Summary
Este artículo describe métodos para inducir y evaluar discinesias inducidas por levodopa en un modelo de rata de la enfermedad de Parkinson. El protocolo ofrece información detallada sobre la intensidad y la frecuencia de una variedad de comportamientos discinéticos, tanto distónicos como hipercinéticos, proporcionando una herramienta confiable para probar tratamientos dirigidos a esta necesidad médica no satisfecha.
Abstract
La levodopa (L-DOPA) sigue siendo la terapia estándar de oro utilizada para tratar los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, los movimientos involuntarios no deseados conocidos como discinesias inducidas por L-DOPA (LID) se desarrollan con el uso prolongado de este precursor de dopamina. Se estima que la incidencia de LID aumenta a aproximadamente el 90% de los individuos con EP dentro de los 10-15 años posteriores al tratamiento. Comprender los mecanismos de esta enfermedad y desarrollar tratamientos antidiscinesia novedosos y efectivos requiere un modelado consistente y preciso para las pruebas preclínicas de intervenciones terapéuticas. Aquí se presenta un método detallado para la inducción confiable y la calificación integral de los LID después de la lesión nigral inducida por 6-OHDA en un modelo de rata de EP. La evaluación confiable de LID en ratas proporciona una herramienta poderosa que se puede utilizar fácilmente en todos los laboratorios para probar terapias emergentes centradas en reducir o eliminar esta carga común inducida por el tratamiento para las personas con EP.
Introduction
Aunque han pasado más de 50 años desde que la levodopa (L-DOPA) se introdujo por primera vez como tratamiento para individuos con EP 1,2, sigue siendo la terapia más efectiva para los síntomas motores parkinsonianos. Los síntomas motores clínicos asociados con la EP provienen de la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en la sustancia negra (SN) pars compacta, lo que resulta en la disminución dramática de la dopamina disponible en el cuerpo estriado. L-DOPA restaura eficazmente los niveles de DA estriatal, lo que resulta en un beneficio motor temprano en la enfermedad 3,4. Inoportunamente, con el tratamiento a largo plazo, la mayoría de las personas con EP desarrollarán discinesias inducidas por L-DOPA (LID), incluyendo corea, distonía y atetosis, que a menudo afectan significativamente las actividades de la vida diaria 5,6,7.
Si bien existen varios modelos conductuales de LID en roedores, las diferencias en el modelado y la evaluación del comportamiento de los LID han puesto en duda la reproducibilidad de los resultados entre laboratorios, así como la confiabilidad de estas herramientas experimentales para la investigación preclínica de la EP. Desarrollado en asociación con un especialista en trastornos clínicos del movimiento8, el protocolo actual es un método sencillo para la inducción y calificación de LID y es apropiado para su uso en un modelo de rata de EP que utiliza lesiones nigrales unilaterales inducidas por 6-hidroxidopamina (6-OHDA) 9,10. La escala de calificación LID proporcionada aquí incluye la puntuación tanto para la intensidad como para la frecuencia del comportamiento discinético en varias partes individuales del cuerpo. También se proporciona información pertinente sobre la optimización del flujo de trabajo de los experimentos y el cuidado y manejo adecuados de los animales parkinsonianos y discinéticos.
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Protocol
Los animales aquí presentados fueron mantenidos y manipulados de acuerdo con los lineamientos institucionales. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan (IACUC) en cumplimiento con las regulaciones federales y estatales.
1. Confirmación sin fármacos del estado de la lesión 6-OHDA
- Prueba de colgado de la cola postural 11,12,13
NOTA: Evalúe el estado de la lesión al menos 1 semana después de la inducción de la lesión 6-OHDA (ver 9,10,35 para obtener detalles sobre la lesión) en sujetos experimentales (por ejemplo, macho o hembra, ratas adultas Sprague Dawley o Fisher 344).- Suspenda a la rata aproximadamente 6 cm por encima de su jaula, sosteniéndose firmemente en la base de la cola, durante ~ 5 s.
- Registre la dirección de la contorsión del cuerpo como + para un animal lesionado con éxito que gira contralateral al lado lesionado y - por falta de torsión o torsión en ambas direcciones.
- NOTA: Estas pruebas son opcionales pero recomendadas. Consulte 14,15,16,17 para obtener opciones/variaciones adicionales de pruebas sin drogas.
- Prueba de arrastre de ajuste de pasos (adaptada de16)
NOTA: Evalúe el estado de la lesión al menos 1 semana después de la inducción unilateral de la lesión 6-OHDA en sujetos experimentales (por ejemplo, macho o hembra, adulto Sprague Dawley o Fisher 344 ratas).- Sostenga a la rata por la base de su cola, elevando los pies traseros de la superficie en ~ 6 cm; arrastre hacia atrás a través de una superficie plana, lisa pero no resbaladiza, ~ 75 cm, más de 5 a 10 s.
- Observe y registre el número de movimientos de ajuste de golpeteo / paso de cada anteojo durante tres pruebas repetidas.
- Puntúe al sujeto como + para una lesión unilateral exitosa cuando se observan 0-2 golpes de anteojo contralateral al lado lesionado, junto con un golpeteo rápido (~ 10 golpecitos) desde el prepeso ipsilateral hasta el lado lesionado (por ejemplo, los animales lesionados unilateralmente en el lado izquierdo muestran déficit de golpeteo (0-2 golpecitos) con el antebrazo derecho contralateral).
- Por el contrario, puntúe de moderado a rápido (5-10 golpecitos) de ambas patas delanteras como - para indicar el estado de la lesión incompleta o desconocida.
NOTA: Un animal ansioso puede mostrar golpeteo rápido / ajuste de pasos incluso si se lesiona con éxito. Si se sospecha esto, coloque a la rata de nuevo en la jaula de su casa y vuelva a probar ≥30 minutos más tarde.
2. Preparación de reactivos y suministros
- Determinar el clorhidrato de éster metílico de L-3,4-dihidroxifenilalanina (levodopa o L-DOPA) y el clorhidrato de benserazida, una dosis periférica de la descarboxilasa (ver Tabla de Materiales), la frecuencia de clasificación y el cronograma experimental que sea apropiado para la pregunta de investigación 12,18,19,20 (Figura 1).
NOTA: Se pueden plantear preguntas de investigación para buscar cualquier cantidad de preguntas que van desde preguntar si una terapia específica podría reducir el LID existente o prevenir la inducción del LID. También pueden explorar si la eficacia terapéutica depende de la dosis de levodopa o si la expresión de LID y / o la eficacia terapéutica varían según el sexo, la especie y la edad del sujeto.
Figura 1: Ejemplo de línea de tiempo de tratamiento. Ejemplo de línea de tiempo de escalada de dosis de L-DOPA de 12 semanas en la duración total, con 8 semanas de inyecciones de L-DOPA que comienzan 3 semanas después de la lesión de 6-OHDA y 4 semanas después del tratamiento experimental. En este ejemplo, la L-DOPA se inyecta por vía subcutánea 5 veces por semana (de lunes a viernes) aproximadamente a la misma hora cada día, durante 2 semanas con cada dosis prescrita de L-DOPA (3, 6, 9 y 12 mg / kg). Las clasificaciones de LID conductuales se llevan a cabo en los días 1, 6 y 10 de cada nivel de dosis de L-DOPA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Pesar a las ratas semanalmente para calcular la cantidad apropiada de medicamentos en función de los cambios de peso en curso durante el estudio.
NOTA: Debido al aumento de la actividad en ratas LID +, existe la posibilidad de perder peso con tratamientos A largo plazo con L-DOPA. Si se produce una pérdida de peso, proporcione a las ratas golosinas nutricionalmente completas y altamente sabrosas (consulte la Tabla de materiales) después de las inyecciones de L-DOPA. - Calcule la cantidad de L-DOPA y benserazida requerida para cada concentración semanal, pesando alícuotas liofilizadas para cada día de inyección y almacenándolas en combinación durante 1-2 semanas a -20 °C en viales de vidrio ámbar hasta el día del tratamiento.
NOTA: La dosis objetivo es de 12 mg/kg o 12 mg de L-DOPA/1000 g de peso corporal. Ejemplo de cálculos para determinar la cantidad de L-DOPA y solución salina necesaria para cada día de una semana utilizando 12 mg de L-DOPA/kg de peso corporal a un volumen de inyección de 1 cc/kg de peso de rata se da en el Archivo Complementario 1.
3. Configuración de la habitación y la jaula
- En el primer día de tratamiento con L-DOPA 3-4 semanas después de la cirugía de lesión 6-OHDA, transfiera las ratas a una sola vivienda, incluido el enriquecimiento aprobado por IACUC.
- Mantener en una sola vivienda durante todo el estudio para evitar la interferencia de los compañeros con las evaluaciones de comportamiento.
- En los días de clasificación LID, coloque las jaulas domésticas en un estante de alambre de acero, giradas en un ángulo de aproximadamente 45 ° para una visualización óptima de la rata (Figura 2A). Voltee las etiquetas de identificación (Figura 2B) hacia arriba y retire las botellas de agua, los estantes de alimentos y todos los tipos de enriquecimiento en la jaula (Figura 2C) para evitar interferencias con las evaluaciones de comportamiento.
Figura 2: Ejemplo de la jaula configurada para las clasificaciones LID de experimentos con ratas a gran escala. (A) Se pueden configurar múltiples jaulas para la clasificación LID utilizando grandes bastidores de metal que permiten una visualización óptima de cada animal. Las jaulas deben separarse en un ángulo de 45 ° con tarjetas de identificación volteadas hacia arriba (B), alimentos, botellas de agua, materiales de anidación y otros enriquecimientos eliminados para limitar la oscuridad visual de la rata y las distracciones para la rata mientras se examinan los comportamientos discinéticos (C). Los bastidores de metal deben estar a unos pocos pies de distancia de cualquier pared para permitir que el evaluador examine a la rata en la parte delantera o trasera de la jaula según sea necesario. Es esencial etiquetar los aparatos de enriquecimiento (por ejemplo, casas de retiro de ratas rojas C) con identificaciones de animales individuales para reemplazarlos en la misma jaula de la que provienen. Esto es particularmente importante cuando se usan animales de diferentes sexos para no aumentar el estrés de los sujetos experimentales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Inyecciones de levodopa y clasificación de discinesia
- Inyecciones subcutáneas de L-DOPA21,22
- Inmediatamente antes de la inyección diaria de L-DOPA, agregue el volumen apropiado de solución salina estéril a la mezcla de L-DOPA y benserazida liofilizada prepesada en el vial de ámbar y agite bien durante 10 s (paso 2.3).
NOTA: El volumen de inyección objetivo es de 1 ml/1000 g de peso corporal (con 12 mg de L-DOPA por ml). El volumen de la solución salina estéril dependerá del número de animales por estudio. - Llene jeringas individuales (por ejemplo, 1.0 o 0.5 ml con aguja de 26 G) con el volumen requerido para cada animal (1 ml / kg de peso de rata) y etiquete cada jeringa con identificación individual del animal.
NOTA: Mantenga las jeringas llenas protegidas de la luz en bolsas estériles hasta el momento de la inyección. L-DOPA se oxida rápidamente en presencia de oxígeno y luz en un ambiente acuoso 23,24,25,26. - Lleve la primera jaula al banco de inyección.
- Retire la rata de su jaula y colóquela en la superficie de inyección.
- Sujete suavemente la cabeza y los hombros contra la superficie sobre la que descansa la rata con la palma de la mano no dominante.
- Suavemente, desalivie la piel de la espalda que recubre las escápulas con el pulgar y el índice de la mano no dominante, inyecte volumen de L-DOPA con la mano dominante en el espacio subcutáneo entre / debajo de los dedos, manteniendo la aguja lo más paralela posible al cuerpo para evitar la inyección intramuscular.
NOTA: Las ratas no son anestesiadas antes de la inyección. - Deseche cada jeringa individual usada en un recipiente afilado.
- Reemplace a la rata en su jaula individual y agregue golosinas nutricionalmente completas, excepto en los días de calificación LID para evitar interferencias con las evaluaciones de comportamiento hasta después de que se completen las calificaciones.
- Establezca el temporizador durante 1-2 minutos dependiendo del tiempo de calificación deseado y el número de ratas en el estudio en los días de calificación. Recupere la siguiente jaula e inyecte a la siguiente rata cuando el temporizador lo indique.
- Repita esto, inyectando una rata cada 1-2 minutos, hasta que se inyecten todas las ratas.
- Inmediatamente antes de la inyección diaria de L-DOPA, agregue el volumen apropiado de solución salina estéril a la mezcla de L-DOPA y benserazida liofilizada prepesada en el vial de ámbar y agite bien durante 10 s (paso 2.3).
- Clasificación de discinesia inducida por levodopa después de la inyección
- Califique la intensidad (Tabla 1) y la frecuencia (Tabla 2) de los movimientos de discinesia distónica e hipercinética en el número deseado de puntos de tiempo, que deben incluir el inicio inicial del comportamiento LID, el comportamiento máximo y la fase de disminución (consulte el Archivo Complementario 2 para un ejemplo de hoja de registro de calificación LID).
- Para ratas Sprague Dawley o Fisher 344 adultas macho y hembra, y un tamaño de muestra de N = 40 ratas, comience las clasificaciones de discinesia 20 minutos después de la primera inyección de L-DOPA, y luego a intervalos de 50 minutos hasta 220 o 270 minutos después de la inyección, dependiendo de cuándo los comportamientos lid hayan disminuido en el 90% -100% de las ratas.
- Si utiliza intervalos de clasificación de 1 minuto, establezca un temporizador durante 1 minuto. Califica a la primera rata durante un minuto. Muévete a la siguiente rata y puntúala durante 1 minuto. Continúe a través de todas las ratas, clasificando durante intervalos de 1 minuto.
- Coloque un temporizador al lado de la jaula visiblemente para que se pueda observar la intensidad del comportamiento LID (Tabla 1) mientras estima la frecuencia de cualquier comportamiento dado (Tabla 2) durante el período de calificación.
- Después de que se completen las clasificaciones para el primer punto de tiempo, comience de nuevo con la primera rata en el siguiente punto de tiempo (por ejemplo, 70 minutos después de la inyección) y continúe en el intervalo deseado (por ejemplo, cada 50 minutos) hasta que se completen todos los puntos de tiempo.
NOTA: Debido a la superposición de las tareas de inyección de L-DOPA y clasificación LID, se necesitan dos personas en los días de calificación, una para inyectar y otra para calificaciones de comportamiento.
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Representative Results
Los LID en ratas parkinsonianas pueden manifestarse como una variedad de movimientos involuntarios anormales (AIM), incluidos comportamientos distónicos, hipercinéticos y estereotípicos. Los criterios de calificación LID para tales comportamientos se presentan aquí para incluir tanto la intensidad (Tabla 1) como la frecuencia (Tabla 2). Esto proporciona una puntuación general de gravedad lid para cada rata que refleja tanto la calidad (intensidad) como la cantidad de tiempo dedicado a participar (frecuencia) en estos comportamientos en cada punto de tiempo de calificación. La puntuación final de gravedad de LID se calcula multiplicando la puntuación de intensidad por la puntuación de frecuencia para cada componente de comportamiento. Los criterios de puntuación para los atributos individuales de los comportamientos LID se proporcionan aquí como descripciones escritas (Tabla 1-2), y los ejemplos se muestran como imágenes fijas con informes detallados (Figura 3) y como videos (Videos animados 1-4). Se proporciona información descriptiva adicional sobre los movimientos individuales y la puntuación en las leyendas de las figuras.
Se puede observar una evaluación exhaustiva del impacto de cualquier tratamiento en la mejora de los comportamientos de LID a lo largo del tiempo utilizando un enfoque de escalada de dosis de L-DOPA, 12 semanas de duración total, con 8 semanas de inyecciones de L-DOPA después de la lesión de 6-OHDA (Figura 1). En este escenario, L-DOPA se administra 5 veces por semana (de lunes a viernes) durante 2 semanas en cada dosis prescrita de L-DOPA. Las calificaciones conductuales que tienen lugar en los días 1, 6 y 10 de cada dosis de L-DOPA proporcionan un enfoque sólido para la evaluación de la eficacia del tratamiento (Figura 1). Sin embargo, los investigadores pueden encontrar que las líneas de tiempo alteradas y los esquemas de dosificación responden mejor a sus preguntas experimentales. De hecho, la dosis de L-DOPA y benserazida, el inhibidor periférico de la descarboxilasa, puede variar dependiendo de la experiencia del investigador con las dosis y / o las hipótesis a probar. Cabe destacar que las dosis más comunes de benserazida están entre 10-15 mg/kg, lo que es apoyado por el informe de Tayarani-Binazir et al. (2012)20 que muestra que los efectos conductuales óptimos de L-DOPA se encuentran con 10 mg/kg de benserazida, sin beneficio adicional a 15 mg/kg.
Existen múltiples formas de presentar y analizar los datos de LID al determinar si un tratamiento dado tiene un impacto significativo en la mejora de este comportamiento aberrante. La Figura 4A proporciona un ejemplo de datos presentados como dosis máxima lid en toda la línea de tiempo experimental. La dosis máxima de LID se puede definir como el punto de tiempo en el que el puntaje promedio de LID del grupo es el mayor. Alternativamente, se puede informar el "pico absoluto", que es el puntaje máximo máximo de LID para un animal, independientemente de cuándo ocurra durante un período de calificación. Además, los datos de calificación de LID se pueden examinar durante cada curso de tiempo de calificación diario y presentarse como datos de grupo experimentales y / o trazados para mostrar la gravedad de LID de cada sujeto individual en cada punto de tiempo (Figura 4B)19. Este último enfoque permite evaluar si algunos tratamientos pueden reducir, por ejemplo, la cantidad total de tiempo que un sujeto muestra LID, pero no necesariamente afectar la gravedad de la dosis máxima. Finalmente, se pueden cuantificar los puntajes totales de gravedad de LID durante toda la sesión de calificación. Para un sujeto determinado, la puntuación de gravedad LID para cada punto de tiempo se suma para producir una puntuación total para ese período de calificación. Este enfoque emula el área bajo las estimaciones de la curva, que también se pueden calcular.
Es esencial apreciar que los datos de puntuación de LID/AIMs, creados utilizando escalas de calificación para asignar valores a la gravedad y/o duración de la discinesia (Tablas 1 y 2), son datos ordinales. Por lo tanto, las pruebas estadísticas más apropiadas son no paramétricas. Si bien no existe una prueba no paramétrica equivalente directa para el análisis bidireccional de la varianza, los datos de LID se pueden analizar con alternativas no paramétricas al ANOVA unidireccional. Específicamente, la prueba de Kruskal-Wallis se utiliza para comparaciones entre sujetos de dos o más grupos independientes. La prueba de Friedman es una alternativa no paramétrica a un ANOVA unidireccional con medidas repetidas utilizadas para comparaciones dentro de los sujetos. Ambos se utilizan con pruebas post-hoc (es decir, Dunn o Dunn-Bonferroni) después de una prueba significativa de Kruskal-Wallis o Friedman. Para examinar si existen diferencias significativas entre dos grupos independientes, la prueba U de Mann-Whitney se considera el equivalente no paramétrico de la prueba t independiente28,29.
Figura 3: Imágenes de fotograma congelado que muestran ejemplos de puntuación de intensidad LID en ratas parkinsonianas. (A) Imagen representativa de una rata parkinsoniana no discinética que muestra la postura parkinsoniana encorvada a menudo típica en ausencia de distonía o hipercinesia. (B) Rata parkinsoniana con gravedad general leve de LID, lo que indica distonía leve a moderada de la extremidad anterior derecha y falta de distonía en el cuello, el tronco o las extremidades posteriores; en el video adjunto (Video Animado 1), se puede ver discinesia de la pitia anterior derecha de pequeña amplitud (RFPD) y movimientos orolingües. (C) Rata parkinsoniana con distonía moderada de cuello y tronco (el texto en negrita se corresponde con flechas direccionales que indican tronco torcido en ángulo de 90°). (D) Rata parkinsoniana discinética con cuello leve y distonía baúl moderada, distonía de extremidad anterior derecha de moderada a grave; en el video que lo acompaña (Video Animado 3), se puede observar RFPD de amplitud mixta. (E) Rata parkinsoniana con cuello moderado a severo y distonía severa del tronco, extremidad posterior derecha severa y distonía moderada de la extremidad anterior derecha (el texto en negrita se corresponde con flechas direccionales que indican que el tronco está torcido ~ 180 °; esto es especialmente notable en el ejemplo # 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ejemplo de datos de LID cumplidos durante 8 semanas de clasificaciones de LID con aumento de la dosis de L-DOPA. (A) Gravedad máxima de la dosis LID (80 min después de L-DOPA) a través del tiempo y las dosis. (B) Curso de tiempo diario (20-170 min post-L-DOPA). Para cada dosis y día, los gráficos superiores reflejan la media ± SEM; los gráficos inferiores muestran las respuestas individuales de los sujetos a lo largo del tiempo. Las estadísticas se calcularon utilizando Kruskal-Wallis con las pruebas de comparación múltiple de Dunn (para pruebas entre sujetos) y pruebas de Friedman con las pruebas de comparación múltiple de Dunn (para pruebas dentro de sujetos). Abreviaturas: Control (Ctr) (n = 7); Tratamiento (Tx) (n = 10). Esta figura se reimprime y adapta con permiso de la Referencia19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Puntuación | Descripción | |
| Distonía de cuello | 0 | ninguno |
| 1 | desplazamiento leve de la cabeza, mantenido durante un tiempo apreciable (>10-20 s); puede ser extremo de lo normal | |
| 1.5 | mezcla de distonía leve y moderada | |
| 2 | cabeza con desplazamiento más notable (ángulo aproximado de 90° con respecto al cuerpo); la cabeza permanece tirada en la dirección del movimiento distónico | |
| 2.5 | mezcla de distonía moderada y grave | |
| 3 | torsión severa constante de la musculatura del cuello (ángulo de >100 ° entre la cabeza y los hombros) | |
| Distonía del tronco | 0 | ninguno |
| 1 | distonía leve/torsión del tronco; 45° de diferencia entre la parte superior e inferior del torso; retenido durante un tiempo apreciable (≥10-20 s) y no predictivo de rotaciones | |
| 1.5 | mezcla de distonía leve y moderada | |
| 2 | distonía moderada/torsión del tronco; 90° de diferencia entre la parte superior e inferior del torso | |
| 2.5 | mezcla de distonía moderada y grave | |
| 3 | distonía/torsión severa constante, postura similar a la de un "sacacorchos" (que se acerca a 180 °; cabeza y pies en direcciones opuestas), incapaz de deambular y puede entrar en rotación de rollo de barril | |
| Distonía de extremidades anteriores | 0 | ninguno |
| 1 | leve; postura anormal de la muñeca o los dedos; ya sea el puño cerrado o el antebrazo rígido, pero generalmente ambos simultáneamente | |
| 1.5 | mezcla de distonía leve y moderada | |
| 2 | Moderado; puño cerrado y extremidad anterior rígida sin sujeción hacia abajo en posición hiperextendida | |
| 2.5 | mezcla de distonía moderada y grave | |
| 3 | Grave; puño cerrado y antebrazo rígido con hiperextensión hacia abajo | |
| Distonía de las extremidades posteriores | 0 | ninguno |
| 1 | extremidad posterior ligeramente sostenida en postura anormal; flexión o extensión. | |
| 1.5 | mezcla de distonía leve y moderada | |
| 2 | extensión rígida moderada o flexión de la extremidad posterior; sin reproducción de los dígitos | |
| 2.5 | mezcla de distonía moderada y grave | |
| 3 | postura rígida severa de la extremidad con hiperextensión anormal +/- reproducción de los dedos | |
| Discinesia del forepaw derecho (RFPD) | 0 | ausente |
| 1 | pequeños movimientos de amplitud, simples movimientos repetitivos de lado a lado, o limpieza hacia arriba y hacia abajo en la región de la cara o la boca; o golpear la pared de la jaula o la basura | |
| 1.5 | mezcla de pequeños y grandes movimientos de amplitud; más común | |
| 2 | movimientos repetitivos hacia arriba y hacia abajo de gran amplitud que implican una extensión severa de la extremidad anterior derecha, tira hacia abajo y hacia el lado opuesto del cuello | |
| Orolingual | 0 | ninguno |
| 1 | masticación vacua principalmente de boca cerrada (sin propósito), rechinar los dientes | |
| 1.5 | masticación vacua, puede haber algo de protuberancia de la lengua, mordeduras repetidas en la camada | |
| 2 | prominente protuberancia repetida de la lengua con prominente boca abierta masticando | |
| Balanceo/temblor de la cabeza | 0 | ninguno |
| 1 | presente (balanceo repetitivo y rítmico de la cabeza (aprox. 4hz)) | |
| Masticación constante de la basura (CCL) | 0 | ninguno |
| 1 | presente (masticación constante de la basura; mordedura obsesiva dirigida al objetivo o masticación de la basura, recogiendo repetidamente, masticando, dejando caer, recogiendo, masticando, dejando caer de la basura) |
Tabla 1: Criterios de calificación LID para la intensidad de comportamientos distónicos o hipercinéticos en ratas parkinsonianas. Estos criterios de calificación proporcionan una gama de medidas de intensidad relacionadas con la calidad / gravedad de las posturas y / o movimientos involuntarios anormales de la rata. Los atributos específicos descritos para posturas y comportamientos generalmente se clasifican como leves, moderados o severos, con descriptores específicos proporcionados aquí. Una puntuación de gravedad final se determina como el producto de Intensidad x Frecuencia (Tabla 2).
| Puntuación | Descripción |
| 0 | Ausente |
| 1 | Intermitente, < 50% del período de observación |
| 2 | Intermitente, ≥ 50% del período de observación |
| 3 | Persistente durante todo el período de observación y no interrumpido por golpes en la jaula |
Tabla 2: Criterios de clasificación LID para la frecuencia de comportamientos distónicos o hipercinéticos. Estos criterios proporcionan una medida de cuantificación para la velocidad a la que se produce o se repite cualquier comportamiento dado durante el período de observación. Esto es importante para evaluar la gravedad general, dado que el comportamiento poco frecuente justifica una puntuación menos grave que una persistente. Una puntuación de gravedad final se determina como el producto de Intensidad (Tabla 1) x Frecuencia.
Video Animado 1: LID Suave con RFPD de pequeña amplitud y masticación de la pata delantera izquierda. Rata parkinsoniana discinética sin distonía apreciable del cuello o del tronco, pero distonía moderada del anteguión derecho, RFPD de pequeña amplitud observada como movimiento de parpadeo rápido repetido de la pata anterior derecha. Esta rata también muestra un comportamiento orolingüe que implica masticación vacua dirigida a la pata delantera izquierda. Dosis de L-DOPA: 12 mg/kg; video grabado ~ 70 minutos después de la inyección. Haga clic aquí para descargar este video.
Video Animado 2: Distonía moderada de tronco y cuello. Rata parkinsoniana discinética con distonía moderada del tronco y el cuello ejemplificada por la diferencia de 90° en la posición de las extremidades anteriores y posteriores (ver diagrama en la Figura 2C). Esta rata también muestra un prominente olfato estereotipado y mordeduras vacías ocasionales en la camada. Dosis de L-DOPA: 12 mg/kg; video grabado ~ 70 minutos después de la inyección. Haga clic aquí para descargar este video.
Video animado 3: Distonía del anteguijón derecho de moderada a grave con RFPD de amplitud mixta. Rata parkinsoniana discinética con cuello leve y distonía baúl moderada, distonía del anteguión derecho de moderada a grave, RFPD de amplitud mixta vista como movimientos de limpieza más pequeños cerca de la boca mezclados con mayor amplitud hacia abajo tirando de la pata delantera derecha. Esta rata también tiene un comportamiento rotacional frecuente que se puede cuantificar además de los perfiles LID. Dosis de L-DOPA: 12 mg/kg; video grabado ~ 70 minutos después de la inyección. Haga clic aquí para descargar este video.
Video animado 4: Head bob y movimientos orolingües con protuberancias de lengua. Rata parkinsoniana discinética con distonía severa del tronco y la pata delantera (distonía de las extremidades posteriores no visible), distonía de cuello de moderada a severa y un balanceo constante de la cabeza con protuberancias de lengua en curso. El bob de la cabeza se asemeja al temblor de 4 Hz visto en PD; sin embargo, en ratas, solo se observa en ratas parkinsonianas discinéticas después de la administración de L-DOPA. Esta rata también tiene RFPD de amplitud mixta, vista como movimientos de amplitud más significativos al principio del video y pequeños movimientos similares a la limpieza cerca de la cara, característicos de rfPD de pequeña amplitud vistos más tarde. Se observó un ligero movimiento en la extremidad anterior severamente distónica / extendida al principio del video; sin embargo, esto está relacionado con la actividad del temblor de cabeza y cuello y no se clasificaría como RFPD de pequeña amplitud. Cuando el observador golpea fuertemente la jaula, estos comportamientos LID no son interrumpibles, lo que sugiere que este es un LID severo que no se puede superar con un sobresalto. Haga clic aquí para descargar este video.
Expediente complementario 1: Ejemplo para calcular la cantidad de L-DOPA. Ejemplo de cálculos para determinar la cantidad de L-DOPA y solución salina necesaria para cada día de una semana utilizando 12 mg de L-DOPA/kg de peso corporal a un volumen de inyección de 1 cc/kg de peso de rata. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: Ejemplo de hoja de registro de calificación LID. Esta hoja se puede utilizar o adaptar para registrar las puntuaciones de intensidad y frecuencia de LID durante las sesiones de calificación. La puntuación de gravedad final se determina como el producto de Intensidad (Tabla 1) x Frecuencia (Tabla 2). Estas escalas de calificación también se pueden utilizar para cuantificar LID en ratones30. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Aquí se presentan detalles para la inducción reproducible y la calificación de LID en un modelo de rata parkinsoniana después de la lesión unilateral de 6-OHDA del sistema DA nigrostriatal. Si bien una vez se pensó que los roedores no desarrollaron LID y que la asimetría rotacional puede ser el análogo de LID en ratas31, los modelos de ratas y ratones se han caracterizado en las últimas dos décadas y son una herramienta bien aceptada para la investigación de LID 15,32,33,34. El protocolo presentado aquí es específicamente útil para diseños experimentales a mayor escala18,19. Proporciona detalles para calificar la intensidad y la frecuencia de una variedad de comportamientos discinéticos, tanto distónicos como hipercinéticos. En particular, las imágenes y videos con las notas detalladas correspondientes y la puntuación de los comportamientos LID distónicos e hipercinéticos ayudarán a la evaluación del experimentador después de la administración de L-DOPA. Si bien no se proporciona un ejemplo de todos los AIM posibles, se ofrece una gama de comportamientos que varían de leves a moderados a graves como marco para la evaluación de LID. Este protocolo ha sido documentado para ayudar a evaluar diversas terapias en ratas parkinsonianas 19,35,36,37. Aumenta otras escalas de calificación de roedores publicadas que se centran principalmente en la duración de los comportamientos LID prescritos 33,38,39. Además, el procedimiento esbozado busca alinear los métodos de puntuación en un modelo de DP de rata con las prácticas actuales que evalúan los LID en primates no humanos (NHP), el modelo de REFERENCIA de PD40,41.
Comúnmente encontrados en la literatura de roedores parkinsonianos son LID, o escalas de calificación AIM que implican examinar exclusivamente la aparición o frecuencia de (1) discinesias de las extremidades (por ejemplo, sacudidas rítmicas de la extremidad anterior contralateral a la lesión33, o movimiento rápido y sin propósito de la extremidad anterior controlado por el hemisferio lesionado39); (2) discinesias axiales (por ejemplo, torsión de los músculos axiales que afectan el cuello, el tronco y la cola33, o torsión distónica del cuello y el torso contralateral al hemisferio lesionado39); y (3) discinesias orolingües (por ejemplo, movimientos masticatorios de la boca vacía con protuberancias de la lengua33, o masticación repetitiva o protuberancias de la lengua cuando la boca de la rata estaba vacía y no estaba en contacto con ningún objeto39). Estas tres categorías de comportamiento reciben una puntuación de gravedad basada en su frecuencia durante el período de observación. La puntuación de gravedad que representa la cantidad de tiempo que un animal pasó exhibiendo estos comportamientos, a menudo sin caracterización de la calidad del comportamiento, se combina en la puntuación final ALO (axial, de extremidades y oringüe).
Por el contrario, el protocolo actual proporciona una escala más detallada que permite no solo la evaluación de los AIM globales, sino que también permite el examen de los AIM en partes independientes del cuerpo (es decir, cuello, tronco, extremidad anterior, extremidad posterior y boca), la intensidad / calidad del AIM que se evalúa, la diferenciación de la distonía de los comportamientos hipercinéticos y, al igual que con otras escalas, incorpora la frecuencia de la aparición de cualquier AIM dado. El objetivo general es permitir una evaluación integral del comportamiento LID expresado en cada asignatura. Por ejemplo, para la lectura conductual única de la distonía del tronco, una rata que exhibe distonía baúl leve (es decir, diferencia de 45 ° entre la parte superior e inferior del torso, no predictiva del comportamiento de giro) durante todo un período de observación es muy diferente de una rata que exhibe distonía baúl grave (es decir, distonía / torsión severa constante, postura similar a un sacacorchos, acercándose a 180 °; cabeza y pies en direcciones opuestas, incapaz de deambular) durante toda la observación. Además, dada la representación topográfica del cuerpo de la rata en el cuerpo estriado, diferenciar los atributos individuales de los LID puede ser informativo36.
Otro componente de este protocolo a considerar cuidadosamente es el diseño experimental de la escalada de la dosis de L-DOPA durante un curso de tiempo de tratamiento prolongado (por ejemplo, 8 semanas) (Figura 1). Un estudio que emplee solo dosis bajas de L-DOPA (por ejemplo, 3-6 mg/kg) y/o administre la dosis de elección durante un período corto (por ejemplo, 2-4 semanas) puede mostrar evidencia de mejora del LID con intervención terapéutica en ratas parkinsonianas; sin embargo, la relevancia de estos estudios para los individuos con EP, donde a menudo se necesita la administración crónica y el aumento de la dosis, es cuestionable. Se podría sugerir que tales protocolos de tratamiento divergentes entre las investigaciones preclínicas y clínicas subyacen a la falta de eficacia observada en los ensayos clínicos realizados con medicamentos que mostraron ser prometedores en los estudios preclínicos con roedores.
Si bien el protocolo presentado aquí proporciona instrucciones sobre un enfoque integral para calificar LID en ratas parkinsonianas y el modelo de rata de LID se ha establecido como un modelo confiable de LID clínico 3,15,38,42,43, existen limitaciones inherentes a cualquier modelo. Los modelos animales son herramientas que son útiles para emular atributos particulares de la enfermedad humana y hacer predicciones sobre, por ejemplo, el impacto que la intervención terapéutica podría tener en un conjunto de características de la enfermedad. Una característica de los modelos LID preclínicos comúnmente debatidos como una limitación potencial es que las ratas requieren un agotamiento significativo de DA para expresar LID. Además, a menudo se cita que lid se desarrolla más rápidamente en modelos de roedores y NHP que en pacientes y, por lo tanto, estas características del modelo no reflejan LID clínico. Sin embargo, a menudo se subestima que, independientemente de la especie (es decir, humano, primate no humano o roedor), generalmente se requiere una pérdida casi completa de la inervación estriatal de DA para que se manifieste LID. Una vez que se administra L-DOPA a sujetos con agotamiento severo de DA estriatal, LID se induce 1,19,38,44,45,46. Una segunda característica que ha fomentado el escepticismo hacia los modelos de roedores de LID proviene de la expectativa de que los signos neurológicos de LID deberían parecerse a las manifestaciones físicas de LID observadas en primates (es decir, humanos y no humanos). De hecho, la aparición de los movimientos anormales clasificados como LID en ratas varía en características de las observadas en primates (por ejemplo, coreoatetosis en primates vs. estereotipia / hipercinesia en roedores). Si bien está más allá de este artículo abordar exhaustivamente este tema, brevemente, tales diferencias en los signos entre especies se basan en el hecho de que los humanos son bípedos habituales, los no primates frecuentan el bípedo y los roedores cuadrúpedos43,46. Así, diversas especies tienen repertorios específicos de comportamientos manifestados por estructuras osteoarticulares y musculares específicas y modulados por sistemas neuronales específicos de la especie43. En consecuencia, el modelado animal de síntomas similares a los humanos debe basarse principalmente en una expectativa de similitud funcional en lugar de en la identidad física43. La interpretación de los hallazgos de modelos animales con la debida prudencia ha proporcionado, y continuará, predicciones valiosas para el tratamiento de la enfermedad.
Si bien actualmente hay un medicamento aprobado por la FDA para el tratamiento de LID en la EP, la amantadina y la intervención quirúrgica de DBS puede mejorar el LID, la eficacia y la tolerabilidad no son óptimas, y no todos los pacientes calificarán para la cirugía de DBS. Como lo revisaron elocuentemente Cenci y sus colegas47, hay una noción expresada por algunos de que las personas afectadas por la EP preferirían estar ON (es decir, experimentando el beneficio motor de L-DOPA) con discinesias que OFF. Como estos autores afirman conmovedoramente: "La verdad más profunda es que los pacientes preferirían estar ENCENDIDOS sin discinesia. Como investigadores y clínicos, debemos aspirar a hacer realidad ese objetivo. Con este fin, se debe alentar y perseguir persistentemente la investigación traslacional sobre LID". En la búsqueda de este objetivo, presentamos nuestro método de inducción y calificación de LID. Nuestra escala de calificación está diseñada para combinar una gama de medidas de intensidad relacionadas con la calidad / gravedad de los AIM e indica la cantidad de tiempo que se muestra una variedad de atributos de discinesia. La intención de este modelo es permitir la determinación de un valor numérico que refleje con precisión la gravedad del LID al tiempo que tiene en cuenta tanto la intensidad como la frecuencia. Además, este valor indica la gravedad de LID no solo sistémicamente, sino en referencia a partes específicas del cuerpo. Con este modelo, nuestro objetivo es garantizar que las terapias experimentales puedan ser rigurosamente probadas por su capacidad para modificar las discinesias inducidas por levodopa.
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Disclosures
No se declararon conflictos de intereses.
Acknowledgments
Queremos reconocer las luchas de todas las personas con enfermedad de Parkinson y la fuerza y resiliencia que muestran todos los días, especialmente el amado padre de KSC, Mark Steece. El trabajo representado aquí fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS090107, NS110398) y el Programa Internacional de Subvenciones de Investigación de la Fundación de la Enfermedad de Parkinson, ahora la Fundación de Parkinson. También nos gustaría agradecer a Molly VanderWerp por su excelente asistencia editorial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Minutes Digital Timer | Staples | 1111764 | |
| Compass CX Compact Scale | Ohaus | 30428202 | |
| 5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide | Cayman Chemicals | 25330 | 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents. |
| Allentown cages | Allentown, LLC | Rat900 | Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides. |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | BD | BD 305540 | For subcutaneous L-DOPA injections |
| Benserazide hydrochloride | Sigma-Aldrich | B7283 | Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD. |
| Glass amber scintillation vials | Thermo Scientific | B7921 | Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline. |
| L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1507 | L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents. |
| Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils | Staples | 107250 | |
| Rodent nutritionally complete enrichment treats | Bio-Serv | F05478 | |
| Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L | Corning | 432129 | |
| Standard Plastic Clipboard | Staples | 1227770 | |
| Steel wired 6' long movable shelving units | Uline | H9488 | Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment |
| Sterile Saline 0.9% | Covidien/Argyle | 1020 | For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections. |
References
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