Summary
この記事では、パーキンソン病のラットモデルにおけるレボドパ誘発性ジスキネジアを誘導および評価する方法について説明します。このプロトコルは、ジストニックおよび過運動性の両方のさまざまな運動異常行動の強度と頻度に関する詳細な情報を提供し、この満たされていない医療ニーズを標的とする治療をテストするための信頼性の高いツールを提供します。
Abstract
レボドパ(L-DOPA)は、パーキンソン病(PD)の運動症状の治療に使用されるゴールドスタンダード療法のままです。しかしながら, L-DOPA誘発性ジスキネジアとして知られている不要な不随意運動 (LID) このドーパミン前駆体の長期使用で発症します。.LIDの発生率は、治療から10〜15年以内にPD患者の約90%にエスカレートすると推定されています。この疾患のメカニズムを理解し、新規かつ効果的な抗ジスキネジア治療薬を開発するには、治療介入の前臨床試験のための一貫した正確なモデリングが必要です。PDのラットモデルにおける6-OHDA誘導性黒質病変後のLIDの信頼性の高い誘導および包括的な評価のための詳細な方法をここに提示する。ラットにおける信頼性の高いLID評価は、PD患者に対するこの一般的な治療誘発性の負担を軽減または排除することに焦点を当てた新しい治療法をテストするために、実験室全体で容易に利用できる強力なツールを提供する。
Introduction
レボドパ(L-DOPA)がPD 1,2の患者の治療法として最初に導入されてから50年以上が経ちましたが、パーキンソン病の運動症状に対する最も効果的な治療法として非常に効果的です。PDに関連する臨床運動症状は、黒質(SN)パースコンパクタにおけるドーパミン(DA)ニューロンの喪失に由来し、線条体において利用可能なドーパミンの劇的な減少をもたらす。L-DOPAは線条体DAレベルを効果的に回復させ、疾患の早期に運動利益をもたらす3,4。不適切なことに、長期治療では、PDを有するほとんどの個人は、舞踏病、ジストニア、およびアテトーシスを含むL-DOPA誘発性ジスキネシア(LID)を発症し、これはしばしば日常生活の活動に重大な影響を及ぼす5,6,7。
げっ歯類におけるLIDの行動モデルはいくつか存在するが、LIDのモデリングと行動評価の違いは、実験室間の結果の再現性、および前臨床PD研究のためのこれらの実験ツールの信頼性に疑問を投げかけている。臨床運動障害専門医8と共同で開発された現在のプロトコルは、LID誘導および評価のための簡単な方法であり、6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)誘発片側性ニグラル病変9,10を利用するPDのラットモデルでの使用に適している。ここで提供されるLID評価尺度には、さまざまな個々の身体部分における運動異常行動の強度と頻度の両方についてのスコアリングが含まれる。実験のワークフロー最適化、パーキンソン病およびジスキネティック動物の適切なケアおよび取り扱いに関する関連情報も提供される。
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Protocol
ここに提示された動物は、制度上のガイドラインに従って維持され、取り扱われた。すべての動物処置は、ミシガン州立大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって、連邦および州の規制に準拠して承認されました。
1. 6-OHDA病変状態の無薬物確認
- 姿勢尾ぶれ試験11,12,13
注:実験対象(例えば、雄または雌、成人のスプレイグ・ドーリーまたはフィッシャー344匹)における6-OHDA病変誘導の少なくとも1週間後(病変の詳細については9、10、35を参照)に病変状態を評価する。- ラットをケージから約6cm上に吊り下げ、尾の付け根を約5秒間しっかりと保持します。
- 身体のねじれの方向を、病変した側に反対側にねじれている首尾よく病変した動物の場合+として記録し、 - 両方向にねじれまたはねじれがない。
- メモ: これらのテストはオプションですが、推奨されます。追加の薬物フリー検査オプション/バリエーションについては、14,15,16,17を参照してください。
- ステップ調整ドラッグテスト(16から適応)
注:実験対象(例えば、雄または雌、成人のスプレイグ・ドーリーまたはフィッシャー344匹)における一方的な6-OHDA病変誘導の少なくとも1週間後に病変状態を評価する。- ラットを尾の付け根で保持し、後ろ足を表面から約6cm持ち上げます。平らで滑らかだが滑りにくい表面を横切って後方にドラッグし、約75 cm、5〜10秒以上。
- 3回の繰り返しテストで各前足のタッピング/ステップ調整の動きを観察し、記録します。
- 0〜2個の前足タップが病変側に対して対側から病変側へ、前足同側から病変側への急速なタッピング(〜10タップ)とともに観察される場合の片側病変の成功について対象を+としてスコア付けする(例えば、左側に一方的に病変した動物は、対側右前足を有するタッピング欠損(0〜2タップ)を示す)。
- 逆に、両方の前足からの中等度から急速なタッピング(5〜10タップ)をスコアとして−として、不完全または未知の病変状態を示す。
注:不安な動物は、病変がうまくいっても急速なタッピング/ステップ調整を示すことがあります。これが疑われる場合は、ラットを自宅のケージに戻し、≥30分後に再テストします。
2. 試薬および供給品の調製
- L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル塩酸塩(レボドパまたはL-DOPA)および末梢脱炭酸酵素阻害剤である塩酸ベンセラジド(材料表を参照)の用量、評価頻度、および治験上の質問12,18,19,20に適した実験タイムラインを決定する(図1)。
注:治験中の質問は、特定の治療法が既存のLIDを減少させるか、またはLIDの誘導を妨げる可能性があるかどうかを尋ねることから、任意の数の質問を求めるために提起することができる。また、治療有効性がレボドパの用量に依存するかどうか、またはLID発現および/または治療有効性が被験者の性別、種、および年齢によって異なるかどうかを調べることもできる。
図1:治療タイムラインの例。 実施例L-DOPA用量漸増タイムラインは全長で12週間、6-OHDA病変後3週間後および実験的処置後4週間後に開始される8週間のL-DOPA注射を用いた。この例では、L-DOPAは、毎日ほぼ同じ時間に、各処方L-DOPA用量(3、6、9、および12mg / kg)で2週間、週に5回(月曜日〜金曜日)皮下注射される。行動LID評価は、各L-DOPA投与量の1日目、6日目、および10日目に行われます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- ラットを毎週計量し、試験中に進行中の体重変化に基づいて適切な薬物量を計算する。
注:LID+ラットの活性の増加により、長期のL-DOPA治療で体重減少の可能性があります。体重減少が発生した場合は、L-DOPA注射後にラットに栄養的に完全で非常に嗜好性の高いおやつ( 材料表を参照)を提供します。 - 毎週の濃度ごとに必要なL-DOPAおよびベンセラジドの量を計算し、注射の日ごとに凍結乾燥アリコートを計量し、ガラス琥珀バイアル中で-20°Cで1〜2週間、治療日まで組み合わせて保存する。
注:目標用量は12mg / kgまたは12mg L-DOPA/1000g体重です。ラット体重1cc/kgの注射量で12mgのL-DOPA/kg体重を用いて、1曜日毎に必要なL-DOPA及び生理食塩水の量を求める計算例を 付記1に記載する。
3. 部屋とケージのセットアップ
- 6-OHDA病変手術後3〜4週間のL-DOPA治療の初日に、ラットをIACUC承認濃縮を含む単一のハウジングに移す。
- 行動評価に対するピアの干渉を避けるために、研究を通して単一の住宅に維持する。
- LID評価日には、ラットを最適に見るために、家庭用ケージを約45° の角度で回したスチールワイヤーラックの上に置きます(図2A)。識別タグ(図2B)を上向きに反転させ、水筒、食料ラック、およびケージ内のあらゆる種類の濃縮物(図2C)を取り外して、行動評価の妨げにならないようにします。
図2:大規模ラット実験のLID評価用に設置されたケージの例 (A)各動物を最適に見ることができる大きな金属ラックを使用して、LID定格用に複数のケージを設定できます。ケージは45°の角度で広げ、IDカードを上向きにひっくり返し(B)、食べ物、水筒、ネスティング材料、その他の濃縮物を取り除き、ラットの視覚的な不明瞭さを制限し、ラットの気を散らすようにします(C)。金属製のラックは、必要に応じてケージの前面または背面にあるラットを検査できるように、壁から数フィート離れている必要があります。濃縮装置(例えば、C-レッドラットの隠れ家)に個々の動物IDをラベル付けして、それらが来たのと同じケージに交換することが不可欠です。これは、実験対象へのストレスを増大させないように、性別の異なる動物を使用する場合に特に重要である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4.レボドパ注射およびジスキネジア評価
- L-ドーパの皮下注射21,22
- L-DOPAの毎日の注射の直前に、アンバーバイアル中の予め秤量された凍結乾燥L-DOPAおよびベンセラジドミックスに適切な量の滅菌生理食塩水を加え、10秒間よく振る(ステップ2.3)。
注:目標注射量は1mL/1000g体重(1mLあたり12mgのL-DOPAを含む)です。滅菌生理食塩水の体積は、1回の研究あたりの動物の数に依存するであろう。 - 個々のシリンジ(例えば、1.0または0.5mLに26G針)を各動物に必要な容量(1mL/kgラット重量)で充填し、各シリンジに個々の動物識別でラベルを付けます。
注:充填されたシリンジは、注射時まで滅菌パウチ内の光から保護してください。L-DOPAは、水性環境中で酸素および光の存在下で急速に酸化する23、24、25、26。 - 最初のケージを注射ベンチに持って行きます。
- ラットをケージから取り出し、注射面に置きます。
- ラットが非利き手の手のひらで休んでいる表面に対して頭と肩を静かに拘束する。
- 非利き手の親指と人差し指で肩甲骨の上に横たわる背中の皮膚を優しくなめ、利き手でL-DOPAボリュームを指の間/下の皮下腔に注入し、筋肉内注射を避けるために針をできるだけ体に平行に保ちます。
注:ラットは注射前に麻酔をかけない。 - 使用済みの個々のシリンジをシャープの容器に廃棄します。
- ラットを個々のケージに入れ替え、評価が完了するまで行動評価への干渉を避けるために、LID評価日を除いて栄養的に完全なおやつを加えます。
- タイマーを 1 ~ 2 分間設定するには、希望する評価時間と、評価日の試験に参加したラットの数によって異なります。次のケージを取り出し、タイマーが示すように次のラットを注射します。
- これを繰り返し、すべてのラットが注射されるまで、1〜2分ごとに1匹のラットを注射する。
- L-DOPAの毎日の注射の直前に、アンバーバイアル中の予め秤量された凍結乾燥L-DOPAおよびベンセラジドミックスに適切な量の滅菌生理食塩水を加え、10秒間よく振る(ステップ2.3)。
- 注射後のレボドパ誘発性ジスキネジア評価
- ジストニックおよび過運動性ジスキネジア運動の強度(表1)および頻度(表2)を、LID行動の初期発症、ピーク挙動、および衰退段階を含む所望の時点数で評価する(LID評価ログシートの例については 、補足ファイル2 を参照)。
- オスおよびメスの成人Sprague DawleyまたはFisher 344ラット、およびサンプルサイズがN = 40ラットの場合、ラットの90%〜100%でLID行動がいつ中止したかに応じて、最初のL-DOPA注射の20分後20分または270分まで50分間隔でジスキネジア評価を開始する。
- 1 分間の評価間隔を使用する場合は、タイマーを 1 分間に設定します。最初のラットを1分間評価する。次のラットに移動し、1分間評価します。すべてのラットを通して、1分間隔で評価を続ける。
- レーティング期間中の任意の動作(表2)の頻度を推定しながら、LID挙動強度(表1)を観察できるように、ケージの隣にタイマーを可視的に配置します。
- 最初の時点の評価が完了した後、次の時点(例えば、注射後70分)で最初のラットで再び開始し、すべての時点が完了するまで所望の間隔(例えば、50分ごと)で継続する。
注:L-DOPA注射とLID評価タスクが重複しているため、評価日には、注射用と行動評価用の2人が必要です。
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Representative Results
パーキンソン病ラットのLIDは、ジストニック、過運動、およびステレオタイプの行動を含む、異常な不随意運動(AIM)の範囲として現れる可能性がある。このような動作のLID評価基準は、強度(表1)と周波数(表2)の両方を含むようにここに示されています。これにより、各ラットの全体的なLID重症度スコアが提供され、各評価時点でのこれらの行動に関与するのに費やされた時間(頻度)の質(強度)と量の両方を反映します。最終的な LID 重大度スコアは、強度スコアに各動作コンポーネントの頻度スコアを掛けることによって計算されます。ここでは、LID 動作の個々の属性のスコアリング基準を説明書 (表 1–2) として示し、例を詳細なレポートを含む静止画 (図 3) およびビデオ (アニメーション ビデオ 1–4) として示します。個々の動きとスコアリングに関する追加の説明情報は、図の凡例で提供されています。
LID行動の改善に対するあらゆる治療の経時的影響の包括的な評価は、L-DOPA用量漸増アプローチ(全長12週間、6-OHDA病変後に8週間のL-DOPA注射)を用いて観察することができる(図1)。このシナリオでは、L-DOPAは、各処方されたL-DOPA用量で2週間、週あたり5倍(月曜日〜金曜日)投与される。各L-DOPA用量の1日目、6日目、および10日目に行われる行動評価は、治療有効性評価のための堅牢なアプローチを提供する(図1)。しかし、研究者は、変更されたタイムラインと投薬スキームが実験的な質問によりよく答えることに気付くかもしれません。実際、末梢脱炭酸酵素阻害剤であるL-DOPAおよびベンセラジドの用量は、用量および/または試験される仮説に関する研究者の経験に応じて変化し得る。ベンセラジドの最も一般的な用量は10〜15mg / kgであり、これはTayarani-Binazir et al. (2012)20 による報告によって支持されており、L-DOPAの最適な行動効果は10mg / kgのベンセラジドで見出され、15mg / kgで追加の利益はないことを示している。
特定の治療がこの異常な行動の改善に有意義な影響を与えるかどうかを判断する際に、LIDデータを提示して分析する方法は複数あります。 図4Aは 、実験タイムライン全体にわたってピーク用量LIDとして提示されたデータの例を提供する。ピーク用量LIDは、グループ平均LIDスコアが最も大きくなる時点として定義することができる。あるいは、評価期間中にいつ発生したかにかかわらず、動物の最大ピークLIDスコアである「絶対ピーク」を報告することもできます。さらに、LID評価データは、各毎日の評価時間経過にわたって検査され、実験群データとして提示され、および/または各時点における個々の被験者のLID重症度を示すようにプロットされ得る(図4B)19。この後者のアプローチは、いくつかの治療が、例えば、被験者がLIDを表示する合計時間を減らすことができるかどうかの評価を可能にするが、必ずしもピーク用量重症度に影響するわけではない。最後に、評価セッション全体の合計 LID 重大度スコアを定量化できます。特定の被験者について、各タイム ポイントの LID 重大度スコアが合計され、その評価期間の合計スコアが生成されます。このアプローチは、曲線推定の下の面積をエミュレートし、これも計算することができます。
LID/AIMsスコアリングデータは、ジスキネジアの重症度および/または持続時間(表1および2)に値を割り当てるための評価尺度を使用して作成された、順序データであることを理解することが重要です。したがって、最も適切な統計検定はノンパラメトリックです。二元配置分散分析の直接等価ノンパラメトリック検定はありませんが、LIDデータは一元配置分散分析のノンパラメトリックな代替手段を使用して分析できます。具体的には、クラスカル-ウォリス検定は、2つ以上の独立した群の被験者間比較に使用されます。フリードマン検定は、被験者内の比較に使用される反復測定を伴う一元配置分散分析のノンパラメトリックな代替手段です。どちらも、有意なクラスカル・ウォリス検定またはフリードマン検定に続く事後検定(すなわち、ダンまたはダン・ボンフェローニ)で使用されます。2つの独立群間に有意な差があるかどうかを調べるために、マン・ホイットニーU検定は、独立t検定28,29のノンパラメトリック等価物と考えられる。
図3:パーキンソン病ラットにおけるLID強度スコアリングの例を示すフリーズフレーム画像。 (a)ジストニアまたは過運動症がない場合に、しばしば典型的な直感的なパーキンソン病姿勢を示す非ジスキネティックパーキンソン病ラットの代表画像。(B)全体的に軽度のLID重症度を有するパーキンソン病ラットで、軽度から中等度の右前肢ジストニアおよび頸部、体幹または後肢ジストニアの欠如を示すもの;付属のビデオ(アニメーションビデオ1)では、振幅の小さい右前足ジスキネジア(RFPD)と口腔舌の動きを見ることができます。(C)中等度の首と体幹のジストニアを有するパーキンソン病ラット(太字のテキストは、90°の角度でねじれた体幹を示す方向矢印に対応する)。(d)軽度の頸部および中等度の体幹ジストニア、中等度から重度の右前肢ジストニアを有するジスキネティックパーキンソン病ラット;付属のビデオ(アニメーションビデオ3)では、混合振幅RFPDが観察できます。(E)中等度から重度の頸部および重度の体幹ジストニア、重度の右後肢、および中等度の右前肢ジストニアを有するパーキンソン病ラット(太字のテキストは、体幹が〜180°ねじれていることを示す方向矢印に対応する;これは例#2において特に顕著である)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:サンプルLIDデータは、L-DOPA投与量の増加を伴う8週間以上のLID定格に準拠しています。 (A)時間と用量にわたるピーク用量LID重症度(L-DOPA後80分)。(B)毎日のタイムコース(L-DOPA後20〜170分)。各用量および日について、上のグラフはSEM±平均を反映している。下のグラフは、時間の経過に伴う個々の被験者の回答を示しています。統計量は、Dunの多重比較検定(被験者間検定)によるKruskal-WallisおよびDunnの多重比較検定(被験者内検定)によるフリードマン検定を用いて計算された。 略語: コントロール (Ctr) (n = 7);処置(Tx)(n=10)。この図は参考文献19の許可を得て転載・翻案したものです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| スコア | 形容 | |
| 首ジストニア | 0 | 何一つ |
| 1 | かなりの時間(>10-20秒)保持された頭の軽度の変位。正常の極端かもしれません | |
| 1.5 | 軽度と中等度のジストニアの混合 | |
| 2 | より顕著な変位(体に対して約90°の角度)を有する頭部。頭部はジストニック運動の方向に引っ張られたまま | |
| 2.5 | 中等度および重度のジストニアの混合 | |
| 3 | 首の筋肉組織の絶え間ない重度のねじれ(頭と肩の間の>100°の角度) | |
| トランクジストニア | 0 | 何一つ |
| 1 | 軽度のジストニア/胴体のねじれ;上半身と下胴体の45°差。かなりの時間(≥10-20秒)保持され、回転を予測しない | |
| 1.5 | 軽度と中等度のジストニアの混合 | |
| 2 | 中等度のジストニア/胴体のねじれ;上半身と下半身の90°差 | |
| 2.5 | 中等度および重度のジストニアの混合 | |
| 3 | 絶え間ない重度のジストニア/ねじれ、「コルクスクリュー」のような姿勢(180°に近づく、頭と足が反対方向)、歩行できず、バレルロールの回転に入ることがあります | |
| 前肢ジストニア | 0 | 何一つ |
| 1 | 軽度;手首または数字の異常な姿勢;握りこぶしまたは硬い前腕のいずれかですが、通常は両方を同時に行うことはできません | |
| 1.5 | 軽度と中等度のジストニアの混合 | |
| 2 | 中程度;握り締められた拳と硬い前肢、過度に拡張された位置で下向きの保持なし | |
| 2.5 | 中等度および重度のジストニアの混合 | |
| 3 | 重篤;握り締められた拳と下向きの過伸展を伴う硬い前腕 | |
| 後肢ジストニア | 0 | 何一つ |
| 1 | 後肢は軽度に異常な姿勢で保持されている。屈曲または拡張。 | |
| 1.5 | 軽度と中等度のジストニアの混合 | |
| 2 | 後肢の中程度の硬い伸展または屈曲;数字のスプレイなし | |
| 2.5 | 中等度および重度のジストニアの混合 | |
| 3 | 異常な過伸展を伴う四肢の重度の硬い姿勢 +/- 数字のスプレイ | |
| 右前足ジスキネジア(RFPD) | 0 | 欠席する |
| 1 | 小さな振幅の動き、単純な反復的な左右、または顔または口の領域での上下の拭き取り;またはケージの壁やゴミを叩く | |
| 1.5 | 小振幅運動と大振幅運動の混在。最も一般的な | |
| 2 | 右前肢の重度の伸展を伴う大きな振幅の反復的な上下運動は、首の下方および反対に引っ張る | |
| オロリンガル | 0 | 何一つ |
| 1 | 主に閉じた口の空虚な(目的のない)咀嚼、歯ぎしり | |
| 1.5 | 空虚な咀嚼、いくつかの舌の突出、ゴミで繰り返し噛むことがあります | |
| 2 | 顕著な開いた口の咀嚼を伴う顕著な反復舌突出 | |
| 頭の揺れ/震え | 0 | 何一つ |
| 1 | 現在(頭の反復的でリズミカルなボブ(約4hz)) | |
| ごみの絶え間ない咀嚼(CCL) | 0 | 何一つ |
| 1 | 現在(ごみの絶え間ない咀嚼;目標指向の強迫観念的な噛むまたはごみの咀嚼、繰り返し拾う、噛む、落とす、拾う、噛む、ごみの落下) |
表1:パーキンソン病ラットにおけるジストニックまたは過運動行動の強度のLID評価基準。 これらの評価基準は、ラットの異常な不随意姿勢および/または動きの質/重症度に関連する一連の強度尺度を提供する。姿勢や行動について記述されている特定の属性は、一般に軽度、中等度、または重度に分類され、ここでは特定の記述子が提供されています。最終的な重大度スコアは、強度 x 頻度の積として決定されます (表 2)。
| スコア | 形容 |
| 0 | 欠席する |
| 1 | 断続的、観測期間の50%< |
| 2 | 間欠的、観測期間の50%≥ |
| 3 | 観察期間全体を通して持続し、ケージを叩くことによって中断されない |
表2:ジストニックまたは過運動行動の頻度のLID評価基準。 これらの基準は、観察期間中に特定の動作が発生または繰り返される速度の定量化尺度を提供します。これは、まれな動作が永続的なスコアよりも重大度が低いことを保証することを考えると、全体的な重大度を評価する上で重要です。最終的な重大度スコアは、強度(表1)×周波数の積として決定されます。
アニメーションビデオ1:振幅が小さいRFPDと左前足の咀嚼を伴う軽度のLID。 有痛な頸部または体幹ジストニアを有さない運動異常性パーキンソン病ラットは、中等度の右前足ジストニアであるが、振幅の小さいRFPDは、右前足の急速な反復ちらつき運動として注目した。このラットはまた、左前足に向けられた空虚な咀嚼を含む口腔言語行動を示す。L-ドーパ投与量: 12 ミリグラム/キログラム;ビデオは、注入後〜70分を記録した。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
アニメーションビデオ2:中等度の体幹と首のジストニア。 中等度の体幹および頸部ジストニアを有するジスキネティックパーキンソン病ラットは、前肢および後肢の位置の90°差によって例示される(図 2Cの図を参照)。このラットはまた、顕著なステレオタイプの嗅覚と時折ごみに空いた噛み付きを表示します。L-ドーパ投与量: 12 ミリグラム/キログラム;ビデオは、注入後〜70分を記録した。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
アニメーションビデオ3:混合振幅RFPDを伴う中等度から重度の右前足ジストニア。 軽度の頸部および中等度の体幹ジストニアを有するスキネティック性パーキンソン病ラット、中等度から重度の右前足ジストニア、混合振幅RFPDは、口の近くの小さな拭き取り運動と混合して、右前足の下方への大きな振幅の引っ張りとが混在する。このラットはまた、LIDプロファイルに加えて定量化することができる頻繁な回転挙動を有する。L-ドーパ投与量: 12 ミリグラム/キログラム;ビデオは、注入後〜70分を記録した。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
アニメーションビデオ4:舌の突起を持つ頭のボブと舌の動き。 重度の体幹および前足ジストニア(後肢ジストニアは見えない)、中等度から重度の頸部ジストニア、および進行中の舌突起を有する一定のヘッドボブを有するジスキネティックパーキンソン病ラット。ヘッドボブはPDに見られる4Hzの振戦に似ています。しかしながら、ラットでは、L-DOPA投与後のジスキネティックパーキンソン病ラットにおいてのみ認められる。このラットはまた、混合振幅RFPDを有し、ビデオの初期においてより顕著な振幅運動および顔付近の小さな拭き取り様運動として見られ、後に見られる小振幅RFPDの特徴である。ビデオの早い段階で、重度のジストニック/拡張された前肢にわずかな動きが観察された。しかし、これは頭頸部振戦活動に関連しており、小振幅RFPDとして分類されないであろう。観察者がケージを強く叩くと、これらのLIDの動作は中断されず、これは驚愕で克服できない深刻なLIDであることを示唆しています。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:L-DOPAの量を計算するための例。 ラット体重1cc/kgの注射量で12mgのL-DOPA/kg体重を用いて、1日毎に必要なL-DOPA及び生理食塩水の量を求める計算例。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2: LID 評価ログ シートの例。 このシートは、レーティングセッション中にLID強度と周波数スコアを記録するために使用または適合させることができます。最終的な重大度スコアは、強度(表1)×頻度(表2)の積として決定される。これらの評価尺度はまた、マウス30におけるLIDを定量化するために使用され得る。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、黒質線条体DA系の片側的6-OHDA病変後のパーキンソン病ラットモデルにおけるLIDの再現性のある誘導および評価の詳細を提示する。かつてはげっ歯類はLIDを発症しておらず、回転非対称性はラット31のLIDの類似体である可能性があると考えられていましたが、ラットとマウスのモデルは過去20年間に特徴付けられており、LID研究のためのよく受け入れられたツールです15,32,33,34。ここで提示されたプロトコルは、より大規模な実験計画18,19に特に有用である。これは、ジストニックおよび過運動性の両方を含む、さまざまな運動異常行動の強度および頻度を評価するための詳細を提供する。特に、対応する詳細なメモとジストニックおよび過運動性LID行動のスコアリングを含む画像およびビデオは、L-DOPA投与後の実験者の評価を支援するであろう。考えられるすべてのAIMの例は提供されていませんが、軽度から中等度、重度までさまざまな行動の範囲がLID評価のフレームワークとして提供されています。このプロトコールは、パーキンソン病ラットにおける様々な治療法の評価に役立つように文書化されている19、35、36、37。これは、主に規定されたLID行動の持続時間に焦点を当てた他の公表されたげっ歯類評価尺度を補強する33,38,39。さらに、概説された手順は、ラットPDモデルにおけるスコアリング方法を、非ヒト霊長類(NHP)におけるLIDを評価する現在の慣行と整合させることを目指す、ベンチマークPDモデル40、41。
パーキンソン病げっ歯類の文献に一般的に見出されるのは、(1)四肢ジスキネジー(例えば、病変33に対向する前肢のリズミカルなジャーク、または病変した半球39によって制御される前肢の急速で目的のない動き)の発生または頻度を排他的に調べることを含むLIDまたはAIM評価尺度である。(2)軸方向ジスキネジー(例えば、頸部、体幹および尾部33に影響を及ぼす軸方向の筋肉のねじれ、または病変した半球39に対する対側の首および胴体のジストニックねじれ);(3)舌舌ジスキネジー(例えば、舌突起33を有する空の口の咀嚼運動、またはラットの口が空であり、いかなる物体とも接触していないときの反復的な咀嚼または舌突起)。これら3つの行動カテゴリには、観察期間中の頻度に基づいて重大度スコアが与えられます。動物がこれらの行動を示すのに費やした時間を表す重症度スコアは、多くの場合、行動の質の特徴付けなしに、最終的なALO(軸方向、四肢、および口腔内)スコアに結合されます。
対照的に、現在のプロトコルは、グローバルAIMの評価を可能にするだけでなく、独立した身体部分(すなわち、首、胴体、前肢、後肢、および口)におけるAIMの検査、評価されるAIMの強度/品質、ジストニアと運動亢進行動の区別、および他の尺度と同様に、任意の所与のAIMの発生頻度を組み込むことを可能にする、より詳細なスケールを提供する。全体的な目標は、各被験者で表現されたLID動作の包括的な評価を可能にすることです。例えば、体幹ジストニアの単一行動読み出しの場合、観察期間全体にわたって軽度の体幹ジストニア(すなわち、上半身と下半身の45°の差、旋回行動を予測しない)を示すラットは、重度の体幹ジストニア(すなわち、一定の重度のジストニア/ねじれ、コルクスクリューのような姿勢、180°に近づく;頭と足が反対方向に接近する)を示すラットとは大きく異なる。 歩行できません)は、観察全体に対して。さらに、線条体におけるラットの身体の地形学的表現を考えると、LIDの個々の属性を区別することは有益であり得る36。
このプロトコルの注意深く検討すべきもう1つの構成要素は、延長された(例えば、8週間)治療時間経過にわたってL-DOPA投与をエスカレートさせる実験計画である(図1)。低用量のL-DOPA(例えば、3〜6mg/kg)のみを採用し、および/または選択した用量を短期間(例えば、2〜4週間)投与する研究は、パーキンソン病ラットにおける治療介入によるLID改善の証拠を示す可能性がある。しかし、慢性投与と用量漸増がしばしば必要とされるPD患者に対するこれらの研究の関連性は疑わしい。前臨床研究と臨床研究の間のこのような異なる治療プロトコルは、前臨床げっ歯類研究で有望視された薬物で実施された臨床試験に見られる有効性の欠如の根底にあることが示唆され得る。
ここで提示されたプロトコルは、パーキンソン病ラットにおけるLIDを評価するための包括的なアプローチに関する指示を提供し、LIDのラットモデルは臨床LID 3、15、38、42、43の信頼できるモデルとして確立されているが、どのモデルにも固有の制限がある。動物モデルは、ヒトの疾患の特定の属性をエミュレートし、例えば、治療的介入が一連の疾患特徴に与える影響について予測を行う上で有用なツールである。潜在的な制限として一般的に議論されている前臨床LIDモデルの特徴の1つは、ラットがLIDを発現するために有意なDA枯渇を必要とすることである。さらに、LIDは患者よりもげっ歯類およびNHPモデルにおいてより急速に発症し、したがってこれらのモデル特性は臨床LIDを反映していないことがしばしば引用される。しかし、種(すなわち、ヒト、非ヒト霊長類、またはげっ歯類)にかかわらず、LIDが現れるためには線条体DA神経支配のほぼ完全な喪失が一般に必要であることは、しばしば過小評価されている。L−DOPAが重度の線条体DA枯渇を有する対象に投与されると、LIDは1、19、38、44、45、46に誘導される。LIDのげっ歯類モデルに対する懐疑論を助長してきた第2の特徴は、LIDの神経学的徴候が霊長類(すなわち、ヒトおよび非ヒト)に見られるLIDの物理的症状に似ているべきであるという期待から来ている。実際、ラットにおけるLIDとして分類される異常な動きの出現は、霊長類に見られるものとは異なる特徴を有する(例えば、霊長類における振付癖症対げっ歯類におけるステレオタイプ/過運動症)。このトピックに包括的に取り組むことはこの記事を超えていますが、簡単に言えば、種間の徴候のそのような違いは、人間が習慣的な二足歩行、非霊長類が頻繁な二足歩行、げっ歯類の四足歩行43,46であるという事実に基づいています。したがって、様々な種は、特定の骨関節および筋肉構造によって現れ、種特異的神経系43によって調節される行動の特異的レパートリーを有する。したがって、ヒト様症状の動物モデリングは、物理的同一性43ではなく、主に機能的類似性の期待に基づくべきである。動物モデルからの所見の解釈は、これまでも、そしてこれからも、疾患治療のための貴重な予測を提供し続けるだろう。
現在、PDにおけるLIDの治療のためのFDA承認薬が1つあり、アマンタジン、およびDBSの外科的介入はLIDを改善することができるが、有効性および忍容性は最適ではなく、すべての患者がDBS手術の資格を得るわけではない。Cenciら47が雄弁にレビューしたように、PDに罹患した個人は、OFFよりもジスキネジアでONになる(すなわち、L-DOPAの運動利益を経験する)という概念が一部によって表明されている。これらの著者が痛烈に述べているように、「より深い真実は、患者がジスキネジアなしでONになることを非常に好むということです。研究者や臨床医として、私たちはその目標を現実のものにすることを目指すべきです。この目的のために、LIDに関するトランスレーショナルリサーチを奨励し、粘り強く追求する必要があります。この目標を追求するために、我々はLIDの誘導と評価の方法を提示する。当社の評価尺度は、AIMの品質/重症度に関連する強度測定の範囲を組み合わせるように設計されており、ジスキネジアのさまざまな属性が表示される時間を示します。このモデルの目的は、強度と周波数の両方を考慮しながら、LIDの重大度を正確に反映した数値を決定できるようにすることです。さらに、この値は、全身的にだけでなく、特定の身体部分に関してもLIDの重症度を示す。このモデルでは、実験的治療薬がレボドパ誘発性ジスキネジアを修飾する能力について厳密に試験されることを確実にすることを目指しています。
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Disclosures
利益相反は宣言されませんでした。
Acknowledgments
私たちは、パーキンソン病を患っているすべての人々の闘いと、彼らが毎日示す強さと回復力、特にKSCの最愛の父、マーク・スティースに感謝したいと思います。ここに示されている研究は、国立神経障害・脳卒中研究所(NS090107、NS110398)とパーキンソン病財団国際研究助成プログラム(現在のパーキンソン財団)の支援を受けました。また、Molly VanderWerpの優れた編集支援にも感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Minutes Digital Timer | Staples | 1111764 | |
| Compass CX Compact Scale | Ohaus | 30428202 | |
| 5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide | Cayman Chemicals | 25330 | 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents. |
| Allentown cages | Allentown, LLC | Rat900 | Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides. |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | BD | BD 305540 | For subcutaneous L-DOPA injections |
| Benserazide hydrochloride | Sigma-Aldrich | B7283 | Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD. |
| Glass amber scintillation vials | Thermo Scientific | B7921 | Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline. |
| L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1507 | L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents. |
| Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils | Staples | 107250 | |
| Rodent nutritionally complete enrichment treats | Bio-Serv | F05478 | |
| Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L | Corning | 432129 | |
| Standard Plastic Clipboard | Staples | 1227770 | |
| Steel wired 6' long movable shelving units | Uline | H9488 | Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment |
| Sterile Saline 0.9% | Covidien/Argyle | 1020 | For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections. |
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