Summary
В этой статье описываются методы индуцирования и оценки дискинезий, вызванных леводопой, на крысиной модели болезни Паркинсона. Протокол предлагает подробную информацию об интенсивности и частоте диапазона дискинетического поведения, как дистонического, так и гиперкинетического, обеспечивая надежный инструмент для тестирования методов лечения, направленных на эту неудовлетворенную медицинскую потребность.
Abstract
Леводопа (L-DOPA) остается золотым стандартом терапии, используемой для лечения двигательных симптомов болезни Паркинсона (БП). Однако нежелательные непроизвольные движения, известные как L-DOPA-индуцированные дискинезии (LIDs), развиваются при длительном использовании этого предшественника дофамина. По оценкам, заболеваемость LID возрастает примерно до 90% людей с БП в течение 10-15 лет лечения. Понимание механизмов этого заболевания и разработка как новых, так и эффективных методов лечения антидискинезии требует последовательного и точного моделирования для доклинического тестирования терапевтических вмешательств. Здесь представлен подробный метод надежной индукции и всесторонней оценки ЛИД после 6-OHDA-индуцированного нигрального поражения на крысиной модели БП. Надежная оценка LID на крысах обеспечивает мощный инструмент, который может быть легко использован в лабораториях для тестирования новых методов лечения, ориентированных на снижение или устранение этого общего бремени, вызванного лечением, для людей с БП.
Introduction
Хотя прошло более 50 лет с тех пор, как леводопа (L-DOPA) была впервые введена в качестве лечения для людей с БП 1,2, она удивительно остается наиболее эффективной терапией двигательных симптомов паркинсонизма. Клинические двигательные симптомы, связанные с БП, связаны с потерей дофаминовых (DA) нейронов в черной субстанции (SN) pars compacta, что приводит к резкому снижению доступного дофамина в полосатом теле. L-DOPA эффективно восстанавливает стриатальный уровень DA, что приводит к двигательной пользе на ранних стадиях заболевания 3,4. Некстати, при длительном лечении у большинства людей с БП развиваются дискинезии, вызванные L-DOPA (LID), включая хорею, дистонию и атетоз, которые часто значительно влияют на повседневную деятельность 5,6,7.
Хотя существует несколько поведенческих моделей LID у грызунов, различия в моделировании и поведенческой оценке LID поставили под сомнение воспроизводимость результатов между лабораториями, а также надежность этих экспериментальных инструментов для доклинических исследований БП. Разработанный совместно со специалистом по клиническим двигательным расстройствам8, текущий протокол является простым методом индукции и рейтинга LID и подходит для использования в крысиной модели БП с использованием 6-гидроксидотамина (6-OHDA), индуцированного односторонним нигральным поражением 9,10. Шкала оценки LID, представленная здесь, включает оценку как интенсивности, так и частоты дискинетического поведения в различных отдельных частях тела. Также предоставляется соответствующая информация об оптимизации рабочего процесса экспериментов и надлежащем уходе и обращении с паркинсоническими и дискинетическими животными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные, представленные здесь, содержались и обрабатывались в соответствии с институциональными руководящими принципами. Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Мичиганского государственного университета (IACUC) в соответствии с федеральными и государственными правилами.
1. Безмедикаментозное подтверждение статуса поражения 6-OHDA
- Тест на повешение постурального хвоста 11,12,13
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените статус поражения по крайней мере через 1 неделю после индукции поражения 6-OHDA (см. 9,10,35 для получения подробной информации о поражении) у экспериментальных субъектов (например, самца или женщины, взрослых Крыс Sprague Dawley или Fisher 344).- Подвешивайте крысу примерно на 6 см выше своей клетки, крепко держась у основания хвоста, в течение ~5 с.
- Запишите направление искривления тела как + для успешно пораженного животного, скручивание контралатерально к пораженной стороне и - за отсутствие скручивания или скручивания в обе стороны.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Эти тесты являются необязательными, но рекомендуются. Смотрите 14,15,16,17 для дополнительных вариантов / вариаций тестирования без наркотиков.
- Тест перетаскивания с регулировкой шага (адаптирован из16)
ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените статус поражения по крайней мере через 1 неделю после односторонней индукции поражения 6-OHDA у экспериментальных субъектов (например, самцов или самок, взрослых крыс Sprague Dawley или Fisher 344).- Держите крысу за основание ее хвоста, поднимая задние лапы от поверхности на ~6 см; перетащите назад по ровной, гладкой, но не скользкой поверхности, ~75 см, более 5–10 с.
- Наблюдайте и записывайте количество движений постукивания/шага регулировки каждой передней лапы в течение трех повторных тестов.
- Оцените испытуемого как + для успешного одностороннего поражения, когда 0-2 постукивания передней лапы наблюдаются контралатерально к пораженной стороне, вместе с быстрым постукиванием (~ 10 постукиваний) от ипсилатеральной передней лапы к пораженной стороне (например, животные, в одностороннем порядке пораженные с левой стороны, демонстрируют дефицит постукивания (0-2 постукивания) с контралатеральной правой передней лапой).
- И наоборот, оцените умеренное или быстрое постукивание (5–10 постукиваний) от обеих передних лап как - для указания неполного или неизвестного статуса поражения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тревожное животное может показать быстрое постукивание / регулировку шага, даже если оно успешно повреждено. Если это подозревается, поместите крысу обратно в домашнюю клетку и повторно протестируйте ≥30 минут спустя.
2. Подготовка реагентов и расходных материалов
- Определяют L-3,4-дигидроксифенилаланина метиловый эфир гидрохлорид (леводопа или L-ДОФА) и бенсеразида гидрохлорид, дозу периферического ингибитора декарбоксилазы (см. Таблицу материалов), номинальную частоту и экспериментальную временную шкалу, подходящую для исследуемого вопроса 12,18,19,20 (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследуемые вопросы могут быть поставлены для поиска любого количества вопросов, начиная от вопроса о том, может ли конкретная терапия уменьшить существующую LID или предотвратить индукцию LID. Они также могут изучить, зависит ли терапевтическая эффективность от дозы леводопы или экспрессия LID и / или терапевтическая эффективность варьируется в зависимости от пола, вида и возраста субъекта.
Рисунок 1: Пример временной шкалы лечения. Пример временной шкалы эскалации дозы L-DOPA составляет 12 недель в общей продолжительности, при этом 8 недель инъекций L-DOPA начинаются через 3 недели после поражения 6-OHDA и через 4 недели после экспериментального лечения. В этом примере L-DOPA подкожно вводят 5 раз в неделю (с понедельника по пятницу) примерно в одно и то же время каждый день, в течение 2 недель при каждой предписанной дозе L-DOPA (3, 6, 9 и 12 мг / кг). Поведенческие рейтинги LID проводятся в дни 1, 6 и 10 каждого уровня дозировки L-DOPA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Взвешивайте крыс еженедельно, чтобы рассчитать соответствующее количество препарата на основе текущих изменений веса во время исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за повышенной активности у крыс LID+ существует потенциал для потери веса при долгосрочном лечении L-DOPA. Если происходит потеря веса, обеспечьте крыс питательно полными, очень вкусными лакомствами (см. Таблицу материалов) после инъекций L-DOPA. - Рассчитайте количество L-ДОФА и бенсеразида, необходимое для каждой недельной концентрации, взвешивая лиофилизированные аликвоты за каждый день инъекции и храня в комбинации в течение 1–2 недель при -20 °C в стеклянных янтарных флаконах до дня обработки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевая доза составляет 12 мг/кг или 12 мг L-DOPA/1000 г массы тела. Пример расчетов для определения количества L-DOPA и физиологического раствора, необходимых для каждого дня недели с использованием 12 мг L-DOPA/кг массы тела при объеме инъекции 1 куб.см/кг массы крысы приведен в Дополнительном файле 1.
3. Установка комнаты и клетки
- В первый день лечения L-DOPA через 3-4 недели после операции по поражению 6-OHDA переведите крыс в одиночное жилье, включая обогащение, одобренное IACUC.
- Содержание в одном жилье на протяжении всего исследования, чтобы избежать вмешательства сверстников в поведенческие оценки.
- В дни рейтинга LID поместите домашние клетки на стальную проволочную стойку, повернутую под углом примерно 45° для оптимального обзора крысы (рисунок 2A). Переверните идентификационные бирки (рисунок 2B) вверх и удалите бутылки с водой, стойки для еды и все виды обогащения в клетке (рисунок 2C), чтобы избежать вмешательства в поведенческие оценки.
Рисунок 2: Пример клетки, установленной для рейтингов LID крупномасштабных экспериментов на крысах. (A) Несколько клеток могут быть настроены для рейтинга LID с использованием больших металлических стоек, которые позволяют оптимально просматривать каждое животное. Клетки должны быть разделены под углом 45 ° с удостоверениями личности, перевернутыми вверх (B), пищей, бутылками с водой, материалами для гнездования и другим обогащением, чтобы ограничить визуальную неясность крысы и отвлекающие факторы для крысы при изучении дискинетического поведения (C). Металлические стойки должны быть в нескольких футах от любой стены, чтобы позволить оценщику осмотреть крысу в передней или задней части клетки по мере необходимости. Важно маркировать аппараты обогащения (например, дома для отдыха красных крыс) индивидуальными идентификаторами животных, чтобы заменить их в той же клетке, из которой они пришли. Это особенно важно при использовании животных разного пола, чтобы не увеличивать стресс для подопытных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Рейтинг инъекций леводопы и дискинезии
- Подкожные инъекции L-DOPA21,22
- Непосредственно перед ежедневной инъекцией L-DOPA добавляют соответствующий объем стерильного физиологического раствора к предварительно взвешенной лиофилизированной смеси L-DOPA и бенсеразида во флаконе янтаря и хорошо встряхивают в течение 10 с (стадия 2.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой объем инъекции составляет 1 мл/1000 г массы тела (с 12 мг L-DOPA на мл). Объем стерильного физиологического раствора будет зависеть от количества животных в одном исследовании. - Наполните отдельные шприцы (например, 1,0 или 0,5 мл иглой 26 г) требуемым объемом для каждого животного (вес крысы 1 мл /кг) и нанесите на каждый шприц индивидуальную идентификацию животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите наполненные шприцы защищенными от света в стерильных пакетах до момента инъекции. L-DOPA быстро окисляется в присутствии кислорода и света в водной среде 23,24,25,26. - Поднесите первую клетку к инъекционному стенду.
- Извлеките крысу из клетки и поместите ее на поверхность инъекции.
- Осторожно прижмите голову и плечи к поверхности, на которой покоится крыса, ладонью недоминирующей руки.
- Аккуратно нанесите кожу на спину, покрывающую лопатки, большим и указательным пальцами недоминирующей руки, введите объем L-DOPA доминирующей рукой в подкожное пространство между/ниже пальцев, держа иглу как можно параллельнее телу, чтобы избежать внутримышечной инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крыс не анестезируют перед инъекцией. - Утилизируйте каждый использованный отдельный шприц в контейнере ошейника.
- Замените крысу в ее индивидуальную клетку и добавьте питательные лакомства, за исключением дней рейтинга LID, чтобы избежать вмешательства в поведенческие оценки до тех пор, пока рейтинги не будут завершены.
- Установите таймер на 1–2 мин в зависимости от желаемого времени рейтинга и количества крыс в исследовании на рейтинговые дни. Извлеките следующую клетку и введите следующую крысу, когда таймер укажет.
- Повторяйте это, вводя одну крысу каждые 1-2 минуты, пока все крысы не будут введены.
- Непосредственно перед ежедневной инъекцией L-DOPA добавляют соответствующий объем стерильного физиологического раствора к предварительно взвешенной лиофилизированной смеси L-DOPA и бенсеразида во флаконе янтаря и хорошо встряхивают в течение 10 с (стадия 2.3).
- Рейтинг дискинезии, вызванной леводопой, после инъекции
- Оцените интенсивность (таблица 1) и частоту (таблица 2) движений дистонической и гиперкинетической дискинезии в желаемом количестве временных точек, которые должны включать начальное начало поведения LID, пиковое поведение и фазу снижения (см. Дополнительный файл 2 для примера журнала рейтинга LID).
- Для самцов и самок взрослых крыс Sprague Dawley или Fisher 344 и размер выборки N = 40 крыс начинают оценку дискинезии через 20 мин после первой инъекции L-DOPA, а затем с интервалом 50 мин до 220 или 270 мин после инъекции, в зависимости от того, когда поведение LID прекратилось у 90%-100% крыс.
- Если используются 1-минутные интервалы рейтинга, установите таймер на 1 мин. Оцените первую крысу в течение одной минуты. Перейдите к следующей крысе и оцените ее в течение 1 мин. Продолжайте через всех крыс, оценивая с интервалом в 1 мин.
- Расположите таймер рядом с клеткой так, чтобы интенсивность поведения LID (таблица 1) можно было наблюдать при оценке частоты любого заданного поведения (таблица 2) в течение периода рейтинга.
- После того, как оценки для первой точки времени завершены, начните снова с первой крысы в следующий момент времени (например, через 70 минут после инъекции) и продолжайте с желаемым интервалом (например, каждые 50 минут) до тех пор, пока не будут завершены все временные точки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за перекрытия задач по внедрению L-DOPA и рейтингу LID в дни рейтинга необходимы два человека, один для инъекций и один для поведенческих рейтингов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ЛИДы у паркинсонических крыс могут проявляться в виде ряда аномальных непроизвольных движений (ИМ), включая дистоническое, гиперкинетическое и стереотипное поведение. Критерии оценки LID для такого поведения представлены здесь, чтобы включить как интенсивность (таблица 1), так и частоту (таблица 2). Это обеспечивает общую оценку серьезности LID для каждой крысы, которая отражает как качество (интенсивность), так и количество времени, затраченного на вовлечение (частоту) в это поведение в каждой точке оценки. Окончательная оценка серьезности LID рассчитывается путем умножения показателя интенсивности на показатель частоты для каждого поведенческого компонента. Критерии оценки отдельных атрибутов поведения LID приведены здесь в виде письменных описаний (таблица 1–2), а примеры показаны в виде неподвижных изображений с подробными отчетами (рисунок 3) и в виде видеороликов (анимированные видео 1–4). Дополнительная описательная информация об отдельных движениях и подсчете очков приведена в условных обозначениях рисунков.
Всестороннюю оценку влияния любого лечения на улучшение поведения LID с течением времени можно наблюдать с использованием подхода эскалации дозы L-DOPA, 12 недель в общей продолжительности, с 8 неделями инъекций L-DOPA после поражения 6-OHDA (рисунок 1). В этом сценарии L-DOPA дается 5 раз в неделю (понедельник-пятница) в течение 2 недель при каждой предписанной дозе L-DOPA. Поведенческие рейтинги, которые проводятся в дни 1, 6 и 10 каждой дозы L-DOPA, обеспечивают надежный подход к оценке эффективности лечения (рисунок 1). Тем не менее, исследователи могут обнаружить, что измененные временные шкалы и схемы дозирования лучше отвечают на их экспериментальные вопросы. Действительно, доза L-DOPA и бенсеразида, периферического ингибитора декарбоксилазы, может варьироваться в зависимости от опыта исследователя с дозами и / или гипотезами, подлежащими тестированию. Следует отметить, что наиболее распространенные дозы бенсеразида составляют от 10 до 15 мг / кг, что подтверждается отчетом Tayarani-Binazir et al. (2012)20 , показывающим, что оптимальные поведенческие эффекты L-DOPA обнаруживаются с 10 мг / кг бенсеразида, без дополнительной пользы при 15 мг / кг.
Существует несколько способов представления и анализа данных LID при определении того, оказывает ли данное лечение значимое влияние на улучшение этого аберрантного поведения. На рисунке 4А приведен пример данных, представленных в виде пиковой дозы LID на протяжении всей экспериментальной временной шкалы. Пиковая доза LID может быть определена как точка времени, в которой средний балл LID группы является наибольшим. В качестве альтернативы можно сообщить об «абсолютном пике», который является максимальным пиковым показателем LID для животного независимо от того, когда это происходит в течение рейтингового периода. Кроме того, данные рейтинга LID могут быть изучены в течение каждого ежедневного курса рейтингового времени и представлены либо в виде данных экспериментальной группы, либо построены на графике, чтобы показать тяжесть LID отдельного субъекта в каждый момент времени (рисунок 4B)19. Этот последний подход позволяет оценить, могут ли некоторые методы лечения сократить, например, общее количество времени, в течение которого субъект демонстрирует LID, но не обязательно влиять на тяжесть пиковой дозы. Наконец, можно количественно оценить общие показатели серьезности LID за весь сеанс оценки. Для данного субъекта оценка серьезности LID за каждый момент времени суммируется для получения общего балла за этот период оценки. Этот подход эмулирует площадь под кривыми оценками, которые также могут быть рассчитаны.
Важно понимать, что данные оценки LID/AIMs, созданные с использованием рейтинговых шкал для присвоения значений тяжести и/или продолжительности дискинезии (таблицы 1 и 2), являются порядковыми данными. Таким образом, наиболее подходящими статистическими тестами являются непараметрические. Хотя не существует прямого эквивалентного непараметрического теста для двустороннего анализа дисперсии, данные LID могут быть проанализированы с помощью непараметрических альтернатив односторонней ANOVA. В частности, тест Крускала-Уоллиса используется для сравнения между субъектами двух или более независимых групп. Тест Фридмана является непараметрической альтернативой односторонней ANOVA с повторяющимися мерами, используемыми для сравнения внутри субъектов. Оба используются с пост-специальными тестами (например, Данн или Данн-Бонферрони) после значительного теста Крускала-Уоллиса или Фридмана. Для изучения того, существуют ли значимые различия между двумя независимыми группами, тест Манна-Уитни U считается непараметрическим эквивалентом независимого t-теста 28,29.
Рисунок 3: Изображения стоп-кадра, показывающие примеры оценки интенсивности LID у крыс с болезнью Паркинсона. (A) Репрезентативное изображение недискинетической паркинсонической крысы, демонстрирующей часто типичную сгорбленную паркинсоническую позу при отсутствии дистонии или гиперкинезии. (B) Паркинсоническая крыса с общей легкой тяжестью LID, указывающей на легкую и умеренную дистонию передней конечности и отсутствие дистонии шеи, туловища или задней конечности; в сопроводительном видео (Animated Video 1) можно увидеть дискинезию правой передней челюсти (RFPD) и оролингвальные движения. (C) Паркинсоническая крыса с умеренной дистонией шеи и туловища (жирный текст соответствует направленным стрелкам, обозначающим туловище, скрученное под углом 90°). (D) дискинетическая паркинсоническая крыса с легкой шеей и умеренной дистонией туловища, умеренной и тяжелой дистонией правой передней конечности; в сопроводительном видео (Animated Video 3) можно наблюдать смешанную амплитуду RFPD. (E) Паркинсоническая крыса с умеренной и тяжелой шеей и тяжелой дистонией туловища, тяжелой правой задней конечностью и умеренной дистонией правой передней конечности (жирный текст соответствует направленным стрелкам, указывающим, что туловище скручено ~ 180 °; это особенно заметно в примере No 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример данных LID, выполненных в течение 8 недель рейтингов LID с увеличением дозировки L-DOPA. (A) Пиковая доза LID тяжести (80 мин после L-DOPA) по времени и дозам. (B) Ежедневный курс времени (20–170 мин после L-DOPA). Для каждой дозы и дня верхние графики отражают среднее ± SEM; нижние графики показывают ответы отдельных субъектов с течением времени. Статистика была рассчитана с использованием Крускала-Уоллиса с несколькими сравнительными тестами Данна (для тестов между субъектами) и тестов Фридмана с несколькими сравнительными тестами Данна (для тестов внутри субъектов). Сокращения: Контроль (Ctr) (n = 7); Лечение (Tx) (n = 10). Этот рисунок перепечатывается и адаптируется с разрешения Ссылки19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Счёт | Описание | |
| Дистония шеи | 0 | никакой |
| 1 | легкое смещение головы, проводимое в течение заметного времени (>10-20 с); может быть крайним или нормальным | |
| 1.5 | смесь легкой и умеренной дистонии | |
| 2 | головка с более заметным смещением (угол около 90° к телу); головные останки вытянуты в сторону дистонического движения | |
| 2.5 | сочетание умеренной и тяжелой дистонии | |
| 3 | постоянный сильный перекрут мускулатуры шеи (угол >100° между головой и плечами) | |
| Стволовая дистония | 0 | никакой |
| 1 | легкая дистония/скручивание туловища; 45° разница между верхним и нижним туловищем; удерживается в течение заметного времени (≥10-20 с) и не предсказывает вращения | |
| 1.5 | смесь легкой и умеренной дистонии | |
| 2 | умеренная дистония/скручивание туловища; Разница в 90° между верхним и нижним туловищем | |
| 2.5 | сочетание умеренной и тяжелой дистонии | |
| 3 | постоянная тяжелая дистония/скручивание, «штопороподобное» позерство (приближение к 180°; голова и ноги в противоположных направлениях), неспособность амбулировать и может перейти в вращение бочки | |
| Дистония передних конечностей | 0 | никакой |
| 1 | мягкий; аномальное позерство запястья или пальцев; либо сжатый кулак, либо жесткое предплечье, но обычно не оба одновременно | |
| 1.5 | смесь легкой и умеренной дистонии | |
| 2 | Умеренный; сжатый кулак и жесткая передняя конечность без удержания вниз в гиперрасширенном положении | |
| 2.5 | сочетание умеренной и тяжелой дистонии | |
| 3 | Тяжелые; сжатый кулак и жесткое предплечье с гиперэкстензией вниз | |
| Дистония задних конечностей | 0 | никакой |
| 1 | задние конечности слегка держатся в ненормальной позе; сгибание или разгибание. | |
| 1.5 | смесь легкой и умеренной дистонии | |
| 2 | умеренное жесткое разгибание или сгибание задней конечности; без воспроизведения цифр | |
| 2.5 | сочетание умеренной и тяжелой дистонии | |
| 3 | тяжелое жесткое позерство конечности с аномальным гиперэкстензией +/- растягивание пальцев | |
| Дискинезия правой передней лапы (RFPD) | 0 | отсутствующий |
| 1 | небольшие амплитудные движения, простые повторяющиеся из стороны в сторону или вытирание вверх и вниз в области лица или рта; или постукивание по стене клетки или мусору | |
| 1.5 | сочетание малых и больших амплитудных движений; наиболее распространенные | |
| 2 | большая амплитуда повторяющихся движений вверх и вниз, включающих сильное разгибание правой передней конечности, тянет вниз и противоположность шеи | |
| Оролингуал | 0 | никакой |
| 1 | преимущественно закрытый рот, пустое (бесцельное) жевание, скрежетание зубами | |
| 1.5 | пустое жевание, может быть некоторое выпячивание языка, повторное прикусывание подстилки | |
| 2 | заметное повторное выпячивание языка с заметным открытым ртом при жевании | |
| Покачивание головы/тремор | 0 | никакой |
| 1 | присутствует (повторяющееся и ритмичное покачивание головы (около 4 Гц)) | |
| Постоянное жевание подстилки (CCL) | 0 | никакой |
| 1 | присутствует (постоянное жевание мусора; целенаправленное навязчивое кусание или жевание мусора, многократное подбирание, жевание, падение, собирание, жевание, выбрасывание мусора) |
Таблица 1: Критерии оценки LID для интенсивности дистонического или гиперкинетического поведения у крыс с болезнью Паркинсона. Эти критерии оценки предоставляют ряд показателей интенсивности, связанных с качеством / тяжестью аномальных непроизвольных поз и / или движений крысы. Конкретные атрибуты, описанные для поз и поведения, обычно классифицируются как легкие, умеренные или тяжелые, с конкретными дескрипторами, приведенными здесь. Окончательная оценка тяжести определяется как произведение интенсивности x частоты (таблица 2).
| Счёт | Описание |
| 0 | Отсутствующий |
| 1 | Прерывистый, < 50% периода наблюдения |
| 2 | Прерывистый, ≥ 50% периода наблюдения |
| 3 | Стойкий на протяжении всего периода наблюдения и не прерываемый постукиванием по клетке |
Таблица 2: Критерии оценки LID для частоты дистонического или гиперкинетического поведения. Эти критерии обеспечивают количественную меру для скорости, с которой любое данное поведение происходит или повторяется в течение периода наблюдения. Это важно для оценки общей тяжести, учитывая, что нечастое поведение требует менее серьезного балла, чем постоянное. Окончательный показатель тяжести определяется как произведение интенсивности (таблица 1) x частота.
Анимационное видео 1: Мягкая крышка с малой амплитудой RFPD и жеванием левой передней лапы. Дискинетическая паркинсоническая крыса без заметной дистонии шеи или туловища, но умеренная дистония правой передней лапы, малая амплитуда RFPD отмечается как быстрое повторное мерцающее движение правой передней лапы. Эта крыса также демонстрирует оролингвальное поведение, включающее пустое жевание, направленное на левую переднюю лапу. Доза L-ДОФА: 12 мг/кг; видео записано ~70 мин после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Анимационное видео 2: Умеренная дистония туловища и шеи. Дискинетическая паркинсоническая крыса с умеренной дистонией туловища и шеи, примером которой является разница в 90° в положении передних и задних конечностей (см. диаграмму на рисунке 2C). Эта крыса также демонстрирует заметное стереотипное обнюхивание и случайные пустые укусы в помете. Доза L-ДОФА: 12 мг/кг; видео записано ~70 мин после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Анимационное видео 3: От умеренной до тяжелой дистонии правой передней лапы со смешанной амплитудой RFPD. Дискинетическая паркинсоническая крыса с легкой дистонией шеи и умеренного туловища, умеренной и тяжелой дистонией правой передней лапы, смешанной амплитудой RFPD, наблюдаемой как меньшие вытирающие движения возле рта, смешанные с большей амплитудой нисходящего вытягивания правой передней лапы. Эта крыса также имеет частое вращательное поведение, которое может быть количественно определено в дополнение к профилям LID. Доза L-ДОФА: 12 мг/кг; видео записано ~70 мин после инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Анимационное видео 4: Головные бобы и оролингвальные движения с выпячиванием языка. Дискинетическая паркинсоническая крыса с тяжелой дистонией туловища и передней лапы (дистония задних конечностей не видна), умеренной и тяжелой дистонией шеи и постоянным покачиванием головы с продолжающимися выпячиваниями языка. Головной боб напоминает дрожь 4 Гц, наблюдаемую при БП; однако у крыс он отмечается только у детенетических паркинсонических крыс после введения L-DOPA. Эта крыса также имеет смешанную амплитуду RFPD, наблюдаемую как более значительные амплитудные движения в начале видео и небольшие трущие движения возле лица, характерные для малой амплитуды RFPD, замеченной позже. Небольшое движение наблюдалось на сильно дистонической/растянутой передней конечности в начале видео; однако это связано с тремором головы и шеи и не будет классифицироваться как RFPD с малой амплитудой. Когда наблюдатель сильно постукивает по клетке, это поведение LID не прерывается, предполагая, что это тяжелая LID, которую нельзя преодолеть с испугом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный файл 1: Пример расчета суммы L-DOPA. Пример расчетов для определения количества L-DOPA и физиологического раствора, необходимого для каждого дня недели с использованием 12 мг L-DOPA/кг массы тела при объеме инъекции 1 куб.см/кг массы крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: Пример журнала рейтинга LID. Этот лист можно использовать или адаптировать для регистрации баллов интенсивности и частоты LID во время рейтинговых сессий. Окончательный показатель тяжести определяется как произведение интенсивности (таблица 1) x частоты (таблица 2). Эти рейтинговые шкалы также могут быть использованы для количественной оценки LID у мышей30. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлены подробные сведения о воспроизводимой индукции и рейтинге LID в модели крысы-паркинсониста после одностороннего поражения 6-OHDA нигростриатальной системы DA. Хотя когда-то считалось, что у грызунов не развивается LID и что ротационная асимметрия может быть аналогом LID у крыс31, модели крыс и мышей были охарактеризованы за последние два десятилетия и являются хорошо принятым инструментом для исследований LID 15,32,33,34. Протокол, представленный здесь, особенно полезен для крупномасштабных экспериментальных проектов18,19. Он предоставляет подробную информацию для оценки интенсивности и частоты диапазона дискинетического поведения, как дистонического, так и гиперкинетического. Примечательно, что изображения и видео с соответствующими подробными заметками и оценкой дистонического и гиперкинетического поведения LID помогут экспериментатору оценить после введения L-DOPA. Хотя пример всех возможных AIM не приводится, в качестве основы для оценки LID предлагается диапазон поведения, варьирующийся от легкой до умеренной и тяжелой. Этот протокол был задокументирован, чтобы помочь оценить различные методы лечения у крыс паркинсонизма 19,35,36,37. Он дополняет другие опубликованные шкалы оценки грызунов, которые фокусируются в основном на продолжительности предписанного поведения LID 33,38,39. Кроме того, изложенная процедура направлена на согласование методов оценки в модели ПДн крыс с текущей практикой оценки LID у нечеловеческих приматов (NHP), эталонная модель PD40,41.
В литературе о грызунах паркинсонизма обычно встречаются LID или шкалы оценки AIM, которые включают исключительно изучение возникновения или частоты (1) дискинезий конечностей (например, ритмические толчки передней конечности, противоположные поражению33, или быстрое, бесцельное движение передней конечности, контролируемое пораженным полушарием39); (2) осевые дискинезии (например, перекрут осевых мышц, влияющих на шею, туловище и хвост33, или дистоническое скручивание шеи и туловища, противоположное пораженному полушарию39); и (3) оролингвальные дискинезии (например, жевательные движения пустого рта с выпячиванием языка33 или повторяющееся жевание или выпячивание языка, когда рот крысы был пуст и не контактировал с каким-либо объектом39). Этим трем поведенческим категориям присваивается оценка тяжести на основе их частоты в течение периода наблюдения. Оценка тяжести, представляющая количество времени, которое животное потратило на проявление этого поведения, часто без характеристики качества поведения, затем объединяется в окончательный балл ALO (осевой, конечностный и оролинговый).
В отличие от этого, текущий протокол обеспечивает более подробную шкалу, которая позволяет не только оценивать глобальные AIM, но также позволяет исследовать AIM в независимых частях тела (т. Е. Шея, Туловище, Передние конечности, задние конечности и рот), интенсивность / качество оцениваемого AIM, дифференциацию дистонии от гиперкинетического поведения и, как и в случае с другими шкалами, включает частоту возникновения любого заданного AIM. Общая цель состоит в том, чтобы позволить всестороннюю оценку поведения LID, выраженного у каждого субъекта. Например, для единственного поведенческого показания дистонии туловища крыса, проявляющая легкую дистонию туловища (т. Е. Разница в 45 ° между верхней и нижней частью туловища, не предсказывающая поведение поворота) в течение всего периода наблюдения сильно отличается от крысы, проявляющей тяжелую дистонию туловища (т. Е. Постоянная тяжелая дистония / скручивание, штопороподобное позерство, приближающееся к 180 °; голова и ноги в противоположных направлениях, не в состоянии амбулировать) для всего наблюдения. Далее, учитывая топографическое представление тела крысы в полосатом теле, дифференциация отдельных признаков ЛИД может быть информативной36.
Другим компонентом этого протокола, который следует тщательно рассмотреть, является экспериментальный дизайн эскалации дозирования L-DOPA в течение длительного (например, 8-недельного) курса лечения (рисунок 1). Исследование, в котором использовались только низкие дозы L-DOPA (например, 3-6 мг/кг) и/или вводили дозу выбора в течение короткого периода (например, 2-4 недели), может показать признаки улучшения LID при терапевтическом вмешательстве у крыс с паркинсонизмом; однако актуальность этих исследований для лиц с БП, где часто требуется хроническое введение и эскалация дозы, сомнительна. Такие различные протоколы лечения между доклиническими и клиническими исследованиями могут быть предложены для обоснования отсутствия эффективности, наблюдаемой в клинических испытаниях, проведенных с препаратами, которые показали многообещающие результаты в доклинических исследованиях на грызунах.
Хотя протокол, представленный здесь, содержит инструкции по комплексному подходу к оценке LID у крыс с болезнью Паркинсона, а крысиная модель LID была установлена как надежная модель клинического LID 3,15,38,42,43, существуют неотъемлемые ограничения для любой модели. Животные модели — это инструменты, которые полезны для эмуляции конкретных атрибутов заболевания человека и прогнозирования, например, влияния, которое терапевтическое вмешательство может оказать на набор признаков заболевания. Одной из особенностей доклинических моделей LID, обычно обсуждаемых в качестве потенциального ограничения, является то, что крысам требуется значительное истощение DA для экспрессии LID. Кроме того, часто упоминается, что LID развивается быстрее у моделей грызунов и NHP, чем у пациентов, и, таким образом, эти характеристики модели не отражают клинический LID. Тем не менее, часто недооценивается, что независимо от вида (например, человека, нечеловеческого примата или грызуна), для проявления LID обычно требуется почти полная потеря стриатальной иннервации DA. После того, как L-DOPA вводится субъектам с тяжелым истощением полосатого DA, LID индуцируется 1,19,38,44,45,46. Вторая особенность, которая способствовала скептицизму по отношению к грызунным моделям LID, исходит из ожидания, что неврологические признаки LID должны напоминать физические проявления LID, наблюдаемые у приматов (то есть человеческих и нечеловеческих). Действительно, появление аномальных движений, классифицированных как LID у крыс, отличается по признакам от тех, которые наблюдаются у приматов (например, хореоатетоз у приматов против стереотипии / гиперкинезии у грызунов). Хотя эта статья выходит за рамки всестороннего рассмотрения этой темы, вкратце, такие различия в признаках между видами основаны на том факте, что люди являются привычными двуногими, неприматы частыми двуногими, а грызуны четвероногими43,46. Таким образом, различные виды имеют специфические репертуары поведения, проявляющегося специфическими костно-суставными и мышечными структурами и модулированного видоспецифическими нейронными системами43. Соответственно, моделирование человекоподобных симптомов на животных должно основываться в первую очередь на ожидании функционального сходства, а не на физической идентичности43. Интерпретация результатов с животных моделей с должной осмотрительностью предоставляла и будет продолжать предоставлять ценные прогнозы для лечения заболеваний.
Хотя в настоящее время существует один одобренный FDA препарат для лечения LID при БП, амантадин, и хирургическое вмешательство DBS может улучшить LID, эффективность и переносимость не являются оптимальными, и не все пациенты будут иметь право на операцию DBS. Как красноречиво рассмотрено Ченчи и его коллегами47, некоторые высказывают мнение, что люди, страдающие БП, предпочли бы быть ON (т.е. испытывая двигательную пользу L-DOPA) с дискинезиями, чем OFF. Как пронзительно заявляют эти авторы: «Более глубокая правда заключается в том, что пациенты очень предпочли бы быть ON без дискинезии. Как исследователи и клиницисты, мы должны стремиться к тому, чтобы эта цель стала реальностью. С этой целью следует поощрять и настойчиво проводить трансляционные исследования LID». Преследуя эту цель, мы представляем наш метод индукции и рейтинга LID. Наша рейтинговая шкала предназначена для объединения ряда показателей интенсивности, связанных с качеством / серьезностью AIM, и указывает количество времени, в течение которого отображаются различные атрибуты дискинезии. Цель этой модели состоит в том, чтобы позволить определить числовое значение, которое точно отражает серьезность LID, учитывая при этом как интенсивность, так и частоту. Кроме того, это значение указывает на тяжесть LID не только системно, но и в отношении конкретных частей тела. С помощью этой модели мы стремимся к тому, чтобы экспериментальные терапевтические средства могли быть тщательно проверены на их способность модифицировать дискинезии, вызванные леводопой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никаких конфликтов интересов объявлено не было.
Acknowledgments
Мы хотим отметить борьбу всех людей с болезнью Паркинсона, а также силу и стойкость, которые они демонстрируют каждый день, особенно любимого отца KSC, Марка Стиса. Представленная здесь работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NS090107, NS110398) и Международной программой исследовательских грантов Фонда болезни Паркинсона, ныне ФондОм Паркинсона. Мы также хотели бы поблагодарить Молли ВандерВерп за ее отличную редакционную помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 Minutes Digital Timer | Staples | 1111764 | |
| Compass CX Compact Scale | Ohaus | 30428202 | |
| 5-(2-aminoethyl)-1,2,4-benzenetriol, monohydrobromide | Cayman Chemicals | 25330 | 6-OHDA is a catecholaminergic neurotoxin that is used to induce dopaminergic lesions and parkinsonian symptoms in rodents. |
| Allentown cages | Allentown, LLC | Rat900 | Allentown cages provide the ability to view the rats from all sides. |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | BD | BD 305540 | For subcutaneous L-DOPA injections |
| Benserazide hydrochloride | Sigma-Aldrich | B7283 | Benserazide is a peripheral decarboxylase inhibitor used with L-DOPA to to induce dyskinesia in rodent models of PD. |
| Glass amber scintillation vials | Thermo Scientific | B7921 | Used for storage of L-DOPA/benserazide at -20 °C until mixed with sterile saline. |
| L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | D1507 | L-3,4-Dihydroxyphenylalanine methyl ester is a precursor to L-DOPA that crosses the blood-brain barrierand use to treat parkinsonian symptoms in rodents. |
| Paper Mate Sharpwriter Mechanical Pencils | Staples | 107250 | |
| Rodent nutritionally complete enrichment treats | Bio-Serv | F05478 | |
| Round Ice Bucket with Lid, 2.5 L | Corning | 432129 | |
| Standard Plastic Clipboard | Staples | 1227770 | |
| Steel wired 6' long movable shelving units | Uline | H9488 | Width/Height can be adjusted to need/number of rats per experiment |
| Sterile Saline 0.9% | Covidien/Argyle | 1020 | For mixing with L-DOPA/benserazide prior to subcutaneous injections. |
References
- Cotzias, G. C., Papavasiliou, P. S., Gellene, R.
- Yahr, M. D., Duvoisin, R. C., Schear, M. J., Barrett, R. E., Hoehn, M. M.
- Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
- Sellnow, R. C., et al. Regulation of dopamine neurotransmission from serotonergic neurons by ectopic expression of the dopamine D2 autoreceptor blocks levodopa-induced dyskinesia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 8 (2019).
- Bastide, M. F., Bezard, E. L-dopa induced dyskinesia in Parkinson's disease]. Bulletin de l'Académie Nationale de Médecine. 199 (2-3), 201-212 (2015).
- Hauser, R. A., et al. ADS-5102 (Amantadine) extended-release capsules for levodopa-induced dyskinesia in Parkinson's Disease (EASE LID 2 study): Interim results of an open-label safety study. Journal of Parkinson's Disease. 7 (3), 511-522 (2017).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. The pharmacology of L-DOPA-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Pharmacological Reviews. 65 (1), 171-222 (2013).
- Steece-Collier, K., et al. Embryonic mesencephalic grafts increase levodopa-induced forelimb hyperkinesia in parkinsonian rats. Movement Disorders. 18 (12), 1442-1454 (2003).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (60), e3234 (2012).
- Simola, N., Morelli, M., Carta, A. R. The 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neurotoxicity Research. 11 (3-4), 151-167 (2007).
- Borlongan, C. V., Hida, H., Nishino, H. Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport. 9 (16), 3615-3621 (1998).
- Fleming, S. M. Behavioral outcome measures for the assessment of sensorimotor function in animal models of movement disorders. International Review of Neurobiology. 89, 57-65 (2009).
- Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Elevated body swing test: a new behavioral parameter for rats with 6-hydroxydopamine-induced hemiparkinsonism. Journal of Neuroscience. 15 (7), Pt 2 5372-5378 (1995).
- Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease: studies on medial forebrain bundle and striatal lesions. Neuroscience. 88 (2), 617-628 (1999).
- Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
- Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15 (5), Pt 2 3863-3875 (1995).
- Monville, C., Torres, E. M., Dunnett, S. B. Comparison of incremental and accelerating protocols of the rotarod test for the assessment of motor deficits in the 6-OHDA model. Journal of Neuroscience Methods. 158 (2), 219-223 (2006).
- Steece-Collier, K., et al. Striatal Nurr1, but not FosB expression links a levodopa-induced dyskinesia phenotype to genotype in Fisher 344 vs. Lewis hemiparkinsonian rats. Experimental Neurology. 330, 113327 (2020).
- Steece-Collier, K., et al. Genetic silencing of striatal CaV1.3 prevents and ameliorates levodopa dyskinesia. Movement Disorders. 34 (5), 697-707 (2019).
- Tayarani-Binazir, K. A., Jackson, M. J., Strang, I., Jairaj, M., Rose, S., Jenner, P. Benserazide dosing regimen affects the response to L-3,4-dihydroxyphenylalanine in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat. Behavioral Pharmacology. 23 (2), 126-133 (2012).
- Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
- Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. American College of Laboratory Animal Medicine series xvii. , Academic Press/Elsevier. London; Waltham, MA. 1268 (2012).
- Zhou, Y. Z., Alany, R. G., Chuang, V., Wen, J. Studies of the Rate Constant of l-DOPA Oxidation and Decarboxylation by HPLC. Chromatographia. 75, 597-606 (2012).
- Stroomer, A. E., Overmars, H., Abeling, N. G., van Gennip, A. H. Simultaneous determination of acidic 3,4-dihydroxyphenylalanine metabolites and 5-hydroxyindole-3-acetic acid in urine by high-performance liquid chromatography. Clinical Chemistry. 36 (10), 1834-1837 (1990).
- PubChem Compound Summary for CID 6047, Levodopa. , Available from: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Levodopa (2021).
- Merck. The Merck Index 13th edn. , Entry# 5485 (2021).
- Ortner, N. J., et al. Lower affinity of isradipine for L-Type Ca(2+) channels during substantia nigra dopamine neuron-like activity: Implications for neuroprotection in Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 37 (228), 6761-6777 (2017).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 3: Comparing groups: Numerical variables. Indian Journal of Dermatology. 61 (3), 251-260 (2016).
- Mishra, P., Pandey, C. M., Singh, U., Keshri, A., Sabaretnam, M. Selection of appropriate statistical methods for data analysis. Annals of Cardiac Anaesthesia. 22 (3), 297-301 (2019).
- Divito, C. B., et al. Loss of VGLUT3 produces circadian-dependent hyperdopaminergia and ameliorates motor dysfunction and l-Dopa-Mediated dyskinesias in a model of Parkinson's Disease. Journal of Neuroscience. 35 (45), 14983-14999 (2015).
- Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
- Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
- Cenci, M. A., Lee, C. S., Bjorklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
- Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
- Collier, T. J., et al. Interrogating the aged striatum: robust survival of grafted dopamine neurons in aging rats produces inferior behavioral recovery and evidence of impaired integration. Neurobiology of Disease. 77, 191-203 (2015).
- Maries, E., et al. Focal not widespread grafts induce novel dyskinetic behavior in parkinsonian rats. Neurobiology of Disease. 21 (1), 165-180 (2006).
- Mercado, N. M., et al. The BDNF Val66Met polymorphism (rs6265) enhances dopamine neuron graft efficacy and side-effect liability in rs6265 knock-in rats. Neurobiology of Disease. 148, 105175 (2021).
- Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders. 33 (6), 889-899 (2018).
- Lindenbach, D. Behavioral and cellular modulation of L-DOPA-induced dyskinesia by beta-adrenoceptor blockade in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 337 (3), 755-765 (2011).
- Petzinger, G. M. Reliability and validity of a new global dyskinesia rating scale in the MPTP-lesioned non-human primate. Movement Disorders. 16 (2), 202-207 (2001).
- Fox, S. H., Johnston, T. H., Li, Q., Brotchie, J., Bezard, E. A critique of available scales and presentation of the Non-Human Primate Dyskinesia Rating Scale. Movement Disorders. 27 (11), 1373-1378 (2012).
- Cenci, M. A., Ohlin, K. E. Rodent models of treatment-induced motor complications in Parkinson's disease. Parkinsonism & Related Disorders. 15, Suppl 4 13-17 (2009).
- Cenci, M. A., Whishaw, I. Q., Schallert, T. Animal models of neurological deficits: how relevant is the rat. Nature Reviews: Neuroscience. 3 (7), 574-579 (2002).
- Zhang, Y., et al. Aberrant restoration of spines and their synapses in L-DOPA-induced dyskinesia: involvement of corticostriatal but not thalamostriatal synapses. Journal of Neuroscience. 33 (28), 11655-11667 (2013).
- Konradi, C., et al. Transcriptome analysis in a rat model of L-DOPA-induced dyskinesia. Neurobiology of Disease. 17 (2), 219-236 (2004).
- Morin, N., Jourdain, V. A., Di Paolo, T. Modeling dyskinesia in animal models of Parkinson disease. Experimental Neurology. 256, 105-116 (2014).
- Cenci, M. A., Riggare, S., Pahwa, R., Eidelberg, D., Hauser, R. A.
