Summary
本方法论文章提出了一种软件辅助定量测量方案，用于量化小鼠骨关节炎膝关节和正常膝关节的组织学软骨下骨厚度作为对照。该方案对细微增厚高度敏感，适用于检测早期骨关节炎软骨下骨变化。
Abstract
软骨下骨增厚和硬化是骨关节炎（OA）的主要标志，无论是在动物模型中还是在人类中。目前，组织学软骨下骨增厚的严重程度主要由基于视觉估计的半定量分级系统确定。本文提出了一种可重复且易于执行的方案，用于定量测量由内侧半月板（DMM）不稳定诱导的膝关节OA小鼠模型中的软骨下骨厚度。该协议利用ImageJ软件在定义股骨内侧髁和内侧胫骨平台的感兴趣区域后，量化组织学图像上的软骨下骨厚度，其中软骨下骨增厚通常发生在DMM诱导的膝关节OA中。使用假手术的膝关节的组织学图像作为对照。统计分析表明，新开发的定量软骨下骨测量系统具有高度的可重复性，观察者和观察者之间的变异性较低。结果表明，与广泛使用的视觉分级系统相比，新方案对细微或轻度软骨下骨增厚更敏感。该协议适用于检测早期和进展的骨关节炎软骨下骨变化，并用于评估OA治疗与OA软骨分级的 体内 疗效。
Introduction
骨关节炎 （OA） 是关节炎最常见的形式，其放射学特征是关节软骨、骨赘和软骨下 （SCB） 硬化症导致关节间隙变窄1，2。虽然关节周围骨在OA病因中的作用尚不完全清楚，但骨赘形成和SCB硬化通常被认为是疾病过程的结果而不是致病因素，但关节周围骨骼结构/形状和生物学的变化可能有助于OA的发展和进展3，4.开发准确且易于执行的OA分级系统，包括SCB测量，对于研究实验室之间的比较研究以及评估旨在预防或减弱OA进展的治疗剂的功效至关重要。
SCB由薄圆顶状骨板和下层小梁骨组成。SCB板是皮质薄片，与钙化软骨平行并紧挨着钙化软骨下方。动脉和静脉血管的小分支以及神经穿透SCB板中的通道，在钙化软骨和小梁骨之间相通。软骨下小梁骨含有血管，感觉神经，骨髓，并且比SCB板更具多孔性和代谢活性。因此，SCB具有减震和支持功能，对正常关节的软骨营养供应和新陈代谢也很重要5，6，7，8。
SCB增厚（在组织学中）和硬化症（在X线照相中）是OA的主要标志和OA病理生理学的关键研究领域。测量 SCB 增厚是组织学评估 OA 严重程度的重要组成部分。先前报道的数字显微放射成像用于测量啮齿动物SCB矿物密度9，以及基于微计算机断层扫描（micro-CT）的OA10，11，12，13啮齿动物模型中的SCB定量测量，提高了我们对SCB结构和SCB变化在OA病理生理学中的作用的理解。SCB面积和厚度也已使用具有特定且昂贵的骨组织形态测量软件的复杂计算机系统通过组织学载玻片进行量化14。然而，基于视觉估计的半定量OA分级系统，包括SCB增厚分级，目前比micro-CT更广泛地使用，因为分级系统易于使用，特别是用于筛选许多组织学图像。然而，大多数现有的OA分级系统主要关注软骨变化15，16，17。广泛使用的骨关节炎SCB厚度分级方法将SCB增厚分为轻度，中度和重度，这在很大程度上是主观的，其可靠性尚未得到充分验证15。可靠且易于执行的分步骨关节炎SCB厚度测量方案要么尚未完全开发，要么未标准化。
本研究旨在开发一种可重复，灵敏且易于执行的方案，以定量测量OA小鼠模型中的SCB厚度。我们严格的测量测试和统计分析表明，这种ImageJ软件辅助的定量测量方案可以量化正常和骨关节炎膝关节的SCB厚度。新开发的方案是可重复的，并且比广泛使用的视觉分级系统对轻度SCB变化更敏感。它可用于检测早期骨关节炎SCB变化，并用于评估OA治疗与OA软骨分级的 体内 疗效。
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Protocol
该协议中包含的所有动物程序均由堪萨斯大学医学中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合所有联邦和州法律法规。
1. 小鼠膝关节OA的产生
- 通过手术破坏内侧半月板（DMM）的小鼠OA的小鼠模型，如Glasson等人描述的那样，在10-11 周龄的22只野生型BALB / c小鼠中。对具有相同背景和年龄的八只小鼠进行假手术作为对照程序。
注意：两性都用于原始项目，以满足NIH将性别视为生物变量的要求，尽管性别差异的检查不是本协议的范围。 - 通过吸入异氟醚麻醉动物。通过监测他们的呼吸频率/用力和对脚趾/尾巴捏合缺乏反应来检查麻醉深度。将动物置于仰卧位。
- 剃掉膝盖区域的皮肤，并用聚维酮碘+酒精皮肤磨砂膏清洁皮肤;三个交替循环。
- 在手术显微镜下在右膝盖上进行DMM手术。通过内侧髌骨切口（长1.2-1.5厘米）暴露膝关节并切开关节囊。保持髌骨和髌腱完整。小心暴露内侧半月板韧带（MML）将内侧半月板固定到胫骨平台后，用显微手术剪刀将其横切以破坏内侧半月板的稳定性。
- 在右膝上进行假手术作为对照程序，其中MML被可视化但未切除。
- 用8-0关闭关节舱可吸收的聚乳糖缝合线和皮肤切口，7-0个不可吸收的缝合线用于DMM和假手术，以确保一旦愈合发生，膝盖的正确使用。
- 在镇痛手术前立即皮下注射SR丁丙诺啡（0.20-0.5mg / kg），可在单次注射后72小时内缓解疼痛。监测手术后的动物。
- 在手术后2周，8周和16周使用CO2 室对动物实施安乐死。失去知觉后，通过物理方法（打开胸腔）确认动物的死亡。这些安乐死方法与美国兽医协会（AVMA）安乐死小组的建议一致。
- 在DMM手术后2周，8周和16周以及假手术后2周和16周收获膝关节进行组织学分析，以获得具有不同程度OA严重程度或SCB增厚的小鼠膝关节。
2. 组织切片和组织学图像的制备
- 将小鼠膝关节组织样本固定在2%多聚甲醛中，在25%甲酸中脱钙，包埋在石蜡中，并切开冠状以检查内侧和外侧隔室。
- 使用切片机从膝关节后侧切割膝关节标本，并以70-80μm的间隔收集5-μm厚的组织切片，以获得整个膝关节的约40个组织切片。微米辅助估计表明，载玻片编号 1-6 来自远后部，11-18 号来自中后部，23-30 号来自中前部，35-40 号来自膝关节远前部。丢弃或收集中间部分以增加污渍。
- 根据制造商的说明执行Safranin-O和快速绿色染色，以专门识别每五张载玻片上的软骨细胞和基质。根据制造商的说明进行血氧菌素 - 曙红染色，以检查细胞和组织水平的膝关节，如前所述19，20，21，22。
- 使用配备数码相机的显微镜获取组织学图像。如前所述进行一般组织病理学分析和组织学OA分级15，19，20，21，22。
3. 使用ImageJ软件定量测量骨关节炎软骨下骨
- 下载 ImageJ 软件并打开感兴趣的组织学图像。
- 从 https://imagej.nih.gov/ij/ 下载与 Java 1.8.0_172 捆绑在一起的 ImageJ。
- 打开 ImageJ 程序。单击功能区上的" 文件 "选项卡，然后单击" 打开 "选项以打开组织学图像。
- 找到文件目录地址，选择图片文件，然后单击" 打开"。
- 用组织学图像上的千分尺校准ImageJ。
- 使用直线工具在千分尺上绘制一个长度单位，然后单击" 分析 >（然后） 设置比例。将 已知距离 和 像素长宽比 设置为 1， 然后单击 确定。ImageJ可以将像素长度转换为千分尺上的单位长度。
- 将测量因子设置为面积。单击 分析>设置测量值 ，然后在新窗口下选中 面积 和 阈值限制 框。此步骤将 ImageJ 设置为在选定的"阈值"内测量参数"面积"。
- 测量感兴趣的总软骨下 （SCB） 区域。
- 定义 SCB 感兴趣区域 （ROI），如图 1A 的橙色框所示，它覆盖了 SCB 皮质板和内侧股骨髁 （MFC） 和内侧胫骨平台 （MTP） 中与皮质板相邻的下层小梁骨的一部分，每个 ROI 都有特定的尺寸。骨关节炎性SCB增厚通常发生在这些区域。在所有检查的关节的每个MFC或MTP中定义具有相同形状和尺寸的SCB ROI，以确保为所有动物测量相同尺寸的特定ROI。
- 使用 ImageJ 主窗口下的多边形选择工具绘制感兴趣的总 SCB 区域的轮廓。
注：选择工具为系统提供了一个阈值，以限制测量面积。 - 测量总 SCB 面积：选择阈值后，单击分析 >测量值。将打开一个带有面积测量值的"结果"窗口。
- 测量含有不含骨髓的固体骨的骨物质区域。
- 单击 "编辑">清除外部 "以排除 SCB 总区域之外的区域。
注意：单击" 清除外部 "选项后，只有总 SCB 区域可见。总 SCB 区域外的图片将变黑。此步骤允许观察者专注于感兴趣区域内的骨物质区域。 - 单击 图像>调整>颜色阈值 以打开"阈值颜色"窗口。单击"阈值颜色"窗口底部的" 原始 "以将图片恢复到原始状态。使用步骤3.3.2中的选择工具在骨物质区域绘制一个小盒子。单击"阈值颜色"窗口底部的" 样品 "选项以定义骨质区域。
注意："阈值颜色"窗口中的"样品"选项允许 ImageJ 选择总 SCB 面积上所有与骨质样本区域相同的像素。选定的骨物质区域将变为红色。 - 单击阈值颜色平衡窗口底部 的选择 以创建面积测量阈值。单击ImageJ主菜单中 的分析>测量 ，骨物质面积测量结果将显示在"结果"窗口中。
- 保存总 SCB 面积和骨质面积的数据。
- 单击 "编辑">清除外部 "以排除 SCB 总区域之外的区域。
- 计算骨物质面积 （mm2） 与感兴趣的总 SCB 面积 （mm2） 之比，表示总 SCB 面积内的骨物质厚度 （mm2/1.0 mm2）。
- 测量DMM诱导的OA的远后，中后，中前和远前区域（如步骤2.2所述）的组织学切片/图像的SCB厚度（如步骤3.1-3.5所述），以评估6个膝关节的区域特异性SCB厚度（图1B）。
注意：这可以验证该定量测量方案的可靠性，因为已知骨关节炎SCB变化与软骨病变共同定位，并且伴有SCB增厚的骨关节炎软骨损伤在啮齿动物膝关节的承重区域（中部）更为严重14，15。因此，使用中段定量测量骨关节炎SCB增厚是合适的。
4. 统计
- 使用来自SCB厚度的定量测量和视觉分级的数据进行统计分析。通过皮尔逊相关系数分析确定观察者之间和观察者内部的变异性和再现性。
- 使用学生 t 检验或单因素方差分析确定研究组之间差异的重要性，然后使用电子表格软件进行事后检验 （Tukey）。将 p 值视为小于 0.05 的 p 值具有统计显著性。
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Representative Results
视觉估计分级和 ImageJ 辅助定量测量之间的再现性比较：
48个感兴趣区域（ROI）（24 MFC和24 MTP）的SCB厚度，由三个独立个体使用文献中描述的现有0-3视觉评分方案进行评分，其中0 =正常（无SCB增厚），1 =轻度，2 =中度，3 =重度SCB增厚。这些图像是从DMM或假手术后2，8和16周的三个不同的术后时间点中选择的。通常，采用DMM手术的小鼠在术后2周显示视觉SCB增厚评分为0，在8周时为1-2分，在16周时为2-3分。然后，由其他三名独立观察者使用ImageJ软件定量测量这些组织学图像的SCB厚度，以验证新方案的再现性和灵敏度。图2显示了具有或不具有MFC和MTP中用于视觉分级或定量测量的ROI的代表性组织学图像，其中检查的图像分为三组：假膝关节（视觉评分0），DMM膝关节（视觉评分0）和DMM膝关节（视觉评分1-3）。
ImageJ辅助定量测量与SCB厚度视觉估计分级之间的再现性的详细比较分析如 表1所示。相关系数检验表明，定量测量比视觉估计分级系统具有相对更强的可重复性。
观察者之间和观察者内部的再现性：
相关系数测试表明，ImageJ辅助测量的高再现性，观察者A，B和C之间的观察者之间相关系数为>0.93，用于MTP和MFC区域中第一次和第二次测量的平均值（图3）。同一组组织学图像的观察者内变异性分析也显示，三个观察者中每个观察者的第一和第二测量评分之间具有很高的再现性，所有观察者的观察者内部相关系数为>0.95（图4）。
敏感性：
为了评估新的定量SCB测量系统是否比广泛使用的视觉分级系统对骨关节炎SCB增厚变化更敏感，首先由三名在OA组织病理学和现有OA分级系统方面经验丰富的独立个体评估了来自24个膝盖/动物的48个感兴趣的组织学图像区域（24个MFC和24个MTP）。如上所述，使用0-3视觉评分方案对SCB增稠进行分级。然后，由另外三名对视觉OA分级结果失明的个体对同一组视觉分级的组织学图像进行ImageJ辅助定量测量。使用ImageJ定量测量每个图像的MFC和MTP的SCB厚度，如协议部分所述。结果表明，视觉SCB增厚得分为1~3的DMM图像的平均SCB厚度（mm2/1.0 mm2）显著高于视觉增厚得分为"0"的Sham图像。更重要的是，具有"0"视觉SCB增厚得分的DMM图像的平均SCB厚度也显着高于具有"0"视觉得分的Sham图像（图5）。数据强烈表明，与视觉分级方法相比，ImageJ辅助定量SCB测量对早期和轻度的SCB增厚变化更敏感。
图1：带有Safranin-O的组织学图像以及来自Sham和DMM组的快速绿色染色，用于ImageJ辅助定量SCB测量。盒子内的骨物质区域以橙色突出显示。内侧股骨髁（MFC）和内侧胫骨平台（MTP）的SCB厚度可以使用ImageJ软件进行定量。MFC 和 MTP 中 ROI 的确切尺寸被放大以提高可见性。（B）对DMM后16周MTP远后，中后，中后，中前和远前区域的组织学图像的SCB厚度进行定量，以评估区域特异性SCB厚度。N = 6。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：具有代表性的组织学图像，带有Safranin-O和来自Sham和DMM组的快速绿色染色，用于视觉SCB分级和定量SCB测量。上图： 用于视觉SCB分级的假和DMM组的显微照片。 下面板： Sham和DMM组的显微照片，用于ImageJ辅助定量SCB测量。MFC 和 MTP 中用黄色虚线（使用 Adobe illustrator 制作）勾勒的框定义了感兴趣的 SCB 区域。盒子内的骨物质（不包括骨髓）区域以橙色突出显示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 3：观察者间变异测试。 相关系数分析表明，在MTP和MFC感兴趣区域，从第 一次和第二次 测量中平均SCB厚度，三个观察者（观察者A，B和C）之间具有很高的再现性。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：观察者内部变异测试。 相关系数分析表明，对于每个观察者A、B和C ，在MTP和MFC感兴趣的区域中，第1次和第2次 SCB厚度测量值之间具有很高的再现性 。
图5：MFC和MTP中SCB厚度的视觉分级和ImageJ辅助定量测量的比较灵敏度分析。 将用于视觉估计分级的组织学图像分为3组（Sham具有"0"SCB增厚评分，DMM具有"0"SCB增厚评分，DMM具有SCB增厚评分1-3）。注：对于具有"0"视觉SCB增厚评分的DMM图像，所有三个观察者的定量SCB厚度值均显着高于具有"0"视觉评分的Sham图像，表明定量测量比视觉分级对轻度SCB增厚更敏感。N = 6。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 方法 | 观察员/记分员 | 断续器 | 断续器 |
| 观察者之间相关系数（r） | |||
| 定量测量 | A vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A vs.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B 与C | 0.9109 | 0.9288 | |
| 视觉分级 | D 与 E | 0.6455 | 0.6031 |
| D 与 F | 0.6 | 0.7419 | |
| E 与 F | 0.6454 | 0.603 | |
| 观察者内部相关系数（r） | |||
| 定量测量 | 一个 | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| 视觉分级 | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
表 1： 软件辅助定量测量与SCB厚度视觉估计分级之间的再现性比较。
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Discussion
测量 SCB 增厚是组织学评估 OA 严重程度的重要组成部分。大多数现有的OA分级系统主要关注软骨变化15，16，17。广泛使用的小鼠骨关节炎SCB厚度分级方法将SCB增厚分为轻度，中度和重度，这在很大程度上是主观的，其可靠性尚未得到充分验证15。本研究已经开发并验证了一种新的测量方案来量化SCB厚度，其中包括以下步骤：在小鼠中创建膝关节OA，制备组织切片和组织学图像，使用ImageJ软件定量测量骨关节炎软骨下骨，以及统计分析以验证方案的敏感性和再现性。
虽然该协议的一般技术遵循ImageJ软件的说明，但我们包括了分步技术细节，以使新用户更容易遵循并验证可重复性。BoneJ程序是ImageJ软件的一个插件，非常适合测量2D黑白图像，但由于骨髓和SCB物质之间的阴影相似，因此无法很好地从SCB总面积中排除骨髓区域。相比之下，当前方案中描述的逐步方法可以使用颜色阈值函数应用于所有彩色组织学图像，以自动将SCB物质与骨髓分离，从而测量净SCB厚度。当前协议中包括一种用于计算SCB密度（净SCB面积mm2 / ROI的1.0 mm2 ）的新方法（不是ImageJ的一部分）。
本文中介绍的协议有几个优点。首先，ImageJ是一个自由软件系统，可以在NIH网站上找到。其次，新系统易于学习和应用;定量测量每个SCB ROI仅需5-6分钟。第三，新系统的结果具有高度可重复性，观察者之间和观察者内部的可变性非常低。最后，与现有的视觉分级系统相比，新系统对轻度SCB增稠变化更敏感。
新系统的一个小限制是需要控制图像作为统计分析的校准器。但是，对于大多数OA项目来说，这应该不是一个问题，因为几乎总是包含用于数据分析的控制图像。另一个潜在的限制是，ImageJ软件可以根据其颜色像素将SCB物质与骨髓分开，这依赖于适当的染色方法来显示骨物质和骨髓的不同颜色。
新的SCB定量测量系统适用于量化各级SCB厚度。对于具有显着SCB增厚的组织学图像，新系统可以准确地量化骨物质的确切面积，然后将其转换为骨密度（净SCB mm2 / 1.0 mm2 的ROI），代表单位面积的骨厚度。对于具有非显着SCB增厚的组织学图像，无法通过视觉分级检测到，新系统可以识别通常在OA早期阶段发生的细微或轻度增厚。因此，新系统可用于监测OA进展和OA治疗的 体内 疗效，并与OA软骨分级配合使用。此外，该协议还可用于在调整SCB ROI尺寸后测量其他物种的SCB厚度。
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Disclosures
作者声明没有竞争性利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家关节炎和肌肉骨骼及皮肤病研究所（编号为R01 AR059088），国防部（DoD）研究奖编号为W81XWH-12-1-0304以及玛丽和保罗哈灵顿杰出教授捐赠基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
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