Summary
Dieser Methodenartikel stellt ein softwaregestütztes quantitatives Messprotokoll zur Quantifizierung der histologischen subchondralen Knochendicke in murinen osteoarthritischen Kniegelenken und normalen Kniegelenken als Kontrollen vor. Dieses Protokoll ist sehr empfindlich gegenüber subtiler Verdickung und eignet sich zur Erkennung früher osteoarthritischer subchondraler Knochenveränderungen.
Abstract
Subchondrale Knochenverdickung und Sklerose sind die Hauptmerkmale der Osteoarthritis (OA), sowohl im Tiermodell als auch beim Menschen. Derzeit wird der Schweregrad der histologischen subchondralen Knochenverdickung hauptsächlich durch auf visueller Schätzung basierende semi-quantitative Grading-Systeme bestimmt. Dieser Artikel stellt ein reproduzierbares und leicht auszuführendes Protokoll zur quantitativen Messung der subchondralen Knochendicke in einem Mausmodell von Knie-OA vor, das durch Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM) induziert wird. Dieses Protokoll verwendete die ImageJ-Software, um die subchondrale Knochendicke auf histologischen Bildern zu quantifizieren, nachdem eine Region von Interesse im medialen Femurkondylus und dem medizinischen Tibiaplateau definiert wurde, wo subchondrale Knochenverdickung normalerweise bei DMM-induzierter Knie-OA auftritt. Als Kontrollen wurden histologische Bilder von Kniegelenken mit einem Scheinverfahren verwendet. Statistische Analysen zeigten, dass das neu entwickelte quantitative subchondrale Knochenmesssystem mit geringen Intra- und Interbeobachtervariabilitäten hochgradig reproduzierbar war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das neue Protokoll empfindlicher auf subtile oder milde subchondrale Knochenverdickung reagiert als die weit verbreiteten visuellen Grading-Systeme. Dieses Protokoll eignet sich sowohl zur Erkennung früher als auch fortschreitender osteoarthritischer subchondraler Knochenveränderungen und zur Beurteilung der In-vivo-Wirksamkeit von OA-Behandlungen in Verbindung mit der OA-Knorpeleinstufung.
Introduction
Osteoarthritis (OA), röntgenographisch gekennzeichnet durch Gelenkraumverengung aufgrund des Verlustes von Gelenkknorpel, Osteophyten und subchondraler Knochen (SCB) Sklerose, ist die häufigste Form der Arthritis1,2. Obwohl die Rolle des periartikulären Knochens in der Ätiologie von OA nicht vollständig verstanden ist, wird allgemein angenommen, dass Osteophytenbildung und SCB-Sklerose eher das Ergebnis des Krankheitsprozesses als ursächliche Faktoren sind, aber Veränderungen in der periartikulären Knochenarchitektur / -form und -biologie können zur Entwicklung und progression von OA beitragen3,4 . Die Entwicklung eines genauen und leicht durchführbaren OA-Bewertungssystems, einschließlich SCB-Messung, ist entscheidend für vergleichende Studien zwischen Forschungslabors und für die Bewertung der Wirksamkeit von Therapeutika, die das Fortschreiten der OA verhindern oder abschwächen sollen.
SCB ist mit einer dünnen kuppelartigen Knochenplatte und einer darunter liegenden Schicht aus trabekulärem Knochen aufgebaut. Die SCB-Platte ist die kortikale Lamelle, die parallel zum und unmittelbar unter dem verkalkten Knorpel liegt. Kleine Äste der arteriellen und venösen Gefäße sowie Nerven dringen durch die Kanäle in der SCB-Platte ein und kommunizieren zwischen dem verkalkten Knorpel und dem trabekulären Knochen. Der subchondrale trabekuläre Knochen enthält Blutgefäße, sensorische Nerven, Knochenmark und ist poröser und metabolischer als die SCB-Platte. Daher übt SCB stoßdämpfende und unterstützende Funktionen aus und ist auch wichtig für die Knorpelnährstoffversorgung und den Stoffwechsel in normalen Gelenken5,6,7,8.
SCB-Verdickung (in der Histologie) und Sklerose (in der Radiographie) sind die Hauptmerkmale von OA und Schlüsselforschungsbereichen der OA-Pathophysiologie. Die Messung der SCB-Verdickung ist ein wichtiger Bestandteil der histologischen Beurteilung des OA-Schweregrads. Zuvor berichtete digitale Mikroradiographie zur Messung der SCB-Mineraldichte von Nagetieren9 sowie die auf Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) basierende quantitative SCB-Messung in Nagetiermodellen von OA10,11,12,13 haben unser Verständnis der SCB-Struktur und der Rolle von SCB-Veränderungen in der OA-Pathophysiologie verbessert. SCB-Fläche und -Dicke wurden auch mit histologischen Objektträgern unter Verwendung eines ausgeklügelten Computersystems mit spezifischer und teurer Knochenhistomorphometrie-Software quantifiziert14. Dennoch sind visuelle Schätzungsbasierte semiquantitative OA-Grading-Systeme, einschließlich SCB-Verdicker-Grading, derzeit weiter verbreitet als Mikro-CT, da die Grading-Systeme einfach zu bedienen sind, insbesondere für das Screening zahlreicher histologischer Bilder. Die meisten bestehenden OA-Grading-Systeme konzentrieren sich jedoch hauptsächlich auf Knorpelveränderungen15,16,17. Eine weit verbreitete osteoarthritische SCB-Dickengradierungsmethode, die die SCB-Verdickung als leicht, mittelschwer und schwer einstuft, ist weitgehend subjektiv und ihre Zuverlässigkeit wurde nicht vollständig validiert15. Ein zuverlässiges und einfach auszuführendes schrittweises osteoarthritisches SCB-Dickenmessprotokoll ist entweder nicht vollständig entwickelt oder nicht standardisiert.
Diese Studie zielte darauf ab, ein reproduzierbares, empfindliches und leicht auszuführendes Protokoll zur quantitativen Messung der SCB-Dicke in einem Mausmodell von OA zu entwickeln. Unsere strengen Messtests und statistischen Analysen zeigten, dass dieses softwaregestützte quantitative Messprotokoll imageJ die SCB-Dicke sowohl in normalen als auch in osteoarthritischen Kniegelenken quantifizieren kann. Das neu entwickelte Protokoll ist reproduzierbar und empfindlicher gegenüber leichten SCB-Änderungen als die weit verbreiteten visuellen Grading-Systeme. Es kann zur Erkennung früher osteoarthritischer SCB-Veränderungen und zur Beurteilung der In-vivo-Wirksamkeit von OA-Behandlungen in Verbindung mit der OA-Knorpeleinstufung verwendet werden.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll enthaltenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am University of Kansas Medical Center in Übereinstimmung mit allen Bundes- und Landesgesetzen und -vorschriften genehmigt.
1. Bildung von Knie-OA bei Mäusen
- Erstellen Sie ein Mausmodell für Knie-OA durch chirurgische Destabilisierung des medialen Meniskus (DMM), wie von Glasson et al.18 bei 22 Wildtyp-BALB / c-Mäusen im Alter von 10-11 Wochen beschrieben. Führen Sie eine Scheinoperation als Kontrollverfahren an acht Mäusen mit dem gleichen Hintergrund und Alter durch.
HINWEIS: Beide Geschlechter wurden für das ursprüngliche Projekt verwendet, um die NIH-Anforderung für die Berücksichtigung des Geschlechts als biologische Variable zu erfüllen, obwohl die Untersuchung des Geschlechtsunterschieds nicht der Geltungsbereich dieses Protokolls ist. - Anästhesieren Sie Tiere durch Inhalation von Isofluran. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie ihre Atemfrequenz / Anstrengung und mangelnde Reaktion auf Zehen- / Schwanzdrücken überwachen. Setzen Sie tiere in eine Rückenlage.
- Rasieren Sie die Haut im Kniebereich und reinigen Sie die Haut mit Povidon-Jod + Alkohol Hautpeeling; drei abwechselnde Zyklen.
- Führen Sie das DMM-Verfahren am rechten Knie unter einem Operationsmikroskop durch. Setzen Sie das Kniegelenk durch einen medialen parapatellaren Schnitt (1,2-1,5 cm länge) aus und schneiden Sie die Gelenkkapsel ein. Halten Sie die Patella und die Patellasehne intakt. Nach sorgfältiger Exposition des medialen Meniskotibialbandes (MML), das den medialen Meniskus am Tibiaplateau verankert, wird es mit einer mikrochirurgischen Schere transektiert, um den medialen Meniskus zu destabilisieren.
- Führen Sie eine Scheinoperation am rechten Knie als Kontrollverfahren durch, bei der die MML visualisiert, aber nicht transektiert wurde.
- Schließen Sie die Gelenkkapsel mit 8-0 resorbierbare Polyglactinnähte und Hautschnitte mit 7-0 nicht resorbierbaren Nähten für DMM- und Scheinverfahren, um die ordnungsgemäße Verwendung des Knies nach der Heilung sicherzustellen.
- Injizieren Sie SR Buprenorphin (0,20-0,5 mg/kg) subkutan (SC) unmittelbar vor dem chirurgischen Eingriff zur Analgesie, die eine Schmerzlinderung bis zu 72 h nach einer einzigen Injektion bewirkt. Überwachen Sie operierte Tiere nach der Operation.
- Euthanasie von Tieren mit einer CO2-Kammer 2, 8 und 16 Wochen nach der Operation. Bestätigen Sie nach der Bewusstlosigkeit den Tod der Tiere durch eine physikalische Methode (Öffnen der Brusthöhle). Diese Methoden der Euthanasie stehen im Einklang mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie der American Veterinary Medical Association (AVMA).
- Ernten Sie die Kniegelenke für histologische Analysen 2, 8 und 16 Wochen nach der DMM-Operation und 2 und 16 Wochen nach der Nap-Operation, um Maus-Kniegelenke mit unterschiedlichen Graden der OA-Schwere oder SCB-Verdickung zu erhalten.
2. Erstellung von Gewebeschnitten und histologischen Bildern
- Fixieren Sie die Gewebeproben des Mauskgelenks in 2% Paraformaldehyd, entkalken Sie sie in 25% Ameisensäure, betten Sie sie in Paraffin ein und schneiden Sie koronal, um sowohl das mediale als auch das laterale Kompartiment zu untersuchen.
- Schneiden Sie Knieproben von der hinteren Seite des Knies mit einem Mikrotom und sammeln Sie Gewebeschnitte, die in Abständen von 70-80 μm 5 μm dick sind, um etwa 40 Gewebeobjektträger über das gesamte Kniegelenk zu erhalten. Eine mikrometergestützte Schätzung legt nahe, dass die Objektträgerzahlen 1-6 aus dem hinteren, 11-18 aus dem mittleren hinteren, 23-30 aus der Mitte des vorderen und 35-40 aus dem weit vorderen Teil des Kniegelenks stammen. Entsorgen oder sammeln Sie dazwischenliegende Abschnitte für zusätzliche Flecken.
- Führen Sie Safranin-O und schnelle grüne Flecken gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um Knorpelzellen und Matrizen auf jeweils fünf Objektträgern spezifisch zu identifizieren. Führen Sie die Hämatoxylin-Eosin-Färbung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, um die Kniegelenke auf zellulärer und Gewebeebene wie zuvor beschrieben zu untersuchen19,20,21,22.
- Erfassen Sie histologische Bilder mit einem Mikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. Allgemeine histopathologische Analysen und histologische OA-Einstufungen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt15,19,20,21,22.
3. Quantitative Messung des osteoarthritischen subchondralen Knochens mit der ImageJ-Software
- Laden Sie die ImageJ-Software herunter und öffnen Sie historische Bilder von Interesse.
- Laden Sie das mit Java 1.8.0_172 gebündelte ImageJ von https://imagej.nih.gov/ij/ herunter.
- Öffnen Sie das Programm ImageJ. Klicken Sie auf der Multifunktionsleiste auf die Registerkarte Datei und dann auf die Option Öffnen , um das histologische Bild zu öffnen.
- Suchen Sie die Adresse des Dateiverzeichnisses, wählen Sie die Bilddatei aus, und klicken Sie auf Öffnen.
- Kalibrieren Sie Bild J mit dem Mikrometer auf den histologischen Bildern.
- Verwenden Sie das Geradeaus-Werkzeug, um eine Längeneinheit auf dem Mikrometer zu skizzieren, und klicken Sie auf Analysieren > (dann) Maßstab festlegen. Legen Sie den bekannten Abstand und das Pixel-Seitenverhältnis auf 1 fest und klicken Sie auf OK. ImageJ kann die Pixellänge in die Einheitslänge auf Mikrometer umrechnen.
- Legen Sie den gemessenen Faktor auf Fläche fest. Klicken Sie auf Analysieren > Messung festlegen und aktivieren Sie unter neuem Fenster das Kontrollkästchen Fläche und Grenzwert auf Schwellenwert . In diesem Schritt wird ImageJ so eingestellt, dass der Parameter "Area" innerhalb des ausgewählten "Threshold" gemessen wird.
- Messen Sie den gesamten interessierenden subchondralen Knochen (SCB).
- Definieren Sie die SCB-Region of Interest (ROI), wie in den orangefarbenen Kästchen in Abbildung 1A dargestellt, die die kortikale SCB-Platte und einen Teil des darunter liegenden trabekulären Knochens neben der kortikalen Platte im medialen Femurkondyl (MFC) und im medialen Tibiaplateau (MTP) mit spezifischen Abmessungen für jeden ROI abdeckt. Osteoarthritische SCB-Verdickung tritt normalerweise in diesen Bereichen auf. Definieren Sie den SCB-ROI mit der gleichen Form und Dimension in jedem MFC oder MTP für alle untersuchten Gelenke, um sicherzustellen, dass für alle Tiere die gleiche Größe des spezifischen ROI gemessen wurde.
- Skizzieren Sie den Umriss des gesamten SCB-Interessenbereichs mit dem Polygonauswahlwerkzeug unter dem Hauptfenster von ImageJ.
HINWEIS: Die Auswahlwerkzeuge geben dem System einen Schwellenwert vor, um den gemessenen Bereich zu begrenzen. - SCB-Gesamtfläche messen: Nachdem der Schwellenwert ausgewählt wurde, klicken Sie auf Analysieren > Messen. Es öffnet sich ein Fenster "Ergebnisse" mit Flächenmessung.
- Messen Sie den Knochensubstanzbereich, der festen Knochen ohne Knochenmark enthält.
- Klicken Sie auf Bearbeiten > Außen löschen , um den Bereich außerhalb des gesamten SCB-Bereichs auszuschließen.
HINWEIS: Nachdem Sie auf die Option "Außen löschen " geklickt haben, ist nur der gesamte SCB-Bereich sichtbar. Das Bild außerhalb der gesamten SCB-Fläche wird schwarz. Dieser Schritt ermöglicht es den Beobachtern, sich auf den Knochensubstanzbereich innerhalb des Interessengebiets zu konzentrieren. - Klicken Sie auf Bild > > Farbschwellenwert anpassen , um das Fenster "Schwellenwertfarbe" zu öffnen. Klicken Sie unten im Fenster "Schwellenwertfarbe" auf Original , um den ursprünglichen Status des Bildes wiederherzustellen. Verwenden Sie die Auswahlwerkzeuge in Schritt 3.3.2, um eine kleine Box im Knochensubstanzbereich zu zeichnen. Klicken Sie unten im Fenster "Schwellenwertfarbe" auf die Option "Probe ", um den Knochensubstanzbereich zu definieren.
HINWEIS: Die Option "Sample" im Fenster "Threshold Color" ermöglicht es ImageJ, die gleichen Pixel auf der gesamten SCB-Fläche wie im Knochensubstanzprobenbereich auszuwählen. Der ausgewählte Knochensubstanzbereich färbt sich rot. - Klicken Sie unten im Fenster Farbbalance des Schwellenwerts auf Auswählen, um einen Schwellenwert für die Flächenmessung zu erstellen. Klicken Sie im Hauptmenü von ImageJ auf Analysieren > Messen , und das Ergebnis der Messung des Knochensubstanzbereichs wird im Fenster "Ergebnisse" angezeigt.
- Speichern Sie die Daten der gesamten SCB-Fläche und der Knochensubstanzfläche.
- Klicken Sie auf Bearbeiten > Außen löschen , um den Bereich außerhalb des gesamten SCB-Bereichs auszuschließen.
- Berechnen Sie das Verhältnis der Knochensubstanzfläche (mm2) zur gesamten interessierenden SCB-Fläche (mm2), die die Knochensubstanzdicke (mm2/1,0 mm2) innerhalb der gesamten SCB-Fläche darstellt.
- Messen Sie die SCB-Dicke histologischer Abschnitte/Bilder (wie in den Schritten 3.1-3.5 beschrieben) von weit-posterioren, mittel-posterioren, mittel-anterioren und weit-vorderen Bereichen (wie in Schritt 2.2 beschrieben) von DMM-induzierter OA, um die bereichsspezifische SCB-Dicke von 6 Kniegelenken zu beurteilen (Abbildung 1B).
HINWEIS: Dies kann die Zuverlässigkeit dieses quantitativen Messprotokolls bestätigen, da bekannt ist, dass osteoarthritische SCB-Veränderungen mit Knorpelläsionen kolokalisieren und dass osteoarthritische Knorpelschäden mit SCB-Verdickung in den gewichtstragenden Bereichen (mittlerer Teil) der Nagetier-Kniegelenke schwerwiegender sind14,15. Daher ist es angebracht, Mittelschnitte für die quantitative Messung der osteoarthritischen SCB-Verdickung zu verwenden.
4. Statistik
- Führen Sie statistische Analysen mit Daten aus quantitativen Messungen und visueller Sortierung der SCB-Dicke durch. Bestimmen Sie die Variabilität und Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb des Beobachters mit den Korrelationskoeffizientenanalysen von Pearson.
- Bestimmen Sie die Signifikanz von Unterschieden zwischen Studiengruppen mithilfe von Student's t-Tests oder Einweg-ANOVA, gefolgt von einem Post-hoc-Test (Tukey) mit Tabellenkalkulationssoftware. Betrachten Sie einen p-Wert von weniger als 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
Reproduzierbarkeitsvergleich zwischen visueller Schätzungsbewertung und ImageJ-gestützter quantitativer Messung:
Die SCB-Dicke in 48 Regions of Interest (ROI) (24 MFC und 24 MTP), definiert aus einem mittleren Abschnitt jedes Knies von 24 Knien/Tieren, wurde von drei unabhängigen Individuen unter Verwendung des bestehenden visuellen 0-3-Scoring-Schemas, wie in der Literatur beschrieben, bewertet15,23, wobei 0 = normal (keine SCB-Verdickung), 1 = mild, 2 = mittel und 3 = schwere SCB-Verdickung. Diese Bilder wurden aus drei verschiedenen postoperativen Zeitpunkten 2, 8 und 16 Wochen nach dem DMM- oder Scheinverfahren ausgewählt. Normalerweise zeigten Mäuse mit DMM-Verfahren 2 Wochen nach der Operation einen visuellen SCB-Verdicker-Score 0, nach 8 Wochen einen 1-2-Score und nach 16 Wochen einen 2-3-Score. Die SCB-Dicke dieser histologischen Bilder wurde dann von drei weiteren unabhängigen Beobachtern mit der ImageJ-Software quantitativ gemessen, um die Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit des neuen Schemas zu validieren. Repräsentative histologische Bilder mit oder ohne skizzierten ROI in MFC und MTP für visuelle Abstufungen oder quantitative Messungen sind in Abbildung 2 dargestellt, in denen die untersuchten Bilder in drei Gruppen unterteilt wurden: Scheinknie (visueller Score 0), DMM-Knie (visueller Score 0) und DMM-Knie (visueller Score 1-3).
Detaillierte vergleichende Analysen der Reproduzierbarkeit zwischen ImageJ-gestützter quantitativer Messung und visueller Schätzung der SCB-Dicke sind in Tabelle 1 dargestellt. Korrelationskoeffiziententests deuten darauf hin, dass die quantitative Messung relativ reproduzierbarer war als das visuelle Schätzungsbewertungssystem.
Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb des Beobachters:
Korrelationskoeffiziententests zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit der ImageJ-gestützten Messungen mit Interbeobachter-Korrelationskoeffizienten von >0,93 zwischen Beobachter A, B und C für den Durchschnitt der ersten und zweiten Messung in den MTP- und MFC-Regionen (Abbildung 3). Die Intra-Beobachter-Variabilitätsanalyse des gleichen Satzes histologischer Bilder zeigte auch eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den ersten und zweiten Messwerten für jeden der drei Beobachter mit einem Intra-Beobachter-Korrelationskoeffizienten von >0,95 für alle Beobachter (Abbildung 4).
Empfindlichkeit:
Um zu beurteilen, ob das neue quantitative SCB-Messsystem empfindlicher auf osteoarthritische SCB-Verdickungsänderungen reagiert als das weit verbreitete visuelle Grading-System, wurden 48 Interessengebiete histologischer Bilder (24 MFC und 24 MTP) von 24 Knien/Tieren zunächst von drei unabhängigen Personen bewertet, die Erfahrung in der OA-Histopathologie und bestehenden OA-Grading-Systemen haben. Die SCB-Verdickung wurde mit einem visuellen Bewertungsschema von 0-3 wie oben beschrieben bewertet. Die ImageJ-gestützte quantitative Messung wurde dann an demselben Satz visuell bewerteter histologischer Bilder von drei weiteren Personen durchgeführt, die für die visuellen OA-Bewertungsergebnisse blind waren. Die SCB-Dicke des MFC und MTP jedes Bildes wurde mit ImageJ quantitativ gemessen, wie im Abschnitt Protokoll beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass die durchschnittliche SCB-Dicke (mm2/1,0 mm2) der DMM-Bilder mit visuellen SCB-Verdickungswerten 1-3 signifikant höher war als die der Sham-Bilder mit einem visuellen Verdickungswert von "0". Noch wichtiger ist, dass die durchschnittliche SCB-Dicke der DMM-Bilder mit einem visuellen SCB-Verdickungswert von "0" ebenfalls signifikant höher war als die der Sham-Bilder mit einem visuellen Score von "0" (Abbildung 5). Die Daten deuten stark darauf hin, dass die ImageJ-unterstützte quantitative SCB-Messung empfindlicher auf die frühen und milden SCB-Verdickungsänderungen reagiert als die visuelle Grading-Methode.
Abbildung 1: Histologische Bilder mit Safranin-O und schneller Grünfärbung aus Sham- und DMM-Gruppen für die ImageJ-gestützte quantitative SCB-Messung. (A) Die mit einer gepunkteten gelben Linie umrandeten Kästchen definieren die SCB-Region of Interest (ROI). Der Bereich der Knochensubstanz innerhalb der Boxen ist orange hervorgehoben. Die SCB-Dicke im medialen Femurkondyl (MFC) und im medialen Tibiaplateau (MTP) kann mit der ImageJ-Software quantifiziert werden. Die genauen Abmessungen des ROI in MFC und MTP werden vergrößert, um die Sichtbarkeit zu erhöhen. (B) Die SCB-Dicke histologischer Bilder aus den weit posterioren, mittel-posterioren, mittel-vorderen und weit-vorderen Bereichen des MTP 16 Wochen nach DMM wurde quantifiziert, um die flächenspezifische SCB-Dicke zu bewerten. N = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative histologische Bilder mit Safranin-O und schneller Grünfärbung aus Sham- und DMM-Gruppen für visuelle SCB-Grading und quantitative SCB-Messung. Obere Tafeln: Mikrofotografien von Schein- und DMM-Gruppen zur visuellen SCB-Einstufung. Untere Paneele: Mikrofotografien von Schein- und DMM-Gruppen zur ImageJ-gestützten quantitativen SCB-Messung. Die Felder, die in MFC und MTP mit einer gepunkteten gelben Linie (erstellt mit Adobe Illustrator) umrandet sind, definieren den interessierenden SCB-Bereich. Der Bereich der Knochensubstanz (ohne Knochenmark) innerhalb der Kästchen ist orange hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Variationstests zwischen Beobachtern. Korrelationskoeffizientenanalysen zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen drei Beobachtern (Beobachter A, B und C) für die SCB-Dicke, gemittelt aus der 1. und 2. Messung in den interessierenden MTP- und MFC-Regionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Intra-Observer-Variationstests. Korrelationskoeffizientenanalysen zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit zwischen den 1. und 2. SCB-Dickenmessungen in den MTP- und MFC-Regionen von Interesse für jeden der Beobachter A, B und C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergleichende Sensitivitätsanalysen des visuellen Gradings und ImageJ-gestützte quantitative Messung der SCB-Dicke im MFC und MTP. Die histologischen Bilder für die visuelle Schätzungsbewertung wurden in drei Gruppen unterteilt (Sham mit "0" SCB-Verdickungswert, DMM mit "0" SCB-Verdickungswert und DMM mit SCB-Verdickungswert 1-3). Hinweis: Die quantitativen SCB-Dickenwerte aller drei Beobachter für die DMM-Bilder mit einem visuellen SCB-Verdickungswert von "0" waren signifikant höher als die der Sham-Bilder mit einem visuellen Score von "0", was darauf hindeutet, dass die quantitative Messung empfindlicher ist als die visuelle Einstufung gegenüber einer leichten SCB-Verdickung. N = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Methode | Beobachter/Torschütze | MTP | MFC |
| Korrelationskoeffizient zwischen Beobachtern (r) | |||
| Quantitative Messung | A vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A vs.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B gegen C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Visuelle Benotung | D gegen E | 0.6455 | 0.6031 |
| D gegen F | 0.6 | 0.7419 | |
| E gegen F | 0.6454 | 0.603 | |
| Intrabeobachter-Korrelationskoeffizient (r) | |||
| Quantitative Messung | Ein | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Visuelle Benotung | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tabelle 1: Reproduzierbarkeitsvergleich zwischen softwaregestützter quantitativer Messung und visueller Schätzungssortierung für die SCB-Dicke.
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Discussion
Die Messung der SCB-Verdickung ist ein wichtiger Bestandteil der histologischen Beurteilung des OA-Schweregrads. Die meisten bestehenden OA-Grading-Systeme konzentrieren sich hauptsächlich auf Knorpelveränderungen15,16,17. Eine weit verbreitete murine osteoarthritische SCB-Dickengradierungsmethode, die SCB-Verdickung als leicht, mittelschwer und schwer kategorisiert, ist weitgehend subjektiv und ihre Zuverlässigkeit wurde nicht vollständig validiert15. Die vorliegende Studie hat ein neues Messprotokoll zur Quantifizierung der SCB-Dicke entwickelt und validiert, das die folgenden Schritte umfasst: Erstellung von Knie-OA bei Mäusen, Vorbereitung von Gewebeschnitten und histologischen Bildern, quantitative Messung von osteoarthritischem subchondralem Knochen mit ImageJ-Software und statistische Analyse zur Validierung der Sensitivität und Reproduzierbarkeit des Protokolls.
Obwohl die allgemeinen Techniken dieses Protokolls den Anweisungen der ImageJ-Software folgen, haben wir Schritt-für-Schritt-technische Details aufgenommen, um neuen Benutzern die Verfolgung zu erleichtern und die Reproduzierbarkeit zu validieren. Das BoneJ-Programm, ein Plug-in der ImageJ-Software, eignet sich gut zum Messen von 2D-Schwarz-Weiß-Bildern, funktioniert jedoch aufgrund der Ähnlichkeit der Schattierung zwischen Knochenmark und SCB-Substanz in Schwarz-Weiß nicht gut zum Ausschließen des Knochenmarkbereichs aus der Gesamtfläche von SCB. Im Gegensatz dazu können die im aktuellen Protokoll beschriebenen schrittweisen Methoden auf alle histologischen Farbbilder angewendet werden, indem die Farbschwellenfunktion verwendet wird, um die SCB-Substanz automatisch vom Knochenmark zu trennen und dadurch die Netto-SCB-Dicke zu messen. Eine neue Methode (nicht Teil von ImageJ) zur Berechnung der SCB-Dichte (Netto-SCB-Fläche mm2/1,0 mm2 ROI) ist im aktuellen Protokoll enthalten.
Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll hat mehrere Vorteile. Erstens ist ImageJ ein freies Softwaresystem und ist auf der NIH-Website verfügbar. Zweitens ist das neue System leicht zu erlernen und anzuwenden; Die quantitative Messung dauert nur 5-6 Minuten pro SCB-ROI. Drittens sind die Ergebnisse des neuen Systems hochgradig reproduzierbar mit sehr geringen Inter- und Intra-Beobachter-Variabilitäten. Schließlich ist das neue System empfindlicher gegenüber leichten SCB-Verdickungsänderungen als bestehende visuelle Sortiersysteme.
Eine kleine Einschränkung des neuen Systems ist die Notwendigkeit von Kontrollbildern als Kalibratoren für statistische Analysen. Dies sollte jedoch für die meisten Open-Access-Projekte kein Problem sein, da Fast immer Kontrollbilder für die Datenanalyse enthalten sind. Eine weitere potenzielle Einschränkung besteht darin, dass die ImageJ-Software SCB-Substanzen anhand ihrer Farbpixel vom Knochenmark trennen kann, was auf geeigneten Färbemethoden beruht, um unterschiedliche Farben für Knochensubstanz und Knochenmark anzuzeigen.
Das neue quantitative SCB-Messsystem eignet sich zur Quantifizierung der SCB-Dicke auf allen Ebenen. Für histologische Bilder mit bemerkenswerter SCB-Verdickung kann das neue System die genaue Fläche der Knochensubstanz genau quantifizieren und dann in die Knochendichte (Netto-SCB mm2/1,0 mm2 ROI) umrechnen, die die Knochendicke pro Flächeneinheit darstellt. Für histologische Bilder mit nicht bemerkenswerter SCB-Verdickung, die nicht durch visuelle Abstufung erkannt werden können, kann das neue System eine subtile oder milde Verdickung identifizieren, die häufig in einer frühen Phase der OA auftritt. Daher kann das neue System zur Überwachung der OA-Progression und der In-vivo-Wirksamkeit von OA-Therapien in Verbindung mit der OA-Knorpeleinstufung eingesetzt werden. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll auch zur Messung der SCB-Dicke bei anderen Spezies nach Anpassung der Größe des SCB-ROI verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health (NIH) unter der Award Number R01 AR059088, dem Department of Defense (DoD) unter der Forschungspreisnummer W81XWH-12-1-0304 und der Mary and Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
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