Summary
यह पद्धति लेख एक सॉफ्टवेयर-सहायता प्राप्त मात्रात्मक माप प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो मुरीन ऑस्टियोआर्थ्रिटिक घुटने के जोड़ों और सामान्य घुटने के जोड़ों में हिस्टोलॉजिक सबकॉन्ड्रल हड्डी की मोटाई को नियंत्रण के रूप में निर्धारित करता है। यह प्रोटोकॉल सूक्ष्म मोटा होने के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है और प्रारंभिक ऑस्टियोआर्थ्रिटिक सबकॉन्ड्रल हड्डी परिवर्तनों का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।
Abstract
Subchondral हड्डी मोटा होना और स्केलेरोसिस पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) के प्रमुख लक्षण हैं, दोनों पशु मॉडल और मनुष्यों में। वर्तमान में, हिस्टोलॉजिक सबकॉन्ड्रल हड्डी मोटा होने की गंभीरता ज्यादातर दृश्य अनुमान आधारित अर्ध-मात्रात्मक ग्रेडिंग सिस्टम द्वारा निर्धारित की जाती है। यह लेख औसत दर्जे के मेनिस्कस (डीएमएम) के अस्थिरता से प्रेरित घुटने ओए के माउस मॉडल में सबकॉन्ड्रल हड्डी की मोटाई को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक पुनरुत्पादक और आसानी से निष्पादित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रोटोकॉल ने औसत दर्जे के ऊरु कोंडिल और मेडिकल टिबियल पठार में रुचि के एक क्षेत्र को परिभाषित करने के बाद हिस्टोलॉजिक छवियों पर सबकॉन्ड्रल हड्डी की मोटाई को मापने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग किया, जहां सबकॉन्ड्रल हड्डी मोटा होना आमतौर पर डीएमएम-प्रेरित घुटने ओए में होता है। एक दिखावा प्रक्रिया के साथ घुटने के जोड़ों से हिस्टोलॉजिक छवियों को नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था। सांख्यिकीय विश्लेषण ने संकेत दिया कि नव विकसित मात्रात्मक सबकॉन्ड्रल हड्डी माप प्रणाली कम इंट्रा- और अंतर-पर्यवेक्षक वैरिएबिलिटी के साथ अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य थी। परिणाम बताते हैं कि नया प्रोटोकॉल व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले दृश्य ग्रेडिंग सिस्टम की तुलना में सूक्ष्म या हल्के सबकॉन्ड्रल हड्डी को मोटा करने के प्रति अधिक संवेदनशील है। यह प्रोटोकॉल दोनों प्रारंभिक और प्रगति osteoarthritic subchondral हड्डी परिवर्तन का पता लगाने के लिए और ओए उपास्थि ग्रेडिंग के साथ संगीत कार्यक्रम में ओए उपचार की विवो प्रभावकारिता में आकलन के लिए उपयुक्त है।
Introduction
पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए), आर्टिकुलर उपास्थि, ऑस्टियोफाइट्स और सबकॉन्ड्रल हड्डी (एससीबी) स्केलेरोसिस के नुकसान के कारण संयुक्त अंतरिक्ष संकुचन द्वारा रेडियोग्राफिक रूप से विशेषता, गठिया 1,2 का सबसे आम रूप है। यद्यपि ओए के एटियलजि में पेरी-आर्टिकुलर हड्डी की भूमिका को पूरी तरह से समझा नहीं गया है, ओस्टियोफाइट गठन और एससीबी स्केलेरोसिस को आमतौर पर प्रेरक कारकों के बजाय रोग प्रक्रिया का परिणाम माना जाता है, लेकिन पेरी-आर्टिकुलर हड्डी वास्तुकला / आकार और जीव विज्ञान में परिवर्तन ओए 3,4 के विकास और प्रगति में योगदान कर सकते हैं। . एससीबी माप सहित एक सटीक और आसानी से निष्पादित ओए ग्रेडिंग प्रणाली का विकास, अनुसंधान प्रयोगशालाओं के बीच तुलनात्मक अध्ययन के लिए और ओए प्रगति को रोकने या क्षीण करने के लिए डिज़ाइन किए गए चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में महत्वपूर्ण है।
एससीबी एक पतली गुंबद जैसी हड्डी की प्लेट और ट्रैबेक्यूलर हड्डी की एक अंतर्निहित परत के साथ बनाया गया है। एससीबी प्लेट कॉर्टिकल लामेला है, जो कैल्सीफाइड उपास्थि के समानांतर और तुरंत नीचे झूठ बोल रही है। धमनी और शिरापरक वाहिकाओं की छोटी शाखाएं, साथ ही साथ तंत्रिकाएं, एससीबी प्लेट में चैनलों के माध्यम से प्रवेश करती हैं, कैल्सीफाइड उपास्थि और ट्रैबेक्यूलर हड्डी के बीच संचार करती हैं। सबकॉन्ड्रल ट्रैबेक्यूलर हड्डी में रक्त वाहिकाएं, संवेदी तंत्रिकाएं, अस्थि मज्जा होते हैं और एससीबी प्लेट की तुलना में अधिक झरझरा और चयापचय सक्रिय होता है। इसलिए, एससीबी सदमे को अवशोषित करने वाले और सहायक कार्यों को लागू करता है और सामान्य जोड़ों में उपास्थि पोषक तत्वों की आपूर्ति और चयापचय के लिए भी महत्वपूर्ण है5,6,7,8।
एससीबी मोटा होना (हिस्टोलॉजी में) और स्केलेरोसिस (रेडियोग्राफी में) ओए और ओए पैथोफिजियोलॉजी के प्रमुख अनुसंधान क्षेत्रों के प्रमुख लक्षण हैं। एससीबी मोटा होना मापना ओए गंभीरता के हिस्टोलॉजिक आकलन का एक महत्वपूर्ण घटक है। पहले कृंतक एससीबी खनिज घनत्व 9 को मापने के लिए डिजिटल माइक्रोरेडियोग्राफी के साथ-साथ OA10,11,12,13 के कृंतक मॉडल में माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) आधारित मात्रात्मक एससीबी माप ने एससीबी संरचना की हमारी समझ और ओए पैथोफिजियोलॉजी में एससीबी परिवर्तनों की भूमिका में सुधार किया है। एससीबी क्षेत्र और मोटाई को विशिष्ट और महंगी हड्डी हिस्टोमोर्फोमेट्री सॉफ्टवेयर 14 के साथ एक परिष्कृत कंप्यूटर सिस्टम का उपयोग करके हिस्टोलॉजिकल स्लाइड के साथ भी परिमाणित किया गया है। फिर भी, दृश्य अनुमान-आधारित अर्ध-मात्रात्मक ओए ग्रेडिंग सिस्टम, जिसमें एससीबी गाढ़ा ग्रेडिंग ग्रेडिंग शामिल है, वर्तमान समय में माइक्रो-सीटी की तुलना में अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि ग्रेडिंग सिस्टम का उपयोग करना आसान है, विशेष रूप से कई हिस्टोलॉजिक छवियों की स्क्रीनिंग के लिए। हालांकि, अधिकांश मौजूदा ओए ग्रेडिंग सिस्टम मुख्य रूप से उपास्थि परिवर्तन15,16,17 पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया osteoarthritic एससीबी मोटाई ग्रेडिंग विधि है कि हल्के, मध्यम, और गंभीर के रूप में एससीबी मोटा होने को वर्गीकृत काफी हद तक व्यक्तिपरक है, और इसकी विश्वसनीयता पूरी तरह से मान्य नहीं किया गया है15. एक विश्वसनीय और आसानी से निष्पादित चरण-दर-चरण ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी मोटाई माप प्रोटोकॉल या तो पूरी तरह से विकसित या गैर-मानकीकृत नहीं है।
इस अध्ययन का उद्देश्य ओए के माउस मॉडल में एससीबी मोटाई को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक पुनरुत्पादक, संवेदनशील और आसानी से निष्पादित प्रोटोकॉल विकसित करना था। हमारे कठोर माप परीक्षणों और सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला है कि यह ImageJ सॉफ़्टवेयर-सहायता प्राप्त मात्रात्मक माप प्रोटोकॉल सामान्य और ऑस्टियोआर्थ्रिटिक घुटने के जोड़ों दोनों में एससीबी मोटाई को माप सकता है। नव विकसित प्रोटोकॉल पुन: प्रस्तुत करने योग्य है और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले दृश्य ग्रेडिंग सिस्टम की तुलना में हल्के एससीबी परिवर्तनों के प्रति अधिक संवेदनशील है। इसका उपयोग शुरुआती ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी परिवर्तनों का पता लगाने और ओए उपास्थि ग्रेडिंग के साथ कॉन्सर्ट में ओए उपचार की विवो प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में शामिल सभी पशु प्रक्रियाओं को सभी संघीय और राज्य कानूनों और नियमों के अनुपालन में, कैनसस मेडिकल सेंटर विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. चूहों में घुटने ओए का निर्माण
- औसत दर्जे का मेनिस्कस (DMM) के सर्जिकल अस्थिरता द्वारा घुटने ओए का एक माउस मॉडल बनाएँ जैसा कि ग्लासन एट अल.18 द्वारा 22 जंगली-प्रकार के BALB / c चूहों में 10-11 सप्ताह की उम्र में वर्णित है। एक ही पृष्ठभूमि और उम्र के साथ आठ चूहों पर एक नियंत्रण प्रक्रिया के रूप में शाम सर्जरी करें।
नोट: दोनों लिंगों का उपयोग मूल परियोजना के लिए एक जैविक चर के रूप में सेक्स पर विचार करने के लिए एनआईएच की आवश्यकता को पूरा करने के लिए किया गया था, हालांकि लिंग अंतर की परीक्षा इस प्रोटोकॉल का दायरा नहीं है। - Isoflurane के साँस लेने के द्वारा जानवरों को बेहोश करना। उनकी श्वसन दर / प्रयास और पैर की अंगुली / पूंछ चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की निगरानी करके संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। जानवरों को एक सुपाइन स्थिति में रखें।
- घुटने के क्षेत्र में त्वचा को शेव करें और पोविडोन-आयोडीन + अल्कोहल त्वचा स्क्रब के साथ त्वचा को साफ करें; तीन प्रत्यावर्ती चक्र।
- एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत दाहिने घुटने पर डीएमएम प्रक्रिया निष्पादित करें। एक औसत दर्जे का parapatellar चीरा (लंबाई में 1.2-1.5 सेमी) के माध्यम से घुटने के जोड़ को बेनकाब करें और संयुक्त कैप्सूल incise. पटेला और पटेलर कण्डरा को अक्षुण्ण रखें। औसत दर्जे के meniscotibial स्नायुबंधन (MML) के सावधानीपूर्वक जोखिम के बाद, जो टिबियल पठार के लिए औसत दर्जे का मेनिस्कस लंगर डालता है, इसे औसत दर्जे के मेनिस्कस को अस्थिर करने के लिए सूक्ष्म-सर्जिकल कैंची के साथ ट्रांसेक्ट करें।
- एक नियंत्रण प्रक्रिया के रूप में दाहिने घुटने पर शाम की सर्जरी करें, जिसमें एमएमएल की कल्पना की गई थी लेकिन ट्रांसेक्ट नहीं किया गया था।
- 8-0 के साथ संयुक्त कैप्सूल बंद करें अवशोषित polyglactin टांके और त्वचा चीरा 7-0 गैर के साथ त्वचा चीरा दोनों DMM और शाम प्रक्रियाओं के लिए टांके एक बार उपचार हुआ है घुटने के उचित उपयोग का आश्वासन देने के लिए.
- एनाल्जेसिया के लिए सर्जिकल प्रक्रिया से ठीक पहले एसआर बुप्रेनोर्फिन (0.20-0.5 मिलीग्राम / किग्रा) चमड़े के नीचे (एससी) इंजेक्ट करें, जो एक इंजेक्शन के बाद 72 घंटे तक दर्द से राहत प्रदान करता है। मॉनिटर सर्जरी के बाद जानवरों का संचालन किया।
- सर्जरी के बाद 2 , 8, और 16 सप्ताह में एक सीओ 2 कक्ष का उपयोग करके जानवरों को Euthanize करें। बेहोशी के बाद, एक भौतिक विधि (छाती गुहा को खोलना) द्वारा जानवरों की मृत्यु की पुष्टि करें। इच्छामृत्यु के ये तरीके अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन (एवीएमए) के इच्छामृत्यु पर पैनल की सिफारिशों के अनुरूप हैं।
- डीएमएम सर्जरी के बाद 2, 8, और 16 सप्ताह में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए घुटने के जोड़ों को काट लें और ओए गंभीरता या एससीबी मोटा होने की विभिन्न डिग्री के साथ माउस घुटने के जोड़ों को प्राप्त करने के लिए शाम सर्जरी के बाद 2 और 16 सप्ताह में।
2. ऊतक वर्गों और हिस्टोलॉजिक छवियों की तैयारी
- माउस घुटने के संयुक्त ऊतक के नमूनों को 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में ठीक करें, उन्हें 25% फॉर्मिक एसिड में डिकैल्सिफाई करें, पैराफिन में एम्बेड करें, और औसत दर्जे के और पार्श्व दोनों डिब्बों की जांच करने के लिए कोरोनली सेक्शन करें।
- एक माइक्रोटोम का उपयोग करके घुटने के पीछे की ओर से घुटने के नमूनों को काटें और पूरे घुटने के जोड़ में लगभग 40 ऊतक स्लाइड प्राप्त करने के लिए 70-80 μm अंतराल पर 5-μm-मोटी ऊतक वर्गों को इकट्ठा करें। एक माइक्रोमीटर-सहायता प्राप्त अनुमान से पता चलता है कि स्लाइड नंबर 1-6 दूर-पीछे से हैं, 11-18 मध्य-पीछे से, 23-30 मध्य-पूर्वकाल से, और 35-40 घुटने के जोड़ के सुदूर-पूर्वकाल भाग से हैं। अतिरिक्त दाग के लिए बीच के अनुभागों को छोड़ें या एकत्र करें.
- विशेष रूप से हर पांच स्लाइड पर उपास्थि कोशिकाओं और matrices की पहचान करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार Safranin-O और तेजी से हरे दाग प्रदर्शन। निर्माता के निर्देशों के अनुसार Hematoxylin-Eosin स्टेनिंग प्रदर्शन सेलुलर और ऊतक के स्तर पर घुटने के जोड़ों की जांच करने के लिए जैसा कि पहले वर्णित है19,20,21,22.
- एक डिजिटल कैमरे से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के साथ हिस्टोलॉजिक छवियों को प्राप्त करें। सामान्य हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण और हिस्टोलॉजिक ओए ग्रेडिंग पहले वर्णित के रूप में आयोजित किए गए थे15,19,20,21,22।
3. ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ osteoarthritic subchondral हड्डी के मात्रात्मक माप
- ImageJ सॉफ़्टवेयर डाउनलोड करें और ब्याज की हिस्टोलॉजिक छवियों को खोलें।
- https://imagej.nih.gov/ij/ से जावा 1.8.0_172 के साथ बंडल ImageJ डाउनलोड करें।
- ImageJ प्रोग्राम खोलें। रिबन पर फ़ाइल टैब क्लिक करें और हिस्टोलॉजिक छवि को खोलने के लिए खोलें विकल्प क्लिक करें.
- फ़ाइल निर्देशिका पता ढूँढें, चित्र फ़ाइल का चयन करें, और खोलें क्लिक करें.
- हिस्टोलॉजिक छवियों पर माइक्रोमीटर के साथ इमेजजे कैलिब्रेट करें।
- माइक्रोमीटर पर लंबाई की एक इकाई स्केच करने के लिए सीधी-रेखा उपकरण का उपयोग करें और > विश्लेषण करें (फिर) स्केल सेट करें पर क्लिक करें। ज्ञात दूरी और पिक्सेल पहलू अनुपात को 1 पर सेट करें और ठीक क्लिक करें. ImageJ माइक्रोमीटर पर इकाई लंबाई के लिए पिक्सेल लंबाई परिवर्तित कर सकते हैं.
- मापा कारक क्षेत्र के लिए सेट करें। विश्लेषण करें क्लिक करें > मापन सेट करें और नई विंडो के अंतर्गत क्षेत्र और थ्रेशोल्ड तक सीमित करें बॉक्स चेक करें. यह चरण चयनित "थ्रेशोल्ड" के भीतर पैरामीटर "क्षेत्र" को मापने के लिए ImageJ सेट करता है।
- ब्याज के कुल subchondral हड्डी (SCB) क्षेत्र को मापें।
- ब्याज के एससीबी क्षेत्र (आरओआई) को परिभाषित करें जैसा कि चित्रा 1 ए के नारंगी बक्से में दिखाया गया है, जो एससीबी कॉर्टिकल प्लेट और अंतर्निहित ट्रैबेक्यूलर हड्डी के एक हिस्से को शामिल करता है जो प्रत्येक आरओआई के लिए विशिष्ट आयामों के साथ औसत दर्जे का ऊरु कोंडिल (एमएफसी) और औसत दर्जे का टिबियल पठार (एमटीपी) में कॉर्टिकल प्लेट से सटे होता है। ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी मोटा होना आमतौर पर इन क्षेत्रों में होता है। सभी जांच किए गए जोड़ों के लिए प्रत्येक एमएफसी या एमटीपी में एक ही आकार और आयाम के साथ एससीबी आरओआई को परिभाषित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विशिष्ट आरओआई का एक ही आकार सभी जानवरों के लिए मापा गया था।
- ImageJ की मुख्य विंडो के तहत बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके ब्याज के कुल SCB क्षेत्र की रूपरेखा स्केच करें।
नोट:: चयन उपकरण मापा क्षेत्र को सीमित करने के लिए सिस्टम एक थ्रेशोल्ड देते हैं। - कुल SCB क्षेत्र को मापें: थ्रेशोल्ड चयनित होने के बाद, > माप का विश्लेषण करें क्लिक करें. क्षेत्र माप के साथ एक "परिणाम" विंडो खुलेगी।
- अस्थि मज्जा के बिना ठोस हड्डी युक्त हड्डी पदार्थ क्षेत्र को मापें।
- कुल SCB क्षेत्र के बाहर के क्षेत्र को बाहर करने के लिए बाहर साफ़ करें > संपादित करें क्लिक करें .
नोट:: केवल कुल SCB क्षेत्र के बाहर साफ़ करें विकल्प क्लिक करने के बाद दिखाई देता है। कुल SCB क्षेत्र के बाहर की तस्वीर काली हो जाएगी। यह कदम पर्यवेक्षकों को ब्याज के क्षेत्र के भीतर हड्डी पदार्थ क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। - "थ्रेशोल्ड रंग" विंडो खोलने के लिए छवि > > रंग थ्रेशोल्ड समायोजित करें क्लिक करें. चित्र को मूल स्थिति में पुनर्स्थापित करने के लिए "थ्रेशोल्ड रंग" विंडो के निचले भाग में मूल क्लिक करें. हड्डी पदार्थ क्षेत्र में एक छोटा बॉक्स आकर्षित करने के लिए चरण 3.3.2 में चयन उपकरण का उपयोग करें। हड्डी पदार्थ क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए "थ्रेशोल्ड रंग" विंडो के निचले भाग में नमूना विकल्प पर क्लिक करें।
नोट:: "नमूना" विकल्प "थ्रेशोल्ड रंग" विंडो में ImageJ हड्डी पदार्थ नमूना क्षेत्र के रूप में कुल SCB क्षेत्र पर सभी समान पिक्सेल का चयन करने के लिए अनुमति देता है। चयनित हड्डी पदार्थ क्षेत्र लाल हो जाएगा। - कोई क्षेत्र माप थ्रेशोल्ड बनाने के लिए थ्रेशोल्ड रंग संतुलन विंडो के निचले भाग में चयन करें क्लिक करें . ImageJ मुख्य मेनू पर > माप का विश्लेषण करें क्लिक करें, और हड्डी पदार्थ क्षेत्र माप परिणाम "परिणाम" विंडो पर दिखाई देगा।
- कुल SCB क्षेत्र और हड्डी पदार्थ क्षेत्र के डेटा को सहेजें।
- कुल SCB क्षेत्र के बाहर के क्षेत्र को बाहर करने के लिए बाहर साफ़ करें > संपादित करें क्लिक करें .
- कुल SCB क्षेत्र के भीतर हड्डी पदार्थ मोटाई (mm2/1.0 mm2) का प्रतिनिधित्व करने वाले ब्याज के कुल SCB क्षेत्र (mm2) के लिए हड्डी पदार्थ क्षेत्र (mm2) के अनुपात की गणना करें।
- DMM-प्रेरित OA के दूर-पीछे, मध्य-पीछे, मध्य-पूर्वकाल, और सुदूर-पूर्वकाल क्षेत्रों (जैसा कि चरण 2.2 में वर्णित है) के हिस्टोलॉजिक वर्गों / छवियों (जैसा कि चरण 3.1-3.5 में वर्णित है) की एससीबी मोटाई को मापें ताकि 6 घुटने के जोड़ों की क्षेत्र-विशिष्ट एससीबी मोटाई का आकलन किया जा सके (चित्रा 1 बी)।
नोट: यह इस मात्रात्मक माप प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता को मान्य कर सकता है क्योंकि यह ज्ञात है कि ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी उपास्थि घावों के साथ सह-स्थानीयकरण को बदलता है और एससीबी गाढ़ा होने के साथ ऑस्टियोआर्थ्रिटिक उपास्थि क्षति कृंतक घुटने के जोड़ों के वजन-असर वाले क्षेत्रों (मध्य-भाग) में अधिक गंभीर है14,15। इसलिए, ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी गाढ़ा होने के मात्रात्मक माप के लिए मध्य-वर्गों का उपयोग करना उचित है।
4. सांख्यिकी
- मात्रात्मक माप और एससीबी मोटाई के दृश्य ग्रेडिंग से डेटा का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें। पियर्सन के सहसंबंध गुणांक विश्लेषण द्वारा अंतर-और अंतर-पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता और पुनरुत्पादन का निर्धारण करें।
- छात्र के टी-टेस्ट या एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके अध्ययन समूहों के बीच मतभेदों के महत्व को निर्धारित करें, इसके बाद स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पोस्ट-हॉक टेस्ट (टुकी) किया जाता है। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण होने के लिए 0.05 से कम के पी-मान पर विचार करें।
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Representative Results
दृश्य अनुमान ग्रेडिंग और ImageJ-सहायता प्राप्त मात्रात्मक माप के बीच पुनरुत्पादन की तुलना:
ब्याज के 48 क्षेत्रों (आरओआई) (24 एमएफसी और 24 एमटीपी) में एससीबी मोटाई, 24 घुटनों / जानवरों से प्रत्येक घुटने के मध्य-खंड से परिभाषित की गई थी, जो मौजूदा 0-3 दृश्य स्कोरिंग योजना का उपयोग करके तीन स्वतंत्र व्यक्तियों द्वारा स्कोर किया गया था जैसा कि साहित्य 15,23 में वर्णित है, जहां 0 = सामान्य (कोई एससीबी मोटा होना), 1 = हल्का, 2 = मध्यम, और 3 = गंभीर एससीबी मोटा होना। इन छवियों को डीएमएम या शाम प्रक्रिया के बाद 2, 8, और 16 सप्ताह में तीन अलग-अलग पोस्टऑपरेटिव समय बिंदुओं से चुना गया था। आमतौर पर, डीएमएम प्रक्रिया वाले चूहों ने 2 सप्ताह के ऑपरेशन के बाद दृश्य एससीबी मोटा होने वाले स्कोर 0 को दिखाया, 8 सप्ताह में 1-2 स्कोर किया, और 16 सप्ताह में 2-3 स्कोर किया। इन हिस्टोलॉजिक छवियों की एससीबी मोटाई को तब मात्रात्मक रूप से तीन अन्य स्वतंत्र पर्यवेक्षकों द्वारा मापा गया था, जो नई योजना की पुनरुत्पादकता और संवेदनशीलता को मान्य करने के लिए इमेजजे सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर रहे थे। दृश्य ग्रेडिंग या मात्रात्मक माप के लिए एमएफसी और एमटीपी में उल्लिखित आरओआई के साथ या बिना प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिक छवियों को चित्रा 2 में प्रस्तुत किया गया है, जिसमें जांच की गई छवियों को तीन समूहों में विभाजित किया गया था: शाम घुटने (दृश्य स्कोर 0), डीएमएम घुटने (दृश्य स्कोर 0), और डीएमएम घुटने (दृश्य स्कोर 1-3)।
छविजे-सहायता प्राप्त मात्रात्मक माप और एससीबी मोटाई के दृश्य अनुमान ग्रेडिंग के बीच पुनरुत्पादन के विस्तृत तुलनात्मक विश्लेषण तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं। सहसंबंध गुणांक परीक्षणों से पता चलता है कि मात्रात्मक माप दृश्य अनुमान ग्रेडिंग प्रणाली की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक पुनरुत्पादक था।
अंतर- और अंतर-पर्यवेक्षक पुनरुत्पादकता:
सहसंबंध गुणांक परीक्षणों ने MTP और MFC क्षेत्रों में पहले और दूसरे माप के औसत के लिए पर्यवेक्षक A, B, और C के बीच >0.93 के अंतर-पर्यवेक्षक सहसंबंध गुणांक के साथ ImageJ-सहायता प्राप्त मापों की उच्च पुनरुत्पादन क्षमता का प्रदर्शन किया (चित्रा 3)। हिस्टोलॉजिक छवियों के एक ही सेट के इंट्रा-ऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता विश्लेषण ने सभी पर्यवेक्षकों के लिए >0.95 के इंट्रा-ऑब्जर्वर सहसंबंध गुणांक के साथ तीन पर्यवेक्षकों में से प्रत्येक के लिए पहले और दूसरे माप स्कोर के बीच उच्च पुनरुत्पादकता भी दिखाई (चित्रा 4)।
संवेदनशीलता:
यह आकलन करने के लिए कि क्या नई मात्रात्मक एससीबी माप प्रणाली व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली दृश्य ग्रेडिंग प्रणाली की तुलना में ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी मोटा होने वाले परिवर्तनों के प्रति अधिक संवेदनशील है, 24 घुटनों / जानवरों से हिस्टोलॉजिक छवियों (24 एमएफसी और 24 एमटीपी) के ब्याज के 48 क्षेत्रों का मूल्यांकन पहले तीन स्वतंत्र व्यक्तियों द्वारा किया गया था जो ओए हिस्टोपैथोलॉजी और मौजूदा ओए ग्रेडिंग सिस्टम में अनुभवी हैं। एससीबी मोटा होना ऊपर वर्णित के रूप में एक 0-3 दृश्य स्कोरिंग योजना का उपयोग करके वर्गीकृत किया गया था। इमेजजे-सहायता प्राप्त मात्रात्मक माप तब एक और तीन व्यक्तियों द्वारा नेत्रहीन वर्गीकृत हिस्टोलॉजिक छवियों के एक ही सेट पर किया गया था, जिन्हें दृश्य ओए ग्रेडिंग परिणामों के लिए अंधा कर दिया गया था। प्रत्येक छवि के MFC और MTP की SCB मोटाई मात्रात्मक रूप से ImageJ के साथ मापा गया था जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है। परिणामों से पता चला है कि दृश्य एससीबी मोटा होने वाले स्कोर 1-3 के साथ डीएमएम छवियों की औसत एससीबी मोटाई (मिमी 2 / 1.0 मिमी 2) "0" दृश्य मोटा होने वाले स्कोर के साथ शाम छवियों की तुलना में काफी अधिक थी। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि एक "0" दृश्य एससीबी मोटा होने वाले स्कोर के साथ डीएमएम छवियों की औसत एससीबी मोटाई भी "0" दृश्य स्कोर (चित्रा 5) के साथ शाम छवियों की तुलना में काफी अधिक थी। डेटा दृढ़ता से सुझाव देता है कि ImageJ-असिस्टेड मात्रात्मक एससीबी माप दृश्य ग्रेडिंग विधि की तुलना में शुरुआती और हल्के एससीबी मोटा होने वाले परिवर्तनों के प्रति अधिक संवेदनशील है।
चित्र1: Safranin-O के साथ हिस्टोलॉजिक छवियों और ImageJ-assisted मात्रात्मक SCB माप के लिए शाम और DMM समूहों से तेजी से हरे रंग के दाग. (A) एक बिंदीदार पीली रेखा के साथ उल्लिखित बक्से ब्याज के SCB क्षेत्र (ROI) को परिभाषित करते हैं। बक्से के भीतर हड्डी के पदार्थ के क्षेत्र को नारंगी में हाइलाइट किया गया है। औसत दर्जे का ऊरु condyle (MFC) और औसत दर्जे का टिबियल पठार (MTP) में SCB मोटाई ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। एमएफसी और एमटीपी में आरओआई के सटीक आयामों को दृश्यता बढ़ाने के लिए बढ़ाया जाता है। (बी) 16 सप्ताह के बाद डीएमएम पर एमटीपी के दूर-पीछे, मध्य-पीछे, मध्य-पूर्वकाल और सुदूर-पूर्वकाल क्षेत्रों से हिस्टोलॉजिक छवियों की एससीबी मोटाई की एससीबी मोटाई को क्षेत्र-विशिष्ट एससीबी मोटाई का आकलन करने के लिए परिमाणित किया गया था। N = 6 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: Safranin-O के साथ प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिक छवियों और दृश्य एससीबी ग्रेडिंग और मात्रात्मक एससीबी माप के लिए शाम और DMM समूहों से तेजी से हरे रंग के दाग। ऊपरी पैनलों: दृश्य एससीबी ग्रेडिंग के लिए शाम और डीएमएम समूहों के फोटोमाइक्रोग्राफ। निचले पैनल: ImageJ-सहायता प्राप्त मात्रात्मक SCB माप के लिए शाम और DMM समूहों के फोटोमाइक्रोग्राफ। एमएफसी और एमटीपी में एक बिंदीदार पीली रेखा (एडोब इलस्ट्रेटर के साथ बनाया गया) के साथ उल्लिखित बक्से ब्याज के एससीबी क्षेत्र को परिभाषित करते हैं। बक्से के भीतर अस्थि पदार्थ (अस्थि मज्जा को छोड़कर) के क्षेत्र को नारंगी में हाइलाइट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: अंतर-पर्यवेक्षक भिन्नता परीक्षण। सहसंबंध गुणांक विश्लेषण तीन पर्यवेक्षकों (पर्यवेक्षकों ए, बी और सी) के बीच एक उच्च पुनरुत्पादकता को इंगित करता है, जो एससीबी मोटाई के लिए ब्याज के एमटीपी और एमएफसी क्षेत्रों में पहले और दूसरे माप से औसत है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: इंट्रा-ऑब्जर्वर भिन्नता परीक्षण। सहसंबंध गुणांक विश्लेषण एमटीपी और एमएफसी क्षेत्रों में पहले और दूसरे एससीबी मोटाई माप के बीच एक उच्च पुनरुत्पादकता का संकेत देते हैं, जो पर्यवेक्षकों ए, बी और सी में से प्रत्येक के लिए रुचि रखते हैं। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: एमएफसी और एमटीपी में एससीबी मोटाई के दृश्य ग्रेडिंग और इमेजजे-असिस्टेड मात्रात्मक माप की तुलनात्मक संवेदनशीलता का विश्लेषण। दृश्य अनुमान ग्रेडिंग के लिए हिस्टोलॉजिक छवियों को तीन समूहों में विभाजित किया गया था ("0" एससीबी मोटा होने वाले स्कोर के साथ शाम, "0" एससीबी मोटा होने वाले स्कोर के साथ डीएमएम, और एससीबी मोटा स्कोर 1-3 के साथ डीएमएम)। नोट: एक "0" दृश्य एससीबी मोटा होने वाले स्कोर के साथ डीएमएम छवियों के लिए सभी तीन पर्यवेक्षकों से मात्रात्मक एससीबी मोटाई मान "0" दृश्य स्कोर के साथ शाम छवियों की तुलना में काफी अधिक थे, यह दर्शाता है कि मात्रात्मक माप हल्के एससीबी मोटा होने के लिए दृश्य ग्रेडिंग की तुलना में अधिक संवेदनशील है। N = 6 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| पद्धति | पर्यवेक्षक / स्कोरर | MTP | MFC |
| अंतर-पर्यवेक्षक सहसंबंध गुणांक (r) | |||
| मात्रात्मक माप | ए बनाम.B | 0.9685 | 0.9421 |
| ए बनाम.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| बी बनाम। C | 0.9109 | 0.9288 | |
| दृश्य ग्रेडिंग | D बनाम E | 0.6455 | 0.6031 |
| D बनाम F | 0.6 | 0.7419 | |
| E बनाम F | 0.6454 | 0.603 | |
| अंतर-पर्यवेक्षक सहसंबंध गुणांक (r) | |||
| मात्रात्मक माप | एक | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| दृश्य ग्रेडिंग | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
तालिका 1: सॉफ्टवेयर-सहायता प्राप्त मात्रात्मक माप और एससीबी मोटाई के लिए दृश्य अनुमान ग्रेडिंग के बीच पुनरुत्पादकता तुलना।
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Discussion
एससीबी मोटा होना मापना ओए गंभीरता के हिस्टोलॉजिक आकलन का एक महत्वपूर्ण घटक है। अधिकांश मौजूदा ओए ग्रेडिंग सिस्टम मुख्य रूप से उपास्थि परिवर्तन15,16,17 पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मुरीन ऑस्टियोआर्थ्रिटिक एससीबी मोटाई ग्रेडिंग विधि जो एससीबी को हल्के, मध्यम और गंभीर के रूप में वर्गीकृत करती है, काफी हद तक व्यक्तिपरक है, और इसकी विश्वसनीयता को पूरी तरह से मान्य नहीं किया गया है15। वर्तमान अध्ययन ने एससीबी मोटाई को मापने के लिए एक नया माप प्रोटोकॉल विकसित और मान्य किया है, जिसमें निम्नलिखित चरण शामिल हैं: चूहों में घुटने के ओए का निर्माण, ऊतक वर्गों और हिस्टोलॉजिक छवियों की तैयारी, इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ ऑस्टियोआर्थ्रिटिक सबकॉन्ड्रल हड्डी का मात्रात्मक माप, और प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता और पुनरुत्पादन को मान्य करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण।
यद्यपि इस प्रोटोकॉल की सामान्य तकनीकें ImageJ सॉफ़्टवेयर के निर्देश का पालन करती हैं, फिर भी हमने नए उपयोगकर्ताओं को पुनरुत्पादन का पालन करने और मान्य करने में आसान बनाने के लिए चरण-दर-चरण तकनीकी विवरण शामिल किए हैं। BoneJ कार्यक्रम, ImageJ सॉफ्टवेयर का एक प्लग-इन, 2 डी काले और सफेद छवियों को मापने के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन काले और सफेद में अस्थि मज्जा और एससीबी पदार्थ के बीच छाया की समानता के कारण एससीबी के कुल क्षेत्र से अस्थि मज्जा क्षेत्र को बाहर करने के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है। इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित चरण-वार विधियों को अस्थि मज्जा से एससीबी पदार्थ को स्वचालित रूप से अलग करने के लिए रंग थ्रेशोल्ड फ़ंक्शन का उपयोग करके सभी रंग हिस्टोलॉजिक छवियों पर लागू किया जा सकता है, जिससे शुद्ध एससीबी मोटाई को मापा जा सकता है। एससीबी घनत्व (आरओआई के शुद्ध एससीबी क्षेत्र मिमी 2/1.0 मिमी 2 ) की गणना के लिए एक नई विधि (इमेजजे का हिस्सा नहीं) वर्तमान प्रोटोकॉल में शामिल है।
इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं। सबसे पहले, ImageJ एक मुफ्त सॉफ्टवेयर सिस्टम है और एनआईएच वेबसाइट पर आसानी से उपलब्ध है। दूसरा, नई प्रणाली को सीखना और लागू करना आसान है; मात्रात्मक माप केवल 5-6 मिनट प्रति SCB ROI लेता है. तीसरा, नई प्रणाली के परिणाम बहुत कम अंतर और इंट्रा-ऑब्जर्वर वैरिएबिलिटी के साथ अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य हैं। अंत में, नई प्रणाली मौजूदा दृश्य ग्रेडिंग सिस्टम की तुलना में हल्के एससीबी मोटा होने वाले परिवर्तनों के प्रति अधिक संवेदनशील है।
नई प्रणाली की एक छोटी सी सीमा सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए कैलिब्रेटर के रूप में नियंत्रण छवियों की आवश्यकता है। हालांकि, यह अधिकांश ओए परियोजनाओं के लिए एक मुद्दा नहीं होना चाहिए क्योंकि नियंत्रण छवियों को लगभग हमेशा डेटा विश्लेषण के लिए शामिल किया जाता है। एक और संभावित सीमा यह है कि इमेजजे सॉफ्टवेयर एससीबी पदार्थों को उनके रंग पिक्सेल के आधार पर अस्थि मज्जा से अलग कर सकता है, जो अस्थि पदार्थ और अस्थि मज्जा के लिए अलग-अलग रंग दिखाने के लिए उचित धुंधला तरीकों पर निर्भर करता है।
नई मात्रात्मक एससीबी माप प्रणाली सभी स्तरों पर एससीबी मोटाई को मापने के लिए उपयुक्त है। उल्लेखनीय एससीबी मोटा होने के साथ हिस्टोलॉजिक छवियों के लिए, नई प्रणाली हड्डी के पदार्थ के सटीक क्षेत्र को सटीक रूप से माप सकती है और फिर इसे हड्डी घनत्व (शुद्ध एससीबी एमएम 2 / 1.0 मिमी 2 आरओआई) में परिवर्तित कर सकती है जो प्रति इकाई क्षेत्र में हड्डी की मोटाई का प्रतिनिधित्व करती है। गैर-उल्लेखनीय एससीबी मोटा होने के साथ हिस्टोलॉजिक छवियों के लिए जिसे दृश्य ग्रेडिंग द्वारा पता नहीं लगाया जा सकता है, नई प्रणाली एक सूक्ष्म या हल्के गाढ़ापन की पहचान कर सकती है जो अक्सर ओए के शुरुआती चरण में होती है। इसलिए, नई प्रणाली का उपयोग ओए प्रगति की निगरानी के लिए और ओए उपास्थि ग्रेडिंग के साथ कॉन्सर्ट में ओए थेरेपी की विवो प्रभावकारिता में किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एससीबी आरओआई के आकार को समायोजित करने के बाद अन्य प्रजातियों में एससीबी मोटाई को मापने के लिए भी किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने हितों के कोई प्रतिस्पर्धी संघर्ष की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के राष्ट्रीय गठिया और मस्कुलोस्केलेटल और त्वचा रोगों द्वारा पुरस्कार संख्या R01 AR059088 के तहत, अनुसंधान पुरस्कार संख्या W81XWH-12-1-0304 के तहत रक्षा विभाग (डीओडी) और मैरी और पॉल हैरिंगटन प्रतिष्ठित प्रोफेसरशिप एंडोमेंट के तहत समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
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