples | 107250 | |
| Rodent nutritionally complete enrichment treats | Bio-Serv | F05478 | |
| Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L | Corning | 432129 | |
| Standard Plastic Clipboard | Staples | 1227770 | |
| Steel wired 6' long movable shelving units | Uline | H9488 | Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment |
| Sterile Saline 0.9% | Covidien/Argyle | 1020 | For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections. |
References
- Cotzias, G. C., Papavasiliou, P. S., Gellene, R.
- Yahr, M. D., Duvoisin, R. C., Schear, M. J., Barrett, R. E., Hoehn, M. M.
- Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
- Sellnow, R. C., et al. Regulation of dopamine neurotransmission from serotonergic neurons by ectopic expression of the dopamine D2 autoreceptor blocks levodopa-induced dyskinesia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 8 (2019).
- Bastide, M. F., Bezard, E. L-dopa induced dyskinesia in Parkinson's disease]. Bulletin de l'Académie Nationale de Médecine. 199 (2-3), 201-212 (2015).
- Hauser, R. A., et al. ADS-5102 (Amantadine) extended-release capsules for levodopa-induced dyskinesia in Parkinson's Disease (EASE LID 2 study): Interim results of an open-label safety study. Journal of Parkinson's Disease. 7 (3), 511-522 (2017).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. The pharmacology of L-DOPA-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Pharmacological Reviews. 65 (1), 171-222 (2013).
- Steece-Collier, K., et al. Embryonic mesencephalic grafts increase levodopa-induced forelimb hyperkinesia in parkinsonian rats. Movement Disorders. 18 (12), 1442-1454 (2003).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (60), e3234 (2012).
- Simola, N., Morelli, M., Carta, A. R. The 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 11 (3-4), 151-167 (2007).
- Borlongan, C. V., Hida, H., Nishino, H. Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport. 9 (16), 3615-3621 (1998).
- Fleming, S. M. Behavioral outcome measures for the assessment of sensorimotor function in animal models of movement disorders. International Review of Neurobiology. 89, 57-65 (2009).
- Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Elevated body swing test: a new behavioral parameter for rats with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism. Journal of Neuroscience. 15 (7), Pt 2 5372-5378 (1995).
- Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neuroscience. 88 (2), 617-628 (1999).
- Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
- Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15 (5), Pt 2 3863-3875 (1995).
- Monville, C., Torres, E. M., Dunnett, S. B. Comparison of incremental and accelerating protocols of the rotarod test for the assessment of motor deficits in the 6-OHDA model. Journal of Neuroscience Methods. 158 (2), 219-223 (2006).
- Steece-Collier, K., et al. Striatal Nurr1, but not FosB expression links a levodopa-induced dyskinesia phenotype to genotype in Fisher 344 vs. Lewis hemiparkinsonian rats. Experimental Neurology. 330, 113327 (2020).
- Steece-Collier, K., et al. Genetic silencing of striatal CaV1.3 prevents and ameliorates levodopa dyskinesia. Movement Disorders. 34 (5), 697-707 (2019).
- Tayarani-Binazir, K. A., Jackson, M. J., Strang, I., Jairaj, M., Rose, S., Jenner, P. Benserazide dosing regimen affects the response to L-3,4-dihydroxyphenylalanine in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat. Behavioral Pharmacology. 23 (2), 126-133 (2012).
- Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
- Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. American College of Laboratory Animal Medicine series xvii. , Academic Press/Elsevier. London; Waltham, MA. 1268 (2012).
- Zhou, Y. Z., Alany, R. G., Chuang, V., Wen, J. Studies of the Rate Constant of l-DOPA Oxidation and Decarboxylation by HPLC. Chromatographia. 75, 597-606 (2012).
- Stroomer, A. E., Overmars, H., Abeling, N. G., van Gennip, A. H. Simultaneous determination of acidic 3,4-dihydroxyphenylalanine metabolites and 5-hydroxyindole-3-acetic acid in urine by high-performance liquid chromatography. Clinical Chemistry. 36 (10), 1834-1837 (1990).
- PubChem Compound Summary for CID 6047, Levodopa. , Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Levodopa (2021).
- Merck. The Merck Index 13th edn. , Entry# 5485 (2021).
- Ortner, N. J., et al. Lower affinity of isradipine for L-Type Ca(2+) channels during substantia nigra dopamine neuron-like activity: Implications for neuroprotection in Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 37 (228), 6761-6777 (2017).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 3: Comparing groups: Numerical variables. Indian Journal of Dermatology. 61 (3), 251-260 (2016).
- Mishra, P., Pandey, C. M., Singh, U., Keshri, A., Sabaretnam, M. Selection of appropriate statistical methods for data analysis. Annals of Cardiac Anaesthesia. 22 (3), 297-301 (2019).
- Divito, C. B., et al. Loss of VGLUT3 produces circadian-dependent hyperdopaminergia and ameliorates motor dysfunction and l-Dopa-Mediated dyskinesias in a model of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 35 (45), 14983-14999 (2015).
- Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
- Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
- Collier, T. J., et al. Interrogating the aged striatum: robust survival of grafted dopamine neurons in aging rats produces inferior behavioral recovery and evidence of impaired integration. Neurobiology of Disease. 77, 191-203 (2015).
- Maries, E., et al. Focal not widespread grafts induce novel dyskinetic behavior in parkinsonian rats. Neurobiology of Disease. 21 (1), 165-180 (2006).
- Mercado, N. M., et al. The BDNF Val66Met polymorphism (rs6265) enhances dopamine neuron graft efficacy and side-effect liability in rs6265 knock-in rats. Neurobiology of Disease. 148, 105175 (2021).
- Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders. 33 (6), 889-899 (2018).
- Lindenbach, D. Behavioral and cellular modulation of L-DOPA-induced dyskinesia by beta-adrenoceptor blockade in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 337 (3), 755-765 (2011).
- Petzinger, G. M. Reliability and validity of a new global dyskinesia rating scale in the MPTP-lesioned non-human primate. Movement Disorders. 16 (2), 202-207 (2001).
- Fox, S. H., Johnston, T. H., Li, Q., Brotchie, J., Bezard, E. A critique of available scales and presentation of the Non-Human Primate Dyskinesia Rating Scale. Movement Disorders. 27 (11), 1373-1378 (2012).
- Cenci, M. A., Ohlin, K. E. Rodent models of treatment-induced motor complications in Parkinson's disease. Parkinsonism & Related Disorders. 15, Suppl 4 13-17 (2009).
- Cenci, M. A., Whishaw, I. Q., Schallert, T. Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat. Nature Reviews: Neuroscience. 3 (7), 574-579 (2002).
- Zhang, Y., et al. Aberrant restoration of spines and their synapses in L-DOPA-induced dyskinesia: involvement of corticostriatal but not thalamostriatal synapses. Journal of Neuroscience. 33 (28), 11655-11667 (2013).
- Konradi, C., et al. Transcriptome analysis in a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia. Neurobiology of Disease. 17 (2), 219-236 (2004).
- Morin, N., Jourdain, V. A., Di Paolo, T. Modeling dyskinesia in animal models of Parkinson disease. Experimental Neurology. 256, 105-116 (2014).
- Cenci, M. A., Riggare, S., Pahwa, R., Eidelberg, D., Hauser, R. A.
