Summary
Dit methodologieartikel presenteert een softwarematig kwantitatief meetprotocol om histologische subchondrale botdikte in muriene artrosekniegewrichten en normale kniegewrichten als controles te kwantificeren. Dit protocol is zeer gevoelig voor subtiele verdikking en is geschikt voor het detecteren van vroege artrose subchondrale botveranderingen.
Abstract
Subchondrale botverdikking en sclerose zijn de belangrijkste kenmerken van artrose (OA), zowel bij diermodellen als bij mensen. Momenteel wordt de ernst van de histologische subchondrale botverdikking meestal bepaald door op visuele schatting gebaseerde semi-kwantitatieve beoordelingssystemen. Dit artikel presenteert een reproduceerbaar en gemakkelijk uit te voeren protocol om de subchondrale botdikte kwantitatief te meten in een muismodel van knie-artrose geïnduceerd door destabilisatie van de mediale meniscus (DMM). Dit protocol maakte gebruik van ImageJ-software om de subchondrale botdikte op histologische beelden te kwantificeren na het definiëren van een interessegebied in de mediale femorale condylus en het medische tibiale plateau waar subchondrale botverdikking meestal optreedt bij DMM-geïnduceerde knie-artrose. Histologische beelden van kniegewrichten met een schijnprocedure werden gebruikt als controles. Statistische analyse gaf aan dat het nieuw ontwikkelde kwantitatieve subchondrale botmeetsysteem zeer reproduceerbaar was met lage intra- en interwaarnemervariabiliteiten. De resultaten suggereren dat het nieuwe protocol gevoeliger is voor subtiele of milde subchondrale botverdikking dan de veelgebruikte visuele beoordelingssystemen. Dit protocol is geschikt voor het detecteren van zowel vroege als voortschrijdende artrose subchondrale botveranderingen en voor het beoordelen van de in vivo werkzaamheid van artrosebehandelingen in combinatie met artrose kraakbeen grading.
Introduction
Artrose (OA), röntgenologisch gekenmerkt door gewrichtsruimtevernauwing als gevolg van het verlies van gewrichtskraakbeen, osteofyten en subchondrale bot (SCB) sclerose, is de meest voorkomende vorm van artritis1,2. Hoewel de rol van peri-articulaire bot in de etiologie van artrose niet volledig wordt begrepen, worden osteofytenvorming en SCB-sclerose over het algemeen beschouwd als het resultaat van het ziekteproces in plaats van oorzakelijke factoren, maar veranderingen in peri-articulaire botarchitectuur / vorm en biologie kunnen bijdragen aan de ontwikkeling en progressie van OA3,4 . De ontwikkeling van een nauwkeurig en gemakkelijk uit te voeren OA-beoordelingssysteem, inclusief SCB-meting, is van cruciaal belang voor vergelijkende studies tussen onderzoekslaboratoria en bij het evalueren van de werkzaamheid van therapeutische middelen die zijn ontworpen om OA-progressie te voorkomen of te verzwakken.
SCB is gebouwd met een dunne koepelachtige botplaat en een onderliggende laag trabeculair bot. De SCB-plaat is de corticale lamellen, die parallel aan en direct onder het verkalkte kraakbeen liggen. Kleine takken van arteriële en veneuze vaten, evenals zenuwen, dringen door de kanalen in de SCB-plaat en communiceren tussen het verkalkte kraakbeen en het trabeculaire bot. Het subchondrale trabeculaire bot bevat bloedvaten, sensorische zenuwen, beenmerg en is poreuzer en metabolisch actiever dan de SCB-plaat. Daarom oefent SCB schokabsorberende en ondersteunende functies uit en is het ook belangrijk voor de toevoer en het metabolisme van kraakbeenvoeding in normale gewrichten5,6,7,8.
SCB-verdikking (in de histologie) en sclerose (in radiografie) zijn de belangrijkste kenmerken van artrose en belangrijke onderzoeksgebieden van de pathofysiologie van artrose. Het meten van SCB-verdikking is een belangrijk onderdeel van histologische beoordelingen van de ernst van artrose. Eerder gerapporteerde digitale microradiografie voor het meten van Knaagdier SCB minerale dichtheid9 evenals micro-computertomografie (micro-CT) gebaseerde kwantitatieve SCB-meting in knaagdiermodellen van OA10,11,12,13 hebben ons begrip van SCB-structuur en de rol van SCB-veranderingen in OA-pathofysiologie verbeterd. SCB-oppervlakte en -dikte zijn ook gekwantificeerd met histologische dia's met behulp van een geavanceerd computersysteem met specifieke en dure bot histomomorfosemetriesoftware14. Niettemin worden op visuele schatting gebaseerde semi-kwantitatieve OA-sorteersystemen, waaronder SCB-verdikkingsgradatie, momenteel op grotere schaal gebruikt dan micro-CT omdat de sorteersystemen gemakkelijk te gebruiken zijn, met name voor het screenen van talrijke histologische beelden. De meeste bestaande OA-sorteersystemen richten zich echter voornamelijk op kraakbeenveranderingen15,16,17. Een veelgebruikte artrose SCB-dikteclassificatiemethode die SCB-verdikking categoriseert als mild, matig en ernstig is grotendeels subjectief en de betrouwbaarheid ervan is niet volledig gevalideerd15. Een betrouwbaar en eenvoudig uit te voeren stap-voor-stap artrose SCB diktemeetprotocol is niet volledig ontwikkeld of niet-gestandaardiseerd.
Deze studie was gericht op het ontwikkelen van een reproduceerbaar, gevoelig en gemakkelijk uit te voeren protocol om de SCB-dikte kwantitatief te meten in een muismodel van OA. Onze rigoureuze meettests en statistische analyse toonden aan dat dit door ImageJ software ondersteunde kwantitatieve meetprotocol de SCB-dikte in zowel normale als artrose kniegewrichten kon kwantificeren. Het nieuw ontwikkelde protocol is reproduceerbaar en gevoeliger voor milde SCB-veranderingen dan de veelgebruikte visuele sorteersystemen. Het kan worden gebruikt voor het detecteren van vroege artrose SCB-veranderingen en voor het beoordelen van de in vivo werkzaamheid van artrosebehandelingen in combinatie met OA-kraakbeenclassificatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprocedures in dit protocol zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het University of Kansas Medical Center, in overeenstemming met alle federale en staatswetten en -voorschriften.
1. Creatie van knie artrose bij muizen
- Maak een muismodel van knie-artrose door chirurgische destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) zoals beschreven door Glasson et al.18 bij 22 wild-type BALB / c-muizen op de leeftijd van 10-11 weken. Voer schijnchirurgie uit als een controleprocedure op acht muizen met dezelfde achtergrond en leeftijd.
OPMERKING: Beide geslachten werden gebruikt voor het oorspronkelijke project om te voldoen aan de NIH-vereiste voor het overwegen van geslacht als een biologische variabele, hoewel onderzoek naar geslachtsverschil niet de reikwijdte van dit protocol is. - Verdoof dieren door inademing van isofluraan. Controleer de diepte van de anesthesie door hun ademhalingsfrequentie / inspanning en gebrek aan respons op teen / staart knijpen te controleren. Zet dieren in rugligging.
- Scheer de huid in het kniegebied en reinig de huid met Povidone-Jodium + alcohol huidscrub; drie afwisselende cycli.
- Voer de DMM-procedure uit op de rechterknie onder een chirurgische microscoop. Stel het kniegewricht bloot via een mediale parapatellaire incisie (1,2-1,5 cm lang) en snijd het gewrichtskapsel in. Houd de patella en de patellapees intact. Na zorgvuldige blootstelling van het mediale meniscotibiale ligament (MML) dat de mediale meniscus aan het tibiale plateau verankert, transect het met een micro-chirurgische schaar om de mediale meniscus te destabiliseren.
- Voer schijnchirurgie uit aan de rechterknie als een controleprocedure, waarbij de MML werd gevisualiseerd maar niet doorgesneden.
- Sluit de gezamenlijke capsule met 8-0 absorbeerbare polyglactine hechtingen en huidincisie met 7-0 niet-absorbeerbare hechtingen voor zowel DMM- als schijnprocedures om het juiste gebruik van de knie te garanderen zodra genezing heeft plaatsgevonden.
- Injecteer SR Buprenorfine (0,20-0,5 mg/kg) subcutaan (SC) onmiddellijk vóór de chirurgische ingreep voor analgesie, die pijnverlichting biedt tot 72 uur na een enkele injectie. Monitor geopereerde dieren na de operatie.
- Euthanaseer dieren met behulp van een CO2-kamer 2, 8 en 16 weken na de operatie. Bevestig na bewusteloosheid de dood van de dieren met een fysieke methode (het openen van de borstholte). Deze methoden van euthanasie zijn in overeenstemming met de aanbevelingen van het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association (AVMA).
- Oogst de kniegewrichten voor histologische analyses op 2, 8 en 16 weken na DMM-operatie en op 2 en 16 weken na Sham-operatie om muiskniegewrichten te verkrijgen met verschillende graden van OA-ernst of SCB-verdikking.
2. Voorbereiding van weefselsecties en histologische beelden
- Fixeer muis knie gewrichtsweefsel monsters in 2% paraformaldehyde, ontkalk ze in 25% mierenzuur, embed in paraffine, en sectie coronaal om zowel de mediale als laterale compartimenten te onderzoeken.
- Snijd kniemonsters van de achterste kant van de knie met behulp van een microtoom en verzamel weefselsecties die 5-μm dik zijn met intervallen van 70-80 μm om ongeveer 40 weefselglijbanen over het hele kniegewricht te verkrijgen. Een micrometerondersteunde schatting suggereert dat diagetallen 1-6 afkomstig zijn van het ver-achterste, 11-18 van midden-achterste, 23-30 van midden-voorste en 35-40 van het verre voorste deel van het kniegewricht. Gooi tussenliggende secties weg of verzamel ze voor extra vlekken.
- Voer Safranin-O en snelle groene vlekken uit volgens de instructies van de fabrikant om kraakbeencellen en matrices specifiek te identificeren op elke vijf dia's. Voer Hematoxyline-Eosine-kleuring uit volgens de instructies van de fabrikant om de kniegewrichten op cellulair en weefselniveau te onderzoeken zoals eerder beschreven19,20,21,22.
- Verkrijg histologische beelden met een microscoop uitgerust met een digitale camera. Algemene histopathologische analyse en histologische OA-beoordeling werden uitgevoerd zoals eerder beschreven15,19,20,21,22.
3. Kwantitatieve meting van artrose subchondraal bot met ImageJ-software
- Download de ImageJ-software en open histologische afbeeldingen van belang.
- Download de ImageJ gebundeld met Java 1.8.0_172 van https://imagej.nih.gov/ij/.
- Open het programma ImageJ. Klik op het tabblad Bestand op het lint en klik op de optie Openen om de histologische afbeelding te openen.
- Zoek het adres van de bestandsmap, selecteer het afbeeldingsbestand en klik op Openen.
- Kalibreer ImageJ met de micrometer op de histologische beelden.
- Gebruik het rechtlijnige gereedschap om één lengte-eenheid op de micrometer te schetsen en klik op Analyseren > (vervolgens) Schaal instellen. Stel de bekende afstand en pixelverhouding in op 1 en klik op OK. ImageJ kan de pixellengte omzetten naar de eenheidslengte op micrometer.
- Stel de gemeten factor in op gebied. Klik op Analyseren > Meting instellen en schakel het selectievakje Gebied en Beperken tot drempel in onder nieuw venster. Met deze stap stelt ImageJ in om de parameter "Gebied" binnen de geselecteerde "Drempel" te meten.
- Meet het totale subchondrale bot (SCB) gebied van belang.
- Definieer het SCB-interessegebied (ROI) zoals weergegeven in de oranje vakken van figuur 1A, die de SCB-corticale plaat en een deel van het onderliggende trabeculaire bot naast de corticale plaat in de mediale femorale condylus (MFC) en het mediale tibiale plateau (MTP) bedekt met specifieke afmetingen voor elke ROI. Artrose SCB verdikking treedt meestal op in deze gebieden. Definieer de SCB ROI met dezelfde vorm en afmeting in elke MFC of MTP voor alle onderzochte gewrichten om ervoor te zorgen dat dezelfde grootte van de specifieke ROI werd gemeten voor alle dieren.
- Schets de omtrek van het totale SCB-interessegebied met behulp van het gereedschap Polygoonselectie onder het hoofdvenster van ImageJ.
OPMERKING: De selectietools geven het systeem een drempel om het gemeten gebied te beperken. - Het totale SCB-gebied meten: Nadat de drempelwaarde is geselecteerd, klikt u op Analyseren > meting. Er wordt een venster "Resultaten" met gebiedsmeting geopend.
- Meet het gebied van de botsubstantie met vast bot zonder beenmerg.
- Klik op Bewerken > Buiten wissen om het gebied buiten het totale SCB-gebied uit te sluiten.
OPMERKING: Alleen het totale SCB-gebied is zichtbaar nadat u op de optie Buiten wissen hebt geklikt. De foto buiten het totale SCB-gebied wordt zwart. Met deze stap kunnen waarnemers zich concentreren op het gebied van de botsubstantie binnen het interessegebied. - Klik op Afbeelding > Pas > kleurdrempel aan om het venster "Drempelkleur" te openen. Klik op Origineel onder aan het venster 'Drempelkleur' om de afbeelding terug te zetten naar de oorspronkelijke status. Gebruik selectiegereedschappen in stap 3.3.2 om een klein vakje in het botsubstantiegebied te tekenen. Klik op de optie Voorbeeld onder aan het venster 'Drempelkleur' om het gebied van de botsubstantie te definiëren.
OPMERKING: Met de optie "Monster" in het venster "Drempelkleur" kan ImageJ dezelfde pixels selecteren op het totale SCB-gebied als het monstergebied van de botstof. Het geselecteerde botsubstantiegebied wordt rood. - Klik op Selecteren onder aan het venster met de drempelkleurbalans om een drempel voor gebiedsmeting te maken. Klik op Analyseren > Meten in het hoofdmenu van ImageJ en het meetresultaat van het botsubstantiegebied wordt weergegeven in het venster "Resultaten".
- Sla de gegevens van het totale SCB-gebied en het botsubstantiegebied op.
- Klik op Bewerken > Buiten wissen om het gebied buiten het totale SCB-gebied uit te sluiten.
- Bereken de verhouding tussen het botsubstantieoppervlak (mm2) en het totale SCB-gebied (mm2) van belang, dat de dikte van de botstof (mm2/1,0 mm2) binnen het totale SCB-gebied vertegenwoordigt.
- Meet de SCB-dikte van histologische secties/afbeeldingen (zoals beschreven in stappen 3.1-3.5) van ver-achterste, mid-posterieure, mid-anterieure en ver-voorste gebieden (zoals beschreven in stap 2.2) van DMM-geïnduceerde OA om de gebiedsspecifieke SCB-dikte van 6 kniegewrichten te beoordelen (figuur 1B).
OPMERKING: Dit kan de betrouwbaarheid van dit kwantitatieve meetprotocol valideren omdat het bekend is dat artrose SCB-veranderingen co-lokaliseren met kraakbeenlaesies en dat artrosekraakbeenschade met SCB-verdikking ernstiger is in de gewichtdragende gebieden (middengedeelte) van knaagdierkniegewrichten14,15. Daarom is het aangewezen om middensecties te gebruiken voor kwantitatieve meting van artrose SCB-verdikking.
4. Statistieken
- Voer statistische analyses uit met behulp van gegevens van kwantitatieve metingen en visuele sortering van SCB-dikte. Bepaal de inter- en intra-waarnemer variabiliteit en reproduceerbaarheid door Pearson's correlatiecoëfficiëntanalyses.
- Bepaal de betekenis van verschillen tussen studiegroepen met behulp van Student's t-tests of one-way ANOVA, gevolgd door een post-hoc test (Tukey) met behulp van spreadsheetsoftware. Beschouw een p-waarde van minder dan 0,05 als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reproduceerbaarheidsvergelijking tussen visuele schattingsgradatie en ImageJ-ondersteunde kwantitatieve meting:
SCB-dikte in 48 interessante regio's (ROI) (24 MFC en 24 MTP), gedefinieerd uit een middengedeelte van elke knie van 24 knieën / dieren, werd gescoord door drie onafhankelijke personen met behulp van het bestaande 0-3 visuele scoreschema zoals beschreven in de literatuur15,23, waarbij 0 = normaal (geen SCB-verdikking), 1 = mild, 2 = matig en 3 = ernstige SCB-verdikking. Deze beelden werden geselecteerd uit drie verschillende postoperatieve tijdstippen op 2, 8 en 16 weken na de DMM- of schijnprocedure. Meestal vertoonden muizen met een DMM-procedure een visuele SCB-verdikkingsscore 0 na 2 weken na de operatie, scores 1-2 na 8 weken en scores 2-3 na 16 weken. De SCB-dikte van deze histologische beelden werd vervolgens kwantitatief gemeten door drie andere onafhankelijke waarnemers met behulp van ImageJ-software om de reproduceerbaarheid en gevoeligheid van het nieuwe schema te valideren. Representatieve histologische beelden met of zonder een geschetste ROI in MFC en MTP voor visuele gradatie of kwantitatieve metingen worden gepresenteerd in figuur 2, waarin onderzochte beelden werden verdeeld in drie groepen: schijnknie (visuele score 0), DMM-knie (visuele score 0) en DMM-knie (visuele score 1-3).
Gedetailleerde vergelijkende analyses van de reproduceerbaarheid tussen imageJ-ondersteunde kwantitatieve metingen en visuele schattingsgradatie van SCB-dikte zijn weergegeven in tabel 1. Correlatiecoëfficiënttests suggereren dat de kwantitatieve meting relatief reproduceerbaarder was dan het visuele schattingsclassificatiesysteem.
Reproduceerbaarheid tussen en binnen waarnemer:
Correlatiecoëfficiënttests toonden een hoge reproduceerbaarheid van de imageJ-ondersteunde metingen met inter-waarnemer correlatiecoëfficiënten van >0,93 tussen waarnemer A, B en C voor het gemiddelde van de eerste en tweede meting in de MTP- en MFC-regio's (figuur 3). Intra-waarnemer variabiliteitsanalyse van dezelfde set histologische beelden toonde ook een hoge reproduceerbaarheid tussen de eerste en tweede meetscores voor elk van de drie waarnemers met een intra-waarnemer correlatiecoëfficiënt van >0,95 voor alle waarnemers (figuur 4).
Gevoeligheid:
Om te beoordelen of het nieuwe kwantitatieve SCB-meetsysteem gevoeliger is voor artrose SCB-verdikkingsveranderingen dan het veelgebruikte visuele beoordelingssysteem, werden 48 interessegebieden van histologische beelden (24 MFC en 24 MTP) van 24 knieën / dieren eerst beoordeeld door drie onafhankelijke personen die ervaring hebben met OA-histopathologie en bestaande OA-beoordelingssystemen. SCB-verdikking werd beoordeeld met behulp van een 0-3 visueel scoreschema zoals hierboven beschreven. BeeldJ-geassisteerde kwantitatieve meting werd vervolgens uitgevoerd op dezelfde set visueel gegradeerde histologische beelden door nog eens drie personen die blind waren voor de visuele OA-gradatieresultaten. De SCB-dikte van de MFC en MTP van elke afbeelding werd kwantitatief gemeten met ImageJ zoals beschreven in de sectie Protocol. De resultaten toonden aan dat de gemiddelde SCB-dikte (mm2/1,0 mm2) van de DMM-afbeeldingen met visuele SCB-verdikkingsscores 1-3 significant hoger was dan die van de Sham-afbeeldingen met een "0" visuele verdikkingsscore. Wat nog belangrijker is, de gemiddelde SCB-dikte van de DMM-afbeeldingen met een "0" visuele SCB-verdikkingsscore was ook significant hoger dan die van de Sham-afbeeldingen met een "0" visuele score (figuur 5). De gegevens suggereren sterk dat de imageJ-ondersteunde kwantitatieve SCB-meting gevoeliger is voor de vroege en milde SCB-verdikkingsveranderingen dan de visuele sorteermethode.
Figuur 1: Histologische beelden met Safranin-O en snelle groene kleuring van Sham- en DMM-groepen voor ImageJ-ondersteunde kwantitatieve SCB-meting. (A) De vakken omlijnd met een gestippelde gele lijn definiëren het SCB-gebied van belang (ROI). Het gebied van botsubstantie in de dozen is oranje gemarkeerd. De SCB-dikte in de mediale femorale condylus (MFC) en het mediale tibiale plateau (MTP) kan worden gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software. De exacte afmetingen van de ROI in MFC en MTP worden vergroot om de zichtbaarheid te verbeteren. (B) SCB-dikte van histologische beelden van ver-achterste, mid-posterieure, mid-anterieure en ver-anterieure gebieden van de MTP na 16 weken na DMM werd gekwantificeerd om gebiedsspecifieke SCB-dikte te beoordelen. N = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve histologische beelden met Safranin-O en snelle groene kleuring van Sham- en DMM-groepen voor visuele SCB-sortering en kwantitatieve SCB-meting. Bovenste panelen: Fotomicrografen van Sham- en DMM-groepen voor visuele SCB-sortering. Onderste panelen: Fotomicrografen van Sham- en DMM-groepen voor imageJ-ondersteunde kwantitatieve SCB-meting. De vakken met een gestippelde gele lijn (gemaakt met Adobe Illustrator) in MFC en MTP definiëren het interessante SCB-gebied. Het gebied van de beensubstantie (met uitzondering van beenmerg) in de dozen is oranje gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Variatietests tussen waarnemers. Correlatiecoëfficiëntanalyses wijzen op een hoge reproduceerbaarheid tussen drie waarnemers (waarnemers A, B en C) voor SCB-dikte gemiddeld van de 1e en 2e metingen in de MTP- en MFC-regio's van belang. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Intra-waarnemer variatietests. Correlatiecoëfficiëntanalyses wijzen op een hoge reproduceerbaarheid tussen de 1e en 2e SCB-diktemetingen in de MTP- en MFC-regio's die van belang zijn voor elk van de waarnemers A, B en C . Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Vergelijkende gevoeligheidsanalyses van visuele sortering en imageJ-ondersteunde kwantitatieve meting van SCB-dikte in de MFC en MTP. De histologische beelden voor visuele schattingsbeoordeling werden verdeeld in drie groepen (Sham met "0" SCB-verdikkingsscore, DMM met "0" SCB-verdikkingsscore en DMM met SCB-verdikkingsscore 1-3). Opmerking: De kwantitatieve SCB-diktewaarden van alle drie de waarnemers voor de DMM-afbeeldingen met een "0" visuele SCB-verdikkingsscore waren significant hoger dan die van de Sham-afbeeldingen met een "0" visuele score, wat aangeeft dat de kwantitatieve meting gevoeliger is dan de visuele gradatie voor milde SCB-verdikking. N = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Methode | Waarnemer/doelpuntenmaker | MTP | MFC |
| Correlatiecoëfficiënt tussen waarnemers (r) | |||
| Kwantitatieve meting | Een vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| Een vs.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B vs. C | 0.9109 | 0.9288 | |
| Visuele gradatie | D tegen E | 0.6455 | 0.6031 |
| D tegen F | 0.6 | 0.7419 | |
| E tegen F | 0.6454 | 0.603 | |
| Correlatiecoëfficiënt intrawaarnemer (r) | |||
| Kwantitatieve meting | Een | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| Visuele gradatie | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
Tabel 1: Reproduceerbaarheidsvergelijking tussen softwareondersteunde kwantitatieve metingen en visuele schattingsgradatie voor SCB-dikte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meten van SCB-verdikking is een belangrijk onderdeel van histologische beoordelingen van de ernst van artrose. De meeste bestaande OA-sorteersystemen richten zich voornamelijk op kraakbeenveranderingen15,16,17. Een veelgebruikte muriene artrose SCB-dikteclassificatiemethode die SCB-verdikking categoriseert als mild, matig en ernstig is grotendeels subjectief en de betrouwbaarheid ervan is niet volledig gevalideerd15. De huidige studie heeft een nieuw meetprotocol ontwikkeld en gevalideerd om de SCB-dikte te kwantificeren, dat de volgende stappen omvat: creatie van knie-artrose bij muizen, voorbereiding van weefselsecties en histologische beelden, kwantitatieve meting van artrose subchondraal bot met ImageJ-software en statistische analyse om de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van het protocol te valideren.
Hoewel de algemene technieken van dit protocol de instructies van ImageJ-software volgen, hebben we stapsgewijze technische details opgenomen om nieuwe gebruikers gemakkelijker te volgen en de reproduceerbaarheid te valideren. Het BoneJ-programma, een plug-in van ImageJ-software, werkt goed voor het meten van 2D zwart-witbeelden, maar functioneert niet goed voor het uitsluiten van beenmerggebied van het totale oppervlak van SCB vanwege de gelijkenis van schaduw tussen beenmerg en SCB-substantie in zwart en wit. Daarentegen kunnen de stapsgewijze methoden die in het huidige protocol worden beschreven, worden toegepast op alle kleurenhistorologische afbeeldingen met behulp van de kleurdrempelfunctie om de SCB-stof automatisch van het beenmerg te scheiden, waardoor de netto SCB-dikte wordt gemeten. Een nieuwe methode (geen onderdeel van ImageJ) voor het berekenen van SCB-dichtheid (netto SCB-oppervlakte mm2/1,0 mm2 ROI) is opgenomen in het huidige protocol.
Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, heeft verschillende voordelen. Ten eerste is ImageJ een gratis softwaresysteem en is het direct beschikbaar op de NIH-website. Ten tweede is het nieuwe systeem eenvoudig te leren en toe te passen; de kwantitatieve meting duurt slechts 5-6 min per SCB ROI. Ten derde zijn de resultaten van het nieuwe systeem zeer reproduceerbaar met zeer lage inter- en intra-waarnemer variabiliteiten. Ten slotte is het nieuwe systeem gevoeliger voor milde SCB-verdikkingsveranderingen dan bestaande visuele nivelleringssystemen.
Een kleine beperking van het nieuwe systeem is de behoefte aan controlebeelden als kalibratoren voor statistische analyse. Dit zou echter geen probleem moeten zijn voor de meeste OA-projecten, omdat besturingsbeelden bijna altijd worden opgenomen voor gegevensanalyse. Een andere mogelijke beperking is dat de ImageJ-software SCB-stoffen van beenmerg kan scheiden op basis van hun kleurpixels, wat afhankelijk is van geschikte kleuringsmethoden om verschillende kleuren voor beensubstantie en beenmerg weer te geven.
Het nieuwe kwantitatieve SCB-meetsysteem is geschikt voor het kwantificeren van SCB-dikte op alle niveaus. Voor histologische beelden met opmerkelijke SCB-verdikking kan het nieuwe systeem het exacte gebied van botsubstantie nauwkeurig kwantificeren en vervolgens omzetten in botdichtheid (netto SCB mm2 / 1,0 mm2 ROI) die de botdikte per oppervlakte-eenheid vertegenwoordigt. Voor histologische beelden met niet-opmerkelijke SCB-verdikking die niet kan worden gedetecteerd door visuele gradatie, kan het nieuwe systeem een subtiele of milde verdikking identificeren die vaak optreedt in een vroege fase van artrose. Daarom kan het nieuwe systeem worden gebruikt voor het monitoren van OA-progressie en in vivo werkzaamheid van OA-therapieën in combinatie met OA-kraakbeenbeoordeling. Bovendien kan dit protocol ook worden gebruikt voor het meten van SCB-dikte in andere soorten na aanpassing van de grootte van SCB ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health (NIH) onder awardnummer R01 AR059088, het Department of Defense (DoD) onder Research Award Number W81XWH-12-1-0304 en de Mary and Paul Harrington Distinguished Professorship Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
- Kotlarz, H., Gunnarsson, C. L., Fang, H., Rizzo, J. A. Insurer and out-of-pocket costs of osteoarthritis in the US: evidence from national survey data. Arthritis and Rheumatology. 60 (12), 3546-3553 (2009).
- Buckwalter, J. A., Martin, J. A.
- Weinans, H., et al. Pathophysiology of peri-articular bone changes in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 190-196 (2012).
- Baker-LePain, J. C., Lane, N. E. Role of bone architecture and anatomy in osteoarthritis. Bone. 51 (2), 197-203 (2012).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: Insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research and Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Madry, H., van Dijk, C. N., Mueller-Gerbl, M. The basic science of the subchondral bone. Knee Surgery, Sports, Traumatology, Arthrosclerosis. 18 (4), 419-433 (2010).
- Milz, S., Putz, R. Quantitative morphology of the subchondral plate of the tibial plateau. Journal of Anatomy. 185, Pt 1 103-110 (1994).
- Blalock, D., Miller, A., Tilley, M., Wang, J.
- Waung, J. A., et al. Quantitative X-ray microradiography for high-throughput phenotyping of osteoarthritis in mice. Osteoarthritis Cartilage. 22 (10), 1396-1400 (2014).
- Botter, S. M., et al. Cartilage damage pattern in relation to subchondral plate thickness in a collagenase-induced model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 16 (4), 506-514 (2008).
- Nalesso, G., et al. Calcium calmodulin kinase II activity is required for cartilage homeostasis in osteoarthritis. Science Reports. 11 (1), 5682 (2021).
- Ding, M., Christian Danielsen, C., Hvid, I. Effects of hyaluronan on three-dimensional microarchitecture of subchondral bone tissues in guinea pig primary osteoarthrosis. Bone. 36 (3), 489-501 (2005).
- Kraus, V. B., Huebner, J. L., DeGroot, J., Bendele, A. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the guinea pig. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 35-52 (2010).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in Mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3 17-23 (2010).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. Journal of Bone and Joint Surgery American. 53 (3), 523-537 (1971).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Wang, J., et al. Transcription factor Nfat1 deficiency causes osteoarthritis through dysfunction of adult articular chondrocytes. Journal of Pathology. 219 (2), 163-172 (2009).
- Zhang, M., Lu, Q., Budden, T., Wang, J. NFAT1 protects articular cartilage against osteoarthritic degradation by directly regulating transcription of specific anabolic and catabolic genes. Bone Joint Research. 8 (2), 90-100 (2019).
- Zhang, M., et al. Epigenetically mediated spontaneous reduction of NFAT1 expression causes imbalanced metabolic activities of articular chondrocytes in aged mice. Osteoarthritis Cartilage. 24 (7), 1274-1283 (2016).
- Rodova, M., et al. Nfat1 regulates adult articular chondrocyte function through its age-dependent expression mediated by epigenetic histone methylation. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (8), 1974-1986 (2011).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
