Summary
Bu metodoloji makalesi, murine osteoartrit diz eklemlerinde ve normal diz eklemlerinde histolojik subkondral kemik kalınlığını kontrol olarak ölçmek için yazılım destekli nicel ölçüm protokolü sürmektedir. Bu protokol ince kalınlaşmaya karşı oldukça hassastır ve erken osteoartrit subkondral kemik değişikliklerini tespit etmek için uygundur.
Abstract
Subkondral kemik kalınlaşma ve skleroz, hem hayvan modellerinde hem de insanlarda osteoartritin (OA) başlıca ayırt edici özellikleridir. Günümüzde histolojik subkondral kemik kalınlaştırmasının şiddeti çoğunlukla görsel tahmine dayalı yarı nicel not sistemleri ile belirlenmiştir. Bu makalede, medial menisküsün (DMM) istikrarsızlaştırılmasıyla indüklenen diz OA fare modelinde subkondral kemik kalınlığını nicel olarak ölçmek için tekrarlanabilir ve kolayca yürütülen bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, subkondral kemik kalınlaştırmasının genellikle DMM kaynaklı diz OA'sında meydana geldiği medial femoral kondyle ve tıbbi tibial platoda ilgi çekici bir bölge tanımladıktan sonra histolojik görüntülerde subkondral kemik kalınlığını ölçmek için ImageJ yazılımını kullandı. Kontrol olarak diz eklemlerinden sham işlemi ile histolojik görüntüler kullanıldı. İstatistiksel analizler, yeni geliştirilen nicel subkondral kemik ölçüm sisteminin düşük intra-ve gözlemciler arası değişkenliklerle yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu gösterdi. Sonuçlar, yeni protokolün ince veya hafif subkondral kemik kalınlaşmaya karşı yaygın olarak kullanılan görsel derecelendirme sistemlerinden daha hassas olduğunu göstermektedir. Bu protokol hem erken hem de ilerleyen osteoartrit subkondral kemik değişikliklerini tespit etmek ve OA kıkırdak derecelendirmesi ile uyumlu olarak OA tedavilerinin in vivo etkinliğini değerlendirmek için uygundur.
Introduction
Eklem kıkırdak, osteofitler ve subkondral kemik (SCB) skleroz kaybına bağlı eklem alanı daralması ile radyografik olarak karakterize osteoartrit (OA), artritin en sık görülen şeklidir1,2. Peri-artiküler kemiğin OA etiyolojislerindeki rolü tam olarak anlaşılamasa da osteofit oluşumu ve SCB sklerozun genellikle etken faktörlerden ziyade hastalık sürecinin bir sonucu olduğu düşünülmektedir, ancak peri-eklem kemik mimarisi/şekli ve biyolojislerindeki değişiklikler OA3,4'ün gelişimine ve ilerlemesine katkıda bulunabilir. . SCB ölçümü de dahil olmak üzere doğru ve kolay yürütülen bir OA derecelendirme sisteminin geliştirilmesi, araştırma laboratuvarları arasında karşılaştırmalı çalışmalar ve OA ilerlemesini önlemek veya zayıflamak için tasarlanmış terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
SCB, ince kubbe benzeri bir kemik plakası ve alttaki trabeküler kemik tabakası ile inşa edilir. SCB plakası, kireçlenmiş kıkırdaklara paralel ve hemen altında yatan kortikal lameldir. Arteriyel ve venöz damarların küçük dalları ve sinirler, kireçlenmiş kıkırdak ve trabeküler kemik arasında iletişim kurarak SCB plakasındaki kanallardan nüfuz eder. Subkondral trabeküler kemik kan damarları, duyusal sinirler, kemik iliği içerir ve SCB plakasından daha gözenekli ve metabolik olarak aktiftir. Bu nedenle, SCB şok emici ve destekleyici işlevler uygular ve normal eklemlerde kıkırdak besin kaynağı ve metabolizması için de önemlidir5,6,7,8.
SCB kalınlaşma (histolojide) ve skleroz (radyografide) OA'nın ve OA patofizyolojisinin önemli araştırma alanlarının başlıca ayırt edici özellikleridir. SCB kalınlaştırıcılığının ölçülmesi, OA şiddetinin histolojik değerlendirmelerinin önemli bir bileşenidir. Daha önce bildirilen kemirgen SCB mineral yoğunluğunu ölçmek için dijital mikroradyografi9 ve OA10,11,12,13 kemirgen modellerinde mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-CT) bazlı nicel SCB ölçümü, SCB yapısını ve SCB değişikliklerinin OA patofizyolojisolojislerindeki rolünü iyileştirdi. SCB alanı ve kalınlığı, belirli ve pahalı kemik histomomorfometri yazılımına sahip sofistike bir bilgisayar sistemi kullanılarak histolojik slaytlarla da ölçülmüştir14. Bununla birlikte, SCB kalınlaştırıcı derecelendirme de dahil olmak üzere görsel tahmin tabanlı yarı nicel OA derecelendirme sistemleri, şu anda mikro BT'den daha yaygın olarak kullanılmaktadır, çünkü derecelendirme sistemlerinin kullanımı kolaydır, özellikle çok sayıda histolojik görüntü taramak için. Bununla birlikte, mevcut OA derecelendirme sistemlerinin çoğu esas olarak kıkırdak değişikliklerine odaklanmaktadır15,16,17. SCB kalınlaştırmasını hafif, orta ve şiddetli olarak kategorize eden yaygın olarak kullanılan bir osteoartrit SCB kalınlığı derecelendirme yöntemi büyük ölçüde özneldir ve güvenilirliği tam olarak doğrulanmamıştır15. Güvenilir ve kolayca yürütülen adım adım osteoartrit SCB kalınlığı ölçüm protokolü tam olarak gelişmemiş veya standartlaştırılmamıştır.
Bu çalışma, OA'nın bir fare modelinde SCB kalınlığını nicel olarak ölçmek için tekrarlanabilir, hassas ve kolayca yürütülen bir protokol geliştirmeyi amaçlamıştır. Titiz ölçüm testlerimiz ve istatistiksel analizlerimiz, bu ImageJ yazılım destekli nicel ölçüm protokolünün hem normal hem de osteoartrit diz eklemlerindeki SCB kalınlığını ölçebileceğini göstermiştir. Yeni geliştirilen protokol tekrarlanabilir ve hafif SCB değişikliklerine karşı yaygın olarak kullanılan görsel derecelendirme sistemlerinden daha hassastır. Erken osteoartrit SCB değişikliklerini tespit etmek ve OA kıkırdak derecelendirmesi ile uyumlu olarak OA tedavilerinin in vivo etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde yer alan tüm hayvan prosedürleri, Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından tüm federal ve eyalet yasa ve yönetmeliklerine uygun olarak onaylanmıştır.
1. Farelerde diz OA'sının oluşturulması
- 10-11 haftalık 22 vahşi tip BALB/c faresinde Glasson ve ark.18 tarafından tanımlandığı gibi medial menisküs (DMM) cerrahi istikrarsızlaştırma ile diz OA bir fare modeli oluşturun. Aynı arka plan ve yaşa sahip sekiz fare üzerinde kontrol prosedürü olarak sham ameliyatı gerçekleştirin.
NOT: Her iki cinsiyet de orijinal proje için cinsiyetin biyolojik bir değişken olarak değerlendirilmesi için NIH gereksinimini karşılamak için kullanılmıştır, ancak cinsiyet farkının incelenmesi bu protokolün kapsamı değildir. - Isoflurane'nin solunmasıyla hayvanları uyuşturun. Solunum hızlarını/eforlarını ve parmak/kuyruk sıkışmasına yanıt eksikliğini izleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin. Hayvanları supine pozisyonuna getirin.
- Diz bölgesindeki cildi tıraş edin ve Povidone-İyot + alkol cilt ovma ile cildi temizleyin; üç alternatif döngü.
- DMM prosedürünü sağ dizde cerrahi mikroskop altında gerçekleştirin. Diz eklemini medial parapateller kesiden (1,2-1,5 cm uzunluğunda) maruz bırakın ve eklem kapsülü incise. Patella ve patellar tendonu sağlam tutun. Medial menisküsleri tibial platoya tutturan medial meniskotibiyal ligamentin (MML) dikkatli bir şekilde maruz kalmasından sonra, medial menisküs dengesini bozmak için mikro cerrahi makasla transekte edin.
- MML'nin görselleştirildiği ancak transekte olmadığı bir kontrol prosedürü olarak sağ dizde sham ameliyatı gerçekleştirin.
- Eklem kapsülü 8-0 ile kapatın emilebilir poliglactin dikişleri ve cilt kesisi ile 7-0 emilemez dikişler hem DMM hem de sham prosedürleri için iyileşme gerçekleştikten sonra dizinin doğru kullanımını sağlamak için.
- Tek bir enjeksiyondan sonra 72 saate kadar ağrı kesici sağlayan analjezi için cerrahi işlemden hemen önce SR Buprenorfin (0.20-0.5 mg/kg) deri altı (SC) enjekte edin. Ameliyattan sonra ameliyat edilen hayvanları izleyin.
- Ameliyat sonrası 2, 8 ve 16 haftalık bir CO2 odası kullanarak hayvanları ötenazi. Bilinçsizlikten sonra, hayvanların ölümünü fiziksel bir yöntemle doğrulayın (göğüs boşluğunu açmak). Bu ötanazi yöntemleri, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (AVMA) Ötanazi Paneli'nin önerileriyle uyumludur.
- DMM ameliyatından 2, 8 ve 16 hafta sonra ve Sham ameliyatından 2 ve 16 hafta sonra histolojik analizler için diz eklemlerini hasat ederek farklı derecelerde OA şiddeti veya SCB kalınlaşma derecelerine sahip fare diz eklemleri elde edin.
2. Doku bölümlerinin ve histolojik görüntülerin hazırlanması
- Fare diz eklem dokusu örneklerini% 2 paraformaldehitte sabitlayın, % 25 formik asitte kireçten arındırın, parafin içine gömün ve hem medial hem de lateral bölmeleri incelemek için bölüm koronal olarak.
- Diz örneklerini bir mikrotom kullanarak dizinin arka tarafından kesin ve tüm diz eklemi boyunca yaklaşık 40 doku kaydırağı elde etmek için 70-80 μm aralıklarla 5-μm kalınlığında doku bölümlerini toplayın. Mikrometre destekli bir tahmin, 1-6 slayt numaralarının uzak posteriordan, 11-18'in orta posteriordan, 23-30'un ön kısımdan ve 35-40'ın diz ekleminin uzak ön kısmından olduğunu göstermektedir. Ek lekeler için araya giren bölümleri atın veya toplayın.
- Her beş slaytta kıkırdak hücrelerini ve matrisleri özel olarak tanımlamak için üreticinin talimatlarına göre Safranin-O ve hızlı yeşil lekeler gerçekleştirin. Daha önce açıklandığı gibi hücresel ve doku seviyelerinde diz eklemlerini incelemek için üreticinin talimatlarına göre Hematoksilin-Eosin boyama gerçekleştirin19,20,21,22.
- Dijital kamera ile donatılmış bir mikroskopla histolojik görüntüler elde edin. Genel histopatolojik analiz ve histolojik OA derecelendirmesi daha önce açıklandığı gibi yapılmıştır15,19,20,21,22.
3. ImageJ yazılımı ile osteoartrit subkondral kemiğin nicel ölçümü
- ImageJ yazılımını indirin ve ilgi çekici histolojik görüntüleri açın.
- Java 1.8.0_172 ile birlikte gelen ImageJ'i https://imagej.nih.gov/ij/'dan indirin.
- ImageJ programını açın. Şeritteki Dosya sekmesini tıklatın ve histolojik resmi açmak için Aç seçeneğini tıklatın.
- Dosya dizini adresini bulun, resim dosyasını seçin ve Aç'ı tıklatın.
- ImageJ'i histolojik görüntülerdeki mikrometre ile kalibre edin.
- Mikrometrede bir uzunluk birimi çizmek için düz çizgi aracını kullanın ve > Analiz Et (sonra) Ölçeği ayarla'yı tıklatın. Bilinen mesafe ve Piksel en boy oranını 1 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. ImageJ piksel uzunluğunu mikrometredeki birim uzunluğa dönüştürebilir.
- Ölçülen faktörü alana ayarlayın. Ölçümü Ayarla > Çözümle'yi tıklatın ve yeni pencerenin altındaki Alan ve Eşikle Sınırla kutusunu işaretleyin. Bu adım, ImageJ'yi seçili "Eşik" içindeki "Alan" parametresini ölçecek şekilde ayarlar.
- Toplam subkondral kemik (SCB) ilgi alanını ölçün.
- SCB kortikal plakasını ve medial femoral kondyle (MFC) ve medial tibial platodaki (MTP) kortikal plakaya bitişik alttaki trabeküler kemiğin bir kısmını kapsayan Şekil 1A'nın turuncu kutularında gösterildiği gibi ilgi çekici SCB bölgesini (ROI) tanımlayın. Osteoartrit SCB kalınlaşma genellikle bu bölgelerde görülür. Belirli bir yatırım getirisinin tüm hayvanlar için aynı boyutta ölçüldüğünden emin olmak için incelenen tüm eklemler için her MFC veya MTP'de aynı şekil ve boyuta sahip SCB yatırım getirisini tanımlayın.
- ImageJ ana penceresinin altındaki Çokgen seçim aracını kullanarak toplam SCB ilgi alanının ana hatlarını çizin.
NOT: Seçim araçları, sisteme ölçülen alanı sınırlamak için bir eşik verir. - Toplam SCB alanını ölçün: Eşik seçildikten sonra > Ölçü analiz et'i tıklatın. Alan ölçümü içeren bir "Sonuçlar" penceresi açılacaktır.
- Kemik iliği olmadan katı kemik içeren kemik madde bölgesini ölçün.
- Toplam SCB alanının dışındaki alanı dışlamak için Düzenle > Dışarıyı Temizle'yi tıklatın.
NOT: Dışla seçeneği tıklatılanınca yalnızca toplam SCB alanı görünür. Toplam SCB alanının dışındaki resim siyaha döner. Bu adım, gözlemcilerin ilgi alanı içindeki kemik madde alanına odaklanmalarını sağlar. - " Eşik Rengi" penceresini açmak için Görüntü > > Renk eşiğini Ayarla'yı tıklatın. Resmi özgün durumuna geri yüklemek için "Eşik Rengi" penceresinin altındaki Orijinal'i tıklatın. Kemik maddesi bölgesinde küçük bir kutu çizmek için 3.3.2 adımındaki seçim araçlarını kullanın. Kemik madde alanını tanımlamak için "Eşik Rengi" penceresinin altındaki Örnek seçeneğini tıklatın.
NOT: "Eşik Rengi" penceresindeki "Örnek" seçeneği, ImageJ'in toplam SCB alanında kemik maddesi örnek alanıyla aynı pikselleri seçmesini sağlar. Seçilen kemik maddesi alanı kırmızıya dönecektir. - Alan ölçümü eşiği oluşturmak için eşik renk dengesi penceresinin altındaki Seç'i tıklatın. ImageJ ana menüsünde > Ölçüyü Analiz Et'i tıklatıp kemik maddesi alanı ölçüm sonucu "Sonuçlar" penceresinde gösterilir.
- Toplam SCB alanı ve kemik maddesi alanının verilerini kaydedin.
- Toplam SCB alanının dışındaki alanı dışlamak için Düzenle > Dışarıyı Temizle'yi tıklatın.
- Toplam SCB alanı içindeki kemik madde kalınlığını (mm2/1,0 mm2) temsil eden kemik madde bölgesinin (mm2) toplam SCB alanına (mm2) oranını hesaplayın.
- 6 diz ekleminin alana özgü SCB kalınlığını değerlendirmek için DMM kaynaklı OA'nın uzak posterior, orta posterior, orta ön ve uzak ön alanlarının histolojik bölümlerinin/görüntülerinin (3.1-3.5 adımlarında açıklandığı gibi) SCB kalınlığını ölçün (Şekil 1B).
NOT: Bu, bu nicel ölçüm protokolünün güvenilirliğini doğrulayabilir, çünkü osteoartrit SCB değişikliklerinin kıkırdak lezyonları ile birlikte lokalize olduğu ve SCB kalınlaşma ile osteoartrit kıkırdak hasarının kemirgen diz eklemlerinin ağırlık taşıyan bölgelerinde (orta kısım) daha şiddetli olduğu bilinmektedir14,15. Bu nedenle, osteoartrit SCB kalınlaşmanın nicel ölçümü için orta bölümlerin kullanılması uygundur.
4. İstatistikler
- SCB kalınlığının nicel ölçümünden ve görsel derecelendirmesinden elde edilen verileri kullanarak istatistiksel analizler gerçekleştirin. Pearson'ın korelasyon katsayısı analizleri ile gözlemciler arası değişkenliği ve tekrarlanabilirliği belirleyin.
- Öğrenci'nin t-testlerini veya tek yönlü ANOVA'yı kullanarak çalışma grupları arasındaki farklılıkların önemini belirleyin ve ardından elektronik tablo yazılımı kullanarak geçici bir test (Tukey). 0,05'ten küçük bir p değerinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Görsel tahmin derecelendirmesi ile ImageJ destekli nicel ölçüm arasında tekrarlanabilirlik karşılaştırması:
24 diz/hayvandan her dizinin orta bölümünden tanımlanan 48 ilgi bölgesinde (ROI) (24 MFC ve 24 MTP) SCB kalınlığı, literatürde açıklandığı gibi mevcut 0-3 görsel puanlama şeması kullanılarak üç bağımsız kişi tarafından puanlanmıştır15,23, burada 0 = normal (SCB kalınlaşması yok), 1 = hafif, 2 = orta ve 3 = şiddetli SCB kalınlaşması. Bu görüntüler, DMM veya sham işleminden 2, 8 ve 16 hafta sonra üç farklı ameliyat sonrası zaman noktasından seçildi. Genellikle, DMM prosedürü olan fareler, operasyon sonrası 2 haftada 0 görsel SCB kalınlaşma puanı, 8 haftada 1-2 ve 16 haftada 2-3 puan gösterdi. Bu histolojik görüntülerin SCB kalınlığı daha sonra yeni şemanın tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini doğrulamak için ImageJ yazılımını kullanan diğer üç bağımsız gözlemci tarafından nicel olarak ölçüldü. Görsel not verme veya nicel ölçümler için MFC ve MTP'de özetlenmiş bir yatırım getirisi olan veya olmayan temsili histolojik görüntüler Şekil 2'de sunulmuştur ve incelenen görüntüler üç gruba ayrılmıştır: düz diz (görsel skor 0), DMM diz (görsel skor 0) ve DMM diz (görsel skor 1-3).
ImageJ destekli nicel ölçüm ile SCB kalınlığının görsel tahmin derecelendirmesi arasındaki tekrarlanabilirliğin ayrıntılı karşılaştırmalı analizleri Tablo 1'de sunulmuştur. Korelasyon katsayısı testleri, nicel ölçümün görsel tahmin derecelendirme sisteminden nispeten daha tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir.
Gözlemciler arası ve gözlemci içi tekrarlanabilirlik:
Korelasyon katsayısı testleri, MTP ve MFC bölgelerindeki birinci ve ikinci ölçümlerin ortalaması için Gözlemci A, B ve C arasında 0,93 > olan gözlemciler arası korelasyon katsayıları ile ImageJ destekli ölçümlerin yüksek tekrarlanabilirliğini göstermiştir (Şekil 3). Aynı histolojik görüntü kümesinin göz içi değişkenlik analizi de tüm gözlemciler için 0,95 > gözlemci içi korelasyon katsayısına sahip üç gözlemcinin her biri için birinci ve ikinci ölçüm puanları arasında yüksek tekrarlanabilirlik göstermiştir (Şekil 4).
Duyarlılık:
Yeni nicel SCB ölçüm sisteminin osteoartrit SCB kalınlaşma değişikliklerine karşı yaygın olarak kullanılan görsel derecelendirme sistemine göre daha hassas olup olmadığını değerlendirmek için, 24 diz/hayvandan histolojik görüntülerin (24 MFC ve 24 MTP) ilgi alanı ilk olarak OA histopatolojisi ve mevcut OA derecelendirme sistemlerinde deneyimli üç bağımsız birey tarafından değerlendirildi. SCB kalınlaşma, yukarıda açıklandığı gibi 0-3 görsel puanlama şeması kullanılarak derecelendirildi. ImageJ destekli nicel ölçüm daha sonra görsel OA not sonuçlarına kör olan diğer üç kişi tarafından aynı görsel dereceli histolojik görüntü setinde gerçekleştirildi. Her görüntünün MFC ve MTP'nin SCB kalınlığı, Protokol bölümünde açıklandığı gibi ImageJ ile nicel olarak ölçüldü. Sonuçlar, görsel SCB kalınlaşma puanları 1-3 olan DMM görüntülerinin ortalama SCB kalınlığının (mm2/1.0 mm2) "0" görsel kalınlaşma puanına sahip Sham görüntülerinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermiştir. Daha da önemlisi, "0" görsel SCB kalınlaşma puanına sahip DMM görüntülerinin ortalama SCB kalınlığı da "0" görsel puana sahip Sham görüntülerinden önemli ölçüde yüksekti (Şekil 5). Veriler, ImageJ destekli nicel SCB ölçümünün erken ve hafif SCB kalınlaşma değişikliklerine karşı görsel derecelendirme yönteminden daha hassas olduğunu kuvvetle göstermektedir.
Şekil 1: ImageJ destekli nicel SCB ölçümü için Sham ve DMM gruplarından Safranin-O ve hızlı yeşil boyama ile histolojik görüntüler. (A) Noktalı sarı çizgi ile özetlenen kutular, ilgi çekici SCB bölgesini (ROI) tanımlar. Kutuların içindeki kemik maddesinin alanı turuncu renkte vurgulanır. Medial femoral kondyle (MFC) ve medial tibial platodaki (MTP) SCB kalınlığı ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülebilir. MFC ve MTP'deki yatırım getirisinin tam boyutları görünürlüğü artırmak için büyütülür. (B) DMM sonrası 16 haftada MTP'nin uzak posterior, orta-arka, orta-ön ve uzak ön bölgelerinden gelen histolojik görüntülerin SCB kalınlığı, bölgeye özgü SCB kalınlığını değerlendirmek için ölçüldü. N = 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görsel SCB derecelendirmesi ve nicel SCB ölçümü için Safranin-O ve Sham ve DMM gruplarından hızlı yeşil boyama ile temsili histolojik görüntüler. Üst paneller: Görsel SCB derecelendirmesi için Sham ve DMM gruplarının fotomikrografları. Alt paneller: ImageJ destekli nicel SCB ölçümü için Sham ve DMM gruplarının fotomikrografları. MFC ve MTP'de noktalı sarı çizgiyle (Adobe illustrator ile yapılan) özetlenen kutular, ilgi çekici SCB bölgesini tanımlar. Kutuların içindeki kemik maddesinin (kemik iliği hariç) alanı turuncu renkte vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gözlemciler arası değişim testleri. Korelasyon katsayısı analizleri, ilgi çekici MTP ve MFC bölgelerindeki 1. ve 2. ölçümlerden ortalama alınan SCB kalınlığı için üç gözlemci (Gözlemciler A, B ve C) arasında yüksek bir tekrarlanabilirlik olduğunu göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gözlemci içi değişim testleri. Korelasyon katsayısı analizleri, MTP ve MFC'nin ilgi çekici bölgelerindeki 1.
Şekil 5: MFC ve MTP'de SCB kalınlığının görsel derecelendirme ve ImageJ destekli nicel ölçümünün karşılaştırmalı duyarlılık analizleri. Görsel tahmin derecelendirmesi için histolojik görüntüler üç gruba ayrıldı ("0" SCB kalınlaşma puanına sahip Sham, "0" SCB kalınlaşma puanına sahip DMM ve SCB kalınlaşma puanı 1-3 olan DMM). Not: "0" görsel SCB kalınlaşma puanına sahip DMM görüntüleri için her üç gözlemciden de nicel SCB kalınlık değerleri, "0" görsel puana sahip Sham görüntülerinden önemli ölçüde daha yüksekti ve bu da nicel ölçümün hafif SCB kalınlaşmaya görsel derecelendirmeden daha hassas olduğunu gösteriyordu. N = 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yöntem | Gözlemci/skorer | MTP | MFC |
| Gözlemciler arası korelasyon katsayısı (r) | |||
| Nicel ölçüm | A'ya karşı.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A'ya karşı.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B vs. C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Görsel not verme | D ve E | 0.6455 | 0.6031 |
| D ve F karşılaştırması | 0.6 | 0.7419 | |
| E ve F karşılaştırması | 0.6454 | 0.603 | |
| Gözlemci içi korelasyon katsayısı (r) | |||
| Nicel ölçüm | A | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Görsel not verme | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tablo 1: Yazılım destekli nicel ölçüm ile SCB kalınlığı için görsel tahmin derecelendirmesi arasında tekrarlanabilirlik karşılaştırması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SCB kalınlaştırıcılığının ölçülmesi, OA şiddetinin histolojik değerlendirmelerinin önemli bir bileşenidir. Mevcut OA derecelendirme sistemlerinin çoğu esas olarak kıkırdak değişikliklerine odaklanmaktadır15,16,17. SCB kalınlaştırmasını hafif, orta ve şiddetli olarak kategorize eden yaygın olarak kullanılan bir murine osteoartrit SCB kalınlığı derecelendirme yöntemi büyük ölçüde özneldir ve güvenilirliği tam olarak doğrulanmamıştır15. Bu çalışma, SCB kalınlığını ölçmek için aşağıdaki adımları içeren yeni bir ölçüm protokolü geliştirmiş ve doğrulamıştır: farelerde diz OA'sının oluşturulması, doku bölümlerinin ve histolojik görüntülerin hazırlanması, ImageJ yazılımı ile osteoartrit subkondral kemiğin nicel ölçümü ve protokolün hassasiyetini ve tekrarlanabilirliğini doğrulamak için istatistiksel analiz.
Bu protokolün genel teknikleri ImageJ yazılımının talimatlarını takip etse de, yeni kullanıcıların tekrarlanabilirliği takip etmesini ve doğrulamasını kolaylaştırmak için adım adım teknik ayrıntılara yer verdik. ImageJ yazılımının bir eklentisi olan BoneJ programı, 2D siyah beyaz görüntüleri ölçmek için iyi çalışır, ancak kemik iliği ile siyah beyaz SCB maddesi arasındaki gölge benzerliği nedeniyle kemik iliği alanını SCB'nin toplam alanından dışlamak için iyi çalışmaz. Buna karşılık, mevcut protokolde açıklanan adım açısından yöntemler, SCB maddesini kemik iliğinden otomatik olarak ayırmak ve böylece net SCB kalınlığını ölçmek için renk eşiği işlevi kullanılarak tüm renk histolojik görüntülerine uygulanabilir. Geçerli protokolde SCB yoğunluğunu hesaplamak için yeni bir yöntem (ImageJ'nin bir parçası değil) (net SCB alanı mm2/1,0 mm2 yatırım getirisi) dahildir.
Bu makalede sunulan protokolün çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, ImageJ özgür bir yazılım sistemidir ve NIH web sitesinde kolayca bulunabilir. İkincisi, yeni sistemin öğrenilir ve uygulanması kolaydır; nicel ölçüm SCB yatırım getirisi başına sadece 5-6 dakika sürer. Üçüncü olarak, yeni sistemden elde edilen sonuçlar çok düşük gözlemciler arası ve gözlemci içi değişkenliklerle oldukça tekrarlanabilir. Son olarak, yeni sistem mevcut görsel derecelendirme sistemlerinden daha hafif SCB kalınlaşma değişikliklerine karşı daha hassastır.
Yeni sistemin küçük bir sınırlaması, istatistiksel analiz için kalibratör olarak kontrol görüntülerine duyulan ihtiyaçtır. Ancak, kontrol görüntüleri neredeyse her zaman veri analizi için dahil olduğundan, bu çoğu OA projesi için bir sorun olmamalıdır. Başka bir potansiyel sınırlama, ImageJ yazılımının SCB maddelerini renk piksellerine göre kemik iliğinden ayırabilmesidir, bu da kemik maddesi ve kemik iliği için farklı renkler göstermek için uygun boyama yöntemlerine dayanır.
Yeni nicel SCB ölçüm sistemi, SCB kalınlığını her seviyede ölçmek için uygundur. Dikkat çekici SCB kalınlaşmasına sahip histolojik görüntüler için, yeni sistem kemik maddesinin tam alanını doğru bir şekilde ölçebilir ve daha sonra birim alan başına kemik kalınlığını temsil eden kemik yoğunluğuna (net SCB mm2/1.0 mm2 ROI) dönüştürebilir. Görsel derecelendirme ile tespit edilemeyen dikkat çekici olmayan SCB kalınlaşmalı histolojik görüntüler için, yeni sistem genellikle OA'nın erken bir aşamasında meydana gelen ince veya hafif bir kalınlaşmayı tanımlayabilir. Bu nedenle, yeni sistem OA kıkırdak derecelendirmesi ile uyumlu olarak OA ilerlemelerini ve OA tedavilerinin in vivo etkinliğini izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol SCB yatırım getirisinin boyutunu ayarladıktan sonra diğer türlerde SCB kalınlığını ölçmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkar çatışması olmadığını beyan ediyor.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIH) tarafından R01 AR059088 Ödül Numarası altında, Savunma Bakanlığı (DoD) W81XWH-12-1-0304 Araştırma Ödülü Altında ve Mary ve Paul Harrington Seçkin Profesörlük Bağışı altında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
