Summary
Denne metodikkartikkelen presenterer en programvareassistert kvantitativ måleprotokoll for å kvantifisere histologiske subkondrale beintykkelser i murine osteoarthritic kneledd og normale kneledd som kontroller. Denne protokollen er svært følsom for subtil fortykning og er egnet for å oppdage tidlige osteoarthritic subchondral bein endringer.
Abstract
Subkondral benfortykning og sklerose er de viktigste kjennetegnene på slitasjegikt (OA), både i dyremodeller og hos mennesker. For tiden bestemmes alvorlighetsgraden av den histologiske subkondrale beinfortykning for det meste av visuelle estimeringsbaserte semi-kvantitative graderingssystemer. Denne artikkelen presenterer en reproduserbar og lett utført protokoll for kvantitativt å måle subkondral bentykkelse i en musemodell av kne OA indusert ved destabilisering av medial menisk (DMM). Denne protokollen brukte ImageJ-programvare for å kvantifisere subkondral bentykkelse på histologiske bilder etter å ha definert en region av interesse for medial femoral condyle og det medisinske tibialplatået der subkondriell benfortykning vanligvis forekommer i DMM-indusert kne OA. Histologiske bilder fra kneledd med en falsk prosedyre ble brukt som kontroller. Statistisk analyse indikerte at det nyutviklede kvantitative subkondrale beinmålingssystemet var svært reproduserbart med lave intra- og interobservatørvariasjoner. Resultatene tyder på at den nye protokollen er mer følsom for subtil eller mild subkondral benfortykning enn de mye brukte visuelle graderingssystemene. Denne protokollen er egnet for å oppdage både tidlige og utviklende osteoarthritic subkondrale beinforandringer og for å vurdere in vivo effekt av OA behandlinger i samråd med OA brusk gradering.
Introduction
Slitasjegikt (OA), karakterisert radiografisk ved innsnevring av fellesrom på grunn av tap av leddbrusk, osteofytter og subkondralben (SCB) sklerose, er den vanligste formen for leddgikt1,2. Selv om rollen som peri-leddben i etiologien til OA ikke er fullt ut forstått, er osteofyttdannelse og SCB-sklerose generelt antatt å være resultatene av sykdomsprosessen i stedet for årsaksfaktorer, men endringer i peri-artikulær benarkitektur / form og biologi kan bidra til utvikling og progresjon av OA3,4 . Utviklingen av et nøyaktig og lett utført OA-graderingssystem, inkludert SCB-måling, er avgjørende for komparative studier blant forskningslaboratorier og i evaluering av effekten av terapeutiske midler designet for å forhindre eller dempe OA-progresjon.
SCB er bygget med en tynn kuppellignende benplate og et underliggende lag av trabekulært bein. SCB-platen er den kortikale lamellen, som ligger parallelt med og umiddelbart under den forkalkede brusk. Små grener av arterielle og venøse kar, samt nerver, trenger gjennom kanalene i SCB-platen, kommuniserer mellom forkalket brusk og trabekulært bein. Det subkondriale trabekulære beinet inneholder blodkar, sensoriske nerver, benmarg og er mer porøs og metabolsk aktiv enn SCB-platen. Derfor utøver SCB støtabsorberende og støttende funksjoner og er også viktig for brusk næringsforsyning og metabolisme i normale ledd5,6,7,8.
SCB-fortykning (i histologi) og sklerose (i radiografi) er de viktigste kjennetegnene til OA og sentrale forskningsområder innen OA-patofysiologi. Måling av SCB-fortykning er en viktig komponent i histologiske vurderinger av OA-alvorlighetsgrad. Tidligere rapportert digital mikroradiografi for måling av gnager SCB mineraltetthet9 samt mikro-beregnet tomografi (mikro-CT) basert kvantitativ SCB-måling i gnagermodeller av OA10,11,12,13 har forbedret vår forståelse av SCB-struktur og rollen som SCB-endringer i OA-patofysiologi. SCB-området og tykkelsen har også blitt kvantifisert med histologiske lysbilder ved hjelp av et sofistikert datasystem med spesifikk og dyr ben histomorfometri programvare14. Likevel er visuelle estimatbaserte semi-kvantitative OA-graderingssystemer, inkludert SCB-fortykningsgradering, mer brukt enn mikro-CT for tiden fordi graderingssystemene er enkle å bruke, spesielt for screening av mange histologiske bilder. Imidlertid fokuserer de fleste eksisterende OA-graderingssystemer hovedsakelig på bruskendringer15,16,17. En mye brukt osteoarthritic SCB tykkelse gradering metode som kategoriserer SCB fortykning som mild, moderat og alvorlig er i stor grad subjektiv, og påliteligheten har ikke blitt fullstendig validert15. En pålitelig og lett utført trinnvis osteoarthritic SCB tykkelse måleprotokoll er enten ikke fullt utviklet eller ikke-standardisert.
Denne studien hadde som mål å utvikle en reproduserbar, sensitiv og lett utført protokoll for kvantitativt å måle SCB-tykkelsen i en musemodell av OA. Våre strenge måletester og statistiske analyser viste at denne ImageJ programvareassisterte kvantitative måleprotokollen kunne kvantifisere SCB-tykkelsen i både normale og osteoarthritic kneledd. Den nyutviklede protokollen er reproduserbar og mer følsom for milde SCB-endringer enn de mye brukte visuelle graderingssystemene. Den kan brukes til å oppdage tidlige osteoarthritic SCB endringer og for å vurdere in vivo effekt av OA behandlinger i samråd med OA brusk gradering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer som er inkludert i denne protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kansas Medical Center, i samsvar med alle føderale og statlige lover og forskrifter.
1. Opprettelse av kne OA hos mus
- Lag en musemodell av kneet OA ved kirurgisk destabilisering av medial menisk (DMM) som beskrevet av Glasson et al.18 i 22 wild-type BALB / c mus ved 10-11 ukers alder. Utfør sham kirurgi som en kontrollprosedyre på åtte mus med samme bakgrunn og alder.
MERK: Begge kjønn ble brukt til det opprinnelige prosjektet for å oppfylle NIH-kravet om behandling av kjønn som biologisk variabel, selv om undersøkelse av kjønnsforskjell ikke er omfanget av denne protokollen. - Bedøv dyr ved innånding av Isofluran. Kontroller dybden på anestesi ved å overvåke åndedrettsfrekvensen/-innsatsen og mangelen på respons på tå/haleklemme. Sett dyr i en liggende stilling.
- Barber huden i kneområdet og rengjør huden med Povidone-jod + alkoholhudskrubb; tre vekslende sykluser.
- Utfør DMM-prosedyren på høyre kne under et kirurgisk mikroskop. Utsett kneleddet gjennom et medial parapatellar snitt (1,2-1,5 cm i lengde) og øk leddkapselen. Hold patella og patellar sene intakt. Etter nøye eksponering av medial meniscotibial ligament (MML) som forankrer medial menisk til tibial platået, transect det med mikro-kirurgisk saks for å destabilisere medial menisk.
- Utfør sham kirurgi på høyre kne som en kontrollprosedyre, der MML ble visualisert, men ikke transektert.
- Lukk leddkapselen med 8-0 absorberbare polyglactin suturer og hud snitt med 7-0 ikke-absorberbare suturer for både DMM og sham prosedyrer for å sikre riktig bruk av kneet når helbredelse har skjedd.
- Injiser SR Buprenorfin (0,20-0,5 mg/kg) subkutant (SC) umiddelbart før kirurgisk prosedyre for smertestillende midler, som gir smertelindring opptil 72 timer etter en enkelt injeksjon. Overvåk opererte dyr etter operasjonen.
- Avlive dyr ved hjelp av et CO2-kammer ved 2, 8 og 16 uker etter operasjonen. Etter bevisstløshet, bekreft dyrenes død ved en fysisk metode (åpne brysthulen). Disse metodene for eutanasi er i samsvar med anbefalingene fra panelet om eutanasi fra American Veterinary Medical Association (AVMA).
- Høst kneleddene for histologiske analyser ved 2, 8 og 16 uker etter DMM-kirurgi og ved 2 og 16 uker etter Sham-kirurgi for å oppnå muse kneledd med forskjellige grader av OA alvorlighetsgrad eller SCB fortykning.
2. Forberedelse av vevsseksjoner og histologiske bilder
- Fest muse kne leddvev prøver i 2% paraformaldehyd, avkalk dem i 25% maursyre, innebygd i paraffin, og seksjon coronally å undersøke både mediale og laterale rom.
- Klipp kneprøver fra den bakre siden av kneet ved hjelp av en mikrotom og samle vevsseksjoner som er 5-μm tykke med 70-80 μm intervaller for å oppnå ca 40 vev glir over hele kneleddet. En mikrometerassistert estimering antyder at lysbildetallene 1-6 er fra fjerntliggende, 11-18 fra midten av bakre, 23-30 fra midten av fremre og 35-40 fra den fjerne fremre delen av kneleddet. Kast eller samle inngripende seksjoner for ytterligere flekker.
- Utfør Safranin-O og raske grønne flekker i henhold til produsentens instruksjoner for å spesifikt identifisere bruskceller og matriser på hver femte lysbilde. Utfør Hematoxylin-Eosin farging i henhold til produsentens instruksjoner for å undersøke kneleddene på cellulære og vevsnivåer som beskrevet tidligere19,20,21,22.
- Skaff deg histologiske bilder med et mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Generell histopatologisk analyse og histopologisk OA gradering ble utført som beskrevet tidligere15,19,20,21,22.
3. Kvantitativ måling av osteoarthritic subchondral bein med ImageJ programvare
- Last ned ImageJ-programvaren og åpne histologiske bilder av interesse.
- Last ned ImageJ med Java 1.8.0_172 fra https://imagej.nih.gov/ij/.
- Åpne ImageJ-programmet. Klikk kategorien Fil på båndet, og klikk alternativet Åpne for å åpne det histologiske bildet.
- Finn filkatalogadressen, merk bildefilen, og klikk Åpne.
- Kalibrer ImageJ med mikrometeret på histologiske bilder.
- Bruk det lineære verktøyet til å skissere én lengdeenhet på mikrometeret, og klikk Analyser > (deretter) Angi skala. Sett størrelsesforholdet Kjent avstand og Piksel til 1, og klikk OK. ImageJ kan konvertere piksellengden til enhetslengden på mikrometeret.
- Sett den målte faktoren til areal. Klikk Analyser > Angi mål og merk av for Område og Begrens til terskel under nytt vindu. Dette trinnet angir at ImageJ skal måle parameteren "Area" innenfor valgt "Threshold".
- Mål det totale subkondrale benområdet (SCB).
- Definer SCB-interesseområdet (ROI) som vist i de oransje boksene i figur 1A, som dekker SCB-kortikale platen og en del av det underliggende trabekulære beinet ved siden av kortikale platen i medial femoral condyle (MFC) og medial tibialplatå (MTP) med spesifikke dimensjoner for hver ROI. Osteoarthritic SCB fortykning forekommer vanligvis i disse områdene. Definer SCB ROI med samme form og dimensjon i hver MFC eller MTP for alle undersøkte ledd for å sikre at samme størrelse på den spesifikke avkastningen ble målt for alle dyr.
- Skisser omrisset av det totale SCB-området av interesse ved å bruke markeringsverktøyet Polygon under hovedvinduet i ImageJ.
MERK: Markeringsverktøyene gir systemet en terskel for å begrense det målte området. - Mål det totale SCB-området: Når terskelen er valgt, klikker du analyser > mål. Et "Resultater" -vindu med arealmåling åpnes.
- Mål benstoffområdet som inneholder fast ben uten benmarg.
- Klikk Rediger > Fjern utenfor for å utelate området utenfor det totale SCB-området.
MERK: Bare det totale SCB-området er synlig etter at du har klikket på Fjern utenfor.alternativet . Bildet utenfor det totale SCB-området blir svart. Dette trinnet gjør det mulig for observatører å fokusere på beinstoffområdet innenfor interesseområdet. - Klikk på Bilde > Juster > fargeterskel for å åpne "Terskelfarge" -vinduet. Klikk Original nederst i "Terskelfarge" -vinduet for å gjenopprette bildet til den opprinnelige statusen. Bruk markeringsverktøy i trinn 3.3.2 til å tegne en liten boks i benstoffområdet. Klikk på Eksempel-alternativet nederst i "Terskelfarge" -vinduet for å definere beinstoffområdet.
MERK: Alternativet "Prøve" i vinduet "Terskelfarge" lar ImageJ velge alle de samme pikslene på det totale SCB-området som beinstoffprøveområdet. Det valgte benstoffområdet blir rødt. - Klikk Velg nederst i vinduet for terskelfargebalanse for å opprette en terskel for områdemåling. Klikk på Analyser > Mål på ImageJ-hovedmenyen, og målingsresultatet for beinstoffområdet vises i "Resultater" -vinduet.
- Lagre dataene for det totale SCB-området og benstoffområdet.
- Klikk Rediger > Fjern utenfor for å utelate området utenfor det totale SCB-området.
- Beregn forholdet mellom benstoffområde (mm2) og totalt SCB-område (mm2) av interesse som representerer benstofftykkelsen (mm2/1,0 mm2) innenfor det totale SCB-området.
- Mål SCB-tykkelsen på histologiske avsnitt/bilder (som beskrevet i trinn 3.1-3.5) av fjernt bakre, midtre bakre, midtre fremre og fjerntliggende områder (som beskrevet i trinn 2.2) av DMM-indusert OA for å vurdere områdespesifikk SCB-tykkelse på 6 kneledd (figur 1B).
MERK: Dette kan validere påliteligheten til denne kvantitative måleprotokollen fordi det er kjent at osteoarthritic SCB-endringer samlokaliserer med bruskskader og at osteoarthritic bruskskader med SCB-fortykning er mer alvorlig i vektbærende områder (midt i delen) av gnager kneledd 14,15. Derfor er det hensiktsmessig å bruke midtseksjoner for kvantitativ måling av osteoarthritic SCB-fortykning.
4. Statistikk
- Utføre statistiske analyser ved hjelp av data fra kvantitativ måling og visuell gradering av SCB-tykkelse. Bestem variasjonen mellom og intraobservatørene og reproduserbarheten ved Pearsons korrelasjonskoeffisientanalyser.
- Bestemme betydningen av forskjeller mellom kollokviegrupper ved hjelp av Student t-tester eller enveis ANOVA, etterfulgt av en post-hoc test (Tukey) ved hjelp av regnearkprogramvare. Vurder en p-verdi på mindre enn 0,05 som statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduserbarhetssammenligning mellom visuell estimatgradering og ImageJ-assistert kvantitativ måling:
SCB-tykkelse i 48 regioner av interesse (ROI) (24 MFC og 24 MTP), definert fra en midtdel av hvert kne fra 24 knær / dyr ble scoret av tre uavhengige personer ved hjelp av den eksisterende 0-3 visuelle scoringsordningen som beskrevet i litteraturen15,23, der 0 = normal (ingen SCB-fortykning), 1 = mild, 2 = moderat og 3 = alvorlig SCB-fortykning. Disse bildene ble valgt fra tre forskjellige postoperative tidspunkter på 2, 8 og 16 uker etter DMM- eller sham-prosedyren. Vanligvis viste mus med DMM-prosedyre visuell SCB-fortykningspoeng 0 ved 2 uker etter operasjonen, scorer 1-2 etter 8 uker og scorer 2-3 etter 16 uker. SCB-tykkelsen på disse histologiske bildene ble deretter kvantitativt målt av tre andre uavhengige observatører som brukte ImageJ-programvare for å validere reproduserbarheten og følsomheten til den nye ordningen. Representative histologiske bilder med eller uten skissert avkastning i MFC og MTP for visuell gradering eller kvantitative målinger presenteres i figur 2, der undersøkte bilder ble delt inn i tre grupper: sham knee (visuell poengsum 0), DMM-kne (visuell poengsum 0) og DMM-kne (visuell poengsum 1-3).
Detaljerte komparative analyser av reproduserbarhet mellom ImageJ-assistert kvantitativ måling og visuell estimatgradering av SCB-tykkelse er presentert i tabell 1. Korrelasjonskoeffisienttester tyder på at den kvantitative målingen var relativt mer reproduserbar enn det visuelle estimatgraderingssystemet.
Reproduserbarhet mellom og intraobservatør:
Korrelasjonskoeffisienttester viste høy reproduserbarhet av ImageJ-assisterte målinger med interobservatørkorrelasjonskoeffisienter av >0,93 mellom Observer A, B og C for gjennomsnittet av første og andre målinger i MTP- og MFC-regionene (figur 3). Intraobservatørvariabilitetsanalyse av det samme settet med histologiske bilder viste også høy reproduserbarhet mellom første og andre måleresultater for hver av de tre observatørene med en intraobservatørkorrelasjonskoeffisient på >0,95 for alle observatører (figur 4).
Følsomhet:
For å vurdere om det nye kvantitative SCB-målesystemet er mer følsomt for osteoarthritic SCB-fortykningsendringer enn det mye brukte visuelle graderingssystemet, ble 48 interesseområder for histopologiske bilder (24 MFC og 24 MTP) fra 24 knær / dyr først vurdert av tre uavhengige personer som har erfaring med OA-histopatologi og eksisterende OA-graderingssystemer. SCB-fortykning ble gradert ved hjelp av en 0-3 visuell scoringsordning som beskrevet ovenfor. ImageJ-assistert kvantitativ måling ble deretter utført på samme sett med visuelt graderte histologiske bilder av ytterligere tre personer som ble blindet for de visuelle OA-graderingsresultatene. SCB-tykkelsen på MFC og MTP for hvert bilde ble kvantitativt målt med ImageJ som beskrevet i Protokoll-delen. Resultatene viste at den gjennomsnittlige SCB-tykkelsen (mm2/1,0 mm2) av DMM-bildene med visuell SCB-fortykningspoeng 1-3 var betydelig høyere enn sham-bildene med en "0" visuell fortykningspoengsum. Enda viktigere er at den gjennomsnittlige SCB-tykkelsen på DMM-bildene med en "0" visuell SCB-fortykningspoengsum også var betydelig høyere enn sham-bildene med en "0" visuell poengsum (figur 5). Dataene tyder sterkt på at ImageJ-assistert kvantitativ SCB-måling er mer følsom for de tidlige og milde SCB-fortykningsendringene enn den visuelle graderingsmetoden.
Figur 1: Histologiske bilder med Safranin-O og rask grønn farging fra Sham- og DMM-grupper for ImageJ-assistert kvantitativ SCB-måling. (A) Boksene som er skissert med en prikket gul linje, definerer SCB-interesseområdet (ROI). Arealet av beinstoff i boksene er uthevet i oransje. SCB-tykkelsen i medial femoral condyle (MFC) og medial tibial platå (MTP) kan kvantifiseres ved hjelp av ImageJ programvare. De nøyaktige dimensjonene til avkastningen i MFC og MTP er forstørret for å forbedre synligheten. (B) SCB-tykkelsen på histologiske bilder fra fjernt bakre, midtre bakre, midtre og fjerntliggende områder av MTP ved 16 uker etter DMM ble kvantifisert for å vurdere områdespesifikk SCB-tykkelse. N = 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative histologiske bilder med Safranin-O og rask grønn farging fra Sham- og DMM-grupper for visuell SCB-gradering og kvantitativ SCB-måling. Øvre paneler: Fotomikrografer av Sham- og DMM-grupper for visuell SCB-gradering. Nedre paneler: Fotomikrografer av Sham- og DMM-grupper for ImageJ-assistert kvantitativ SCB-måling. Boksene som er skissert med en prikket gul linje (laget med Adobe-illustratør) i MFC og MTP definerer SCB-regionen av interesse. Arealet av benstoff (unntatt benmarg) i boksene er uthevet i oransje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Variasjonstester mellom observatører. Korrelasjonskoeffisientanalyser indikerer en høy reproduserbarhet mellom tre observatører (Observers A, B og C) for SCB-tykkelse i gjennomsnitt fra 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Intraobservatørvariasjonstester. Korrelasjonskoeffisientanalyser indikerer en høy reproduserbarhet mellom 1.
Figur 5: Komparative sensitivitetsanalyser av visuell gradering og ImageJ-assistert kvantitativ måling av SCB-tykkelse i MFC og MTP. Histologiske bilder for visuell estimatgradering ble delt til tre grupper (Sham med "0" SCB-fortykningspoeng, DMM med "0" SCB-fortykningspoeng og DMM med SCB-fortykningspoeng 1-3). Merk: De kvantitative SCB-tykkelsesverdiene fra alle tre observatørene for DMM-bildene med en "0" visuell SCB-fortykningspoengsum var betydelig høyere enn sham-bildene med en "0" visuell poengsum, noe som indikerer at den kvantitative målingen er mer følsom enn den visuelle graderingen til mild SCB-fortykning. N = 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Metode | Observatør/målscorer | MTP | MFC |
| Koeffisient mellom observatører (r) | |||
| Kvantitativ måling | A vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A vs.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B i forhold til C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Visuell vurdering | D i forhold til E | 0.6455 | 0.6031 |
| D i forhold til F | 0.6 | 0.7419 | |
| E i forhold til F | 0.6454 | 0.603 | |
| Intraobservatørkorrelasjonskoeffisient (r) | |||
| Kvantitativ måling | En | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Visuell vurdering | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tabell 1: Reproduserbarhetssammenligning mellom programvareassistert kvantitativ måling og visuell estimatgradering for SCB-tykkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måling av SCB-fortykning er en viktig komponent i histologiske vurderinger av OA-alvorlighetsgrad. De fleste eksisterende OA-graderingssystemer fokuserer hovedsakelig på bruskendringer15,16,17. En mye brukt murine osteoarthritic SCB tykkelse gradering metode som kategoriserer SCB fortykning som mild, moderat og alvorlig er i stor grad subjektiv, og påliteligheten har ikke blitt fullstendig validert15. Den nåværende studien har utviklet og validert en ny måleprotokoll for å kvantifisere SCB-tykkelse, som inkluderer følgende trinn: opprettelse av kne OA hos mus, fremstilling av vevsseksjoner og histologiske bilder, kvantitativ måling av osteoarthritic subkondralben med ImageJ-programvare, og statistisk analyse for å validere følsomheten og reproduserbarheten til protokollen.
Selv om de generelle teknikkene i denne protokollen følger instruksjonene i ImageJ-programvare, har vi inkludert trinnvise tekniske detaljer for å gjøre nye brukere enklere å følge og validere reproduserbarheten. BoneJ-programmet, en plugin-modul av ImageJ-programvare, fungerer bra for måling av 2D svart-hvitt-bilder, men fungerer ikke bra for å ekskludere benmargområde fra det totale området av SCB på grunn av likheten av skygge mellom benmarg og SCB-stoff i svart og hvitt. I kontrast kan de trinnvise metodene beskrevet i den nåværende protokollen brukes på alle farge histologiske bilder ved hjelp av fargeterskelfunksjonen for automatisk å skille SCB-stoffet fra benmarg, og dermed måle netto SCB-tykkelse. En ny metode (ikke en del av ImageJ) for beregning av SCB-tetthet (netto SCB-område mm2/1,0 mm2 av ROI) er inkludert i gjeldende protokoll.
Protokollen som presenteres i denne artikkelen har flere fordeler. For det første er ImageJ et gratis programvaresystem og er lett tilgjengelig på NIH-nettstedet. For det andre er det nye systemet enkelt å lære og bruke; Den kvantitative målingen tar bare 5-6 min per SCB ROI. For det tredje er resultatene fra det nye systemet svært reproduserbare med svært lave inter- og intraobservatørvariasjoner. Til slutt er det nye systemet mer følsomt for milde SCB-fortykningsendringer enn eksisterende visuelle graderingssystemer.
En mindre begrensning i det nye systemet er behovet for kontrollbilder som kalibratorer for statistisk analyse. Dette bør imidlertid ikke være et problem for de fleste OA-prosjekter, da kontrollbilder nesten alltid er inkludert for dataanalyse. En annen potensiell begrensning er at ImageJ-programvaren kan skille SCB-stoffer fra benmarg basert på fargepiksler, som er avhengig av passende fargingsmetoder for å vise forskjellige farger for beinstoff og benmarg.
Det nye kvantitative SCB-målesystemet er egnet for kvantifisering av SCB-tykkelse på alle nivåer. For histologiske bilder med bemerkelsesverdig SCB-fortykning kan det nye systemet nøyaktig kvantifisere det nøyaktige arealet av beinstoff og deretter konvertere det til bentetthet (netto SCB mm2/1,0 mm2 av ROI) som representerer bentykkelse per enhetsområde. For histologiske bilder med ikke-bemerkelsesverdig SCB-fortykning som ikke kan oppdages ved visuell gradering, kan det nye systemet identifisere en subtil eller mild fortykning som ofte skjer i en tidlig fase av OA. Derfor kan det nye systemet brukes til overvåking av OA-progresjon og in vivo-effekt av OA-terapier sammen med OA bruskgradering. Videre kan denne protokollen også brukes til å måle SCB-tykkelse i andre arter etter å ha justert størrelsen på SCB ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health (NIH) under Tildelingsnummer R01 AR059088, Forsvarsdepartementet (DoD) under Forskningspris nummer W81XWH-12-1-0304, og Mary og Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
