Summary
تقدم مقالة المنهجية هذه بروتوكول قياس كمي بمساعدة البرمجيات لقياس سمك العظام تحت الغضروف النسيجي في مفاصل الركبة الفئرانية المصابة بالتهاب المفاصل العظمي الفئراني ومفاصل الركبة الطبيعية كضوابط. هذا البروتوكول حساس للغاية للسماكة الدقيقة وهو مناسب للكشف المبكر عن تغيرات العظام تحت الغضروف العظمية المبكرة.
Abstract
سماكة العظام تحت الغضروف والتصلب هي السمات المميزة الرئيسية لهشاشة العظام (OA) ، سواء في النماذج الحيوانية أو في البشر. حاليا ، يتم تحديد شدة سماكة العظام تحت الغضروف النسيجي في الغالب من خلال أنظمة التصنيف شبه الكمي القائمة على التقدير البصري. تقدم هذه المقالة بروتوكولا قابلا للتكرار وسهل التنفيذ لقياس سمك العظام تحت الغضروف الكمي كميا في نموذج فأر من OA الركبة الناجم عن زعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي (DMM). استخدم هذا البروتوكول برنامج ImageJ لقياس سمك العظام تحت الغضروف على الصور النسيجية بعد تحديد منطقة ذات أهمية في اللقمة الفخذية الإنسية وهضبة الظنبوب الطبية حيث يحدث سماكة العظام تحت الغضروف عادة في OA الركبة الناجم عن DMM. تم استخدام الصور النسيجية من مفاصل الركبة مع إجراء صوري كضوابط. وأشار التحليل الإحصائي إلى أن نظام قياس العظام الكمي تحت الغضروف الذي تم تطويره حديثا كان قابلا للتكرار بدرجة كبيرة مع وجود اختلافات منخفضة داخل المراقبين وفيما بينهم. تشير النتائج إلى أن البروتوكول الجديد أكثر حساسية لسماكة العظام تحت الغضروف الدقيقة أو الخفيفة من أنظمة التصنيف البصري المستخدمة على نطاق واسع. هذا البروتوكول مناسب للكشف عن كل من التغيرات المبكرة والمتقدمة في العظام تحت الغضروف ولتقييم فعالية علاجات OA في الجسم الحي بالتنسيق مع تصنيف غضروف OA.
Introduction
هشاشة العظام (OA) ، التي تتميز شعاعيا بتضييق مساحة المفاصل بسبب فقدان الغضروف المفصلي ، والخلايا العظمية ، وتصلب العظام تحت الغضروف (SCB) ، هي الشكل الأكثر شيوعا لالتهاب المفاصل 1,2. على الرغم من أن دور العظام المحيطة بالمفصل في مسببات OA غير مفهوم تماما ، إلا أن تكوين الخلايا العظمية والتصلب SCB يعتقد عموما أنهما نتائج لعملية المرض وليس العوامل المسببة ، ولكن التغييرات في بنية / شكل العظام حول المفصل والبيولوجيا قد تسهم في تطور وتطور OA3,4 . يعد تطوير نظام دقيق وسهل التنفيذ لتصنيف الزراعة العضوية ، بما في ذلك قياس SCB ، أمرا بالغ الأهمية للدراسات المقارنة بين مختبرات الأبحاث وفي تقييم فعالية العوامل العلاجية المصممة لمنع أو تخفيف تطور OA.
تم بناء SCB مع صفيحة عظمية رقيقة تشبه القبة وطبقة أساسية من العظام التربيقية. صفيحة SCB هي الصفيحة القشرية ، التي تقع بالتوازي مع الغضروف المتكلس وتحته مباشرة. تخترق الفروع الصغيرة من الأوعية الشريانية والوريدية ، وكذلك الأعصاب ، القنوات الموجودة في صفيحة SCB ، وتتواصل بين الغضروف المتكلس والعظم التربيقي. يحتوي العظم التربيقي تحت الغضروف على أوعية دموية وأعصاب حسية ونخاع عظمي وهو أكثر مسامية ونشاطا استقلابيا من لوحة SCB. لذلك ، يمارس SCB وظائف امتصاص الصدمات والداعمة وهو مهم أيضا لإمدادات المغذيات الغضروفية والتمثيل الغذائي في المفاصل الطبيعية5،6،7،8.
سماكة SCB (في علم الأنسجة) والتصلب (في التصوير الشعاعي) هي السمات المميزة الرئيسية للزراعة العضوية ومجالات البحث الرئيسية في الفيزيولوجيا المرضية OA. يعد قياس سماكة SCB مكونا مهما في التقييمات النسيجية لشدة OA. وقد أدى التصوير الشعاعي المجهري الرقمي الذي تم الإبلاغ عنه سابقا لقياس الكثافة المعدنية للقوارض SCB9 وكذلك التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT) القائم على قياس SCB الكمي في نماذج القوارض من OA10,11,12,13 إلى تحسين فهمنا لبنية SCB ودور تغيرات SCB في الفيزيولوجيا المرضية ل OA. كما تم تحديد مساحة SCB وسمكها كميا باستخدام شرائح نسيجية باستخدام نظام كمبيوتر متطور مع برنامج محدد ومكلف لقياس الأنسجة العظمية14. ومع ذلك، فإن أنظمة تصنيف النفاذ المفتوح شبه الكمي القائمة على التقدير البصري، بما في ذلك تصنيف سماكة SCB، تستخدم على نطاق أوسع من التصوير المقطعي المحوسب الجزئي في الوقت الحالي لأن أنظمة الدرجات سهلة الاستخدام، خاصة لفحص العديد من الصور النسيجية. ومع ذلك ، فإن معظم أنظمة تصنيف OA الحالية تركز بشكل أساسي على تغيرات الغضاريف15،16،17. طريقة تصنيف سمك SCB العظمية المستخدمة على نطاق واسع والتي تصنف سماكة SCB على أنها خفيفة ومعتدلة وشديدة هي طريقة ذاتية إلى حد كبير ، ولم يتم التحقق من موثوقيتها بالكامل15. بروتوكول قياس سمك SCB الموثوق به وسهل التنفيذ خطوة بخطوة إما غير مطور بالكامل أو غير موحد.
هدفت هذه الدراسة إلى تطوير بروتوكول قابل للتكرار وحساس وسهل التنفيذ لقياس سمك SCB كميا في نموذج الماوس من الزراعة العضوية (OA). أظهرت اختبارات القياس الصارمة والتحليل الإحصائي أن بروتوكول القياس الكمي المدعوم ببرنامج ImageJ هذا يمكن أن يحدد سمك SCB في كل من مفاصل الركبة العادية والتهاب المفاصل العظمي. البروتوكول الذي تم تطويره حديثا قابل للتكرار وأكثر حساسية لتغيرات SCB الخفيفة من أنظمة التصنيف المرئي المستخدمة على نطاق واسع. يمكن استخدامه للكشف المبكر عن تغيرات SCB العظمية المفصلية وتقييم فعالية علاجات OA في الجسم الحي بالتنسيق مع تصنيف غضروف OA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية المدرجة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في المركز الطبي بجامعة كانساس ، وفقا لجميع القوانين واللوائح الفيدرالية والولائية.
1. إنشاء OA الركبة في الفئران
- إنشاء نموذج فأر من OA الركبة عن طريق زعزعة الاستقرار الجراحي للغضروف المفصلي الإنسي (DMM) كما هو موضح من قبل Glasson et al.18 في 22 فئران BALB / c من النوع البري في عمر 10-11 أسبوعا. إجراء جراحة صورية كإجراء تحكم على ثمانية فئران لها نفس الخلفية والعمر.
ملاحظة: تم استخدام كلا الجنسين في المشروع الأصلي لتلبية متطلبات المعاهد الوطنية للصحة للنظر في الجنس كمتغير بيولوجي ، على الرغم من أن فحص الفرق بين الجنسين ليس هو نطاق هذا البروتوكول. - تخدير الحيوانات عن طريق استنشاق الأيزوفلوران. تحقق من عمق التخدير من خلال مراقبة معدل التنفس / الجهد وعدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم / الذيل. ضع الحيوانات في وضع ضعيف.
- حلق الجلد في منطقة الركبة وتنظيف الجلد باستخدام Povidone-Iodine + فرك الجلد الكحولي ؛ ثلاث دورات بالتناوب.
- قم بإجراء DMM على الركبة اليمنى تحت المجهر الجراحي. كشف مفصل الركبة من خلال شق شبه رضفي إنسي (طوله 1.2-1.5 سم) وشق كبسولة المفصل. حافظ على سلامة الرضفة والوتر الرضفي. بعد التعرض الدقيق للرباط السحفي الإنسي (MML) الذي يثبت الغضروف المفصلي الإنسي بهضبة الظنبوب، قم بنقله بمقص جراحي مجهري لزعزعة استقرار الغضروف المفصلي الإنسي.
- قم بإجراء جراحة صورية على الركبة اليمنى كإجراء تحكم ، حيث تم تصور MML ولكن لم يتم نقله.
- أغلق كبسولة المفصل مع 8-0 خيوط متعددة الغلاكتين قابلة للامتصاص وشق الجلد مع 7-0 خيوط غير قابلة للامتصاص لكل من إجراءات DMM و sham لضمان الاستخدام السليم للركبة بمجرد حدوث الشفاء.
- حقن SR Buprenorphine (0.20-0.5 ملغم / كغ) تحت الجلد (SC) مباشرة قبل الإجراء الجراحي للتسكين ، والذي يوفر تخفيف الألم لمدة تصل إلى 72 ساعة بعد حقنة واحدة. مراقبة الحيوانات التي يتم تشغيلها بعد الجراحة.
- القتل الرحيم للحيوانات باستخدام غرفة CO2 في 2 و 8 و 16 أسبوعا بعد الجراحة. بعد فقدان الوعي ، تأكد من وفاة الحيوانات بطريقة فيزيائية (فتح تجويف الصدر). وتتفق أساليب القتل الرحيم هذه مع توصيات الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA).
- حصاد مفاصل الركبة للتحليلات النسيجية في 2 و 8 و 16 أسبوعا بعد جراحة DMM وفي 2 و 16 أسبوعا بعد جراحة الشام للحصول على مفاصل ركبة الفأر بدرجات مختلفة من شدة OA أو سماكة SCB.
2. إعداد أقسام الأنسجة والصور النسيجية
- إصلاح عينات أنسجة مفصل ركبة الفأر في 2٪ من بارافورمالديهايد ، وإزالة الكلس منها في 25٪ من حمض الفورميك ، وتضمينها في البارافين ، وقسم كوروناليا لفحص كل من المقصورات الإنسية والجانبية.
- قطع عينات الركبة من الجانب الخلفي من الركبة باستخدام ميكروتوم وجمع أقسام الأنسجة التي يبلغ سمكها 5 ميكرومتر على فترات 70-80 ميكرومتر للحصول على حوالي 40 شريحة أنسجة عبر مفصل الركبة بأكمله. يشير تقدير بمساعدة الميكرومتر إلى أن أرقام الشرائح 1-6 هي من الجزء الخلفي البعيد ، و 11-18 من منتصف الخلف ، و 23-30 من الوسط الأمامي ، و 35-40 من الجزء الأمامي البعيد من مفصل الركبة. تخلص من الأقسام المتداخلة أو اجمعها بحثا عن بقع إضافية.
- قم بإجراء Safranin-O والبقع الخضراء السريعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد خلايا الغضروف والمصفوفات على وجه التحديد في كل خمس شرائح. قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوسين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لفحص مفاصل الركبة على المستويات الخلوية والأنسجة كما هو موضح سابقا19،20،21،22.
- احصل على صور نسيجية باستخدام مجهر مجهز بكاميرا رقمية. تم إجراء التحليل النسيجي المرضي العام ودرجات OA النسيجية كما هو موضح سابقا15،19،20،21،22.
3. القياس الكمي للعظم تحت الغضروفي العظمي مع برنامج ImageJ
- قم بتنزيل برنامج ImageJ وافتح الصور النسيجية ذات الاهتمام.
- قم بتنزيل ImageJ المجمعة مع Java 1.8.0_172 من https://imagej.nih.gov/ij/.
- افتح برنامج ImageJ. انقر فوق علامة التبويب ملف على الشريط وانقر فوق الخيار فتح لفتح الصورة النسيجية.
- ابحث عن عنوان دليل الملفات، وحدد ملف الصورة، ثم انقر فوق فتح.
- معايرة ImageJ مع الميكرومتر على الصور النسيجية.
- استخدم أداة الخط المستقيم لرسم وحدة طول واحدة على الميكرومتر وانقر فوق تحليل > (ثم) تعيين المقياس. اضبط المسافة المعروفة ونسبة العرض إلى الارتفاع للبكسل على 1 وانقر فوق موافق. يمكن ل ImageJ تحويل طول البكسل إلى طول الوحدة على الميكرومتر.
- اضبط العامل المقاس على المساحة. انقر فوق تحليل > تعيين القياس وتحديد المنطقة والحد من المربع الحد إلى العتبة ضمن نافذة جديدة. تقوم هذه الخطوة بتعيين ImageJ لقياس المعلمة "Area" ضمن "العتبة" المحددة.
- قياس إجمالي منطقة اهتمام العظام تحت الغضروفية (SCB).
- حدد منطقة اهتمام SCB (ROI) كما هو موضح في المربعات البرتقالية في الشكل 1A ، والتي تغطي الصفيحة القشرية SCB وجزء من العظم التربيقي الأساسي المجاور للصفيحة القشرية في اللقمة الفخذية الإنسية (MFC) وهضبة الظنبوب الإنسية (MTP) بأبعاد محددة لكل عائد على الاستثمار. عادة ما يحدث سماكة SCB العظمية المفصلية في هذه المناطق. حدد عائد الاستثمار SCB بنفس الشكل والبعد في كل MFC أو MTP لجميع المفاصل التي تم فحصها لضمان قياس نفس حجم عائد الاستثمار المحدد لجميع الحيوانات.
- ارسم المخطط التفصيلي لإجمالي مساحة اهتمام SCB باستخدام أداة تحديد المضلع أسفل النافذة الرئيسية ل ImageJ.
ملاحظة: تمنح أدوات التحديد النظام عتبة للحد من المساحة المقاسة. - قياس إجمالي مساحة SCB: بعد تحديد العتبة، انقر على تحليل > قياس. سيتم فتح نافذة "النتائج" مع قياس المنطقة.
- قياس منطقة مادة العظام التي تحتوي على عظام صلبة بدون نخاع العظم.
- انقر فوق تحرير > مسح خارج لاستبعاد المساحة خارج مساحة SCB الإجمالية.
ملاحظة: تكون منطقة SCB الإجمالية مرئية فقط بعد النقر فوق الخيار مسح خارجي. ستتحول الصورة خارج إجمالي مساحة SCB إلى اللون الأسود. تسمح هذه الخطوة للمراقبين بالتركيز على منطقة مادة العظام داخل منطقة الاهتمام. - انقر فوق صورة > ضبط عتبة اللون > لفتح نافذة "لون العتبة". انقر على الأصل في أسفل نافذة "لون العتبة" لاستعادة الصورة إلى الحالة الأصلية. استخدم أدوات التحديد في الخطوة 3.3.2 لرسم مربع صغير في منطقة المادة العظمية. انقر على خيار العينة في أسفل نافذة "لون العتبة" لتحديد منطقة مادة العظام.
ملاحظة: يسمح خيار "العينة" في نافذة "لون العتبة" ل ImageJ بتحديد جميع وحدات البكسل نفسها على إجمالي مساحة SCB مثل منطقة عينة مادة العظام. ستتحول منطقة المادة العظمية المحددة إلى اللون الأحمر. - انقر فوق تحديد في أسفل نافذة توازن لون العتبة لإنشاء عتبة قياس مساحة. انقر على تحليل > القياس في القائمة الرئيسية ImageJ ، وستظهر نتيجة قياس منطقة مادة العظام في نافذة "النتائج".
- احفظ بيانات إجمالي مساحة SCB ومنطقة مادة العظام.
- انقر فوق تحرير > مسح خارج لاستبعاد المساحة خارج مساحة SCB الإجمالية.
- احسب نسبة مساحة مادة العظام (mm2) إلى إجمالي مساحة SCB (mm2) ذات الأهمية والتي تمثل سمك مادة العظام (mm2/1.0 mm2) داخل إجمالي مساحة SCB.
- قم بقياس سمك SCB للمقاطع/الصور النسيجية (كما هو موضح في الخطوات 3.1-3.5) للمناطق الخلفية البعيدة والوسطى الخلفية والوسطى الأمامية والبعيدة (كما هو موضح في الخطوة 2.2) من النفاذ المفتوح الناجم عن DMM لتقييم سمك SCB الخاص بالمنطقة من 6 مفاصل ركبة (الشكل 1B).
ملاحظة: يمكن أن يؤدي ذلك إلى التحقق من موثوقية بروتوكول القياس الكمي هذا لأنه من المعروف أن تغيرات SCB لالتهاب المفاصل العظمي تتزامن مع آفات الغضاريف وأن تلف الغضروف العظمي المفصلي مع سماكة SCB يكون أكثر حدة في المناطق الحاملة للوزن (الجزء الأوسط) من مفاصل ركبة القوارض14,15. لذلك ، من المناسب استخدام الأقسام المتوسطة للقياس الكمي لسماكة SCB العظمية المفصلية.
4. الإحصائيات
- إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام البيانات من القياس الكمي والدرجات البصرية لسمك SCB. تحديد التباين بين المراقبين وداخلهم وقابليتهم للتكرار من خلال تحليلات معامل الارتباط من بيرسون.
- تحديد أهمية الاختلافات بين مجموعات الدراسة باستخدام اختبارات t الخاصة بالطالب أو ANOVA أحادية الاتجاه ، متبوعة باختبار ما بعد مخصص (Tukey) باستخدام برنامج جداول البيانات. ضع في اعتبارك أن قيمة p التي تقل عن 0.05 ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقارنة قابلية التكرار بين تقدير التقدير البصري والقياس الكمي بمساعدة ImageJ:
تم تسجيل سمك SCB في 48 منطقة ذات أهمية (ROI) (24 MFC و 24 MTP) ، تم تعريفه من قسم منتصف كل ركبة من 24 ركبة / من قبل ثلاثة أفراد مستقلين باستخدام مخطط التسجيل البصري الحالي 0-3 كما هو موضح في الأدبيات 15,23 ، حيث 0 = طبيعي (لا سماكة SCB) ، 1 = معتدل ، 2 = معتدل ، و 3 = سماكة SCB شديدة. تم اختيار هذه الصور من ثلاث نقاط زمنية مختلفة بعد العملية الجراحية في 2 و 8 و 16 أسبوعا بعد إجراء DMM أو إجراء صوري. عادة ، أظهرت الفئران التي لديها إجراء DMM درجة سماكة SCB البصرية 0 في أسبوعين بعد العملية ، ودرجات 1-2 في 8 أسابيع ، ودرجات 2-3 في 16 أسبوعا. ثم تم قياس سمك SCB لهذه الصور النسيجية كميا من قبل ثلاثة مراقبين مستقلين آخرين باستخدام برنامج ImageJ للتحقق من قابلية الاستنساخ وحساسية المخطط الجديد. يتم عرض الصور النسيجية التمثيلية مع أو بدون عائد استثمار محدد في MFC و MTP للدرجات البصرية أو القياسات الكمية في الشكل 2 ، حيث تم تقسيم الصور التي تم فحصها إلى ثلاث مجموعات: الركبة الصورية (النتيجة البصرية 0) ، ركبة DMM (النتيجة البصرية 0) ، وركبة DMM (النتيجة البصرية 1-3).
وترد في الجدول 1 تحليلات مقارنة مفصلة لقابلية الاستنساخ بين القياس الكمي بمساعدة ImageJ والتقدير البصري لسمك SCB. تشير اختبارات معامل الارتباط إلى أن القياس الكمي كان أكثر قابلية للتكرار نسبيا من نظام تقدير التقدير البصري.
قابلية التكرار بين المراقبين وداخلهم:
وأظهرت اختبارات معامل الارتباط قابلية عالية لتكرار القياسات بمساعدة ImageJ مع معاملات ارتباط بين المراقبين بلغت >0.93 بين المراقب A وB وC لمتوسط القياسات الأولى والثانية في منطقتي MTP وMFC (الشكل 3). كما أظهر تحليل التباين داخل المراقب لنفس المجموعة من الصور النسيجية قابلية عالية للتكرار بين درجتي القياس الأولى والثانية لكل من المراقبين الثلاثة مع معامل ارتباط داخل المراقب يبلغ >0.95 لجميع المراقبين (الشكل 4).
حساسية:
لتقييم ما إذا كان نظام قياس SCB الكمي الجديد أكثر حساسية لتغيرات سماكة SCB العظمية المفصلية من نظام الدرجات البصرية المستخدم على نطاق واسع ، تم تقييم 48 مجالا من مجالات الاهتمام بالصور النسيجية (24 MFC و 24 MTP) من 24 ركبة / لأول مرة من قبل ثلاثة أفراد مستقلين من ذوي الخبرة في علم أمراض الأنسجة العضوية وأنظمة تصنيف OA الحالية. تم تصنيف سماكة SCB باستخدام مخطط تسجيل مرئي 0-3 كما هو موضح أعلاه. ثم تم إجراء القياس الكمي بمساعدة ImageJ على نفس المجموعة من الصور النسيجية المتدرجة بصريا من قبل ثلاثة أفراد آخرين أصيبوا بالعمى عن نتائج تصنيف OA البصرية. تم قياس سمك SCB من MFC و MTP لكل صورة كميا باستخدام ImageJ كما هو موضح في قسم البروتوكول. أظهرت النتائج أن متوسط سمك SCB (mm2/1.0 mm2) لصور DMM مع درجات سماكة SCB البصرية 1-3 كان أعلى بكثير من صور Sham ذات درجة سماكة بصرية "0". والأهم من ذلك، أن متوسط سمك SCB لصور DMM ذات درجة سماكة SCB المرئية "0" كان أيضا أعلى بكثير من سمك صور الشام ذات الدرجة البصرية "0" (الشكل 5). تشير البيانات بقوة إلى أن قياس SCB الكمي بمساعدة ImageJ أكثر حساسية لتغيرات سماكة SCB المبكرة والخفيفة من طريقة التصنيف البصري.
الشكل 1: الصور النسيجية مع Safranin-O والتلطيخ الأخضر السريع من مجموعات Sham و DMM لقياس SCB الكمي بمساعدة ImageJ. (A) تحدد المربعات الموضحة بخط أصفر منقط منطقة اهتمام SCB (ROI). يتم تمييز منطقة مادة العظام داخل الصناديق باللون البرتقالي. يمكن قياس سمك SCB في اللقمة الفخذية الإنسية (MFC) وهضبة الظنبوب الإنسية (MTP) باستخدام برنامج ImageJ. يتم توسيع الأبعاد الدقيقة لعائد الاستثمار في MFC و MTP لتعزيز الرؤية. (ب) تم تحديد سمك SCB للصور النسيجية من المناطق الخلفية البعيدة والوسطى والوسطى الأمامية والبعيدة من MTP في 16 أسبوعا بعد DMM لتقييم سمك SCB الخاص بالمنطقة. N = 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور نسيجية تمثيلية مع Safranin-O وتلطيخ أخضر سريع من مجموعات Sham و DMM لتصنيف SCB المرئي وقياس SCB الكمي. اللوحات العلوية: صور مجهرية لمجموعات الشام وDMM لتصنيف SCB المرئي. الألواح السفلية: الصور المجهرية لمجموعات الشام و DMM لقياس SCB الكمي بمساعدة ImageJ. تحدد المربعات الموضحة بخط أصفر منقط (مصنوع باستخدام Adobe illustrator) في MFC و MTP منطقة SCB المثيرة للاهتمام. يتم تمييز منطقة مادة العظام (باستثناء نخاع العظام) داخل الصناديق باللون البرتقالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختبارات التباين بين المراقبين. وتشير تحليلات معامل الارتباط إلى وجود قابلية عالية للتكرار بين ثلاثة مراقبين (المراقبون ألف وباء وجيم) لسمك البارافينات المكلورة قصيرة السلسلة في المتوسط المتحرك من القياسين 1 و2 في منطقتي MTP وMFC المعنيتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اختبارات التباين داخل المراقب. تشير تحليلات معامل الارتباط إلى وجود قابلية عالية للتكرار بين قياسات سمك SCB 1st و 2nd في منطقتي MTP و MFC ذات الأهمية لكل من المراقبين A و B و C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليلات الحساسية المقارنة للدرجات البصرية والقياس الكمي بمساعدة ImageJ لسمك SCB في MFC وMTP. تم تقسيم الصور النسيجية لدرجات التقدير البصري إلى ثلاث مجموعات (الشام مع درجة سماكة SCB "0" ، DMM مع درجة سماكة SCB "0" ، و DMM مع درجة سماكة SCB 1-3). ملاحظة: كانت قيم سمك SCB الكمية من جميع المراقبين الثلاثة لصور DMM ذات درجة سماكة SCB المرئية "0" أعلى بكثير من تلك الموجودة في صور Sham ذات الدرجة البصرية "0" ، مما يشير إلى أن القياس الكمي أكثر حساسية من الدرجات البصرية لسماكة SCB الخفيفة. N = 6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أسلوب | مراقب/هداف | الخطة المتوسطة الأجل | MFC |
| معامل الارتباط بين المراقبين (r) | |||
| القياس الكمي | أ ضد.B | 0.9685 | 0.9421 |
| أ مقابل .C | 0.9413 | 0.9427 | |
| ب مقابل . C | 0.9109 | 0.9288 | |
| الدرجات البصرية | D vs. E | 0.6455 | 0.6031 |
| D vs. F | 0.6 | 0.7419 | |
| E vs. F | 0.6454 | 0.603 | |
| معامل الارتباط داخل المراقب (r) | |||
| القياس الكمي | A | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| الدرجات البصرية | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
الجدول 1: مقارنة قابلية التكرار بين القياس الكمي بمساعدة البرمجيات وتقدير التقدير البصري لسمك SCB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد قياس سماكة SCB مكونا مهما في التقييمات النسيجية لشدة OA. تركز معظم أنظمة تصنيف OA الحالية بشكل أساسي على تغيرات الغضاريف15،16،17. طريقة تصنيف سمك SCB العظمية الفئرانية المستخدمة على نطاق واسع والتي تصنف سماكة SCB على أنها خفيفة ومعتدلة وشديدة هي طريقة ذاتية إلى حد كبير ، ولم يتم التحقق من موثوقيتها بالكامل15. وقد طورت هذه الدراسة وصادقت على بروتوكول قياس جديد لقياس سمك SCB كميا، والذي يتضمن الخطوات التالية: إنشاء OA الركبة في الفئران، وإعداد أقسام الأنسجة والصور النسيجية، والقياس الكمي للعظام تحت الغضروفية العظمية المفصلية باستخدام برنامج ImageJ، والتحليل الإحصائي للتحقق من حساسية البروتوكول وقابليته للتكرار.
على الرغم من أن التقنيات العامة لهذا البروتوكول تتبع تعليمات برنامج ImageJ ، فقد قمنا بتضمين تفاصيل تقنية خطوة بخطوة لتسهيل متابعة المستخدمين الجدد والتحقق من صحة قابلية التكرار. يعمل برنامج BoneJ ، وهو مكون إضافي لبرنامج ImageJ ، بشكل جيد لقياس الصور بالأبيض والأسود 2D ولكنه لا يعمل بشكل جيد لاستبعاد منطقة نخاع العظم من المساحة الإجمالية ل SCB بسبب تشابه الظل بين نخاع العظم ومادة SCB بالأبيض والأسود. في المقابل ، يمكن تطبيق الطرق التدريجية الموضحة في البروتوكول الحالي على جميع الصور النسيجية الملونة باستخدام وظيفة عتبة اللون لفصل مادة SCB تلقائيا عن نخاع العظام ، وبالتالي قياس سمك SCB الصافي. يتم تضمين طريقة جديدة (ليست جزءا من ImageJ) لحساب كثافة SCB (صافي مساحة SCB mm2 / 1.0 mm2 من عائد الاستثمار) في البروتوكول الحالي.
البروتوكول المقدم في هذه المقالة له العديد من المزايا. أولا ، ImageJ هو نظام برمجي مجاني ومتاح بسهولة على موقع المعاهد الوطنية للصحة. ثانيا، النظام الجديد سهل التعلم والتطبيق. يستغرق القياس الكمي 5-6 دقائق فقط لكل عائد استثمار SCB. ثالثا، إن نتائج النظام الجديد قابلة للتكرار بدرجة كبيرة مع تباين منخفض جدا بين المراقبين وداخلهم. وأخيرا ، فإن النظام الجديد أكثر حساسية لتغيرات سماكة SCB الخفيفة من أنظمة التصنيف المرئية الحالية.
أحد القيود البسيطة للنظام الجديد هو الحاجة إلى صور التحكم كمعايرة للتحليل الإحصائي. ومع ذلك ، لا ينبغي أن يكون هذا مشكلة بالنسبة لمعظم مشاريع النفاذ المفتوح حيث يتم تضمين صور التحكم دائما تقريبا لتحليل البيانات. هناك قيد محتمل آخر هو أن برنامج ImageJ يمكنه فصل مواد SCB عن نخاع العظم بناء على وحدات البكسل اللونية الخاصة بها ، والتي تعتمد على طرق التلطيخ المناسبة لإظهار ألوان مميزة لمادة العظام ونخاع العظام.
نظام قياس SCB الكمي الجديد مناسب لقياس سمك SCB على جميع المستويات. بالنسبة للصور النسيجية ذات سماكة SCB الملحوظة ، يمكن للنظام الجديد تحديد المساحة الدقيقة لمادة العظام بدقة ثم تحويلها إلى كثافة العظام (صافي SCB mm2 / 1.0 mm2 من ROI) التي تمثل سمك العظام لكل وحدة مساحة. بالنسبة للصور النسيجية ذات سماكة SCB غير الملحوظة التي لا يمكن اكتشافها عن طريق الدرجات البصرية ، يمكن للنظام الجديد تحديد سماكة خفية أو خفيفة تحدث غالبا في مرحلة مبكرة من الزراعة العضوية. لذلك ، يمكن استخدام النظام الجديد لمراقبة تطور OA وفي الجسم الحي فعالية علاجات OA بالتنسيق مع تصنيف غضروف OA. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لقياس سمك SCB في الأنواع الأخرى بعد ضبط حجم عائد الاستثمار SCB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب تنافسي في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل والأمراض العضلية الهيكلية والجلدية التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01 AR059088 ، ووزارة الدفاع (DoD) تحت رقم جائزة البحث W81XWH-12-1-0304 ، ومنحة ماري وبول هارينغتون للأستاذية المتميزة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
