Summary
Denne metodeartikel præsenterer en softwareassisteret kvantitativ måleprotokol til kvantificering af histologisk subchondral knogletykkelse i murine osteoarthritiske knæled og normale knæled som kontroller. Denne protokol er meget følsom over for subtil fortykning og er velegnet til at detektere tidlige slidgigt subkondrale knogleændringer.
Abstract
Subchondral knoglefortykkelse og sklerose er de vigtigste kendetegn ved slidgigt (OA), både i dyremodeller og hos mennesker. I øjeblikket bestemmes sværhedsgraden af den histologiske subchondrale knoglefortykkelse for det meste af visuel estimering baseret på semi-kvantitative klassificeringssystemer. Denne artikel præsenterer en reproducerbar og let udført protokol til kvantitativ måling af subchondral knogletykkelse i en musemodel af knæ OA induceret ved destabilisering af den mediale meniskus (DMM). Denne protokol brugte ImageJ-software til at kvantificere subchondral knogletykkelse på histologiske billeder efter at have defineret en region af interesse for den mediale lårbenskondyle og det medicinske tibialplateau, hvor subchondral knoglefortykkelse normalt forekommer i DMM-induceret knæ OA. Histologiske billeder fra knæled med en sham-procedure blev brugt som kontroller. Statistisk analyse viste, at det nyudviklede kvantitative subchondrale knoglemålesystem var meget reproducerbart med lave intra- og interobservatørvariationer. Resultaterne tyder på, at den nye protokol er mere følsom over for subtil eller mild subchondral knoglefortykkelse end de meget anvendte visuelle klassificeringssystemer. Denne protokol er egnet til at detektere både tidlige og fremadskridende slidgigt subchondral knogleforandringer og til vurdering in vivo-effekt af OA-behandlinger i samspil med OA-bruskklassificering.
Introduction
Slidgigt (OA), karakteriseret radiografisk ved indsnævring af ledrummet på grund af tab af ledbrusk, osteofytter og subchondral knogle (SCB) sklerose, er den mest almindelige form for arthritis1,2. Selvom periartikulær knogles rolle i OA's ætiologi ikke er fuldt ud forstået, menes osteofytdannelse og SCB-sklerose generelt at være resultaterne af sygdomsprocessen snarere end årsagsfaktorer, men ændringer i periartikulær knoglearkitektur / form og biologi kan bidrage til udvikling og progression af OA3,4 . Udviklingen af et nøjagtigt og let udført OA-klassificeringssystem, herunder SCB-måling, er afgørende for komparative undersøgelser blandt forskningslaboratorier og for evaluering af effekten af terapeutiske midler designet til at forhindre eller dæmpe OA-progression.
SCB er bygget med en tynd kuppellignende knogleplade og et underliggende lag af trabekulær knogle. SCB-pladen er den kortikale lamella, der ligger parallelt med og umiddelbart under den forkalkede brusk. Små grene af arterielle og venøse kar samt nerver trænger gennem kanalerne i SCB-pladen og kommunikerer mellem den forkalkede brusk og den trabekulære knogle. Den subchondrale trabekulære knogle indeholder blodkar, sensoriske nerver, knoglemarv og er mere porøs og metabolisk aktiv end SCB-pladen. Derfor udøver SCB stødabsorberende og støttende funktioner og er også vigtig for bruskenæringsstofforsyning og metabolisme i normale led5,6,7,8.
SCB-fortykkelse (i histologi) og sklerose (i radiografi) er de vigtigste kendetegn ved OA og centrale forskningsområder inden for OA-patofysiologi. Måling af SCB-fortykkelse er en vigtig komponent i histologiske vurderinger af OA-sværhedsgrad. Tidligere rapporteret digital mikroradiologi til måling af gnaver SCB mineraltæthed9 samt mikrocomputertomografi (mikro-CT) baseret kvantitativ SCB-måling i gnavermodeller af OA10,11,12,13 har forbedret vores forståelse af SCB-struktur og SCB-ændringers rolle i OA-patofysiologi. SCB-areal og tykkelse er også blevet kvantificeret med histologiske dias ved hjælp af et sofistikeret computersystem med specifik og dyr knogle histomorfometri software14. Ikke desto mindre anvendes visuelle estimatbaserede semi-kvantitative OA-klassificeringssystemer, herunder SCB-fortykkelsesklassificering, mere udbredt end mikro-CT på nuværende tidspunkt, fordi klassificeringssystemerne er lette at bruge, især til screening af adskillige histologiske billeder. De fleste eksisterende OA-klassificeringssystemer fokuserer dog primært på bruskændringer15,16,17. En meget anvendt slidgigt SCB-tykkelsesklassificeringsmetode, der kategoriserer SCB-fortykkelse som mild, moderat og svær, er stort set subjektiv, og dens pålidelighed er ikke fuldt valideret15. En pålidelig og let udført trin-for-trin slidgigt SCB tykkelsesmåleprotokol er enten ikke fuldt udviklet eller ikke-standardiseret.
Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en reproducerbar, følsom og let udført protokol til kvantitativ måling af SCB-tykkelsen i en musemodel af OA. Vores strenge måletest og statistiske analyse viste, at denne ImageJ-softwareassisterede kvantitative måleprotokol kunne kvantificere SCB-tykkelsen i både normale og slidgigtiske knæled. Den nyudviklede protokol er reproducerbar og mere følsom over for milde SCB-ændringer end de meget anvendte visuelle klassificeringssystemer. Det kan bruges til at detektere tidlige slidgigt SCB-ændringer og til vurdering af in vivo-effekt af OA-behandlinger i samspil med OA-bruskklassificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er inkluderet i denne protokol, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kansas Medical Center i overensstemmelse med alle føderale og statslige love og regler.
1. Oprettelse af knæ OA hos mus
- Opret en musemodel af knæ OA ved kirurgisk destabilisering af den mediale menisk (DMM) som beskrevet af Glasson et al.18 i 22 vildtype BALB / c mus ved 10-11 ugers alderen. Udfør sham kirurgi som en kontrolprocedure på otte mus med samme baggrund og alder.
BEMÆRK: Begge køn blev brugt til det oprindelige projekt for at opfylde NIH-kravet om overvejelse af køn som en biologisk variabel, selvom undersøgelse af kønsforskel ikke er omfattet af denne protokol. - Anæstesi dyr ved indånding af isofluran. Kontroller dybden af anæstesi ved at overvåge deres respirationsfrekvens / indsats og manglende reaktion på tå / hale klemme. Sæt dyr i liggende stilling.
- Barber huden i knæområdet og rengør huden med Povidon-jod + alkohol hudskrubbe; tre vekslende cyklusser.
- Udfør DMM-proceduren på højre knæ under et kirurgisk mikroskop. Udsæt knæleddet gennem et medialt parapatellart snit (1,2-1,5 cm i længden) og indsnit ledkapslen. Hold patellaen og patellar senen intakt. Efter omhyggelig eksponering af det mediale meniscotibiale ledbånd (MML), som forankrer den mediale menisk til tibialplateauet, transekteres det med mikrokirurgisk saks for at destabilisere den mediale menisk.
- Udfør sham kirurgi på højre knæ som en kontrolprocedure, hvor MML blev visualiseret, men ikke transekteret.
- Luk ledkapslen med 8-0 absorberbare polyglactinsuturer og hudsnit med 7-0 ikke-absorberbare suturer til både DMM- og sham-procedurer for at sikre korrekt brug af knæet, når helingen er sket.
- SR Buprenorphin (0,20-0,5 mg/kg) subkutant (SC) injiceres subkutant før det kirurgiske indgreb for analgesi, hvilket giver smertelindring op til 72 timer efter en enkelt injektion. Overvåg opererede dyr efter operationen.
- Afliv dyr ved hjælp af et CO2-kammer 2, 8 og 16 uger efter operationen. Efter bevidstløshed bekræftes dyrenes død ved en fysisk metode (åbning af brysthulen). Disse metoder til eutanasi er i overensstemmelse med anbefalingerne fra panelet for eutanasi fra American Veterinary Medical Association (AVMA).
- Høst knæleddene til histologiske analyser 2, 8 og 16 uger efter DMM-operationen og 2 og 16 uger efter Sham-operationen for at opnå museknæled med forskellige grader af OA-sværhedsgrad eller SCB-fortykkelse.
2. Forberedelse af vævssektioner og histologiske billeder
- Fix museknæled vævsprøver i 2% paraformaldehyd, afkalk dem i 25% myresyre, indlejre i paraffin og sektion koronalt for at undersøge både mediale og laterale rum.
- Skær knæprøver fra den bageste side af knæet ved hjælp af et mikrotome og saml vævssektioner, der er 5 μm tykke med 70-80 μm intervaller for at opnå ca. 40 vævsglider over hele knæleddet. Et mikrometerassisteret skøn tyder på, at diasnumrene 1-6 er fra den fjerne bageste, 11-18 fra midten af bageste, 23-30 fra midten af forreste og 35-40 fra den yderste forreste del af knæleddet. Kassér eller saml mellemliggende sektioner for yderligere pletter.
- Udfør Safranin-O og hurtige grønne pletter i henhold til producentens anvisninger for specifikt at identificere bruskceller og matricer på hvert femte dias. Udfør hæmatoxylin-eosinfarvning i henhold til producentens anvisninger for at undersøge knæleddene på celle- og vævsniveauer som beskrevet tidligere19,20,21,22.
- Erhverv histologiske billeder med et mikroskop udstyret med et digitalt kamera. Generel histopatologisk analyse og histologisk OA-klassificering blev udført som beskrevet tidligere15,19,20,21,22.
3. Kvantitativ måling af slidgigt subchondral knogle med ImageJ-software
- Download ImageJ-softwaren, og åbn histologiske billeder af interesse.
- Download ImageJ bundtet med Java 1.8.0_172 fra https://imagej.nih.gov/ij/.
- Åbn ImageJ-programmet. Klik på fanen Filer på båndet, og klik på Indstillingen Åbn for at åbne det histologiske billede.
- Find filmappeadressen, vælg billedfilen, og klik på Åbn.
- Kalibrer ImageJ med mikrometeret på de histologiske billeder.
- Brug det lineære værktøj til at skitsere en længdeenhed på mikrometeret, og klik på Analysér > (derefter) Indstil skala. Indstil kendt afstand og pixelstørrelsesforhold til 1 , og klik på OK. ImageJ kan konvertere pixellængden til enhedslængden på mikrometeret.
- Indstil den målte faktor til areal. Klik på Analysér > Indstil måling, og markér afkrydsningsfeltet Område og Begræns til tærskel under nyt vindue. Dette trin indstiller ImageJ til at måle parameteren "Area" inden for den valgte "Threshold".
- Mål det samlede subchondrale knogleområde (SCB).
- Definer SCB-interesseområdet (ROI) som vist i de orange felter i figur 1A, som dækker SCB-kortikale plade og en del af den underliggende trabekulære knogle ved siden af den kortikale plade i den mediale lårbenskondyle (MFC) og mediale tibialplateau (MTP) med specifikke dimensioner for hver ROI. Osteoarthritic SCB fortykkelse forekommer normalt i disse områder. Definer SCB-ROI med samme form og dimension i hver MFC eller MTP for alle undersøgte led for at sikre, at den samme størrelse af det specifikke investeringsafkast blev målt for alle dyr.
- Skitsér omridset af det samlede SCB-interesseområde ved hjælp af Polygon-markeringsværktøjet under hovedvinduet i ImageJ.
BEMÆRK: Markeringsværktøjerne giver systemet en tærskel for at begrænse det målte område. - Mål det samlede SCB-område: Når tærsklen er valgt, skal du klikke på Analysér > måling. Et "Resultater" vindue med arealmåling åbnes.
- Mål knoglestofområdet, der indeholder fast knogle uden knoglemarv.
- Klik på Rediger > Ryd udenfor for at udelukke området uden for det samlede SCB-område.
BEMÆRK: Kun det samlede SCB-område er synligt, når du har klikket på Ryd udenfor . Billedet uden for det samlede SCB-område bliver sort. Dette trin giver observatører mulighed for at fokusere på knoglestofområdet inden for interesseområdet. - Klik på Billede > Juster > farvetærskel for at åbne vinduet "Tærskelfarve". Klik på Original nederst i vinduet "Tærskelfarve" for at gendanne billedet til den oprindelige status. Brug markeringsværktøjer i trin 3.3.2 til at tegne en lille kasse i knoglestofområdet. Klik på indstillingen Eksempel nederst i vinduet "Tærskelfarve" for at definere knoglestofområdet.
BEMÆRK: Indstillingen "Prøve" i vinduet "Tærskelfarve" giver ImageJ mulighed for at vælge alle de samme pixels på det samlede SCB-område som knoglestofprøveområdet. Det valgte knoglestofområde bliver rødt. - Klik på Vælg nederst i vinduet tærskelfarvebalance for at oprette en arealmålingstærskel. Klik på Analysér > Måling i ImageJ-hovedmenuen, og resultatet af måling af knoglest stofområdet vises i vinduet "Resultater".
- Gem dataene for det samlede SCB-område og knoglestofområdet.
- Klik på Rediger > Ryd udenfor for at udelukke området uden for det samlede SCB-område.
- Beregn forholdet mellem knoglestofareal (mm2) og det samlede SCB-areal (mm2) af interesse, som repræsenterer knoglestoftykkelsen (mm2/1,0 mm2) inden for det samlede SCB-areal.
- Mål SCB-tykkelsen af histologiske sektioner/billeder (som beskrevet i trin 3.1-3.5) af langt bageste, midterste bageste, midterste forreste og langt forreste områder (som beskrevet i trin 2.2) af DMM-induceret OA for at vurdere områdespecifik SCB-tykkelse på 6 knæled (figur 1B).
BEMÆRK: Dette kan validere pålideligheden af denne kvantitative måleprotokol, fordi det er kendt, at slidgigt SCB-ændringer co-lokaliseres med brusklæsioner, og at slidgigtbruskskader med SCB-fortykkelse er mere alvorlige i de vægtbærende områder (midterste del) af gnavereknæled14,15. Det er derfor hensigtsmæssigt at anvende midtersektioner til kvantitativ måling af slidgigt SCB-fortykkelse.
4. Statistik
- Udfør statistiske analyser ved hjælp af data fra kvantitativ måling og visuel klassificering af SCB-tykkelse. Bestem inter- og intra-observatør variabilitet og reproducerbarhed ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficientanalyser.
- Bestem betydningen af forskelle mellem studiegrupper ved hjælp af Studerendes t-tests eller envejs ANOVA, efterfulgt af en post-hoc test (Tukey) ved hjælp af regnearkssoftware. Betragt en p-værdi på mindre end 0,05 som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproducerbarhedssammenligning mellem visuel estimatklassificering og ImageJ-assisteret kvantitativ måling:
SCB-tykkelse i 48 interesseområder (ROI) (24 MFC og 24 MTP), defineret fra en midtersektion af hvert knæ fra 24 knæ / dyr, blev scoret af tre uafhængige individer ved hjælp af det eksisterende 0-3 visuelle scoringsskema som beskrevet i litteraturen15,23, hvor 0 = normal (ingen SCB-fortykkelse), 1 = mild, 2 = moderat og 3 = svær SCB-fortykkelse. Disse billeder blev udvalgt fra tre forskellige postoperative tidspunkter på 2, 8 og 16 uger efter DMM- eller sham-proceduren. Normalt viste mus med DMM-procedure visuel SCB-fortykkelsesscore 0 2 uger efter operationen, scorer 1-2 efter 8 uger og scorer 2-3 efter 16 uger. SCB-tykkelsen af disse histologiske billeder blev derefter kvantitativt målt af tre andre uafhængige observatører ved hjælp af ImageJ-software til at validere reproducerbarheden og følsomheden af det nye skema. Repræsentative histologiske billeder med eller uden et skitseret ROI i MFC og MTP til visuel klassificering eller kvantitative målinger er præsenteret i figur 2, hvor undersøgte billeder blev opdelt i tre grupper: sham knee (visual score 0), DMM knee (visual score 0) og DMM knee (visual score 1-3).
Detaljerede komparative analyser af reproducerbarhed mellem ImageJ-assisteret kvantitativ måling og visuel estimatgraduering af SCB-tykkelse er præsenteret i tabel 1. Korrelationskoefficienttest tyder på, at den kvantitative måling var relativt mere reproducerbar end det visuelle estimatklassificeringssystem.
Reproducerbarhed mellem og inden for observatører:
Korrelationskoefficienttest viste høj reproducerbarhed af de ImageJ-assisterede målinger med interobservatørkorrelationskoefficienter på >0,93 mellem observatør A, B og C for gennemsnittet af den første og anden måling i MTP- og MFC-regionerne (figur 3). Intra-observatør variabilitetsanalyse af det samme sæt histologiske billeder viste også høj reproducerbarhed mellem den første og anden målescore for hver af de tre observatører med en intra-observatør korrelationskoefficient på >0,95 for alle observatører (figur 4).
Følsomhed:
For at vurdere, om det nye kvantitative SCB-målesystem er mere følsomt over for slidgigt SCB-fortykkelsesændringer end det almindeligt anvendte visuelle klassificeringssystem, blev 48 interesseområder for histologiske billeder (24 MFC og 24 MTP) fra 24 knæ/dyr først vurderet af tre uafhængige personer, der har erfaring med OA-histopatologi og eksisterende OA-klassificeringssystemer. SCB-fortykkelse blev klassificeret ved hjælp af et 0-3 visuelt scoringsskema som beskrevet ovenfor. ImageJ-assisteret kvantitativ måling blev derefter udført på det samme sæt visuelt klassificerede histologiske billeder af yderligere tre personer, der blev blindet for de visuelle OA-klassificeringsresultater. SCB-tykkelsen af MFC'en og MTP'en for hvert billede blev kvantitativt målt med ImageJ som beskrevet i afsnittet Protokol. Resultaterne viste, at den gennemsnitlige SCB-tykkelse (mm2/1,0 mm2) af DMM-billederne med visuel SCB-fortykkelsesscore 1-3 var signifikant højere end for Sham-billederne med en "0" visuel fortykkelsesscore. Endnu vigtigere var den gennemsnitlige SCB-tykkelse af DMM-billederne med en "0" visuel SCB-fortykkelsesscore også signifikant højere end for Sham-billederne med en "0" visuel score (figur 5). Dataene tyder stærkt på, at den ImageJ-assisterede kvantitative SCB-måling er mere følsom over for de tidlige og milde SCB-fortykningsændringer end den visuelle klassificeringsmetode.
Figur 1: Histologiske billeder med Safranin-O og hurtig grøn farvning fra Sham- og DMM-grupper til ImageJ-assisteret kvantitativ SCB-måling. (A) Boksene skitseret med en prikket gul linje definerer SCB-interesseområdet (ROI). Området med knoglestof i kasserne er fremhævet i orange. SCB-tykkelsen i den mediale lårbenskondyle (MFC) og mediale tibialplateau (MTP) kan kvantificeres ved hjælp af ImageJ-software. De nøjagtige dimensioner af ROI i MFC og MTP forstørres for at forbedre synligheden. B) SCB-tykkelsen af histologiske billeder fra fjerntliggende, midterste bageste, midterste forreste og fjerntliggende områder af MTP'en 16 uger efter DMM blev kvantificeret for at vurdere områdespecifik SCB-tykkelse. N = 6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative histologiske billeder med Safranin-O og hurtig grøn farvning fra Sham- og DMM-grupper til visuel SCB-klassificering og kvantitativ SCB-måling. Øverste paneler: Fotomikrografer af Sham- og DMM-grupper til visuel SCB-klassificering. Nederste paneler: Fotomikrografer af Sham- og DMM-grupper til ImageJ-assisteret kvantitativ SCB-måling. De felter, der er skitseret med en prikket gul linje (lavet med Adobe illustrator) i MFC og MTP, definerer det SCB-område, der er af interesse. Området med knoglestof (undtagen knoglemarv) i kasserne er fremhævet med orange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Variationstest mellem observatører. Korrelationskoefficientanalyser indikerer en høj reproducerbarhed mellem tre observatører (observatører A, B og C) for SCB-tykkelse i gennemsnit fra 1. og 2. måling i MTP- og MFC-regionerne af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Intra-observatør variationstest. Korrelationskoefficientanalyser indikerer en høj reproducerbarhed mellem 1. og 2. SCB-tykkelsesmålinger i MTP- og MFC-regionerne af interesse for hver af observatørerne A, B og C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenlignende følsomhedsanalyser af visuel klassificering og ImageJ-assisteret kvantitativ måling af SCB-tykkelse i MFC og MTP. De histologiske billeder til visuel estimatklassificering blev opdelt i tre grupper (Sham med "0" SCB-fortykkelsesscore, DMM med "0" SCB-fortykkelsesscore og DMM med SCB-fortykkelsesscore 1-3). Bemærk: De kvantitative SCB-tykkelsesværdier fra alle tre observatører for DMM-billederne med en "0" visuel SCB-fortykningsscore var signifikant højere end for Sham-billederne med en "0" visuel score, hvilket indikerer, at den kvantitative måling er mere følsom end den visuelle klassificering til mild SCB-fortykkelse. N = 6. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Metode | Observatør/målscorer | MTP | MFC |
| Korrelationskoefficient mellem observatører (r) | |||
| Kvantitativ måling | A vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A mod .C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B vs. C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Visuel klassificering | D vs. E | 0.6455 | 0.6031 |
| D mod F | 0.6 | 0.7419 | |
| E mod F | 0.6454 | 0.603 | |
| Korrelationskoefficient for interne observatører (r) | |||
| Kvantitativ måling | En | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Visuel klassificering | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tabel 1: Reproducerbarhedssammenligning mellem softwareassisteret kvantitativ måling og visuel estimatklassificering for SCB-tykkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måling af SCB-fortykkelse er en vigtig komponent i histologiske vurderinger af OA-sværhedsgrad. De fleste eksisterende OA-klassificeringssystemer fokuserer primært på bruskændringer15,16,17. En meget anvendt murine osteoarthritisk SCB tykkelsesklassificeringsmetode, der kategoriserer SCB-fortykkelse som mild, moderat og svær, er stort set subjektiv, og dens pålidelighed er ikke fuldt valideret15. Den foreliggende undersøgelse har udviklet og valideret en ny måleprotokol til kvantificering af SCB-tykkelse, som omfatter følgende trin: oprettelse af knæ-OA i mus, forberedelse af vævssektioner og histologiske billeder, kvantitativ måling af slidgigt subchondral knogle med ImageJ-software og statistisk analyse for at validere protokollens følsomhed og reproducerbarhed.
Selvom de generelle teknikker i denne protokol følger instruktionerne i ImageJ-software, har vi inkluderet trinvise tekniske detaljer for at gøre nye brugere lettere at følge og validere reproducerbarheden. BoneJ-programmet, et plug-in af ImageJ-software, fungerer godt til måling af 2D sort / hvide billeder, men fungerer ikke godt til at udelukke knoglemarvsareal fra det samlede areal af SCB på grund af ligheden mellem skygge mellem knoglemarv og SCB-stof i sort / hvid. I modsætning hertil kan de trinvise metoder, der er beskrevet i den aktuelle protokol, anvendes på alle farve histologiske billeder ved hjælp af farvetærskelfunktionen til automatisk at adskille SCB-stoffet fra knoglemarven og derved måle netto SCB-tykkelse. En ny metode (ikke en del af ImageJ) til beregning af SCB-densitet (netto SCB-areal mm2/1,0 mm2 ROI) er inkluderet i den nuværende protokol.
Protokollen præsenteret i denne artikel har flere fordele. For det første er ImageJ et gratis softwaresystem og er let tilgængeligt på NIH's websted. For det andet er det nye system let at lære og anvende; den kvantitative måling tager kun 5-6 minutter pr. SCB ROI. For det tredje er resultaterne fra det nye system meget reproducerbare med meget lave variationer mellem og inden for observatører. Endelig er det nye system mere følsomt over for milde SCB-fortykkelsesændringer end eksisterende visuelle klassificeringssystemer.
En mindre begrænsning ved det nye system er behovet for kontrolbilleder som kalibratorer til statistisk analyse. Dette bør dog ikke være et problem for de fleste OA-projekter, da kontrolbilleder næsten altid er inkluderet til dataanalyse. En anden potentiel begrænsning er, at ImageJ-softwaren kan adskille SCB-stoffer fra knoglemarv baseret på deres farvepixels, som er afhængige af passende farvningsmetoder til at vise forskellige farver for knoglest stof og knoglemarv.
Det nye kvantitative SCB-målesystem er velegnet til kvantificering af SCB-tykkelsen på alle niveauer. For histologiske billeder med bemærkelsesværdig SCB-fortykkelse kan det nye system nøjagtigt kvantificere det nøjagtige areal af knoglestof og derefter konvertere det til knogletæthed (netto SCB mm2 / 1,0 mm2 ROI), der repræsenterer knogletykkelse pr. Arealenhed. For histologiske billeder med ikke-bemærkelsesværdig SCB-fortykkelse, der ikke kan detekteres ved visuel klassificering, kan det nye system identificere en subtil eller mild fortykkelse, der ofte forekommer i en tidlig fase af OA. Derfor kan det nye system bruges til overvågning af OA-progression og in vivo-effekt af OA-terapier i samspil med OA-bruskklassificering. Desuden kan denne protokol også anvendes til måling af SCB-tykkelsen hos andre arter efter justering af størrelsen af SCB's ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health (NIH) under Award Number R01 AR059088, Department of Defense (DoD) under Research Award Number W81XWH-12-1-0304 og Mary and Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
