Summary
מאמר מתודולוגיה זה מציג פרוטוקול מדידה כמותית בסיוע תוכנה כדי לכמת את עובי העצם התת-צ'ונדרלי היסטולוגי במפרקי הברך האוסטאוארת-דלקתיים של מורין ומפרקי הברך הרגילים כפקדים. פרוטוקול זה רגיש מאוד לעיבוי עדין ומתאים לאיתור שינויים מוקדמים בעצם התת-מפרקתית האוסטאוארתרית.
Abstract
עיבוי עצם תת-קונדרלי וטרשת הם סימני ההיכר העיקריים של דלקת מפרקים ניוונית (OA), הן במודלים של בעלי חיים והן בבני אדם. נכון לעכשיו, חומרת עיבוי העצם התת-קונדרלי ההיסטולוגי נקבעת בעיקר על ידי מערכות דירוג חצי כמותיות מבוססות הערכה חזותית. מאמר זה מציג פרוטוקול ניתן לשחזור ומבוצע בקלות כדי למדוד כמותית את עובי העצם התת-קונדרלי במודל עכבר של OA הברך המושרה על ידי ערעור היציבות של המניסקוס המדיאלי (DMM). פרוטוקול זה השתמש בתוכנת ImageJ כדי לכמת את עובי העצם התת-קונדרלי בתמונות היסטולוגיות לאחר שהגדיר אזור מעניין בקונדיל הירך המדיאלי ובמישור הסיבתי הרפואי שבו עיבוי עצם תת-קונדרלי מתרחש בדרך כלל ב- DMM המושרה בברך OA. תמונות היסטולוגיות ממפרקי הברך עם הליך מזויף שימשו כפקדים. ניתוח סטטיסטי הצביע על כך שמערכת מדידת העצם התת-קונדרלית הכמותית שפותחה לאחרונה הייתה ניתנת לשחזור עם שונות פנים-ארצית ובין-צופה נמוכה. התוצאות מצביעות על כך שהפרוטוקול החדש רגיש יותר לעיבוי עצם תת-קונדרלי עדין או מתון מאשר למערכות הדירוג החזותיות הנפוצות. פרוטוקול זה מתאים לאיתור שינויים מוקדמים ומתקדמים בעצם תת-מפרקית אוסטיאוארתרית והן להערכת היעילות של טיפולי vivo של טיפולי OA בתיאום עם דירוג סחוס OA.
Introduction
דלקת מפרקים ניוונית (OA), המאופיינת באופן רדיוגרפי על ידי צמצום מרחב משותף עקב אובדן סחוס מפרקי, ניוונית, וטרשת עצם תת-קונדרלית (SCB), היא הצורה הנפוצה ביותר של דלקת פרקים 1,2. למרות שתפקידה של עצם פרי-מפרקית באטיולוגיה של OA אינו מובן במלואו, היווצרות אוסטאופיטים וטרשת SCB נחשבים בדרך כלל לתוצאות תהליך המחלה ולא לגורמים סיבתיים, אך שינויים בארכיטקטורת העצם/הצורה והביולוגיה הפרי-מפרקית עשויים לתרום להתפתחות ולהתקדמות של OA3,4 . הפיתוח של מערכת דירוג OA מדויקת וקלה לביצוע, כולל מדידת SCB, הוא קריטי למחקרים השוואתיים בקרב מעבדות מחקר ובהערכת היעילות של סוכנים טיפוליים שנועדו למנוע או להחליש התקדמות OA.
SCB בנוי עם צלחת עצם דמוית כיפה דקה ושכבה בסיסית של עצם טרבלקולרית. צלחת SCB היא lamella קליפת המוח, שוכב במקביל ומיד מתחת הסחוס מסויד. ענפים קטנים של כלי עורקים ורידים, כמו גם עצבים, לחדור דרך הערוצים בלוח SCB, תקשורת בין הסחוס מסויד ועצם trabecular. העצם התת-קונדרלית trabecular מכיל כלי דם, עצבים חושיים, מח עצם והוא נקבובי יותר ופעיל מטבולית יותר מאשר צלחת SCB. לכן, SCB מפעילה פונקציות סופגות זעזועים ותומכות והיא חשובה גם לאספקת חומרים מזינים סחוס וחילוף חומרים במפרקים רגילים5,6,7,8.
עיבוי SCB (בהיסטולוגיה) וטרשת (ברדיוגרפיה) הם סימני ההיכר העיקריים של OA ואזורי מחקר מרכזיים של פתולוגיה OA. מדידת עיבוי SCB היא מרכיב חשוב בהערכות היסטולוגיות של חומרת OA. דיווח בעבר מיקרורדיוגרפיה דיגיטלית למדידת צפיפות מינרלים SCB מכרסמים9, כמו גם טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT) מבוסס מדידת SCB כמותית במודלים מכרסמים של OA10,11,12,13 שיפרו את ההבנה שלנו של מבנה SCB ואת התפקיד של שינויים SCB בפתופיזיולוגיה OA. שטח ועובי SCB גם כונתה עם שקופיות היסטולוגיות באמצעות מערכת מחשב מתוחכמת עם תוכנה היסטומורפומטריית עצם ספציפית ויקרה14. עם זאת, מערכות דירוג OA חצי-כמותיות מבוססות הערכה חזותית, כולל דירוג עיבוי SCB, נמצאות בשימוש נרחב יותר מאשר מיקרו-CT בעת הנוכחית מכיוון שמערכות הדירוג קלות לשימוש, במיוחד להקרנת תמונות היסטולוגיות רבות. עם זאת, רוב מערכות הדירוג הקיימות של OA מתמקדות בעיקר בשינויי סחוס15,16,17. שיטת דירוג עובי SCB ניוונית בשימוש נרחב המקטלגת את עיבוי SCB כמתון, מתון וחמור היא סובייקטיבית ברובה, ואמינותה לא אומתה במלואה15. פרוטוקול מדידת עובי SCB אוסטיאוארתריטיס אמין וניתן לביצוע בקלות בשלב אחר שלב אינו מפותח במלואו או אינו מתוקנן.
מחקר זה נועד לפתח פרוטוקול ניתן לשחזור, רגיש וקל לביצוע כדי למדוד כמותית את עובי SCB במודל עכבר של OA. בדיקות המדידה הקפדניות שלנו והניתוח הסטטיסטי שלנו הראו שפרוטוקול מדידה כמותי זה בסיוע תוכנת ImageJ יכול לכמת את עובי ה- SCB במפרקי הברך הרגילים והאוסטאוארתרטיים כאחד. הפרוטוקול החדש שפותח ניתן לשחזור ורגיש יותר לשינויי SCB קלים מאשר מערכות הדירוג החזותיות הנפוצות. זה יכול לשמש לאיתור שינויים SCB osteoarthritic מוקדם להערכת יעילות vivo של טיפולי OA בתיאום עם דירוג סחוס OA OA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים הכלולים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) במרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס, בהתאם לכל החוקים והתקנות הפדרליים והמדינתיים.
1. יצירת OA הברך בעכברים
- צור מודל עכבר של OA הברך על ידי ערעור כירורגי של המניסקוס המדיאלי (DMM) כפי שתואר על ידי Glasson et al.18 ב 22 עכברי BALB / c מסוג פראי בגיל 10-11 שבועות. בצע ניתוח מזויף כהליך בקרה על שמונה עכברים עם אותו רקע וגיל.
הערה: שני המינים שימשו לפרויקט המקורי כדי לענות על דרישת NIH להתחשבות במין כמשתנה ביולוגי, אם כי בחינת הבדלי מין אינה היקף הפרוטוקול הזה. - מרדים בעלי חיים על ידי שאיפה של איזופלוריין. בדוק את עומק ההרדמה על ידי ניטור קצב הנשימה שלהם / מאמץ וחוסר תגובה לצביטת בוהן / זנב. שים את החיות בתנוחה סופית.
- לגלח את העור באזור הברך ולנקות את העור עם Povidone-יוד + קרצוף עור אלכוהול; שלושה מחזורים מתחלפים.
- בצע את הליך DMM בברך ימין תחת מיקרוסקופ כירורגי. לחשוף את מפרק הברך באמצעות חתך parapatellar המדיאלי (1.2-1.5 ס"מ אורך) ו לכרות את כמוסת המפרק. שמור את פיקת הברך ואת גיד פיקת הברך ללא פגע. לאחר חשיפה מדוקדקת של הרצועה המניסקוטיבלית המדיאלית (MML) המעגנת את המניסקוס המדיאלי לרמה הסיבית, סובבו אותה במספריים מיקרו-כירורגיות כדי לערער את המניסקוס המדיאלי.
- בצע ניתוח מזויף בברך ימין כהליך בקרה, שבו ה- MML הומחה אך לא הועבר.
- סוגרים את הקפסולה המשותפת עם 8-0 תפרי פוליגלקטין נספגים וחתך בעור עם 7-0 תפרים שאינם ניתנים לספיגה הן עבור DMM והן עבור הליכי זיוף כדי להבטיח שימוש נכון בברך לאחר הריפוי.
- הזרקת SR Buprenorphine (0.20-0.5 מ"ג/ק"ג) תת עורית (SC) מיד לפני ההליך הכירורגי עבור משככי כאבים, אשר מספק הקלה בכאב עד 72 שעות לאחר זריקה אחת. לפקח על בעלי חיים שניתחו לאחר הניתוח.
- המתת חסד של בעלי חיים באמצעות תא CO2 ב 2, 8, ו 16 שבועות לאחר הניתוח. לאחר חוסר הכרה, לאשר את מותם של בעלי החיים בשיטה פיזית (פתיחת חלל החזה). שיטות אלה של המתת חסד עולות בקנה אחד עם המלצות הפאנל על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (AVMA).
- לקצור את מפרקי הברך עבור ניתוחים היסטולוגיים ב 2, 8, ו 16 שבועות לאחר ניתוח DMM וב 2 ו 16 שבועות לאחר ניתוח שאם כדי להשיג מפרקי ברך העכבר עם דרגות שונות של חומרת OA או עיבוי SCB.
2. הכנת קטעי רקמות ותמונות היסטולוגיות
- תקן דגימות רקמת מפרק הברך של העכבר ב- 2% paraformaldehyde, נקה אותן ב-25% חומצה פורמית, הטמע בפרפין, וקטע את קורונלילי כדי לבחון הן את התאים המדיאליים והן את התאים הצדדיים.
- לחתוך דגימות הברך מהצד האחורי של הברך באמצעות microtome ולאסוף קטעי רקמה כי הם 5-מיקרומטר עובי במרווחי 70-80 מיקרומטר כדי לקבל כ 40 שקופיות רקמות על פני מפרק הברך כולו. הערכה בסיוע מיקרומטר עולה כי מספרי שקופיות 1-6 הם מן האחורי הרחוק, 11-18 מאמצע האחורי, 23-30 מאמצע הקדמי, ו 35-40 מהחלק הקדמי הרחוק של מפרק הברך. יש להשליך או לאסוף מקטעים מתערבים לכתמים נוספים.
- בצע Safranin-O וכתמים ירוקים מהירים על פי הוראות היצרן כדי לזהות באופן ספציפי תאי סחוס ומטריצות על כל חמש שקופיות. בצע כתמי המטוקסילין-אאוזין על פי הוראות היצרן לבחון את מפרקי הברך ברמות התא והרקמות כפי שתואר קודם לכן 19,20,21,22.
- רכש תמונות היסטולוגיות עם מיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית. ניתוח היסטופתולוגי כללי ודירוג OA היסטולוגי נערכו כמתואר לעיל 15,19,20,20,21,22.
3. מדידה כמותית של עצם תת-תכונדרלית אוסטיאוארטית עם תוכנת ImageJ
- הורד את תוכנת ImageJ ופתח תמונות היסטולוגיות מעניינות.
- הורד את ImageJ יחד עם Java 1.8.0_172 מ- https://imagej.nih.gov/ij/.
- פתח את תוכנית ImageJ. לחץ על הכרטיסיה קובץ ברצועת הכלים ולחץ על האפשרות פתח כדי לפתוח את התמונה ההיסטולוגית.
- חפש את כתובת ספריית הקבצים, בחר את קובץ התמונה ולחץ על פתח.
- כייל את ImageJ עם המיקרומטר בתמונות ההיסטולוגיות.
- השתמש בכלי קו ישר כדי לשרטט יחידת אורך אחת במיקרומטר ולחץ על נתח > (לאחר מכן) הגדר קנה מידה. הגדר את יחס הגובה-רוחב של המרחק הידוע והפיקסל ל- 1 ולחץ על אישור. ImageJ יכול להמיר את אורך הפיקסלים לאורך היחידה במיקרומטר.
- הגדר את הגורם הנמדד לאזור. לחץ על נתח > הגדר מדידה וסמן את התיבה אזור והגבלה לסף תחת חלון חדש. שלב זה מגדיר את ImageJ כדי למדוד את הפרמטר "Area" בתוך "סף" שנבחר.
- מדוד את אזור העניין הכולל של העצם התת-קונדרלית (SCB).
- הגדר את אזור העניין של SCB (ROI) כפי שמוצג בקופסאות הכתומות של איור 1A, המכסה את לוחית קליפת המוח SCB וחלק מהעצם הטרבקרית הבסיסית הצמודה לצלחת קליפת המוח בקונדיל הירך המדיאלי (MFC) וברמה המדיאלית (MTP) עם ממדים ספציפיים לכל החזר על ההשקעה. עיבוי SCB osteoarthritic מתרחשת בדרך כלל באזורים אלה. הגדר את ההחזר על ההשקעה של SCB עם אותה צורה וממד בכל MFC או MTP עבור כל המפרקים שנבדקו כדי להבטיח שאותו גודל של ההחזר על ההשקעה הספציפי נמדד עבור כל בעלי החיים.
- שרטטו את החלוקה לרמות של אזור העניין הכולל של SCB באמצעות כלי הבחירה Polygon מתחת לחלון הראשי של ImageJ.
הערה: כלי הבחירה מעניקים למערכת סף להגבלת האזור הנמדד. - מדוד את אזור ה- SCB הכולל: לאחר בחירת הסף, לחץ על נתח > מדידה. ייפתח חלון "תוצאות" עם מדידת שטח.
- מדוד את אזור חומר העצם המכיל עצם מוצקה ללא מח עצם.
- לחץ על ערוך > נקה בחוץ כדי לא לכלול את האזור מחוץ לאזור ה- SCB הכולל.
הערה: רק אזור ה- SCB הכולל גלוי לאחר לחיצה על האפשרות נקה חיצונית . התמונה מחוץ לאזור SCB הכולל תהפוך לשחורה. שלב זה מאפשר למשקיפים להתמקד באזור חומר העצם בתחום העניין. - לחץ על תמונה > התאם > סף צבע כדי לפתוח את החלון "צבע סף". לחץ על מקורי בתחתית החלון "צבע סף" כדי לשחזר את התמונה למצב המקורי. השתמש בכלי בחירה בשלב 3.3.2 כדי לצייר קופסה קטנה באזור חומר העצם. לחץ על האפשרות דוגמה בתחתית החלון "צבע סף" כדי להגדיר את אזור חומר העצם.
הערה: האפשרות "מדגם" בחלון "צבע סף" מאפשרת ל- ImageJ לבחור את כל אותם פיקסלים באזור ה- SCB הכולל כמו אזור דגימת חומר העצם. אזור חומר העצם שנבחר יהפוך לאדום. - לחץ על בחר בתחתית חלון איזון צבע הסף כדי ליצור סף מדידת שטח. לחץ על נתח > מדוד בתפריט הראשי של ImageJ, ותוצאת מדידת אזור חומר העצם תוצג בחלון "תוצאות".
- שמור את הנתונים של אזור SCB הכולל ואזור חומר העצם.
- לחץ על ערוך > נקה בחוץ כדי לא לכלול את האזור מחוץ לאזור ה- SCB הכולל.
- חשב את היחס בין אזור חומר העצם (mm2) לאזור SCB הכולל (mm2) של עניין המייצג את עובי חומר העצם (mm2/1.0 mm2) בתוך שטח SCB הכולל.
- מדוד את עובי ה-SCB של מקטעים/תמונות היסטולוגיים (כמתואר בשלבים 3.1-3.5) של אזורים אחוריים רחוקים, אמצע-אחוריים, אמצע-קדמיים וקדימיים רחוקים (כמתואר בשלב 2.2) של OA המושרה ב-DMM כדי להעריך עובי SCB ספציפי לאזור של 6 מפרקי ברכיים (איור 1B).
הערה: זה יכול לאמת את האמינות של פרוטוקול מדידה כמותית זה כי ידוע כי שינויים SCB osteoarthritic בשיתוף לוקליזציה עם נגעים סחוס וכי נזק סחוס osteoarthritic עם עיבוי SCB הוא חמור יותר באזורים נושאי משקל (אמצע החלק) של מפרקי הברך מכרסמים14,15. לכן, ראוי להשתמש באמצע מקטעים למדידה כמותית של עיבוי SCB osteoarthritic.
4. סטטיסטיקה
- בצע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות נתונים ממדידה כמותית ודירוג חזותי של עובי SCB. קבעו את השונות והשחזור הבין-צופה-תוך-צופה על-ידי ניתוח מקדם המתאם של פירסון.
- קבע את משמעות ההבדלים בין קבוצות לימוד באמצעות מבחני t של סטודנט או ANOVA חד כיווני, ואחריו מבחן פוסט הוק (Tukey) באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני. שקול p-ערך של פחות מ 0.05 להיות משמעותי מבחינה סטטיסטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השוואת שחזור בין דירוג הערכה חזותית למדידה כמותית בסיוע ImageJ:
עובי SCB ב -48 אזורי עניין (ROI) (24 MFC ו- 24 MTP), המוגדר ממקטע ביניים של כל ברך מ -24 ברכיים / בעלי חיים הובקע על ידי שלושה אנשים עצמאיים באמצעות ערכת הניקוד החזותי הקיימת 0-3 כמתואר בספרות15,23, כאשר 0 = נורמלי (ללא עיבוי SCB), 1 = מתון, 2 = מתון, ו - 3 = עיבוי SCB חמור. תמונות אלה נבחרו מתוך שלוש נקודות זמן שונות לאחר הניתוח ב 2, 8, ו 16 שבועות לאחר הליך DMM או מזויף. בדרך כלל, עכברים עם הליך DMM הראו ציון עיבוי SCB חזותי 0 ב 2 שבועות לאחר הניתוח, ציונים 1-2 ב 8 שבועות, וציונים 2-3 ב 16 שבועות. עובי SCB של תמונות היסטולוגיות אלה נמדדו אז כמותית על ידי שלושה משקיפים עצמאיים אחרים באמצעות תוכנת ImageJ כדי לאמת את השחזור והרגישות של התוכנית החדשה. תמונות היסטולוגיות מייצגות עם או בלי החזר השקעה מפורט ב-MFC וב-MTP לדירוג חזותי או מדידות כמותיות מוצגות באיור 2, שבו תמונות שנבדקו חולקו לשלוש קבוצות: ברך מזויפת (ציון חזותי 0), ברך DMM (ציון חזותי 0) וברך DMM (ציון חזותי 1-3).
ניתוחים השוואתיים מפורטים של רבייה בין מדידה כמותית בסיוע ImageJ ודירוג הערכה חזותית של עובי SCB מוצגים בטבלה 1. בדיקות מקדם מתאם מצביעות על כך שהמדידה הכמותית הייתה יחסית יותר ניתנת לשחזור ממערכת הדירוג של ההערכה החזותית.
רבייה בין-עינית ותוך-צופה:
בדיקות מקדם מתאם הדגימו רבייה גבוהה של המדידות בסיוע ImageJ עם מקדמי מתאם בין-צופים של >0.93 בין >0.93 בין אובזרבר A, B ו- C לממוצע המדידות הראשונה והשנייה באזורי MTP ו- MFC (איור 3). ניתוח השונות התוך-צופה של אותה קבוצה של תמונות היסטולוגיות הראה גם רבייה גבוהה בין ציוני המדידה הראשונה והשנייה עבור כל אחד משלושת המשקיפים עם מקדם מתאם תוך-צופה של >0.95 לכל הצופים (איור 4).
רגישות:
כדי להעריך אם מערכת המדידה הכמותית החדשה SCB רגישה יותר לשינויי עיבוי SCB אוסטיאוארתריטיים מאשר מערכת הדירוג החזותית הנפוצה, 48 תחומי עניין של תמונות היסטולוגיות (24 MFC ו- 24 MTP) מ -24 ברכיים / בעלי חיים הוערכו לראשונה על ידי שלושה אנשים עצמאיים המנוסים בהיסטופתולוגיה של OA ובמערכות דירוג קיימות של OA. עיבוי SCB דורג באמצעות ערכת ניקוד חזותית 0-3 כמתואר לעיל. מדידה כמותית בסיוע ImageJ בוצעה לאחר מכן על אותה קבוצה של תמונות היסטולוגיות מדורגות חזותית על ידי שלושה אנשים אחרים שהתעוורו לתוצאות הדירוג החזותיות של OA. עובי SCB של MFC ו- MTP של כל תמונה נמדד באופן כמותי עם ImageJ כמתואר בסעיף פרוטוקול. התוצאות הראו כי עובי SCB הממוצע (mm2/1.0 mm2) של תמונות DMM עם ציוני עיבוי SCB חזותיים 1-3 היה גבוה משמעותית מזה של תמונות Sham עם ציון עיבוי חזותי "0". חשוב מכך, גם עובי ה-SCB הממוצע של תמונות DMM עם ציון עיבוי SCB חזותי "0" היה גבוה משמעותית מזה של תמונות Sham עם ציון חזותי "0" (איור 5). הנתונים מצביעים בחום על כך שמדידת SCB הכמותית בסיוע ImageJ רגישה יותר לשינויי עיבוי SCB המוקדמים והמתונים מאשר שיטת הדירוג החזותי.
איור 1: תמונות היסטולוגיות עם Safranin-O וכתמים ירוקים מהירים מקבוצות Sham ו- DMM למדידת SCB כמותית בסיוע ImageJ. (A) התיבות המסומנות בקו צהוב מנוקד מגדירות את אזור העניין של SCB (ROI). האזור של חומר העצם בתוך הקופסאות מודגש בכתום. ניתן לכמת את עובי ה- SCB בקונדיל הירך המדיאלי (MFC) וברמה המדיאלית (MTP) באמצעות תוכנת ImageJ. הממדים המדויקים של ההחזר על ההשקעה ב- MFC וב- MTP מוגדלים כדי לשפר את הנראות. (B) עובי SCB של תמונות היסטולוגיות מאזורים אחוריים רחוקים, אמצע אחוריים, אמצע קדמיים וקדמיים של MTP ב 16 שבועות לאחר DMM היה כימות כדי להעריך עובי SCB ספציפי לאזור. N = 6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות היסטולוגיות מייצגות עם Safranin-O וכתמים ירוקים מהירים מקבוצות Sham ו- DMM לדירוג SCB חזותי ומדידת SCB כמותית. לוחות עליונים: פוטומיקוגרפיות של קבוצות Sham ו- DMM לדירוג SCB חזותי. לוחות נמוכים יותר: פוטומיקוגרפיות של קבוצות שאם ו- DMM למדידת SCB כמותית בסיוע ImageJ. התיבות המסומנות בקו צהוב מנוקד (עשויות מ- Adobe Illustrator) ב- MFC וב- MTP מגדירות את אזור ה- SCB מעניין. האזור של חומר העצם (למעט מח עצם) בתוך הקופסאות מודגש בכתום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מבחני וריאציה בין-צופים. ניתוחי מקדם מתאם מצביעים על רבייה גבוהה בין שלושה משקיפים (משקיפים A, B ו- C) עבור עובי SCB בממוצע מן המדידות 1 ו - 2 באזורי MTP ו- MFC של עניין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בדיקות וריאציה תוך-צופה. ניתוחי מקדם מתאם מצביעים על יכולת רבייה גבוהה בין מדידות עובי ה- SCB הראשון והשני באזורי MTP ו- MFC של עניין עבור כל אחד מהצופים A, B ו- C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוחי רגישות השוואתית של דירוג חזותי ומדידה כמותית בסיוע ImageJ של עובי SCB ב- MFC וב- MTP. התמונות ההיסטולוגיות לדירוג הערכה חזותית חולקו לשלוש קבוצות (Sham עם ציון עיבוי SCB "0", DMM עם ציון עיבוי SCB "0" ו- DMM עם ציון עיבוי SCB 1-3). הערה: ערכי עובי SCB הכמותיים מכל שלושת המשקיפים עבור תמונות DMM עם ציון עיבוי SCB חזותי "0" היו גבוהים משמעותית מזה של תמונות Sham עם ציון חזותי "0", המציין כי המדידה הכמותית רגישה יותר מאשר הדירוג החזותי לעיבוי SCB מתון. N = 6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שיטת | משקיף/מבקיע | MTP | MFC |
| מקדם מתאם בין-משקיפים (r) | |||
| מדידה כמותית | א' לעומת.B | 0.9685 | 0.9421 |
| א' לעומת.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B לעומת. C | 0.9109 | 0.9288 | |
| דירוג חזותי | D לעומת E | 0.6455 | 0.6031 |
| D לעומת F. | 0.6 | 0.7419 | |
| E לעומת F. | 0.6454 | 0.603 | |
| מקדם מתאם תוך-משקיף (r) | |||
| מדידה כמותית | A | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| דירוג חזותי | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
טבלה 1: השוואת שחזור בין מדידה כמותית בסיוע תוכנה לדירוג הערכה חזותית עבור עובי SCB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מדידת עיבוי SCB היא מרכיב חשוב בהערכות היסטולוגיות של חומרת OA. רוב מערכות הדירוג הקיימות של OA מתמקדות בעיקר בשינויי סחוס15,16,17. שיטת דירוג עובי SCB אוסטיאוארתריטית נפוצה, המקטלגת את עיבוי SCB כמתון, מתון וחמור, היא סובייקטיבית ברובה, ואמינותה לא אומתה במלואה15. המחקר הנוכחי פיתח ואימת פרוטוקול מדידה חדש כדי לכמת את עובי SCB, הכולל את השלבים הבאים: יצירת OA הברך בעכברים, הכנת קטעי רקמות ותמונות היסטולוגיות, מדידה כמותית של עצם תת-קונדרלית אוסטיאוארתרית עם תוכנת ImageJ, וניתוח סטטיסטי כדי לאמת את הרגישות והשחזור של הפרוטוקול.
למרות הטכניקות הכלליות של פרוטוקול זה בצע את ההוראות של תוכנת ImageJ, כללנו פרטים טכניים שלב אחר שלב כדי להפוך משתמשים חדשים קלים יותר לעקוב ולאמת את השכפול. תוכנית BoneJ, תוסף של תוכנת ImageJ, פועלת היטב למדידת תמונות דו-ממדיות בשחור-לבן אך אינה מתפקדת היטב להחרגת אזור מח העצם מהשטח הכולל של SCB בשל הדמיון בין צל בין מח עצם לחומר SCB בשחור ולבן. לעומת זאת, ניתן להחיל את השיטות החישוביות המתוארות בפרוטוקול הנוכחי על כל התמונות ההיסטולוגיות הצבעוניות באמצעות פונקציית סף הצבע כדי להפריד באופן אוטומטי את חומר ה- SCB ממח העצם, ובכך למדוד את עובי ה- SCB נטו. שיטה חדשה (שאינה חלק מ- ImageJ) לחישוב צפיפות SCB (אזור SCB נטו mm2/1.0 mm2 של החזר על ההשקעה) כלולה בפרוטוקול הנוכחי.
לפרוטוקול המוצג במאמר זה יש מספר יתרונות. ראשית, ImageJ היא מערכת תוכנה חופשית והיא זמינה באתר NIH. שנית, המערכת החדשה קלה ללמידה וליישום; המדידה הכמותית אורכת רק 5-6 דקות לכל החזר השקעה של SCB. שלישית, התוצאות מהמערכת החדשה ניתנות לשחזור עם שונות בין-עינית-ואינטר-צופה נמוכה מאוד. לבסוף, המערכת החדשה רגישה יותר לשינויי עיבוי SCB מתונים מאשר מערכות דירוג חזותיות קיימות.
מגבלה מינורית של המערכת החדשה היא הצורך בתמונות בקרה ככיולים לניתוח סטטיסטי. עם זאת, זה לא צריך להיות בעיה עבור רוב פרוייקטי OA כמו תמונות בקרה כמעט תמיד כלולים לניתוח נתונים. מגבלה פוטנציאלית נוספת היא שתוכנת ImageJ יכולה להפריד בין חומרי SCB למח עצם בהתבסס על פיקסלי הצבע שלהם, המסתמכים על שיטות הכתמה מתאימות כדי להראות צבעים שונים לחומר העצם ומח העצם.
מערכת המדידה הכמותית החדשה SCB מתאימה לכימות עובי SCB בכל הרמות. עבור תמונות היסטולוגיות עם עיבוי SCB מדהים, המערכת החדשה יכולה לכמת במדויק את האזור המדויק של חומר העצם ולאחר מכן להמיר אותו לצפיפות העצם (נטו SCB mm2/1.0 mm2 של החזר על ההשקעה) המייצג את עובי העצם לכל אזור יחידה. עבור תמונות היסטולוגיות עם עיבוי SCB לא יוצא דופן שלא ניתן לזהותו על ידי דירוג חזותי, המערכת החדשה יכולה לזהות עיבוי עדין או מתון המתרחש לעתים קרובות בשלב מוקדם של OA. לכן, המערכת החדשה יכולה לשמש לניטור התקדמות OA וביעילות vivo של טיפולי OA בתיאום עם דירוג סחוס OA. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש גם למדידת עובי SCB במינים אחרים לאחר התאמת הגודל של החזר על ההשקעה SCB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרס R01 AR059088, משרד ההגנה (DoD) תחת פרס מחקר מספר W81XWH-12-1-0304, וקרן הפרופסורים המכובדת של מרי ופול הרינגטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
