Summary
Cet article méthodologique présente un protocole de mesure quantitative assisté par logiciel pour quantifier l’épaisseur osseuse sous-chondrale histologique dans les articulations du genou arthrosiques murines et les articulations normales du genou comme témoins. Ce protocole est très sensible à l’épaississement subtil et convient à la détection précoce des changements osseux sous-chondriques ostéoarthritiques.
Abstract
L’épaississement des os sous-chondraux et la sclérose sont les principales caractéristiques de l’arthrose (OA), à la fois chez les modèles animaux et chez l’homme. Actuellement, la gravité de l’épaississement histologique de l’os sous-chondral est principalement déterminée par des systèmes de classement semi-quantitatifs basés sur l’estimation visuelle. Cet article présente un protocole reproductible et facile à exécuter pour mesurer quantitativement l’épaisseur osseuse sous-chondrale dans un modèle murin d’arthrose du genou induite par la déstabilisation du ménisque médian (DMM). Ce protocole a utilisé le logiciel ImageJ pour quantifier l’épaisseur osseuse sous-chondrale sur des images histologiques après avoir défini une région d’intérêt dans le condyle fémoral médian et le plateau tibial médical où l’épaississement osseux sous-chondral se produit généralement dans l’arthrose du genou induite par la DMM. Des images histologiques des articulations du genou avec une procédure simulée ont été utilisées comme témoins. L’analyse statistique a indiqué que le nouveau système de mesure quantitative de l’os sous-chondral était hautement reproductible avec de faibles variabilités intra- et inter-observateurs. Les résultats suggèrent que le nouveau protocole est plus sensible à l’épaississement osseux sous-chondral subtil ou léger que les systèmes de classement visuel largement utilisés. Ce protocole est adapté pour détecter les changements osseux sous-chondrals ostéoarthritiques précoces et progressifs et pour évaluer l’efficacité in vivo des traitements de l’arthrose de concert avec le classement du cartilage de l’arthrose.
Introduction
L’arthrose (OA), caractérisée radiographiquement par un rétrécissement de l’espace articulaire dû à la perte de cartilage articulaire, d’ostéophytes et de sclérose osseuse sous-chondrale (SCB), est la forme la plus courante d’arthrite1,2. Bien que le rôle de l’os péri-articulaire dans l’étiologie de l’arthrose ne soit pas entièrement compris, la formation d’ostéophytes et la sclérose en SCB sont généralement considérées comme les résultats du processus de la maladie plutôt que des facteurs causaux, mais les changements dans l’architecture/la forme et la biologie des os péri-articulaires peuvent contribuer au développement et à la progression de l’ARTH3,4 . Le développement d’un système de classement de l’arthrose précis et facile à exécuter, y compris la mesure de l’ARTH, est essentiel pour les études comparatives entre laboratoires de recherche et pour évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques conçus pour prévenir ou atténuer la progression de l’arthrose.
SCB est construit avec une fine plaque osseuse en forme de dôme et une couche sous-jacente d’os trabéculaire. La plaque SCB est la lamelle corticale, située parallèlement et immédiatement sous le cartilage calcifié. De petites branches des vaisseaux artériels et veineux, ainsi que des nerfs, pénètrent par les canaux de la plaque SCB, communiquant entre le cartilage calcifié et l’os trabéculaire. L’os trabéculaire sous-chondral contient des vaisseaux sanguins, des nerfs sensoriels, de la moelle osseuse et est plus poreux et métaboliquement actif que la plaque SCB. Par conséquent, le SCB exerce des fonctions d’absorption et de soutien des chocs et est également important pour l’apport en nutriments du cartilage et le métabolisme dans les articulations normales5,6,7,8.
L’épaississement du SCB (en histologie) et la sclérose (en radiographie) sont les principales caractéristiques de l’arthrose et des domaines de recherche clés de la physiopathologie de l’arthrose. La mesure de l’épaississement du SCB est un élément important des évaluations histologiques de la gravité de l’arthrose. La microradiographie numérique précédemment rapportée pour mesurer la densité minérale SCB des rongeurs9 ainsi que la mesure quantitative SCB basée sur la micro-tomodensitométrie (micro-CT) dans les modèles de rongeurs d’OA10,11,12,13 ont amélioré notre compréhension de la structure SCB et du rôle des changements SCB dans la physiopathologie de l’ARTH. La surface et l’épaisseur du SCB ont également été quantifiées à l’aide de lames histologiques à l’aide d’un système informatique sophistiqué doté d’un logiciel d’histomorphométrie osseuse spécifique et coûteux14. Néanmoins, les systèmes de classement semi-quantitatif de l’arthrose basés sur l’estimation visuelle, y compris le classement d’épaississement SCB, sont plus largement utilisés que la micro-tomodensitométrie à l’heure actuelle parce que les systèmes de classement sont faciles à utiliser, en particulier pour le criblage de nombreuses images histologiques. Cependant, la plupart des systèmes existants de classement de l’arthrose se concentrent principalement sur les changements du cartilage15,16,17. Une méthode de gradation de l’épaisseur SCB ostéoarthritique largement utilisée qui catégorise l’épaississement SCB comme léger, modéré et sévère est largement subjective, et sa fiabilité n’a pas été entièrement validée15. Un protocole de mesure d’épaisseur SCB ostéoarthritique fiable et facile à exécuter étape par étape n’est pas entièrement développé ou non normalisé.
Cette étude visait à développer un protocole reproductible, sensible et facile à exécuter pour mesurer quantitativement l’épaisseur du SCB dans un modèle murin d’arthrose. Nos tests de mesure rigoureux et nos analyses statistiques ont démontré que ce protocole de mesure quantitative assisté par logiciel ImageJ pouvait quantifier l’épaisseur du SCB dans les articulations normales et arthrosiques du genou. Le protocole nouvellement développé est reproductible et plus sensible aux changements légers de SCB que les systèmes de notation visuelle largement utilisés. Il peut être utilisé pour détecter les changements précoces de SCB ostéoarthritique et pour évaluer l’efficacité in vivo des traitements de l’arthrose de concert avec le classement du cartilage de l’arthrose.
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Protocol
Toutes les procédures animales incluses dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Centre médical de l’Université du Kansas, conformément à toutes les lois et réglementations fédérales et étatiques.
1. Création d’arthrose du genou chez la souris
- Créer un modèle murin d’arthrose du genou par déstabilisation chirurgicale du ménisque médian (DMM) tel que décrit par Glasson et al.18 chez 22 souris BALB/c de type sauvage à l’âge de 10 à 11 semaines. Effectuez une chirurgie simulée comme procédure de contrôle sur huit souris ayant le même arrière-plan et le même âge.
NOTE: Les deux sexes ont été utilisés pour le projet initial afin de répondre à l’exigence des NIH pour la prise en compte du sexe en tant que variable biologique, bien que l’examen de la différence entre les sexes ne soit pas la portée de ce protocole. - Anesthésier les animaux par inhalation d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant leur fréquence respiratoire / effort et leur manque de réponse au pincement de l’orteil / de la queue. Mettez les animaux en position couchée.
- Raser la peau dans la région du genou et nettoyer la peau avec Povidone-Iode + gommage cutané à l’alcool; trois cycles alternés.
- Effectuez la procédure DMM sur le genou droit sous un microscope chirurgical. Exposez l’articulation du genou à travers une incision parapatellaire médiale (1,2-1,5 cm de longueur) et incisez la capsule articulaire. Gardez la rotule et le tendon rotulien intacts. Après une exposition minutieuse du ligament méniscoptibial médian (LMM) qui ancre le ménisque médian au plateau tibial, transectez-le avec des ciseaux micro-chirurgicaux pour déstabiliser le ménisque médial.
- Effectuez une chirurgie simulée sur le genou droit comme procédure de contrôle, dans laquelle la LMM a été visualisée mais non transectée.
- Fermez la capsule articulaire avec 8-0 sutures de polyglactine résorbables et incision cutanée avec sutures non résorbables 7-0 pour les procédures DMM et sham afin d’assurer une utilisation correcte du genou une fois la guérison effectuée.
- Injecter la BUprénorphine SR (0,20-0,5 mg / kg) par voie sous-cutanée (SC) immédiatement avant l’intervention chirurgicale pour l’analgésie, ce qui soulage la douleur jusqu’à 72 h après une seule injection. Surveiller les animaux opérés après la chirurgie.
- Euthanasier les animaux à l’aide d’une chambre à CO2 2, 8 et 16 semaines après la chirurgie. Après l’inconscience, confirmez la mort des animaux par une méthode physique (ouverture de la cavité thoracique). Ces méthodes d’euthanasie sont conformes aux recommandations du groupe scientifique sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association (AVMA).
- Récoltez les articulations du genou pour des analyses histologiques à 2, 8 et 16 semaines après la chirurgie DMM et à 2 et 16 semaines après la chirurgie Sham pour obtenir des articulations du genou de souris avec différents degrés de gravité OA ou d’épaississement SCB.
2. Préparation de coupes tissulaires et d’images histologiques
- Fixez des échantillons de tissu articulaire du genou de souris dans du paraformaldéhyde à 2%, décalcifiez-les dans de l’acide formique à 25%, incorporez-les dans de la paraffine et coupez coronalement pour examiner les compartiments médial et latéral.
- Coupez des échantillons de genou du côté postérieur du genou à l’aide d’un microtome et prélevez des coupes de tissu de 5 μm d’épaisseur à des intervalles de 70 à 80 μm pour obtenir environ 40 lames de tissu sur l’ensemble de l’articulation du genou. Une estimation assistée par micromètre suggère que les numéros de diapositive 1 à 6 proviennent de l’extrême postérieur, 11 à 18 du milieu postérieur, 23 à 30 du milieu antérieur et 35 à 40 de la partie postérieure de l’articulation du genou. Jetez ou collectez les sections intermédiaires pour détecter d’autres taches.
- Effectuez des taches safranin-O et des taches vertes rapides selon les instructions du fabricant pour identifier spécifiquement les cellules et les matrices cartilagineuses sur cinq lames. Effectuer la coloration de l’hématoxyline-éosine conformément aux instructions du fabricant pour examiner les articulations du genou aux niveaux cellulaire et tissulaire comme décrit précédemment19,20,21,22.
- Acquérir des images histologiques avec un microscope équipé d’un appareil photo numérique. L’analyse histopathologique générale et le classement histologique de l’arthrose ont été effectués comme décrit précédemment15,19,20,21,22.
3. Mesure quantitative de l’os sous-chondral ostéoarthritique avec le logiciel ImageJ
- Téléchargez le logiciel ImageJ et ouvrez les images histologiques d’intérêt.
- Téléchargez l’ImageJ fourni avec Java 1.8.0_172 à partir de https://imagej.nih.gov/ij/.
- Ouvrez le programme ImageJ. Cliquez sur l’onglet Fichier du ruban et cliquez sur l’option Ouvrir pour ouvrir l’image histologique.
- Recherchez l’adresse du répertoire de fichiers, sélectionnez le fichier image, puis cliquez sur Ouvrir.
- Calibrer ImageJ avec le micromètre sur les images histologiques.
- Utilisez l’outil En ligne droite pour esquisser une unité de longueur sur le micromètre et cliquez sur Analyser > (puis) Définir l’échelle. Définissez la distance connue et le rapport L/H en pixels sur 1, puis cliquez sur OK. ImageJ peut convertir la longueur du pixel en longueur unitaire sur le micromètre.
- Définissez le facteur mesuré sur la surface. Cliquez sur Analyser > Définir la mesure et cochez la case Zone et Limite au seuil sous la nouvelle fenêtre. Cette étape permet à ImageJ de mesurer le paramètre « Area » dans le « Threshold » sélectionné.
- Mesurer la zone d’intérêt de l’os sous-chondral total (SCB).
- Définissez la région d’intérêt (ROI) SCB comme indiqué dans les cases orange de la figure 1A, qui couvre la plaque corticale SCB et une partie de l’os trabéculaire sous-jacent adjacente à la plaque corticale dans le condyle fémoral médian (MFC) et le plateau tibial médian (MTP) avec des dimensions spécifiques pour chaque retour sur investissement. L’épaississement ostéoarthritique du SCB se produit généralement dans ces zones. Définissez le roi SCB avec la même forme et la même dimension dans chaque MFC ou MTP pour toutes les articulations examinées afin de s’assurer que la même taille du retour sur investissement spécifique a été mesurée pour tous les animaux.
- Esquissez le contour de la zone d’intérêt totale du SCB à l’aide de l’outil de sélection Polygone sous la fenêtre principale d’ImageJ.
REMARQUE: Les outils de sélection donnent au système un seuil pour limiter la zone mesurée. - Mesurer la surface totale du SCB : une fois le seuil sélectionné, cliquez sur Analyser > Mesure. Une fenêtre « Résultats » avec mesure de surface s’ouvrira.
- Mesurez la zone de la substance osseuse contenant de l’os solide sans moelle osseuse.
- Cliquez sur Modifier > Effacer à l’extérieur pour exclure la zone en dehors de la zone SCB totale.
REMARQUE: Seule la zone SCB totale est visible après avoir cliqué sur l’option Effacer l’extérieur . L’image à l’extérieur de la zone totale du SCB deviendra noire. Cette étape permet aux observateurs de se concentrer sur la zone de la substance osseuse dans la zone d’intérêt. - Cliquez sur Image > Ajuster > seuil de couleur pour ouvrir la fenêtre « Couleur de seuil ». Cliquez sur Original en bas de la fenêtre « Couleur de seuil » pour restaurer l’image à l’état d’origine. Utilisez les outils de sélection de l’étape 3.3.2 pour dessiner une petite boîte dans la région de la substance osseuse. Cliquez sur l’option Échantillon en bas de la fenêtre « Couleur du seuil » pour définir la zone de la substance osseuse.
REMARQUE: L’option « Échantillon » dans la fenêtre « Couleur de seuil » permet à ImageJ de sélectionner tous les mêmes pixels sur la zone totale SCB que la zone d’échantillon de substance osseuse. La zone de substance osseuse sélectionnée deviendra rouge. - Cliquez sur Sélectionner en bas de la fenêtre de balance des couleurs du seuil pour créer un seuil de mesure de surface. Cliquez sur Analyser > mesure dans le menu principal d’ImageJ, et le résultat de la mesure de la zone de la substance osseuse s’affichera dans la fenêtre « Résultats ».
- Enregistrez les données de la zone totale de SCB et de la zone de substance osseuse.
- Cliquez sur Modifier > Effacer à l’extérieur pour exclure la zone en dehors de la zone SCB totale.
- Calculer le rapport entre la surface de la substance osseuse (mm2) et la surface totale du SCB (mm2) d’intérêt, qui représente l’épaisseur de la substance osseuse (mm2/1,0 mm2) dans la surface totale du SCB.
- Mesurer l’épaisseur SCB des sections/images histologiques (telles que décrites aux étapes 3.1 à 3.5) des zones extrêmement postérieures, mi-postérieures, mi-antérieures et antérieures (comme décrit à l’étape 2.2) de l’arthrose induite par le DMM pour évaluer l’épaisseur SCB spécifique à la zone de 6 articulations du genou (Figure 1B).
REMARQUE: Cela peut valider la fiabilité de ce protocole de mesure quantitative car on sait que les changements ostéoarthritiques SCB co-localisent avec les lésions cartilagineuses et que les lésions du cartilage arthrosique avec épaississement SCB sont plus graves dans les zones de poids (partie médiane) des articulations du genou des rongeurs14,15. Par conséquent, il convient d’utiliser des sections médianes pour la mesure quantitative de l’épaississement ostéoarthritique du SCB.
4. Statistiques
- Effectuer des analyses statistiques à l’aide de données de mesure quantitative et de calibrage visuel de l’épaisseur SCB. Déterminer la variabilité et la reproductibilité entre et intra-observateurs par les analyses de coefficient de corrélation de Pearson.
- Déterminez l’importance des différences entre les groupes d’étude à l’aide des tests t de Student ou de l’ANOVA unidirectionnelle, suivis d’un test post-hoc (Tukey) à l’aide d’un tableur. Considérez qu’une valeur de p inférieure à 0,05 est statistiquement significative.
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Representative Results
Comparaison de reproductibilité entre l’étalonnage d’estimation visuelle et la mesure quantitative assistée par ImageJ :
L’épaisseur du SCB dans 48 régions d’intérêt (ROI) (24 MFC et 24 MTP), définie à partir d’une section médiane de chaque genou à partir de 24 genoux / animaux, a été notée par trois individus indépendants en utilisant le schéma de notation visuelle 0-3 existant tel que décrit dans la littérature15,23, où 0 = normal (pas d’épaississement SCB), 1 = léger, 2 = modéré et 3 = épaississement SCB sévère. Ces images ont été sélectionnées à partir de trois points de temps postopératoires différents à 2, 8 et 16 semaines après la procédure DMM ou simulacre. Habituellement, les souris avec la procédure DMM ont montré un score visuel d’épaississement SCB 0 à 2 semaines après l’opération, des scores 1-2 à 8 semaines et des scores 2-3 à 16 semaines. L’épaisseur SCB de ces images histologiques a ensuite été mesurée quantitativement par trois autres observateurs indépendants à l’aide du logiciel ImageJ pour valider la reproductibilité et la sensibilité du nouveau schéma. Des images histologiques représentatives avec ou sans retour sur investissement décrit dans MFC et MTP pour l’étalonnage visuel ou les mesures quantitatives sont présentées à la figure 2, dans laquelle les images examinées ont été divisées en trois groupes: genou factice (score visuel 0), genou DMM (score visuel 0) et genou DMM (score visuel 1-3).
Des analyses comparatives détaillées de la reproductibilité entre la mesure quantitative assistée par ImageJ et l’estimation visuelle de l’épaisseur SCB sont présentées dans le tableau 1. Les tests de coefficient de corrélation suggèrent que la mesure quantitative était relativement plus reproductible que le système de notation de l’estimation visuelle.
Reproductibilité inter- et intra-observateurs :
Les tests de coefficient de corrélation ont démontré une reproductibilité élevée des mesures assistées par ImageJ avec des coefficients de corrélation inter-observateurs de >0,93 entre les observateurs A, B et C pour la moyenne des première et deuxième mesures dans les régions MTP et MFC (Figure 3). L’analyse de la variabilité intra-observateur du même ensemble d’images histologiques a également montré une reproductibilité élevée entre les scores de mesure du premier et du deuxième pour chacun des trois observateurs avec un coefficient de corrélation intra-observateur de >0,95 pour tous les observateurs (Figure 4).
Sensibilité:
Pour évaluer si le nouveau système de mesure quantitative du SCB est plus sensible aux changements d’épaississement du SCB ostéoarthritique que le système de classement visuel largement utilisé, 48 zones d’intérêt des images histologiques (24 MFC et 24 MTP) de 24 genoux / animaux ont d’abord été évaluées par trois personnes indépendantes expérimentées dans l’histopathologie de l’arthrose et les systèmes existants de classement de l’arthrose. L’épaississement SCB a été gradué à l’aide d’un schéma de notation visuelle de 0 à 3 comme décrit ci-dessus. La mesure quantitative assistée par ImageJ a ensuite été effectuée sur le même ensemble d’images histologiques visuellement graduées par trois autres personnes qui ont été aveuglées par les résultats de la notation visuelle de l’arthrose. L’épaisseur SCB du MFC et du MTP de chaque image a été mesurée quantitativement avec ImageJ comme décrit dans la section Protocole. Les résultats ont démontré que l’épaisseur moyenne du SCB (mm2/1,0 mm2) des images DMM avec des scores d’épaississement visuels SCB de 1 à 3 était significativement plus élevée que celle des images Sham avec un score d’épaississement visuel « 0 ». Plus important encore, l’épaisseur SCB moyenne des images DMM avec un score d’épaississement visuel SCB « 0 » était également significativement plus élevée que celle des images Sham avec un score visuel « 0 » (Figure 5). Les données suggèrent fortement que la mesure quantitative du SCB assistée par ImageJ est plus sensible aux changements d’épaississement précoces et légers du SCB que la méthode de classement visuel.
Figure 1 : Images histologiques avec Safranin-O et coloration verte rapide des groupes Sham et DMM pour la mesure quantitative SCB assistée par ImageJ. (A) Les cases soulignées d’une ligne jaune pointillée définissent la région d’intérêt (ROI) SCB. La zone de substance osseuse à l’intérieur des boîtes est surlignée en orange. L’épaisseur SCB dans le condyle fémoral médian (MFC) et le plateau tibial médian (MTP) peut être quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ. Les dimensions exactes du roi en MFC et MTP sont agrandies pour améliorer la visibilité. (B) L’épaisseur SCB des images histologiques des zones postérieures, mi-postérieures, mi-antérieures et lointaines antérieures du MTP à 16 semaines après le DMM a été quantifiée pour évaluer l’épaisseur du SCB spécifique à la zone. N = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images histologiques représentatives avec Safranin-O et coloration verte rapide des groupes Sham et DMM pour le classement visuel SCB et la mesure quantitative SCB. Panneaux supérieurs : Photomicrographies de groupes Sham et DMM pour l’étalonnage visuel SCB. Panneaux inférieurs : Photomicrographies des groupes Sham et DMM pour la mesure quantitative SCB assistée par ImageJ. Les cases soulignées d’une ligne jaune pointillée (réalisée avec Adobe Illustrator) dans MFC et MTP définissent la région d’intérêt SCB. La zone de la substance osseuse (à l’exclusion de la moelle osseuse) à l’intérieur des boîtes est surlignée en orange. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Essais de variation inter-observateurs. Les analyses de coefficient de corrélation indiquent une reproductibilité élevée entre trois observateurs (observateurs A, B et C) pour l’épaisseur SCB moyennée à partir des 1ère et 2ème mesures dans les régions d’intérêt MTP et MFC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Essais de variation intra-observateurs. Les analyses de coefficient de corrélation indiquent une reproductibilité élevée entre les mesures d’épaisseur 1ère et 2ème SCB dans les régions MTP et MFC d’intérêt pour chacun des observateurs A, B et C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Analyses comparatives de sensibilité du calibrage visuel et mesure quantitative assistée par ImageJ de l’épaisseur du SCB dans le MFC et le MTP. Les images histologiques pour l’évaluation de l’estimation visuelle ont été divisées en trois groupes (Sham avec un score d’épaississement SCB « 0 », DMM avec un score d’épaississement SCB « 0 » et DMM avec un score d’épaississement SCB 1-3). Remarque : Les valeurs quantitatives d’épaisseur SCB des trois observateurs pour les images DMM avec un score d’épaississement visuel SCB « 0 » étaient significativement plus élevées que celles des images Sham avec un score visuel « 0 », ce qui indique que la mesure quantitative est plus sensible que l’étalonnage visuel à un épaississement SCB léger. N = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Méthode | Observateur/marqueur | MTP | Le |
| Coefficient de corrélation inter-observateurs (r) | |||
| Mesure quantitative | A vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A vs.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B c. C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Étalonnage visuel | D contre E | 0.6455 | 0.6031 |
| D contre F | 0.6 | 0.7419 | |
| E contre F | 0.6454 | 0.603 | |
| Coefficient de corrélation intra-observateur (r) | |||
| Mesure quantitative | Un | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Étalonnage visuel | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tableau 1 : Comparaison de reproductibilité entre la mesure quantitative assistée par logiciel et le classement d’estimation visuelle pour l’épaisseur SCB.
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Discussion
La mesure de l’épaississement du SCB est un élément important des évaluations histologiques de la gravité de l’arthrose. La plupart des systèmes existants de classement de l’arthrose se concentrent principalement sur les changements du cartilage15,16,17. Une méthode de gradation de l’épaisseur SCB ostéoarthritique murine largement utilisée qui catégorise l’épaississement SCB comme léger, modéré et sévère est largement subjective, et sa fiabilité n’a pas été entièrement validée15. La présente étude a développé et validé un nouveau protocole de mesure pour quantifier l’épaisseur du SCB, qui comprend les étapes suivantes: création de l’arthrose du genou chez la souris, préparation de coupes tissulaires et d’images histologiques, mesure quantitative de l’os sous-chondral arthrosique avec le logiciel ImageJ et analyse statistique pour valider la sensibilité et la reproductibilité du protocole.
Bien que les techniques générales de ce protocole suivent les instructions du logiciel ImageJ, nous avons inclus des détails techniques étape par étape pour rendre les nouveaux utilisateurs plus faciles à suivre et valider la reproductibilité. Le programme BoneJ, un plug-in du logiciel ImageJ, fonctionne bien pour mesurer des images 2D en noir et blanc, mais ne fonctionne pas bien pour exclure la zone de la moelle osseuse de la zone totale de SCB en raison de la similitude de l’ombre entre la moelle osseuse et la substance SCB en noir et blanc. En revanche, les méthodes par étapes décrites dans le protocole actuel peuvent être appliquées à toutes les images histologiques en couleur en utilisant la fonction de seuil de couleur pour séparer automatiquement la substance SCB de la moelle osseuse, mesurant ainsi l’épaisseur nette du SCB. Une nouvelle méthode (qui ne fait pas partie d’ImageJ) pour calculer la densité SCB (surface nette SCB mm2/1,0 mm2 de RETOUR SUR INVESTISSEMENT) est incluse dans le protocole actuel.
Le protocole présenté dans cet article présente plusieurs avantages. Tout d’abord, ImageJ est un système de logiciel libre et est facilement disponible sur le site Web des NIH. Deuxièmement, le nouveau système est facile à apprendre et à appliquer; la mesure quantitative ne prend que 5-6 min par SCB ROI. Troisièmement, les résultats du nouveau système sont hautement reproductibles avec de très faibles variabilités inter- et intra-observateurs. Enfin, le nouveau système est plus sensible aux légers changements d’épaississement SCB que les systèmes de classement visuel existants.
Une limitation mineure du nouveau système est la nécessité d’images de contrôle comme calibrateurs pour l’analyse statistique. Cependant, cela ne devrait pas être un problème pour la plupart des projets d’accès ouvert, car les images de contrôle sont presque toujours incluses pour l’analyse des données. Une autre limitation potentielle est que le logiciel ImageJ peut séparer les substances SCB de la moelle osseuse en fonction de leurs pixels de couleur, qui repose sur des méthodes de coloration appropriées pour montrer des couleurs distinctes pour la substance osseuse et la moelle osseuse.
Le nouveau système de mesure quantitative SCB est adapté à la quantification de l’épaisseur SCB à tous les niveaux. Pour les images histologiques avec un épaississement SCB remarquable, le nouveau système peut quantifier avec précision la zone exacte de la substance osseuse, puis la convertir en densité osseuse (SCB net mm2 / 1,0 mm2 de retour sur investissement) représentant l’épaisseur osseuse par unité de surface. Pour les images histologiques avec un épaississement SCB non remarquable qui ne peut pas être détecté par étalonnage visuel, le nouveau système peut identifier un épaississement subtil ou léger qui se produit souvent à une phase précoce de l’arthrose. Par conséquent, le nouveau système peut être utilisé pour surveiller la progression de l’arthrose et l’efficacité in vivo des thérapies contre l’arthrose de concert avec le classement du cartilage de l’arthrose. De plus, ce protocole pourrait également être utilisé pour mesurer l’épaisseur du SCB chez d’autres espèces après ajustement de la taille du retour sur investissement du SCB.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de bourse R01 AR059088, le ministère de la Défense (DoD) sous le numéro de bourse de recherche W81XWH-12-1-0304 et le Mary and Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
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