Summary
Denna metodartikel presenterar en programvara-assisterad kvantitativa mätning protokoll för att kvantifiera histologic subchondral ben tjocklek i murine osteoarthritic knä leder och normala knä leder som kontroller. Detta protokoll är mycket känsligt för subtila förtjockning och är lämpligt för att upptäcka tidiga osteoarthritic subchondral ben förändringar.
Abstract
Subchondral benförtjockning och skleros är de viktigaste kännetecknen för artros (OA), både i djurmodeller och hos människor. För närvarande bestäms svårighetsgraden av histologic subchondral ben förtjockning mestadels av visuell uppskattning baserade semi-kvantitativa graderingssystem. Denna artikel presenterar ett reproducerbart och lätt utfört protokoll för att kvantitativt mäta subchondral ben tjocklek i en mus modell av knä OA framkallas av destabilisering av den mediala menisk (DMM). Detta protokoll använde ImageJ programvara för att kvantifiera subchondral ben tjocklek på histologic bilder efter att ha definierat en region av intresse i den mediala femorala condyle och den medicinska tibial platå där subchondral ben förtjockning uppstår vanligtvis i DMM-inducerad knä OA. Histologic bilder från knä leder med en bluff förfarande användes som kontroller. Statistisk analys visade att det nyutvecklade kvantitativa subchondral benmätningssystemet var mycket reproducerbart med låga intra- och inter-observer variabiliteter. Resultaten tyder på att det nya protokollet är mer känsligt för subtila eller milda subchondral ben förtjockning än de allmänt använda visuella graderingssystem. Detta protokoll är lämpligt för att upptäcka både tidiga och fortskridande osteoarthritic subchondral benförändringar och för bedömning in vivo effekt av OA behandlingar i samband med OA brosk gradering.
Introduction
Artros (OA), kännetecknas radiographically av gemensamma utrymme förträngning på grund av förlusten av artikulär brosk, osteofyter och subchondral ben (SCB) skleros, är den vanligaste formen av artrit1,2. Även om rollen av peri-artikulär ben i etiologin av OA inte är helt klarlagd, osteofytbildning och SCB skleros tros i allmänhet vara resultaten av sjukdomsprocessen snarare än orsaksfaktorer, men förändringar i peri-artikulär benarkitektur/form och biologi kan bidra till utveckling och progression av OA3,4 . Utvecklingen av ett korrekt och lätt utfört OA-graderingssystem, inklusive SCB-mätning, är avgörande för jämförande studier bland forskningslaboratorier och för att utvärdera effekten av terapeutiska medel som är utformade för att förhindra eller dämpa OA-progression.
SCB är byggd med en tunn kupolliknande benplatta och ett underliggande lager av trabekulärt ben. SCB-plattan är den kortikala lamellen, som ligger parallellt med och omedelbart under det förkalkade brosket. Små grenar av arteriella och venösa kärl, liksom nerver, tränger genom kanalerna i SCB-plattan och kommunicerar mellan det förkalkade brosket och det trabekulära benet. Det subkrendrala trabekulära benet innehåller blodkärl, sensoriska nerver, benmärg och är mer poröst och metaboliskt aktivt än SCB-plattan. Därför utövar SCB stötdämpande och stödjande funktioner och är också viktigt för brosknäringstillförsel och metabolism i normala leder5,6,7,8.
SCB förtjockning (i histologi) och skleros (i radiografi) är de viktigaste kännetecknen för OA och viktiga forskningsområden inom OA patofysiologi. Mätning SCB förtjockning är en viktig del av histologic bedömningar av OA allvarlighetsgrad. Tidigare rapporterad digital mikroradiografi för mätning av gnagare SCB mineraltäthet9 samt mikro-datortomografi (micro-CT) baserad kvantitativ SCB mätning i gnagare modeller av OA10,11,12,13 har förbättrat vår förståelse av SCB struktur och rollen av SCB förändringar i OA patofysiologi. SCB-området och tjockleken har också kvantifierats med histologiska bilder med hjälp av ett sofistikerat datorsystem med specifik och dyr ben histomorfometri programvara14. Icke desto mindre används visuella uppskattningsbaserade semi-kvantitativa OA-klassificeringssystem, inklusive SCB-förtjockning gradering, mer än mikro-CT för närvarande eftersom betygssystemen är lätta att använda, särskilt för screening av många histologic bilder. De flesta befintliga OA-klassificeringssystem fokuserar dock främst på broskförändringar15,16,17. En allmänt använd osteoarthritic SCB tjocklek graderingsmetod som kategoriserar SCB förtjockning som mild, måttlig och svår är till stor del subjektiv, och dess tillförlitlighet har inte validerats helt15. Ett tillförlitligt och lätt utfört steg-för-steg osteoarthritic SCB tjocklek mätprotokoll är antingen inte fullt utvecklat eller o standardiserat.
Denna studie syftade till att utveckla ett reproducerbart, känsligt och lätt utfört protokoll för att kvantitativt mäta SCB tjocklek i en musmodell av OA. Våra rigorösa mättester och statistiska analyser visade att detta ImageJ mjukvarustödda kvantitativa mätprotokoll kunde kvantifiera SCB-tjockleken i både normala och osteoarthritic knäleder. Det nyutvecklade protokollet är reproducerbart och känsligare för milda SCB-förändringar än de allmänt använda visuella graderingssystemen. Det kan användas för att upptäcka tidiga osteoarthritic SCB förändringar och för att bedöma in vivo effekt av OA behandlingar i samband med OA brosk gradering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer som ingår i detta protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kansas Medical Center, i enlighet med alla federala och statliga lagar och förordningar.
1. Skapande av knä OA hos möss
- Skapa en musmodell av knä OA genom kirurgisk destabilisering av den mediala menisken (DMM) som beskrivs av Glasson et al.18 hos 22 vilda BALB/c möss vid 10-11 veckors ålder. Utför skenkirurgi som en kontrollprocedur på åtta möss med samma bakgrund och ålder.
OBS: Båda könen användes för det ursprungliga projektet för att uppfylla NIH-kravet för övervägande av kön som en biologisk variabel, även om undersökning av könsskillnad inte är omfattningen av detta protokoll. - Bedöva djur genom inandning av Isofluran. Kontrollera anestesidjupet genom att övervaka andningsfrekvensen/ansträngningen och bristen på svar på tå/svansnyp. Sätt djur i en supine position.
- Raka huden i knäområdet och rengör huden med Povidone-Jod + alkohol hudskrubb; tre alternerande cykler.
- Utför DMM-proceduren på höger knä under ett kirurgiskt mikroskop. Exponera knäleden genom ett mediala parapatellarsnitt (1,2-1,5 cm långt) och incise ledkapseln. Håll patella och patellar senan intakt. Efter noggrann exponering av mediala meniscotibial ligament (MML) som förankrar den mediala menisken till tibial platån, transect det med mikro-kirurgiska sax att destabilisera den mediala menisken.
- Utför skenkirurgi på höger knä som en kontroll förfarande, där MML visualiserades men inte transected.
- Stäng ledkapseln med 8-0 absorberbara polyglactin suturer och huden snitt med 7-0 icke-absorberbara suturer för både DMM och bluff förfaranden för att säkerställa korrekt användning av knäet när läkning har inträffat.
- Injicera SR Buprenorfin (0, 20-0, 5 mg/kg) subkutant (SC) omedelbart före det kirurgiska ingreppet för analgesi, vilket ger smärtlindring upp till 72 timmar efter en enda injektion. Övervaka opererade djur efter operation.
- Avliva djur med en CO2-kammare vid 2, 8 och 16 veckor efter operationen. Efter medvetslöshet, bekräfta djurens död med en fysisk metod (öppna brösthålan). Dessa metoder för dödshjälp överensstämmer med rekommendationerna från panelen för dödshjälp från American Veterinary Medical Association (AVMA).
- Skörda knä lederna för histologiska analyser vid 2, 8 och 16 veckor efter DMM kirurgi och 2 och 16 veckor efter Sham kirurgi för att få mus knä leder med olika grader av OA svårighetsgrad eller SCB förtjockning.
2. Beredning av vävnadssektioner och histologiska bilder
- Fixa mus knä gemensamma vävnad prover i 2% paraformaldehyd, avkalka dem i 25% myrsyra, bädda in i paraffin och avsnitt koronalt för att undersöka både mediala och laterala fack.
- Skär knäprover från knäets bakre sida med hjälp av en mikrotom och samla vävnadssektioner som är 5-μm tjocka vid 70-80 μm intervall för att få cirka 40 vävnadsrutschbanor över hela knäleden. En mikrometer-assisterad uppskattning tyder på att bildnummer 1-6 är från den långt bakre, 11-18 från mitten av bakre, 23-30 från mitten av främre och 35-40 från den långt främre delen av knäleden. Kassera eller samla mellanliggande sektioner för ytterligare fläckar.
- Utför Safranin-O och snabba gröna fläckar enligt tillverkarens instruktioner för att specifikt identifiera broskceller och matriser på var femte bild. Utför Hematoxylin-Eosin färgning enligt tillverkarens instruktioner för att undersöka knä lederna på cellulära och vävnad nivåer som beskrivs tidigare19,20,21,22.
- Skaffa histologiska bilder med ett mikroskop utrustat med en digitalkamera. Allmän histopatologisk analys och histologic OA gradering genomfördes som beskrivits tidigare15,19,20,21,22.
3. Kvantitativ mätning av osteoarthritic subchondral ben med ImageJ programvara
- Ladda ner ImageJ-programvaran och öppna histologic bilder av intresse.
- Ladda ner ImageJ med Java 1.8.0_172 från https://imagej.nih.gov/ij/.
- Öppna ImageJ-programmet. Klicka på fliken Arkiv i menyfliksområdet och klicka på alternativet Öppna för att öppna den histologiska bilden.
- Leta reda på filkatalogadressen, markera bildfilen och klicka på Öppna.
- Kalibrera ImageJ med mikrometern på de histologiska bilderna.
- Använd det linjära verktyget för att skissa en längdenhet på mikrometern och klicka på Analysera > (sedan) Ställ in skala. Ställ in bildförhållandet För känt avstånd och Pixel till 1 och klicka på OK. ImageJ kan konvertera pixellängden till enhetens längd på mikrometern.
- Ställ in den uppmätta faktorn på område. Klicka på Analysera > Ange mätning och markera rutan Område och Gräns till tröskelvärde under nytt fönster. Det här steget ställer in ImageJ för att mäta parametern "Område" inom valt "Tröskelvärde".
- Mät det totala subkrendralbenet (SCB) av intresse.
- Definiera SCB-området av intresse (ROI) som visas i de orange rutorna i figur 1A, som täcker SCB-kortikalplattan och en del av det underliggande trabekulära benet intill den närliggande plattan i den mediala femorala kondylen (MFC) och medial tibialplatå (MTP) med specifika dimensioner för varje ROI. Osteoarthritic SCB förtjockning förekommer vanligtvis i dessa områden. Definiera SCB ROI med samma form och dimension i varje MFC eller MTP för alla undersökta leder för att säkerställa att samma storlek på den specifika avkastningen mättes för alla djur.
- Skissa konturen av det totala SCB-intresseområdet med hjälp av Polygon-urvalsverktyget under bildjens huvudfönster.
OBS: Urvalsverktygen ger systemet en tröskel för att begränsa det uppmätta området. - Mät det totala SCB-området: När tröskelvärdet har valts klickar du på Analysera > Mått. Ett "Resultat"-fönster med områdesmätning öppnas.
- Mät bensubstansområdet som innehåller fast ben utan benmärg.
- Klicka på Redigera > Rensa utanför om du vill utesluta området utanför det totala SCB-området.
OBS: Endast det totala SCB-området visas efter att ha klickat på Alternativet Rensa utanför . Bilden utanför det totala SCB-området blir svart. Detta steg gör det möjligt för observatörer att fokusera på bensubstansområdet inom intresseområdet. - Klicka på Bild > Justera > färgtröskel för att öppna fönstret "Tröskelvärdesfärg". Klicka på Original längst ned i fönstret "Tröskelfärg" för att återställa bilden till den ursprungliga statusen. Använd urvalsverktyg i steg 3.3.2 för att rita en liten låda i bensubstansområdet. Klicka på alternativet Exempel längst ned i fönstret "Tröskelfärg" för att definiera bensubstansområdet.
OBS: Alternativet "Prov" i fönstret "Tröskelfärg" gör det möjligt för ImageJ att välja alla samma pixlar på det totala SCB-området som bensubstansprovområdet. Det valda bensubstansområdet blir rött. - Klicka på Välj längst ned i fönstret för färgbalans för tröskelvärdet om du vill skapa ett tröskelvärde för områdesmätning. Klicka på Analysera > mått på ImageJ:s huvudmeny, så visas mätresultatet för bensubstansområdet i fönstret "Resultat".
- Spara data om SCB:s totala område och bensubstansområde.
- Klicka på Redigera > Rensa utanför om du vill utesluta området utanför det totala SCB-området.
- Beräkna förhållandet mellan bensubstansareal (mm2) och den totala SCB-areal (mm2) av intresse som representerar bensubstanstjockleken (mm2/1,0 mm2) inom den totala SCB-ytan.
- Mät SCB-tjockleken på histologiska sektioner/bilder (enligt beskrivningen i steg 3.1-3.5) av långt bakre, mellersta bakre, mitt främre och långt främre områden (enligt beskrivningen i steg 2.2) av DMM-inducerad OA för att bedöma områdesspecifik SCB-tjocklek på 6 knäleder (figur 1B).
OBS: Detta kan validera tillförlitligheten i detta kvantitativa mätprotokoll eftersom det är känt att osteoarthritic SCB förändringar samlokalisera med brosk organskador och att osteoarthritic brosk skador med SCB förtjockning är allvarligare i de viktbärande områdena (mitten av delen) av gnagare knä leder14,15. Därför är det lämpligt att använda mittsektioner för kvantitativ mätning av osteoarthritic SCB förtjockning.
4. Statistik
- Utför statistiska analyser med hjälp av data från kvantitativ mätning och visuell gradering av SCB-tjocklek. Bestäm variabiliteten och reproducerbarheten mellan och intraobservatörerna genom Pearsons korrelationskoefficientanalyser.
- Bestäm betydelsen av skillnader mellan studiegrupper med hjälp av Students t-tester eller enkelriktade ANOVA, följt av ett post hoc-test (Tukey) med hjälp av kalkylprogram. Anser att ett p-värde på mindre än 0,05 är statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbarhetsjämförelse mellan visuell uppskattningsgradering och ImageJ-assisterad kvantitativ mätning:
SCB tjocklek i 48 regioner av intresse (ROI) (24 MFC och 24 MTP), definieras från en mittsektion av varje knä från 24 knän/djur poängsattes av tre oberoende individer med hjälp av befintliga 0-3 visuella poängschemat som beskrivs i litteraturen15,23, där 0 = normal (ingen SCB förtjockning), 1 = mild, 2 = måttlig och 3 = allvarlig SCB förtjockning. Dessa bilder valdes från tre olika postoperativa tidpunkter vid 2, 8 och 16 veckor efter DMM eller sham förfarandet. Vanligtvis visade möss med DMM förfarande visuell SCB förtjockning poäng 0 vid 2 veckor efter operationen, poäng 1-2 vid 8 veckor och poäng 2-3 vid 16 veckor. SCB tjockleken på dessa histologic bilder mättes sedan kvantitativt av tre andra oberoende observatörer som använder ImageJ programvara för att validera reproducerbarhet och känslighet av det nya systemet. Representativa histologic bilder med eller utan en skisserad ROI i MFC och MTP för visuell gradering eller kvantitativa mätningar presenteras i figur 2, där undersökta bilder delades in i tre grupper: sham knee (visuell poäng 0), DMM knä (visuell poäng 0) och DMM knä (visuell poäng 1-3).
Detaljerade jämförande analyser av reproducerbarhet mellan ImageJ-assisterad kvantitativ mätning och visuell uppskattningsgradering av SCB-tjocklek presenteras i tabell 1. Korrelationskoefficienttester tyder på att den kvantitativa mätningen var relativt mer reproducerbar än det visuella bedömningsgraderingssystemet.
Reproducerbarhet mellan och inom observatörer:
Korrelationskoefficienttester visade hög reproducerbarhet för de ImageJ-stödda mätningarna med korrelationskoefficienter mellan observatörer på >0,93 mellan observatör A, B och C för medelvärdet av den första och andra mätningarna i MTP- och MFC-regionerna (figur 3). Variabilitetsanalys inom observatören av samma uppsättning histologic bilder visade också hög reproducerbarhet mellan den första och andra mätpoängen för var och en av de tre observatörerna med en korrelationskoefficient inom observatören på >0,95 för alla observatörer (figur 4).
Känslighet:
För att bedöma om det nya kvantitativa SCB-mätsystemet är mer känsligt för osteoarthritic SCB förtjockning förändringar än det allmänt använda visuella graderingssystemet, bedömdes 48 områden av intresse för histologic bilder (24 MFC och 24 MTP) från 24 knän/djur först av tre oberoende individer som har erfarenhet av OA histopatologi och befintliga OA graderingssystem. SCB förtjockning graderades med hjälp av en 0-3 visuell poängsättning schema som beskrivs ovan. ImageJ-assisterad kvantitativ mätning utfördes sedan på samma uppsättning visuellt graderade histologic bilder av ytterligare tre individer som var blinda för de visuella OA graderingsresultaten. SCB tjocklek på MFC och MTP för varje bild mättes kvantitativt med ImageJ enligt beskrivningen i avsnittet Protokoll. Resultaten visade att den genomsnittliga SCB tjockleken (mm2/1,0 mm2) av DMM bilder med visuella SCB förtjockning poäng 1-3 var betydligt högre än för Sham bilder med en "0" visuella förtjockning poäng. Ännu viktigare är att den genomsnittliga SCB-tjockleken på DMM-bilderna med en "0" visuell SCB-förtjockningspoäng också var betydligt högre än för Sham-bilderna med en "0" visuell poäng (bild 5). Uppgifterna tyder starkt på att den ImageJ-stödda kvantitativa SCB-mätningen är mer känslig för de tidiga och milda SCB-förtjockningsändringarna än den visuella graderingsmetoden.
Figur 1: Histologic-bilder med Safranin-O och snabb grön färgning från Sham- och DMM-grupper för ImageJ-assisterad kvantitativ SCB-mätning. (A) Rutorna som beskrivs med en prickad gul linje definierar SCB-regionen av intresse (ROI). Bensubstansområdet i lådorna är markerat i orange. SCB tjocklek i mediala femorala condyle (MFC) och mediala tibial platå (MTP) kan kvantifieras med Hjälp av ImageJ programvara. De exakta dimensionerna av AVKASTNINGEN i MFC och MTP förstoras för att förbättra synligheten. (B) SCB tjocklek på histologic bilder från långt bakre, mid-posterior, mitten-främre och långt främre områden i MTP vid 16 veckor post-DMM kvantifierades för att bedöma områdesspecifika SCB tjocklek. N = 6. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa histologic bilder med Safranin-O och snabb grön färgning från Sham och DMM grupper för visuell SCB gradering och kvantitativ SCB mätning. Övre paneler: Fotomikrografer av Sham- och DMM-grupper för visuell SCB-gradering. Nedre paneler: Fotomikrografer av Sham- och DMM-grupper för ImageJ-assisterad kvantitativ SCB-mätning. Rutorna som beskrivs med en prickad gul linje (gjord med Adobe illustrator) i MFC och MTP definierar SCB-området av intresse. Bensubstansområdet (exklusive benmärg) i lådorna markeras i orange. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Variationstester mellan observatörer. Korrelationskoefficientanalyser indikerar en hög reproducerbarhet mellan tre observatörer (observatörerna A, B och C) för SCB-tjockleken i genomsnitt från den första och andra mätningarna i de MTP- och MFC-regioner som är av intresse. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Variationstester inom observatören. Korrelationskoefficientanalyser indikerar en hög reproducerbarhet mellan 1: a och 2: a SCB-tjockleksmätningarna i MTP- och MFC-regionerna av intresse för var och en av observatörerna A, B och C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförande känslighetsanalyser av visuell gradering och ImageJ-assisterad kvantitativ mätning av SCB-tjocklek i MFC och MTP. De histologic bilderna för visuell uppskattning gradering delades in i tre grupper (Sham med "0" SCB förtjockning poäng, DMM med "0" SCB förtjockning poäng och DMM med SCB förtjockning poäng 1-3). Anm.: De kvantitativa SCB-tjockleksvärdena från alla tre observatörerna för DMM-bilderna med en "0" visuell SCB-förtjockningspoäng var betydligt högre än för Sham-bilderna med en "0" visuell poäng, vilket indikerar att den kvantitativa mätningen är känsligare än den visuella graderingen till mild SCB-förtjockning. N = 6. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Metod | Observatör/målskytt | MTP | MFC |
| Korrelationskoefficient för interobservatörer (r) | |||
| Kvantitativ mätning | A mot.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A mot.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B jämfört med C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Visuell bedömning | D mot E | 0.6455 | 0.6031 |
| D mot F | 0.6 | 0.7419 | |
| E mot F | 0.6454 | 0.603 | |
| Korrelationskoefficient för intraobservatörer (r) | |||
| Kvantitativ mätning | A | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Visuell bedömning | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tabell 1: Reproducerbarhetsjämförelse mellan programvaruassisterad kvantitativ mätning och visuell uppskattningsgradering för SCB-tjocklek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mätning SCB förtjockning är en viktig del av histologic bedömningar av OA allvarlighetsgrad. De flesta befintliga OA-klassificeringssystem fokuserar främst på broskförändringar15,16,17. En allmänt använd murin osteoarthritic SCB tjocklek graderingsmetod som kategoriseraR SCB förtjockning som mild, måttlig och svår är till stor del subjektiv, och dess tillförlitlighet har inte validerats helt15. Denna studie har utvecklat och validerat ett nytt mätprotokoll för att kvantifiera SCB tjocklek, som inkluderar följande steg: skapande av knä OA hos möss, beredning av vävnad avsnitt och histologic bilder, kvantitativ mätning av osteoarthritic subchondral ben med ImageJ programvara och statistisk analys för att validera känslighet och reproducerbarhet av protokollet.
Även om de allmänna teknikerna i detta protokoll följer instruktionen för ImageJ-programvara, har vi inkluderat steg-för-steg tekniska detaljer för att göra nya användare lättare att följa och validera reproducerbarheten. BoneJ-programmet, en plug-in av ImageJ-programvara, fungerar bra för att mäta 2D svartvita bilder men fungerar inte bra för att utesluta benmärgsområdet från den totala ytan av SCB på grund av likheten av nyans mellan benmärg och SCB-substans i svartvitt. Däremot kan de stegvisa metoder som beskrivs i det nuvarande protokollet tillämpas på alla färg histologic bilder med hjälp av färgtröskelfunktionen för att automatiskt separera SCB-substansen från benmärgen och därigenom mäta netto SCB tjocklek. En ny metod (inte en del av ImageJ) för beräkning av SCB-densitet (netto SCB-yta mm2/1,0 mm2 ROI) ingår i det aktuella protokollet.
Protokollet som presenteras i den här artikeln har flera fördelar. För det första är ImageJ ett gratis mjukvarusystem och är lätt tillgängligt på NIH-webbplatsen. För det andra är det nya systemet lätt att lära sig och tillämpa. den kvantitativa mätningen tar endast 5-6 min per SCB ROI. För det tredje är resultaten från det nya systemet mycket reproducerbara med mycket låga variabiliteter mellan och inom observatörer. Slutligen är det nya systemet mer känsligt för milda SCB-förtjockningsförändringar än befintliga visuella graderingssystem.
En mindre begränsning av det nya systemet är behovet av kontrollbilder som kalibratorer för statistisk analys. Detta bör dock inte vara ett problem för de flesta OA-projekt eftersom kontrollbilder nästan alltid ingår för dataanalys. En annan potentiell begränsning är att ImageJ-programvaran kan separera SCB-ämnen från benmärg baserat på deras färgpixlar, som förlitar sig på lämpliga färgningsmetoder för att visa distinkta färger för bensubstans och benmärg.
Det nya kvantitativa SCB-mätsystemet är lämpligt för kvantifiering av SCB-tjocklek på alla nivåer. För histologic bilder med anmärkningsvärd SCB förtjockning, det nya systemet kan exakt kvantifiera det exakta området av bensubstans och sedan omvandla det till bentäthet (netto SCB mm2/1,0 mm2 ROI) som representerar bentjocklek per enhet område. För histologic bilder med icke-anmärkningsvärda SCB förtjockning som inte kan upptäckas genom visuell gradering, kan det nya systemet identifiera en subtil eller mild förtjockning som ofta uppstår i en tidig fas av OA. Därför kan det nya systemet användas för övervakning av OA progression och in vivo effekt av OA terapier i samarbete med OA brosk gradering. Dessutom skulle detta protokoll också kunna användas för att mäta SCB-tjockleken hos andra arter efter justering av storleken på SCB ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01 AR059088, Department of Defense (DoD) under Research Award Number W81XWH-12-1-0304 och Mary and Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
