Summary
이 글은 파킨슨병의 래트 모델에서 레보도파로 인한 운동이상증을 유도하고 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 운동 이상과 운동 장애 행동의 범위, 둘 다 강도와 빈도에 관한 자세한 정보를 제공하여이 충족되지 않은 의학적 필요를 목표로하는 치료법을 테스트 할 수있는 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다.
Abstract
레보도파 (L-DOPA)는 파킨슨 병 (PD) 운동 증상을 치료하는 데 사용되는 황금 표준 치료법으로 남아 있습니다. 그러나 L-DOPA-유도 운동 장애 (LIDs)로 알려진 원치 않는 비자발적 운동은이 도파민 전구체를 장기간 사용하면 발생합니다. LID의 발생률은 치료 후 10-15 년 이내에 PD를 가진 개인의 약 90 %로 확대되는 것으로 추정됩니다. 이 질병의 메커니즘을 이해하고 새롭고 효과적인 항 운동 장애 치료법을 개발하려면 치료 중재의 전임상 테스트를위한 일관되고 정확한 모델링이 필요합니다. PD의 래트 모델에서 6-OHDA-유도된 니그랄 병변에 이어 LIDs의 신뢰할 수 있는 유도 및 포괄적인 평가를 위한 상세한 방법이 여기에 제시된다. 쥐의 신뢰할 수있는 LID 평가는 PD를 가진 개인에 대한이 일반적인 치료 유발 부담을 줄이거 나 제거하는 데 중점을 둔 새로운 치료법을 테스트하기 위해 실험실 전체에서 쉽게 활용할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
레보도파 (L-DOPA)가 PD 1,2를 가진 개인을위한 치료법으로 처음 도입 된 지 50 년이 넘었지만 파킨슨 병 운동 증상에 대한 가장 효과적인 치료법으로 남아 있습니다. PD와 관련된 임상 운동 증상은 흑질(SN) 파콤파에서 도파민(DA) 뉴런의 손실로부터 비롯되며, 선조체에서 이용가능한 도파민의 극적인 감소를 초래한다. L-DOPA는 삼중항 DA 수준을 효과적으로 회복시켜 질병 초기에 운동 효과를 가져옵니다 3,4. 부적절하게, 장기간 치료로, PD를 가진 대부분의 개인은 무도병, 근긴장 이상증 및 무취증을 포함하여 L-DOPA 유도 운동 장애 (LID)를 개발할 것이며, 이는 종종 일상 생활의 활동에 큰 영향을 미칩니다 5,6,7.
설치류에서 LID의 여러 행동 모델이 존재하지만, LID의 모델링 및 행동 평가의 차이는 실험실 간의 결과의 재현성과 전임상 PD 연구를위한 이러한 실험 도구의 신뢰성에 의문을 제기했습니다. 임상 운동 장애 전문가8과 공동으로 개발 된 현재의 프로토콜은 LID 유도 및 등급을위한 간단한 방법이며 6-하이드록시도파민 (6-OHDA)을 활용한 PD의 래트 모델에 사용하기에 적합합니다 9,10 유도 일측성 니그랄 병변. 여기에 제공된 LID 등급 척도에는 다양한 개별 신체 부위에서 운동 장애 행동의 강도와 빈도에 대한 점수가 포함됩니다. 실험의 워크플로우 최적화와 파킨슨병 및 운동장애 동물의 적절한 관리 및 취급에 관한 관련 정보도 제공됩니다.
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Protocol
여기에 제시된 동물들은 제도적 지침에 따라 유지되고 처리되었습니다. 모든 동물 절차는 연방 및 주 규정에 따라 미시간 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 6-OHDA 병변 상태의 약물 없는 확인
- 자세 꼬리 걸이 검사11,12,13
참고: 실험 대상자(예: 남성 또는 여성, 성인 Sprague Dawley 또는 Fisher 344 래트)에서 6-OHDA 병변 유도 후 최소 1주일 후에 병변 상태를 평가합니다(병변에 대한 자세한 내용은9,10,35 참조).- 쥐를 새장 위에 약 6cm 정도 매달아 꼬리 바닥을 단단히 잡고 ~ 5 초 동안 붙든다.
- 병변 측에 대측으로 비틀어지는 성공적으로 병변 된 동물에 대해 + 로 신체 왜곡의 방향을 기록하고 - 양방향으로 비틀거나 비틀림이 없기 때문에.
- 참고: 이러한 테스트는 선택 사항이지만 권장됩니다. 추가 약물 없는 검사 옵션/변형에 대해서는 14,15,16,17을 참조하십시오.
- 드래그 테스트 단계 조정 (16에서 조정)
참고: 실험 대상자(예: 남성 또는 여성, 성인 Sprague Dawley 또는 Fisher 344 래트)에서 일방적인 6-OHDA 병변 유도 후 최소 1주일 후에 병변 상태를 평가합니다.- 꼬리 밑으로 쥐를 잡고 뒷발을 표면에서 ~ 6cm 정도 들어 올립니다. 평평하고 매끄럽지 만 미끄러워지지 않는 표면, ~ 75cm, 5-10 초 동안 뒤로 드래그하십시오.
- 세 번의 반복 테스트를 통해 각 앞발의 움직임을 조정하는 탭핑 / 스텝 수를 관찰하고 기록하십시오.
- 앞발 동방성에서 병변 측까지 빠른 두드리기 (~ 10 탭)와 함께 0-2 앞발 탭이 병변 측과 대측으로 관찰 될 때 성공적인 일방적 인 병변에 대해 피험자를 +로 채점하십시오 (예 : 왼쪽에서 일방적으로 병변 한 동물은 대측 오른쪽 앞발로 두드리는 적자 (0-2 탭)를 나타냄).
- 반대로, 불완전하거나 알려지지 않은 병변 상태를 나타 내기 위해 두 앞발에서 중간 또는 빠른 두드리기 (5-10 탭)로 점수를냅니다.
참고 : 불안한 동물은 성공적으로 병변을 일으킨 경우에도 빠른 태핑 / 단계 조정을 보여줄 수 있습니다. 이것이 의심되는 경우, 쥐를 집 새장에 다시 넣고 ≥30 분 후에 다시 테스트하십시오.
2. 시약 및 소모품의 제조
- L-3,4-디하이드록시페닐알라닌 메틸 에스테르 하이드로클로라이드(레보도파 또는 L-DOPA) 및 벤세라지드 하이드로클로라이드, 말초 탈카르복실라제 억제제(물질 표 참조) 투여량, 평가 빈도 및 조사 질문12,18,19,20에 적합한 실험 타임라인을 결정한다(도 1).
참고: 특정 치료법이 기존 LID를 줄이거나 LID의 유도를 방해할 수 있는지 묻는 것에서부터 다양한 질문을 하기 위해 조사 질문을 제기할 수 있습니다. 그들은 또한 치료 효능이 레보도파의 용량에 의존하는지 또는 LID 발현 및 / 또는 치료 효능이 피험자의 성별, 종 및 연령에 따라 다른지 여부를 탐구 할 수 있습니다.
그림 1: 치료 타임라인의 예. 실시예 L-DOPA 투여량-확대 타임라인은 총 길이 12주로, 6-OHDA 병변 후 3주 및 치료 후 4주 후에 시작되는 L-DOPA 주사의 8주와 함께 실험적 길이이다. 이 예에서 L-DOPA는 처방 된 각 L-DOPA 용량 (3, 6, 9 및 12 mg / kg)에서 2 주 동안 매일 거의 같은 시간에 주당 5x (월요일 - 금요일)를 피하 주사합니다. 행동 LID 등급은 각 L-DOPA 투여량 수준의 1, 6 및 10일에 일자로 측정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 매주 쥐의 무게를 측정하여 연구 동안 진행중인 체중 변화에 따라 적절한 약물 양을 계산하십시오.
참고 : LID + 쥐의 활성 증가로 인해 장기간의 L-DOPA 치료로 체중 감량 가능성이 있습니다. 체중 감소가 발생하면 L-DOPA 주사 후 영양학적으로 완전하고 맛이 좋은 치료법 ( 자료 표 참조)을 쥐에게 제공하십시오. - 각 주간 농도에 필요한 L-DOPA 및 벤세라지드의 양을 계산하고, 주사 일마다 동결건조된 분취량을 칭량하고, 치료 당일까지 유리 호박색 바이알에 -20°C에서 1-2주 동안 조합하여 보관한다.
참고: 대상 용량은 12 mg/kg 또는 12 mg L-DOPA/1000 g 체중입니다. 쥐 체중 1cc/kg의 주사 부피에서 12mg L-DOPA/kg 체중을 사용하여 1주일의 매일에 필요한 L-DOPA 및 식염수의 양을 결정하기 위한 계산의 예는 보충 파일 1에 나와 있습니다.
3. 방과 감금소 설치
- 6-OHDA 병변 수술 후 3-4 주 후에 L-DOPA 치료 첫날에 IACUC 승인 농축을 포함하여 쥐를 단일 주택으로 옮깁니다.
- 행동 평가에 대한 동료 간섭을 피하기 위해 연구 전반에 걸쳐 단일 주택에 유지하십시오.
- LID 등급의 날에는 가정용 케이지를 강철 와이어 랙에 놓고 쥐를 최적으로 볼 수 있도록 약 45° 각도로 돌립니다(그림 2A). 식별 태그(그림 2B)를 위쪽으로 뒤집고 물병, 식품 선반 및 케이지의 모든 유형의 농축물(그림 2C)을 제거하여 행동 평가에 방해가 되지 않도록 합니다.
도 2: 대규모 래트 실험의 LID 등급을 위해 설정된 케이지의 예. (A) 각 동물을 최적으로 볼 수있는 대형 금속 랙을 사용하여 LID 등급에 대해 여러 케이지를 설정할 수 있습니다. 케이지는 ID 카드를 위쪽으로 뒤집어 45 ° 각도로 펼쳐야하며(B), 음식, 물병, 둥지 재료 및 기타 농축물을 제거하여 쥐의 시각적 모호성을 제한하고 쥐에게 산만 함을 제거하면서 운동 장애 행동 (C)을 검사해야합니다. 금속 랙은 필요에 따라 평가자가 케이지의 앞이나 뒤에서 쥐를 검사 할 수 있도록 벽에서 몇 피트 떨어져 있어야합니다. 농축 장치 (예 : C- 레드 쥐 퇴각 주택)를 개별 동물 ID로 표시하여 그들이 온 동일한 케이지로 대체하는 것이 필수적입니다. 이것은 실험 대상에 대한 스트레스를 증가시키지 않기 위해 성별이 다른 동물을 사용할 때 특히 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 레보도파 주사 및 운동장애 등급
- L-DOPA21,22의 피하 주사
- L-DOPA의 일일 주사 직전에, 호박색 바이알에 미리 칭량된 동결건조된 L-DOPA 및 벤세라지드 혼합물에 적절한 부피의 멸균 식염수를 첨가하고, 10초 동안 잘 흔들어 준다(단계 2.3).
참고: 목표 주사 부피는 체중 1mL/1000g(mL당 L-DOPA 12mg 포함)입니다. 멸균 식염수의 부피는 연구 당 동물의 수에 의존할 것이다. - 개별 주사기 (예 : 26G 바늘로 1.0 또는 0.5 mL)를 각 동물에 필요한 부피 (1 mL / kg 쥐 무게)로 채우고 각 주사기에 개별 동물 식별로 라벨을 붙입니다.
참고: 충전된 주사기는 주사 시까지 멸균 파우치에 빛으로부터 보호해 두십시오. L-DOPA는 수성 환경(23,24,25,26)에서 산소와 빛의 존재 하에서 빠르게 산화된다. - 첫 번째 케이지를 주입 벤치로 가져 오십시오.
- 새장에서 쥐를 제거하고 주입 표면에 놓습니다.
- 쥐가 비 지배적 인 손바닥으로 쉬고있는 표면에 대해 머리와 어깨를 부드럽게 억제하십시오.
- 부드럽게 비 지배적 인 손의 엄지와 검지로 견갑골 위에 놓인 뒤쪽의 피부를 비웃고, 지배적 인 손으로 L-DOPA 볼륨을 손가락 사이의 / 아래 피하 공간에 주입하여 바늘을 가능한 한 신체와 평행하게 유지하여 근육 주사를 피하십시오.
참고 : 쥐는 주사 전에 마취되지 않습니다. - 사용 된 각 개별 주사기를 날카로운 용기에 넣으십시오.
- 쥐를 개별 케이지에 교체하고 LID 등급 일을 제외하고 영양학적으로 완전한 치료법을 추가하여 등급이 완료 될 때까지 행동 평가에 대한 간섭을 피하십시오.
- 원하는 평가 시간과 평가 일에 대한 연구에서 쥐의 수에 따라 타이머를 1-2 분 동안 설정하십시오. 다음 케이지를 검색하고 타이머가 나타낼 때 다음 쥐를 주입하십시오.
- 모든 쥐가 주입 될 때까지 1-2 분마다 한 마리의 쥐를 주사하여이 작업을 반복하십시오.
- L-DOPA의 일일 주사 직전에, 호박색 바이알에 미리 칭량된 동결건조된 L-DOPA 및 벤세라지드 혼합물에 적절한 부피의 멸균 식염수를 첨가하고, 10초 동안 잘 흔들어 준다(단계 2.3).
- 레보도파-유도 운동이상증 등급 주사 후
- LID 거동, 피크 거동 및 쇠퇴 단계의 초기 발병을 포함해야 하는 원하는 수의 시점에서, 운동이상성 및 운동이상운동 장애의 강도(표 1) 및 빈도(표 2)를 평가한다(LID 등급 로그 시트의 예는 보충 파일 2 참조).
- 남성과 여성 성인 Sprague Dawley 또는 Fisher 344 래트의 경우, N = 40 마리의 래트의 샘플 크기는 첫 번째 L-DOPA 주사 후 20 분 후에 운동 장애 등급을 시작한 다음 LID 행동이 래트의 90 % -100 %에서 중단 된 시점에 따라 주사 후 220 또는 270 분까지 50 분 간격으로 시작합니다.
- 1분 등급 간격을 사용하는 경우 타이머를 1분 동안 설정합니다. 첫 번째 쥐를 한 분 동안 평가하십시오. 다음 쥐로 이동하여 1 분 동안 평가하십시오. 모든 쥐를 계속 통과하여 1 분 간격으로 평가하십시오.
- 타이머를 케이지 옆에 눈에 띄게 위치시켜 LID 거동 강도(표 1)가 평가 기간 동안 임의의 주어진 거동(표 2)의 빈도를 추정하면서 관찰될 수 있도록 한다.
- 첫 번째 시점들에 대한 평가가 완료된 후 다음 시점(예를 들어, 주사 후 70분)에서 첫 번째 래트로 다시 시작하고 모든 시점이 완료될 때까지 원하는 간격(예를 들어, 매 50분마다)으로 계속한다.
참고 : L-DOPA 주사와 LID 등급 작업이 겹치기 때문에 평가 일에 두 사람이 필요하며, 하나는 주사와 행동 등급에 필요합니다.
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Representative Results
파킨슨 쥐의 LID는 근긴장 이상, 운동 과다 및 고정 관념 행동을 포함한 비정상적인 비자발적 운동 (AIMs)의 범위로 나타날 수 있습니다. 이러한 거동에 대한 LID 등급 기준은 강도(표 1) 및 빈도(표 2)를 모두 포함하도록 여기에 제시되어 있다. 이것은 각 평가 시점에서 이러한 행동에 참여한 데 소요된 시간의 양(빈도)과 품질(강도)을 모두 반영하는 각 래트에 대한 전반적인 LID 심각도 점수를 제공합니다. 최종 LID 심각도 점수는 강도 점수에 각 행동 성분에 대한 빈도 점수를 곱하여 계산됩니다. LID 동작의 개별 속성에 대한 점수 기준은 여기에 서면 설명(표 1–2)으로 제공되며, 예제는 자세한 보고서가 포함된 스틸 이미지(그림 3) 및 비디오(애니메이션 비디오 1–4)로 표시됩니다. 개별 움직임 및 점수에 대한 추가 설명 정보는 그림 범례에서 제공됩니다.
시간에 따른 LID 행동의 개선에 대한 모든 치료의 영향에 대한 포괄적 인 평가는 L-DOPA 용량 확대 접근법, 총 길이 12 주, 6-OHDA 병변 후 8 주간의 L-DOPA 주사를 사용하여 관찰 할 수 있습니다 (그림 1). 이 시나리오에서 L-DOPA는 처방 된 각 L-DOPA 용량으로 2 주 동안 주당 5x (월요일 - 금요일)가 제공됩니다. 각 L-DOPA 용량의 1일, 6일 및 10일에 발생하는 행동 등급은 치료 효능 평가를 위한 강력한 접근법을 제공한다(그림 1). 그러나 연구자들은 변경된 타임 라인과 투약 계획이 실험 질문에 더 잘 대답한다는 것을 알 수 있습니다. 실제로, 말초 탈탄산효소 억제제인 L-DOPA와 벤세라지드의 투여량은 투여량 및/또는 시험될 가설에 대한 조사자의 경험에 따라 달라질 수 있다. benserazide의 가장 일반적인 복용량은 10-15 mg / kg 사이이며, Tayarani-Binazir et al. (2012) 20 의 보고서에 의해 뒷받침되며, L-DOPA의 최적 행동 효과는 10 mg / kg의 benserazide에서 발견되며 15 mg / kg에서 추가 혜택이 없음을 보여줍니다.
주어진 치료가 이러한 비정상적인 행동을 개선하는 데 의미있는 영향을 미치는지 여부를 결정할 때 LID 데이터를 제시하고 분석하는 여러 가지 방법이 있습니다. 도 4A는 전체 실험 타임라인에 걸쳐 피크 선량 LID로서 제시된 데이터의 예를 제공한다. 피크 선량 LID는 그룹 평균 LID 점수가 가장 큰 시점으로서 정의될 수 있다. 또는 평가 기간 동안 언제 발생하는지에 관계없이 동물에 대한 최대 피크 LID 점수 인 '절대 피크'를보고 할 수 있습니다. 추가적으로, LID 등급 데이터는 각각의 일일 평가 시간 코스에 걸쳐 검사될 수 있고, 실험 그룹 데이터로서 및/또는 각 시점에서의 개별 피험자의 LID 심각도를 보여주기 위해 플롯팅될 수 있다(도 4B)19). 이러한 후자의 접근법은 일부 치료법이 예를 들어, 피험자가 LID를 표시하는 총 시간을 감소시킬 수 있는지에 대한 평가를 허용하지만, 반드시 피크 용량 중증도에 영향을 미치는 것은 아니다. 마지막으로, 전체 평가 세션에서 총 LID 심각도 점수를 정량화 할 수 있습니다. 주어진 피험자에 대해, 각 시점들에 대한 LID 심각도 점수는 그 평가 기간에 대한 총 스코어를 생성하기 위해 합산된다. 이 접근법은 곡선 추정 아래의 면적을 에뮬레이트하며, 이는 또한 계산될 수 있다.
운동장애 심각도 및/또는 기간에 값을 할당하기 위해 등급 척도를 사용하여 생성된 LID/AIM 점수 데이터(표 1 및 2)는 서수 데이터라는 점을 이해하는 것이 중요합니다. 따라서 가장 적절한 통계 테스트는 비모수적입니다. 분산의 양방향 분석을 위한 직접적인 동등한 비모수 검정은 없지만 LID 데이터는 단방향 ANOVA에 대한 비모수 대안으로 분석할 수 있습니다. 구체적으로, Kruskal-Wallis 시험은 둘 이상의 독립적인 그룹의 피험자 간 비교를 위해 사용된다. 프리드먼 테스트는 피험자 내에서 비교에 사용되는 반복 측정이 있는 단방향 ANOVA에 대한 비모수 대안입니다. 둘 다 중요한 Kruskal-Wallis 또는 Friedman의 테스트에 이어 사후 테스트 (예 : Dunn 또는 Dunn-Bonferroni)와 함께 사용됩니다. 두 개의 독립적 인 그룹 사이에 의미있는 차이가 있는지 여부를 조사하기 위해 Mann-Whitney U 테스트는 독립적 인 t- 테스트28,29와 동등한 비 모수 적으로 간주됩니다.
그림 3: 파킨슨병 쥐에서 LID 강도 점수 매기기의 예를 보여주는 동결 프레임 이미지. (a) 근긴장이상증 또는 운동장애가 없는 상태에서 흔히 전형적인 구부러진 파킨슨병 자세를 나타내는 비운동성 파킨슨병 쥐의 대표적인 이미지. (b) 전반적으로 경미한 LID 중증도를 갖는 파킨슨병 쥐, 경증 내지 중등도의 오른쪽 앞다리 긴장 이상증 및 목, 몸통 또는 뒷다리 근긴장 이상증의 결여를 나타냄; 첨부 된 비디오 (애니메이션 비디오 1)에서 작은 진폭 오른쪽 앞발 운동 장애 (RFPD) 및 구두 언어 움직임을 볼 수 있습니다. (C) 적당한 목과 몸통 근긴장 이상증을 가진 파킨슨 병 쥐 (굵은 텍스트는 90 ° 각도로 꼬인 트렁크를 나타내는 방향 화살표와 일치합니다). (d) 경미한 목 및 중등도의 줄기 근긴장 이상증, 중등도 내지 중증 우측 앞다리 근긴장 이상증을 갖는 운동이상성 파킨슨병 래트; 수반되는 비디오(애니메이션 비디오 3)에서, 혼합 진폭 RFPD가 관찰될 수 있다. (E) 중등도에서 중증의 목과 심한 줄기 근긴장 이상증, 심한 오른쪽 뒷다리 및 중등도의 오른쪽 앞다리 근긴장 이상증을 가진 파킨슨 병 쥐 (굵은 텍스트는 트렁크가 ~ 180 ° 꼬여 있음을 나타내는 방향 화살표와 일치합니다. 이것은 특히 예 # 2에서 주목할 만합니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: L-DOPA 투여량이 증가하면서 8주 동안 LID 등급을 준수한 예의 LID 데이터. (A) 시간 및 용량에 걸친 피크 용량 LID 중증도 (L-DOPA-DOPA 후 80분). (B) 일일 시간 코스 (L-DOPA에서 20-170 분). 각 투여량 및 일에 대해, 상부 그래프는 평균 ± SEM을 반영한다; 하단 그래프는 시간에 따른 개별 주제 응답을 보여줍니다. 통계는 Kruskal-Wallis를 사용하여 Dunn의 다중 비교 테스트 (피험자 간 테스트)와 Dunn의 다중 비교 테스트 (피험자 내 테스트)를 사용한 프리드먼 테스트를 사용하여 계산되었습니다. 약어: 제어 (Ctr) (n = 7); 치료 (Tx) (n = 10). 이 그림은 참조19의 허가를 받아 재인쇄되고 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 점수 | 묘사 | |
| 목 긴장 이상증 | 0 | 없음 |
| 1 | 상당한 시간 동안 유지되는 머리의 온화한 변위 (>10-20 초); 정상의 극단적 일 수 있습니다. | |
| 1.5 | 경증과 중등도의 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 2 | 더 주목할만한 변위가있는 머리 (몸에 약 90 ° 각도); 머리는 근긴장 이상 운동의 방향으로 당겨진 채로 남아 있습니다. | |
| 2.5 | 중등도와 중증 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 3 | 목 근육의 지속적인 심한 비틀림 (머리와 어깨 사이의 >100 ° 각도) | |
| 트렁크 긴장 이상 | 0 | 없음 |
| 1 | 가벼운 근긴장 이상 / 트렁크의 비틀림; 상부 몸통과 하부 몸통 사이의 45 ° 차이; 상당한 시간 (≥10-20 초) 동안 유지되며 회전을 예측하지 못합니다. | |
| 1.5 | 경증과 중등도의 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 2 | 중간 정도의 근긴장 이상 / 트렁크의 비틀림; 상부 몸통과 하부 몸통의 90° 차이 | |
| 2.5 | 중등도와 중증 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 3 | 일정한 심한 근긴장 이상 / 비틀림, "코르크 스크류"와 같은 자세 (180 ° 접근; 머리와 발은 반대 방향으로), ambulate 할 수없고 배럴 롤 회전에 들어갈 수 있습니다. | |
| 앞다리 긴장 이상증 | 0 | 없음 |
| 1 | 온화한; 손목이나 숫자의 비정상적인 자세; 주먹이나 딱딱한 팔뚝 중 하나이지만 일반적으로 둘 다 동시에 잡히지는 않습니다. | |
| 1.5 | 경증과 중등도의 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 2 | 보통; 꽉 조여진 주먹과 단단한 앞다리가 지나치게 확장 된 자세로 아래쪽으로 잡히지 않고 | |
| 2.5 | 중등도와 중증 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 3 | 심각한; 꽉 조여진 주먹과 단단한 팔뚝, 아래쪽으로 과잉 확장 기능 | |
| 힌팔다리 긴장 이상증 | 0 | 없음 |
| 1 | 뒷다리는 비정상적인 자세로 가볍게 잡힌다. 굴곡 또는 확장. | |
| 1.5 | 경증과 중등도의 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 2 | 뒷다리의 적당한 경직 연장 또는 굴곡; 숫자의 재생 없음 | |
| 2.5 | 중등도와 중증 근긴장 이상증의 혼합 | |
| 3 | 비정상적인 과잉 확장 +/- 숫자의 재생과 사지의 심한 경직 자세 | |
| 오른쪽 앞발 운동 장애 (RFPD) | 0 | 없는 |
| 1 | 작은 진폭 움직임, 간단한 반복적 인 좌우 또는 얼굴이나 입의 영역에서 위아래로 닦기; 또는 새장 벽이나 깔짚을 두드리는 것 | |
| 1.5 | 작고 큰 진폭 운동의 혼합; 가장 일반적인 | |
| 2 | 오른쪽 앞다리의 심한 확장과 관련된 큰 진폭 반복적 인 상하 움직임, 목의 아래쪽과 반대쪽으로 당겨집니다. | |
| 구술 언어 | 0 | 없음 |
| 1 | 주로 닫힌 입 진공 (목적없는)기, 치아 연삭 | |
| 1.5 | 진공는 소리, 혀가 튀어 나올 수 있으며, 깔짚에 반복적으로 물릴 수 있습니다. | |
| 2 | 눈에 띄는 열린 입으로는 눈에 띄는 반복 혀 돌출 | |
| 머리 밥 / 떨림 | 0 | 없음 |
| 1 | 현재 (머리의 반복적이고 리드미컬한 밥 (약 4hz)) | |
| 쓰레기의 지속적인기 (CCL) | 0 | 없음 |
| 1 | 현재 (쓰레기의 끊임없는기; 목표는 쓰레기를 물거나는 강박 관념을 지시하고, 반복적으로 집어 들고,고, 떨어 뜨리고, 집어 들고,고, 쓰레기를 떨어 뜨리는 것을 지시했다) |
표 1: 파킨슨병 래트의 운동 이상 또는 운동 이상작용의 강도에 대한 LID 등급 기준. 이러한 평가 기준은 쥐의 비정상적인 비자발적 자세 및/또는 움직임의 질/중증도와 관련된 다양한 강도 측정을 제공한다. 자세 및 행동에 대해 설명된 특정 속성은 일반적으로 경증, 중등도 또는 중증으로 분류되며, 여기에 특정 설명자가 제공됩니다. 최종 심각도 점수는 강도 x 빈도의 곱으로 결정됩니다(표 2).
| 점수 | 묘사 |
| 0 | 없는 |
| 1 | 간헐적, 관찰 기간의 < 50% |
| 2 | 간헐적, 관찰 기간의 ≥ 50% |
| 3 | 전체 관찰 기간 동안 지속되며 케이지를 두드리면 중단되지 않습니다. |
표 2: 운동 장애 또는 운동성 행동의 빈도에 대한 LID 등급 기준. 이러한 기준은 관찰 기간 동안 주어진 행동이 발생하거나 반복되는 속도에 대한 정량화 척도를 제공합니다. 이것은 드문 행동이 지속적인 행동보다 덜 심각한 점수를 보증한다는 점을 감안할 때 전반적인 심각도를 평가하는 데 중요합니다. 최종 심각도 점수는 강도(표 1) x 빈도의 곱으로 결정됩니다.
애니메이션 비디오 1 : 작은 진폭 RFPD와 왼쪽 앞발을는 가벼운 LID입니다. 눈에 띄는 목이나 트렁크 근긴장 이상증이 없지만 적당한 오른쪽 앞발 긴장 이상, 작은 진폭 RFPD가없는 운동 장애 파킨슨 쥐는 오른쪽 앞발의 빠른 반복적 인 깜박임 운동으로 지적되었습니다. 이 쥐는 또한 왼쪽 앞발을 향한 진공는 것과 관련된 구강 언어 행동을 표시합니다. L-DOPA 복용량 : 12 mg / kg; 비디오는 주사 후 ~ 70 분 동안 녹화되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
애니메이션 비디오 2 : 적당한 트렁크와 목 긴장 이상. 적당한 몸통과 목 근긴장 이상증을 가진 운동이상성 파킨슨 쥐는 앞다리와 뒷다리의 위치의 90° 차이에 의해 예시된다( 도 2C의 다이어그램 참조). 이 쥐는 또한 눈에 띄는 고정 관념의 냄새를 맡고 때로는 깔짚에 진공 물기를 표시합니다. L-DOPA 복용량 : 12 mg / kg; 비디오는 주사 후 ~ 70 분 동안 녹화되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
애니메이션 비디오 3 : 혼합 진폭 RFPD가있는 중등도에서 중증 오른쪽 앞발 긴장 이상증. 경미한 목과 중등도의 트렁크 근긴장 이상증, 중등도에서 심한 오른쪽 앞발 긴장 이상증, 오른쪽 앞발의 더 큰 진폭을 아래로 당기는 것과 혼합 된 입 근처의 작은 닦는 움직임으로 보이는 혼합 진폭 RFPD가있는 운동 이상성 파킨슨 쥐. 이 쥐는 또한 LID 프로파일 이외에 정량화 될 수있는 빈번한 회전 거동을 가지고 있습니다. L-DOPA 복용량 : 12 mg / kg; 비디오는 주사 후 ~ 70 분 동안 녹화되었습니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
애니메이션 비디오 4 : 혀 돌출부가있는 머리 밥과 구두 언어 운동. 심한 몸통과 앞발 근긴장 이상증 (뒷다리 근긴장 이상증이 보이지 않음), 중등도에서 심한 목 긴장 이상증, 혀가 돌출 된 일정한 머리 밥이있는 운동 장애 파킨슨 쥐. 헤드 밥은 PD에서 볼 수있는 4 Hz 떨림과 유사합니다. 그러나, 래트에서, L-DOPA 투여 후 운동장애 파킨슨병 래트에서만 주목된다. 이 쥐는 또한 혼합 진폭 RFPD를 가지고 있는데, 비디오 초기에 더 중요한 진폭 운동과 얼굴 근처의 작은 닦는 것과 같은 움직임으로 보이며, 나중에 볼 수있는 작은 진폭 RFPD의 특징입니다. 비디오 초반에 심한 긴장 이상 / 연장 된 앞다리에서 약간의 움직임이 관찰되었습니다. 그러나 이것은 두경부 떨림 활동과 관련이 있으며 작은 진폭 RFPD로 분류되지 않습니다. 관찰자가 케이지를 강하게 두드리면 이러한 LID 동작은 중단 될 수 없으므로 이것이 놀랄만 한 극복 할 수없는 심각한 LID임을 암시합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : L-DOPA의 양을 계산하기위한 예. 쥐 체중 1cc/kg의 주사 부피에서 12mg L-DOPA/kg 체중을 사용하여 주중 매일 필요한 L-DOPA 및 식염수의 양을 결정하기 위한 계산의 예. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: LID 등급 로그 시트의 예. 이 시트는 등급 세션 동안 LID 강도 및 주파수 점수를 기록하는 데 사용하거나 조정할 수 있습니다. 최종 심각도 점수는 강도(표 1) x 빈도(표 2)의 곱으로 결정된다. 이들 등급 척도는 또한 마우스(30)에서 LID를 정량화하는데 사용될 수 있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 것은 nigrostriatal DA 시스템의 일방적 인 6-OHDA 병변에 이어 파킨슨 쥐 모델에서 LID의 재현 가능한 유도 및 등급에 대한 세부 사항입니다. 설치류가 LID를 개발하지 않았고 회전 비대칭이 쥐 31에서 LID의 아날로그 일 수 있다고 생각되었지만, 쥐와 마우스 모델은 지난 20 년 동안 특징 지어 졌으며 LID 연구 15,32,33,34에 잘 받아 들여지는 도구입니다. 여기에 제시된 프로토콜은 대규모 실험 설계18,19에 특히 유용합니다. 그것은 운동 이상성 행동, 운동 이상과 운동 이상증의 범위의 강도와 빈도를 평가하기위한 세부 사항을 제공합니다. 특히, 이에 상응하는 상세한 메모와 운동 이상증 및 운동 이상증 LID 행동의 점수가 포함 된 이미지 및 비디오는 L-DOPA 투여 후 실험자의 평가를 도울 것입니다. 가능한 모든 AIM의 예가 제공되지는 않지만 경증에서 중등도, 중증까지 다양한 행동이 LID 평가의 프레임 워크로 제공됩니다. 이 프로토콜은 파킨슨 쥐19,35,36,37에서 다양한 치료법을 평가하는 데 도움이되도록 문서화되었습니다. 그것은 주로 처방 된 LID 행동33,38,39의 지속 기간에 초점을 맞춘 다른 출판 된 설치류 등급 척도를 보강합니다. 또한, 요약된 절차는 래트 PD 모델에서의 스코어링 방법을 벤치마크 PD 모델40,41인 비인간 영장류(NHPs)에서 LID를 평가하는 현재의 관행과 정렬시키려고 한다.
파킨슨병 설치류 문헌에서 흔히 발견되는 것은 LID, 또는 (1) 사지 운동장애의 발생 또는 빈도를 배타적으로 조사하는 것을 포함하는 AIM 등급 척도(예를 들어, 병변(33)에 대향하는 앞다리의 리듬 저크, 또는 병변 반구(39)에 의해 조절되는 앞다리의 신속하고 목적없는 움직임); (2) 축방향 운동이상증(예를 들어, 목, 트렁크 및 꼬리(33)에 영향을 미치는 축방향 근육의 비틀림, 또는 병변 반구(39)에 대측성인 목과 몸통의 긴장 이상성 비틀림); 및 (3) 구강언어 운동장애(예를 들어, 혀 돌출부(33)를 갖는 빈 입의 매스틱 운동, 또는 쥐의 입이 비어 있고 임의의 물체와 접촉하지 않을 때 반복적인 매스틱화 또는 혀 돌출부(39)). 이 세 가지 행동 범주에는 관찰 기간 동안의 빈도에 따라 심각도 점수가 부여됩니다. 동물이 행동의 질을 특성화하지 않고 종종 이러한 행동을 나타내는 데 소요 된 시간을 나타내는 심각도 점수는 최종 ALO (축, 사지 및 구술) 점수로 결합됩니다.
대조적으로, 현재의 프로토콜은 글로벌 AIM의 평가뿐만 아니라 독립적 인 신체 부위 (즉, 목, 몸통, 앞다리, 뒷다리 및 입)에서 AIM의 검사를 가능하게하는보다 상세한 척도를 제공하며, 평가되는 AIM의 강도 / 품질, 운동 이상과 운동 행동 이상증의 차별화, 그리고 다른 스케일과 마찬가지로 주어진 AIM의 발생 빈도를 통합합니다. 전반적인 목표는 각 과목에서 표현 된 LID 행동에 대한 포괄적 인 평가를 허용하는 것입니다. 예를 들어, 트렁크 근긴장 이상증의 단일 행동 판독의 경우, 전체 관찰 기간 동안 경미한 트렁크 근긴장 이상증 (즉, 선회 행동을 예측하지 않는 상체와 하부 몸통 사이의 45 ° 차이)을 나타내는 쥐는 심한 줄기 긴장 이상 (즉, 일정한 심한 긴장 이상 / 비틀림, 코르크 스크류와 같은 자세, 180 ° 접근; 머리와 발이 반대 방향으로 접근)을 나타내는 쥐와 매우 다릅니다. 전체 관찰을 위해 ambulate) 할 수 없습니다. 또한, 선조체에서 쥐의 신체의 지형적 표현을 고려할 때, LID의 개별 속성을 구별하는 것은 유익할 수 있다(36).
신중하게 고려해야 할 이 프로토콜의 또 다른 구성 요소는 연장된(예를 들어, 8주) 치료 시간 과정에 걸쳐 L-DOPA 투약을 에스컬레이션하는 실험적 설계이다(그림 1). L-DOPA의 저용량 (예를 들어, 3-6 mg / kg) 만 사용하거나 단기간 (예 : 2-4 주) 동안 선택한 용량을 투여하는 연구는 파킨슨 쥐의 치료 개입으로 LID 개선의 증거를 보여줄 수 있습니다. 그러나 만성 투여 및 용량 확대가 종종 필요한 PD를 가진 개인과의 관련성은 의문의 여지가 있습니다. 전임상 및 임상 조사 사이의 이러한 다양한 치료 프로토콜은 전임상 설치류 연구에서 약속을 보여준 약물로 수행 된 임상 시험에서 볼 수있는 효능 부족의 기초가되도록 제안 될 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 파킨슨 쥐에서 LID를 평가하기위한 포괄적 인 접근법에 대한 지침을 제공하고 LID의 쥐 모델은 임상 LID 3,15,38,42,43의 신뢰할 수있는 모델로 확립되었지만 모든 모델에 고유 한 제한이 있습니다. 동물 모델은 인간 질병의 특정 특성을 모방하고 예를 들어 치료 개입이 일련의 질병 특징에 미칠 수있는 영향에 대한 예측을 내리는 데 유용한 도구입니다. 잠재적 한계로서 일반적으로 논의되는 전임상 LID 모델의 한 가지 특징은 쥐가 LID를 발현하기 위해 상당한 DA 고갈을 필요로 한다는 것이다. 또한, LID가 환자보다 설치류 및 NHP 모델에서 더 빠르게 개발되므로 이러한 모델 특성은 임상 LID를 반영하지 않는다는 것이 종종 인용됩니다. 그러나, 종(즉, 인간, 비인간 영장류 또는 설치류)에 관계없이, LID가 나타나기 위해서는 삼중항 DA 신경과민의 거의 완전한 손실이 일반적으로 필요하다는 것이 종종 과소평가된다. 일단 L-DOPA가 심각한 삼중항 DA 고갈을 가진 피험자에게 투여되면, LID는 1,19,38,44,45,46으로 유도된다. LID의 설치류 모델에 대한 회의론을 조장한 두 번째 특징은 LID의 신경 학적 징후가 영장류 (즉, 인간 및 비 인간)에서 볼 수있는 LID의 물리적 징후와 유사해야한다는 기대에서 비롯됩니다. 실제로, 쥐에서 LID로 분류 된 비정상적인 움직임의 출현은 영장류에서 보이는 것과는 특징이 다릅니다 (예 : 영장류의 무도제 대 설치류의 고정 관념 / 운동 과다증). 이 주제를 포괄적으로 다루는 것은이 기사를 넘어서는 것이지만, 간단히 말해서, 종 간의 징후의 이러한 차이는 인간이 습관적 인 이중 페달, 비 영장류가 빈번한 이중 페달, 설치류43,46이라는 사실에 근거합니다. 따라서, 다양한 종들은 특정 골관절 및 근육 구조에 의해 나타나고 종-특이적 신경 시스템(43)에 의해 조절되는 행동의 특정 레퍼토리를 갖는다. 따라서, 인간 유사 증상의 동물 모델링은 주로 물리적 동일성(43)보다는 기능적 유사성에 대한 기대에 기초해야 한다. 적절한 신중함을 가진 동물 모델로부터의 발견의 해석은 질병 치료에 대한 귀중한 예측을 계속 제공 할 것입니다.
현재 PD, 아만타딘 및 DBS의 외과 적 개입으로 LID를 치료하기위한 FDA 승인 약물이 하나 있지만 효능과 내약성이 최적이지는 않으며 모든 환자가 DBS 수술을받을 자격이있는 것은 아닙니다. Cenci와 동료 (47)에 의해 웅변 적으로 검토 된 바와 같이, PD로 고통받는 개인은 OFF보다 운동 장애가있는 ON (즉, L-DOPA의 모터 이점을 경험)이 될 것이라는 개념이 일부 표현되어 있습니다. 이 저자들은 신랄하게 다음과 같이 말합니다 : "더 깊은 진실은 환자가 운동 장애없이 ON이되는 것을 매우 선호한다는 것입니다. 연구자이자 임상의로서 우리는 그 목표를 현실로 만들기 위해 열망해야합니다. 이를 위해 LID에 대한 번역 연구가 장려되고 지속적으로 추구되어야합니다. " 이 목표를 추구하면서, 우리는 LID의 유도 및 평가 방법을 제시합니다. 우리의 등급 척도는 AIM의 품질 / 심각도와 관련된 다양한 강도 측정을 결합하도록 설계되었으며 운동 장애의 다양한 속성이 표시되는 시간을 나타냅니다. 이 모델의 의도는 강도와 빈도를 모두 고려하면서 LID 심각도를 정확하게 반영하는 수치 값을 결정할 수 있도록하는 것입니다. 또한이 값은 LID 심각도를 체계적으로뿐만 아니라 특정 신체 부위와 관련하여 나타냅니다. 이 모델을 통해 우리는 실험적 치료제가 레보도파로 인한 운동 이상증을 변형시키는 능력에 대해 엄격하게 테스트 할 수 있도록하는 것을 목표로합니다.
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Disclosures
이해 상충은 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
우리는 파킨슨 병을 앓고있는 모든 사람들의 투쟁과 그들이 매일 보여주는 힘과 탄력성, 특히 KSC의 사랑하는 아버지 인 Mark Steece를 인정하고 싶습니다. 여기에 대표 된 연구는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NS090107, NS110398)와 파킨슨 병 재단 국제 연구 보조금 프로그램, 현재 파킨슨 재단의 지원을 받았다. 우리는 또한 Molly VanderWerp가 그녀의 훌륭한 편집 지원에 대해 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Minutes Digital Timer | Staples | 1111764 | |
| Compass CX Compact Scale | Ohaus | 30428202 | |
| 5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide | Cayman Chemicals | 25330 | 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents. |
| Allentown cages | Allentown, LLC | Rat900 | Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides. |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | BD | BD 305540 | For subcutaneous L-DOPA injections |
| Benserazide hydrochloride | Sigma-Aldrich | B7283 | Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD. |
| Glass amber scintillation vials | Thermo Scientific | B7921 | Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline. |
| L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1507 | L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents. |
| Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils | Staples | 107250 | |
| Rodent nutritionally complete enrichment treats | Bio-Serv | F05478 | |
| Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L | Corning | 432129 | |
| Standard Plastic Clipboard | Staples | 1227770 | |
| Steel wired 6' long movable shelving units | Uline | H9488 | Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment |
| Sterile Saline 0.9% | Covidien/Argyle | 1020 | For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections. |
References
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