Summary
이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.
Abstract
막대 광수용체는 뚜렷한 구획을 가진 고도로 편광 된 감각 뉴런입니다. 마우스 막대는 길고 (∼80 μm) 얇고 (~2 μm) 망막의 최외곽층, 광수용체 층에 측방으로 패킹되어, 유사한 세포 하부 구획의 정렬을 초래한다. 전통적으로, 동결된 평탄한 망막의 접선 절편은 상이한 막대 구획 내의 단백질의 이동 및 국소화를 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 막대 지배적 마우스 망막의 높은 곡률은 접선 단면화를 어렵게 만든다. 구획 사이의 단백질 수송에 대한 연구에 동기를 부여하여, 우리는 막대 외부 세그먼트 (ROS)와 서부 블로트를위한 다른 세포 하부 구획을 안정적으로 분리하는 두 가지 박리 방법을 개발했습니다. 우리의 비교적 빠르고 간단한 기술은 농축 및 아세포 특이적 분획을 제공하여 정상 막대에서 중요한 광수용체 단백질의 분포 및 재분포를 정량적으로 측정합니다. 더욱이, 이러한 분리 기술은 또한 건강한 망막 및 퇴행성 망막 내의 다른 세포층의 단백질 조성을 분리하고 정량적으로 조사하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.
Introduction
신경 망막의 최외곽층에 단단히 포장 된 막대 광수용체 세포는 희미한 빛 시력의 필수적인 부분입니다. 충실한 광자 카운터 역할을 하기 위해 로드는 광형질도입(phototransduction)이라고 불리는 G-단백질 기반 신호전달 경로를 활용하여 단일 광자 포획에 대한 신속하고 증폭되며 재현 가능한 반응을 생성합니다. 빛에 대한 이러한 반응은 궁극적으로 원형질막에서 전류의 변화를 촉발시키고 그 후 시각 시스템의 나머지 부분에 신호를 보냅니다1. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 각 막대 세포는 뚜렷한 막대 모양의 모양을 가지며 외부 세그먼트 (OS), 내부 세그먼트 (IS), 세포체 (CB) 및 시냅스 말단 (ST)으로 구성된 고도로 편광 된 세포 형태를 나타냅니다. 각 세포 하부 구획에는 특정 단백질 기계 (막 결합 및 용해성), 생체 분자 특징 및 시각적 광형질도입, 일반적인 하우스 키핑 및 단백질 합성, 시냅스 전달과 같은 중요한 역할을하는 단백질 복합체가 있습니다2,3.
30여 년 전, 아세포 단백질, 특히 트랜스듀신(OS로부터 멀어짐)과 어레스틴(OS를 향하여)의 광의존적 상호 이동이 처음 관찰되었다4,5,6,7. 초기에, 이 관찰된 현상은 부분적으로는 에피토프 마스킹에 대한 면역조직화학의 취약성 때문에 회의론으로 받아들여졌다8. 2000년대 초에, 자극-의존성 단백질 전좌는 엄격하고 힘든 물리적 절편 기술9을 사용하여 확인되었다. 면역블롯팅에 이어 동결된 평탄한 설치류 망막의 직렬 접선 절편은 트랜스듀신9,10, arrestin11,12 및 recoverin13이 모두 빛에 반응하여 세포하 재분배를 겪는다는 것을 밝혀냈다. 이러한 주요 신호전달 단백질의 광구동 전좌는 광형질도입 캐스케이드9,14,15의 감도를 조절할 뿐만 아니라, 광손상에 대한 신경보호가 될 수도 있다고 여겨진다16,17,18. 막대에서의 광 구동 단백질 수송은 막대 세포 생물학 및 생리학에 매우 중요한 것으로 보이기 때문에 단백질 분포를 결정하기 위해 다른 세포 하위 구획을 분리 할 수있는 기술은 귀중한 연구 도구입니다.
현재, 막대 세포 하부 구획을 분리하기위한 몇 가지 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 길고 재현하기 어렵거나 상당한 양의 망막 분리가 필요할 수 있습니다. 밀도 구배 원심분리19를 통한 막대 외부 세그먼트(ROS) 제제는 예를 들어, 망막 균질물로부터 ROS를 분리하는데 일반적으로 사용된다. 이 방법은 웨스턴 블롯에 널리 사용되지만 절차는 매우 시간이 많이 걸리고 최소 8-12 뮤린 레티네20이 필요합니다. 한편, 냉동 뮤린 및 래트 망막의 직렬 접선 절편은 OS, IS, CB, 및 ST9,11,13을 단리하는데 성공적으로 구현되었다. 그러나이 방법은 접선 절편화 전에 망막 층을 정렬하기 위해 작고 고도로 구부러진 뮤린 망막을 완전히 평평하게 할 필요가 있기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 시각 시스템의 질병을 되풀이하는 마우스 모델과 트랜스제닉 마우스가 과다하기 때문에 개별 막대 구획을 안정적이고 신속하며 쉽게 분리하는 기술의 생성은 각 특수 구획에서 발생하는 생리 학적 과정과 건강 및 질병의 시각적 과정의 기초가되는 메커니즘을 드러내는 데 공약을 가지고 있습니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 현재의 프로토콜보다 더 쉽게 막대 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 박리 방법을 설명합니다. 패치 클램프 기록21을 위해 형광 표지된 양극성 세포를 노출시키는 기술로부터 적응된 첫 번째 박리 방법은 셀룰로오스 여과지를 사용하여 살아있는 분리된 뮤린 망막으로부터 ROS를 순차적으로 제거한다(도 1). 병아리22 및 개구리23 망막으로부터 3개의 일차 망막 세포층을 분리하는 절차에서 적응된 두 번째 방법은 접착 테이프를 사용하여 동결건조된 망막으로부터 ROS 및 막대 내부 세그먼트(RIS)를 제거한다(그림 2). 두 절차 모두 1 시간 내에 완료 할 수 있으며 상당히 사용자 친화적입니다. 우리는 로드 트랜스듀신(GNAT1) 및 어레스틴(ARR1)의 광유도 전좌를 입증하기 위해 C57BL/6J 마우스로부터의 어두운 적응 및 광노출 망막을 활용하여 웨스턴 블롯에 대한 이러한 두 가지 분리 프로토콜의 효과에 대한 검증을 제공합니다. 또한, 테이프 필링 방법을 사용하여, 우리는 우리의 기술이 면역 세포 화학 (ICC)에 의해 획득 된 단백질 국소화 데이터와 서양 블로트 사이의 불일치를 조사하고 해결하는 데 사용될 수 있다는 추가적인 증거를 제공합니다. 구체적으로, 우리의 기술은 1) 단백질 키나아제 C-알파 (PKCα) 이소형이 양극성 세포뿐만 아니라 뮤린 ROS 및 RIS에도 존재하며, 낮은 농도임에도 불구하고24,25, 및 2) 로돕신 키나아제 (GRK1)가 단리된 OS 샘플에 우세하게 존재한다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 특정 막대와 망막 단백질을 분리하고 정량화하기위한 두 가지 박리 기술의 효과를 보여줍니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 실험은 서던 캘리포니아 대학 (USC)의 동물 관리 연구위원회의 지역 기관 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 살아있는 세포 망막 박리 방법
- Ames의 완충액, 필링 종이 및 해부 접시 준비
- 무딘 팁 아이리스 가위(또는 이와 동등한 가위 유형)를 사용하여 셀룰로오스 여과지(등급 413)를 약 5mm x 2.5mm 크기의 직사각형으로 자릅니다. 나중에 사용할 수 있도록 절단을 보관하십시오.
- Ames' Medium, 2.38g HEPES 및 0.877g의 NaCl 1병을 배합하여 Ames' HEPES 버퍼 1L를 준비합니다. 시약을 멸균 유리 병에 증류수 초순수로 용해시키고 삼투압 및 pH를 각각 280 mOsm 및 7.4로 조정한다. 여과하여 멸균시키고(기공 크기 0.2 μm), 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 4°C에서 보관한다.
- Ames' Medium 1병과 NaHCO3 1.9g을 결합하여 Ames' 중탄산염 완충액 1L를 준비합니다. 시약을 멸균 유리 병에 증류수 초순수로 용해시키고 삼투압 및 pH를 각각 280 mOsm 및 7.4로 조정한다. 여과하여 멸균시키고(기공 크기 0.2 μm), 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 4°C에서 보관한다.
참고: Ames의 HEPES 및 Ames의 중탄산염 버퍼는 미리 준비하여 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다. - 35 x 10mm 페트리 접시 바닥에 메스(블레이드 번호 11, 40mm)가 있는 격자 또는 바둑판 패턴을 만듭니다.
참고 : 페트리 접시의 질감이있는 바닥은 망막 해부 중에 고립되고 자유롭게 떠있는 눈을 제자리에 고정시킵니다.
- 망막의 해부
참고: 이 절차에서는 버퍼를 실온(RT)으로 가져와 보관해야 합니다. 해부 중에 신선한 탄산 에임스의 중탄산염 버퍼로 15 분마다 새로 고칩니다. 이것은 필요한 생리학적 pH를 유지한다.- 해부 전 약 15-20분 전에 튜브 캡 어댑터가 장착된 100mL 실험실 또는 미디어 병에 Ames의 HEPES 버퍼를 산소를 공급하고 Ames의 중탄산염 버퍼를 조직 배양 챔버 및 튜브 캡 어댑터가 장착된 100mL 실험실 또는 미디어 병에 95% O2 및 5 % CO2 로 버블링합니다.
- 이소플루란 흡입 또는 이산화탄소(CO2)에 의해 C57BL/6J 마우스(생후 2-3개월)의 두 성별을 동일하게 안락사시킨 후 자궁경부 탈구를 실시한다. 구부러진 가위로 눈을 에핵화하고 거품이 난 Ames의 중탄산염 버퍼로 채워진 질감이 있는 35 x 10mm 페트리 접시에 눈을 넣습니다.
- 18G 바늘로 각막-림푸스 접합부에 구멍을 뚫어 아이컵(그림 1A)을 만듭니다. 이 접합부의 둘레를 따라 마이크로 해부 홍채 가위를 사용하여 각 눈의 각막을 제거하십시오. 핀셋을 사용하여 각 눈에서 렌즈와 유리체 유머를 분리하고 버리십시오.
- 망막 색소 상피 (RPE)-공막-맥락막 복합체를 신경 망막으로부터 조심스럽게 벗겨서 안구 컵에서 망막을 분리하십시오. RPE-공막-맥락막 복합체를 폐기하십시오. 가장자리 만 처리하여 해부 중에 망막이 손상되지 않도록하십시오.
- 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여 분리된 망막을 버블링된 Ames' 중탄산염 버퍼로 채워진 60 x 15mm 접시의 뚜껑으로 옮깁니다.
- 반구 모양의 망막을 오목하게 (광수용체가 접시의 바닥을 향하고 있음) 방향을 잡고 홍채 가위 또는 메스 (블레이드 번호 10, 40mm)를 사용하여 각 망막 (시신경을 통해)을 양분합니다. 각 절반 망막의 곡선 가장자리를 트리밍하여 두 개의 사각형을 만듭니다(그림 1A).
참고: 각 반으로 줄어든 망막의 곡률을 최소화하면 후속 박리 단계에서 망막이 더 잘 평평해지고 막대 외부 세그먼트(ROS) 층의 정확한 박리가 생성됩니다. - 반으로 줄어든 망막을 95% O2 및 5% CO2로 지속적으로 버블링되는 조직 인큐베이션 챔버에 보관하십시오.
참고 : 분리 된 망막은 ~ 24 시간 동안 탄수화물 화 된 Ames의 중탄산염 완충액에 보관할 수 있습니다.
- 여과지 필링에 의한 막대 외부 세그먼트 (ROS) 수집
참고: 필요한 생리적 pH를 유지하기 위해 박리 과정에서 15-20분마다 RT 산소화된 Ames의 HEPES 버퍼를 새로 고칩니다.- 넓은 보어 전달 피펫과 5mm x 2.5mm 여과지가 있는 티슈 챔버에서 100% O2로 버블링된 Ames의 HEPES 버퍼로 채워진 35 x 10mm 페트리 접시에 망막 구형 1개를 옮깁니다.
- 분할 된 망막을 오목하게 향하게하고 광수용체가 접시의 바닥을 향해 아래로 향하고 있는지 확인하십시오. 핀셋으로 반으로 줄어든 망막의 측면을 가볍게 잡고 여과지 위로 옮깁니다. 망막이 여과지에 중앙에 배치되면 절반으로 줄어든 망막이 여과지에 닿도록 여과지를 위쪽으로 움직여 ROS-to-여과지 접착력을 만듭니다(그림 1B).
참고: 광수용체 층이 여과지와 직접 접촉하는지 확인하십시오. - 부착된 망막이 있는 여과지를 조심스럽게 Ames의 HEPES 버퍼에서 들어올립니다. 여과지의 아래쪽(망막이 없는 쪽)을 종이 타월에 놓고 2~3회 닦아 말립니다(그림 1B).
- 망막이있는 여과지 측면에 Ames의 HEPES 한 방울을 추가하십시오. 방금 설명한 대로 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 말립니다. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.
- 망막이 있는 여과지를 페트리 접시에 다시 넣습니다. 핀셋을 사용하여 반으로 줄어든 망막의 모든 가장자리를 부드럽게 밀어 올리고 사방의 여과지에서 멀리 뺍니다.
- 망막을 여과지에서 섬세하게 벗겨냅니다. 박리 과정에서 망막의 극단적 인 둘레 만 만져서 망막의 구조적 무결성을 보존하십시오.
- 페트리 접시에서 여과지를 들어 올리고 종이 타월에 과도한 액체를 제거하십시오. 망막과 접촉한 쪽이 종이 타월에 닿지 않는지 확인하십시오.
- 부분 ROS 층이 있는 여과지를 얼음 위에 라벨이 표시된 튜브에 넣습니다(그림 1B). 껍질을 벗긴 망막을 Ames의 HEPES 버퍼에 잠기십시오.
- 이 반으로 줄어든 망막에 대해 박리 과정을 약 7-8회 반복하여 전체 ROS 층을 제거한다. 각 껍질을 벗긴 후, 하나의 반으로 줄어든 망막으로부터 분리된 ROS를 함유할 동일한 튜브에 여과지를 놓는다.
참고: 반으로 줄어든 망막을 여과지에서 떼어낼 때 망막이 찢어지지 않도록 주의하십시오. - 분리된 ROS의 모든 여과지 껍질을 함유하는 튜브를 즉시 사용하기 위해 얼음 위에 놓거나 드라이아이스 상에 직접 동결시키고 -80°C에서 보관한다.
- 핀셋을 사용하여 남은 껍질을 벗긴 망막 (ROS 부족)을 적절하게 표지 된 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 올려 놓고 즉시 사용하거나 드라이 아이스로 얼리고 -80 °C에서 보관하십시오.
- 반으로 줄어든 각 망막에 대해 필링 과정을 반복하고 각 튜브에 정확하게 라벨을 붙입니다.
2. 동결건조된 망막 박리법
- 완충액, 박리 배지, 해부 접시 준비 및 동결 건조기 설정
- 1L 저장병에 증류수 500mL를 첨가하여 링거 용액을 준비합니다. 130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 및 0.02 mM EDTA의 최종 농도에 도달하도록 시약을 용해시킨다. NaOH로 pH를 7.4로 조정하고, 초순수를 첨가하여 최종 부피를 1 L로 만들고, 삼투압을 313 mOsm으로 조정한다.
- 사용 전에, 링거 용액을 멸균 필터(기공 크기 0.2 μm)로 여과하고, 뚜껑을 파라핀 필름으로 밀봉하고, 4°C에서 보관한다.
- 무딘 팁 아이리스 가위(또는 이와 동등한 가위 유형)를 사용하여 셀룰로오스 여과지를 약 5mm x 2.5mm 크기의 직사각형으로 자릅니다. 연필을 사용하여 필터 용지의 한쪽면에 글을 써서 고유 한 레이블을 만듭니다.
- 메스(블레이드 번호 11, 40 mm)를 사용하여 35 x 10 mm 페트리 접시의 바닥에 격자 또는 바둑판 패턴을 만듭니다.
- 제조업체의 사양에 따라 동결 건조기를 켭니다.
- Dewar 플라스크 또는 유사한 절연 진공 플라스크에서 액체 질소를 획득하십시오.
- 망막 박리
- 프로토콜의 섹션 1에 설명된 대로 망막 박리를 완료합니다(도 1A). Ames의 버퍼 대신 콜드 링거의 솔루션을 사용하십시오.
- 해부 후 반으로 줄어든 직사각형 망막을 차가운 링거 용액으로 채워진 35 x 10mm 페트리 접시에 보관하고 얼음 위에 놓습니다.
- 동결건조를 위한 망막 시료 준비
- 5 x 2.5mm 여과지를 놓고 반쯤 된 망막을 차가운 링거의 버퍼로 채워진 질감화 된 35 x 10mm 페트리 접시에 옮깁니다. 넓은 보어 전달 피펫을 사용하여 각 망막을 접시 사이로 옮깁니다.
- 핀셋을 사용하여 망막이 오목하게 위로 향하도록 조심스럽게 뒤집고(광수용체가 위쪽을 향하고 있음) 여과지 위에 놓이도록 움직입니다(그림 2A).
참고 : 감광체가 여과지에 닿지 않도록하십시오 (망막 신경절 세포층은 여과지와 직접 접촉해야합니다) 고유 한 라벨이 보입니다. 망막 분리물을 쉽고 빠르게 식별하려면 고유한 라벨을 여과지의 아래쪽에 위치시키는 것이 좋습니다. - 절반으로 줄어든 망막 조각이 여과지에 닿도록 가장자리를 위쪽으로 들어 올리고 링거의 용액에서 여과지를 계속 들어올립니다.
- 여과지의 아래쪽(망막이 없는 쪽)을 종이 타월에 놓고 조심스럽게 2-3번 닦아 과도한 액체를 제거합니다(그림 2A).
- 핀셋으로 여과지를 집어 들고 망막이있는 여과지 측면에 차가운 링거 한 방울을 추가하십시오. 여과지를 종이 타월에 다시 올려 놓고 과도한 액체를 제거하십시오. 이 과정을 두 번 더 반복하십시오.
참고: 이러한 번갈아 가며 습윤 및 건조 단계는 조직이 여과지에 단단히 부착되도록 합니다. - 부착 된 각 망막 / 여과지 샘플을 모든 샘플을 동결 할 준비가 될 때까지 차가운 링거로 채워진 페트리 접시에 보관하십시오. 모든 반으로 줄어든 망막에 대해이 과정을 반복하십시오.
- 깨끗하고 건조한 35 x 10mm 페트리 접시 (바닥만)와 3.5 x 3.5 인치 정사각형으로 자른 알루미늄 호일 조각을 얻으십시오.
- 핀셋으로 차가운 링거의 버퍼에서 각 샘플을 들어 올립니다. 핀셋이 여과지 가장자리에만 닿았는지 확인하여 망막이 절반으로 줄어든 것을 피하십시오.
- 각 여과지의 아래쪽 측면 (망막이없는 쪽)을 종이 타월에 놓고 과도한 액체를 제거하십시오.
- 차가운 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)의 방울을 망막이 부착되는 여과지의 측면에 첨가한다. 과도한 액체를 제거하기 위해 종이 타월에 여과지를 닦으십시오.
주: 얼기 전에 여과지의 습기가 충분히 제거되었는지 확인하십시오. - 모든 여과지 조각을 35 x 10mm 페트리 접시에 넣으십시오. 보풀이 없는 티슈 페이퍼를 사용하여 여과지 주변의 과도한 액체를 제거하십시오.
참고 : 샘플로 페트리 접시를 과밀하지 마십시오. 네 개 이상의 뮤린 눈을 사용하는 경우 망막 / 여과지 샘플을 보관하기 위해 더 큰 페트리 접시 또는 여러 개의 작은 페트리 접시를 사용하는 것이 좋습니다. - 접시 전체를 알루미늄 호일로 단단히 감싸십시오. 알루미늄 호일의 가장자리가 고정되어 있고 페트리 접시의 바닥에 부드럽게 눌려져 있는지 확인하십시오. 알루미늄 호일 뚜껑에 0.1-0.2mm 구멍 몇 개를 뚫습니다(그림 2A).
- 금속 집게를 사용하여 페트리 접시로 덮인 알루미늄 호일을 액체 질소로 서서히 내립니다. 샘플을 동결건조할 준비가 될 때까지 액체 질소(<10분)에 보관하십시오.
- 동결건조
- 알루미늄 호일로 덮인 페트리 접시를 동결 건조 플라스크에 넣고 제조업체의 프로토콜에 따라 동결 건조기 기계에 부착하십시오. 망막을 30 분 동안 동결 건조하십시오.
- 동결 건조기에서 플라스크를 분리하고 제조업체에 따라 기계를 차단하십시오.
- 알루미늄 호일을 제거하고 같은 날 동결 건조 된 샘플로 작업하거나 적절하게 표지 된 1 mL 마이크로 원심분리 튜브에 보관하십시오. 이들 튜브를 무수 건조제로 채워진 용기(예: 50 mL 원뿔형 튜브)에 넣고 샘플을 -80°C에서 보관한다.
- 접착 테이프 필링에 의한 막대 외부 및 내부 세그먼트 수집.
- 명확한 접착 테이프 (1-2cm)의 스트립을 자르고 빠른 사용을 위해 테이프 디스펜서 / 실험실 벤치 / 등의 가장자리에 스트립을 보관하십시오.
- 껍질을 벗기기 위해 망막 샘플 하나를 플라스틱 60 x 15mm 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다. 여과지의 가장 바깥 쪽 가장자리 만 잡고 망막에 닿지 않도록하십시오.
- 무딘 팁 아이리스 가위 (또는 동등한 가위 유형)를 사용하여 작은 직사각형 테이프 조각을 조직의 대략적인 크기 (1.5 x 2.5mm)로 자릅니다.
- 동결건조된 망막 위에 작은 테이프 조각을 조심스럽게 깔고(그림 2B) 핀셋에 약간의 압력을 가하여 광수용체 층(주황색/분홍색 색조의 최상층)과 결합하는지 확인합니다.
- 테이프를 천천히 벗겨냅니다. 로드 외부 세그먼트(ROS) 및 로드 내부 세그먼트(RIS) 모두 테이프에 부착됩니다(그림 2B).
- 골절 된 표면에 얇은 흰색 필름이 있는지 확인하십시오. 이렇게 RIS.To RIS를 분리하고 다른 테이프 조각을 놓은 다음 테이프를 파단된 표면에 아래로 밀어 넣습니다(그림 2B).
참고: 얇은 흰색 레이어 전체를 제거하는 데 테이프가 두 개 이상 필요할 수 있습니다. - 주황색/분홍색 층만 있는 테이프 조각을 +ROS라고 표시된 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 얇은 흰색 층이 있는 테이프 또는 테이프 조각을 +RIS라고 표시된 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.
참고 : 동결 건조 된 망막을 테이프로 분리하는 것은 연습이 필요합니다. 테이프에 가해지는 압력의 양은 동결건조된 샘플이 어떻게 분획되는지에 영향을 미칩니다. 샘플 위에 테이프에 너무 많은 압력을 가하면 동결 건조 된 망막 전체가 여과지를 벗겨 내고 테이프에 달라 붙습니다. 테이프에 너무 적은 압력이 가해지면 주황색/분홍색 상단 레이어(+ROS)가 테이프에 달라붙지 않습니다. - 테이프를 사용하여 여과지로부터 두껍고 하얀 층을 벗겨냄으로써 여과지 상에 위치한 남은 망막 조직(ROS 및 RIS 층의 bereft, -OIS)을 수집한다. 분리물을 -OIS로 표지된 튜브에 넣는다.
- 각 반으로 줄어든 망막 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 단백질 정량, 겔 전기영동 및 단백질 면역블롯을 같은 날 수행하는 경우 동결건조된 망막으로부터 분리된 층을 실온에서 보관하거나, 추후 사용을 위해 -80°C에서 무수 건조제로 채워진 용기(예: 50 mL 원뿔형 튜브)에 보관한다.
3. 박리 분리를위한 웨스턴 블롯 샘플 준비
- RIPA 용해 완충액 준비
- 100 mL 저장 병에서, 시약을 첨가하여 최종 농도인 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 및 1 mM EDTA를 얻었다. 탈이온화 초순수 100 mL를 넣고 완전히 섞는다.
참고: RIPA 용해 완충액은 2-8°C에서 2-3주 동안 보관할 수 있습니다. 더 긴 보관을 위해, 분취량을 -20°C 냉동고에 보관한다. - 실험 당일, 프로테아제 억제제 칵테일 (0.1 M PMSF, 1:1000 아프로티닌 및 1:1000 루펩틴)을 RIPA 용해 완충액에 첨가하고 얼음 위에 보관하십시오.
- 100 mL 저장 병에서, 시약을 첨가하여 최종 농도인 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 및 1 mM EDTA를 얻었다. 탈이온화 초순수 100 mL를 넣고 완전히 섞는다.
- 여과지 박리 용해물 웨스턴 블롯을위한 준비
- 여과지 껍질 및 남은 박리된 망막을 함유하는 튜브가 얼음 위에 유지되는지(당일 실험을 위해) 또는 -80°C 냉동고 보관에서 제거되었는지 확인하고 얼음 위에 놓는다.
- 여과지 껍질이 들어있는 마이크로 원심분리 튜브의 바닥에서 과도한 액체를 제거하십시오. 미니 원심 분리기에서 2-4 초 동안 빠르게 회전하고 남아있는 액체를 버리십시오.
- 차가운 RIPA 완충액 45-55 μL를 피펫으로 여과지를 함유하는 튜브에 넣고 분리하였다.
- 각 샘플을 깨끗하고 오토클레이브 된 페슬 믹서로 1 분 동안 균질화하십시오. 여과지가 페슬 믹서와 닿아 있는지 확인하십시오. 여과지를 바닥이 아닌 각 튜브의 측면에 보관하십시오.
- 핀셋을 사용하여 여과지를 각 튜브의 측면으로 옮기고 미니 원심 분리기에서 2-4 초 동안 회전하십시오. 그러면 필터 용지에서 RIPA 버퍼가 제거됩니다.
- 건조 된 여과지를 제거하고 필요한 경우 각 튜브 내의 모든 필터 용지에 대해 반복하십시오.
- 균질액을 새 튜브로 옮기고 적절하게 라벨을 붙입니다.
참고: 이 단계는 가장 시간이 많이 걸리는 단계이며, 제대로 완료되지 않으면 많은 샘플이 여과지에 흡수됩니다. - 차가운 RIPA 버퍼 60-80 μL를 피펫으로 남은 박리된 망막과 함께 개별 튜브에 넣습니다.
- 각 샘플을 깨끗하고 오토클레이브 된 페슬 믹서로 1 분 동안 균질화하십시오.
- 테이프 필링 서부 블롯을위한 용해물 준비
- RT 동결건조된 샘플 또는 -80°C 샘플을 얼음 위에 놓는다.
- 차가운 RIPA 버퍼 50-70 μL를 +ROS 및 +RIS 테이프 껍질을 포함하는 각 튜브에 피펫.
- 60-80 μL의 냉 용해 완충액을 피펫 잔여 동결건조된 망막을 함유하는 -OIS 튜브에 넣고, ROS 및 RIS를 제거하였다.
- 각 샘플을 깨끗한 페슬 믹서로 1 분 동안 균질화하십시오. 개별 튜브의 테이프가 페슬 믹서 및 용해 버퍼와 접촉하고 있는지 확인하십시오.
- 멸균 된 핀셋으로 테이프를 튜브 옆으로 옮기고 미니 원심 분리기로 2-4 초 동안 회전하십시오. 이렇게하면 테이프에서 액체가 제거됩니다. 튜브에서 말린 테이프를 제거하십시오.
참고: 이 시점에서 '여과지 박리' 또는 '테이프 필링' 방법을 위해 동일한 망막에서 분리한 두 개의 반 망막 분리물을 결합하여 BCA(bicinchoninic acid assay)를 수행하기에 충분한 부피를 확보할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
본 전략은 웨스턴 블롯 분석을 위해 특정 막대 세포 구획들 사이에서 단백질을 분리하고 분석하는 비교적 빠르고 간단한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 우리는 두 가지 순차적 박리 기술 (그림 1 및 그림 2)을 적용한 다음 면역 블롯팅을 적용하여 이러한 방법이 암흑 및 광 적응 동물 모두에서 막대 트랜스 듀신 (GNAT1) 및 어레스틴 (ARR1)의 알려진 분포를 검출하는 데 안정적으로 사용될 수 있음을 입증했습니다. 다른 세포층으로부터의 오염 없이 막대 세포 하부 구획을 정밀하게 분리하는 데 있어서 우리의 두 프로토콜의 효과를 검증하기 위해, 시토크롬 C(Cyt C), 액틴 및 Gß5S/Gß5L26에 대한 항체로 면역블롯을 조사하였다. 사용된 항체 및 희석물의 리스트가 표 1에 제시된다. Cyt C 및 액틴은 근위 망막에 풍부한 단백질이지만 ROS에는 없기 때문에 ROS 순도를 나타냈다. GNAT127에 대한 GTPase 활성화 단백질 (GAP)의 구성 요소 인 Gß5L은 ROS 및 RIS에 존재하며 이러한 단리를위한 대조군으로 사용되었습니다. Gß5S는 ROS 또는 RIS에는 존재하지 않지만 다른 모든 막대 구획에 있는 더 짧은 스플라이스 이소형으로, 비ROS/RIS 분리된 세포내 구획에 대한 대조군으로 사용되었습니다.
먼저, 순차적 살아있는 세포 망막 박리 방법의 효과는 어두운 및 광적응 마우스의 막대에서 GNAT1 및 ARR1의 분포를 분석함으로써 평가되었다(도 3). ROS(+ROS)를 함유하는 여과지를 총 하나의 전체 망막으로부터 풀링하고, 상응하는 잔류 조직(-ROS)을 또한 결합시켰다. 지시된 단백질로부터의 신호는 후속적으로 +ROS 샘플과 -ROS 샘플 사이에서 비교되었고, 전체 분리된 망막이 입력 대조군으로서 작용하였다. 이들 샘플에 대한 단백질 농도 및 균질화 부피는 표 2에 제시되어 있다. 도 3A에 제시된 결과는, 암적응 동물에서 GNAT1 및 ARR128의 분포가 GNAT1 신호가 +ROS 분리에서 눈에 띄게 가장 강한 반면, ARR1 신호가 -ROS 분리에서 더 강했던 그들의 알려진 암흑 상태 분포와 밀접하게 일치한다는 것을 보여준다. 따라서, 광-노광된 망막에서, GNAT1 신호는 +ROS 단리에서 현저하게 감소되었고, -ROS 샘플에서 증가된 신호를 갖는 반면, 광-유도된 ARR1 전좌는 +ROS 및 -ROS 샘플에서 가시화될 수 있었다. 여섯 개의 상이한 실험으로부터의 결과가 정량화되었고, +ROS 및 -ROS 샘플에서 GNAT1 및 ARR1에 대한 암흑/광 조건 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 발견되었다(도 3B). 이러한 발견은 막대 세포 하부 구획 내에서 이전에 알려진 단백질 빛/어둠의 움직임과 일치하며, 이 기술이 농축된 +ROS 분획을 분리할 수 있음을 강력하게 나타낸다.
우리의 살아있는 세포 박리 방법을 더 검증하기 위해, 우리는 +ROS 및 -ROS 샘플 모두에서 알려진 ROS 순도 마커 분포를 조사했습니다. 암흑 및 광 적응 샘플 모두에서 Gß5S, Cyt C 및 액틴 신호는 +ROS 샘플에서 제외되며(그림 3A), 다른 세포 층으로부터의 오염이 없음을 입증합니다. 또한 Gß5L 신호는 +ROS 샘플에서 명확하게 볼 수 있었습니다(그림 3A). 또한, 액틴 및 Gß5L 신호는 +ROS 및 -ROS 분획의 순도를 확인했을 뿐만 아니라, +ROS 샘플의 신호가 Gß5L 및 -ROS 샘플에 대해 정규화되는 등 정상화를 위한 대조군으로도 작용하여 액틴에 대해 정규화되었습니다. 도 3A에 제시된 바와 같이, 살아있는 세포 박리 단리물은 최적의 면역블롯팅 정규화 및 분석을 위해 로딩 대조군, 특히 전체 망막 균질물과 함께 로딩되는 것이 좋다. 함께, 이러한 데이터는 우리의 살아있는 세포 박리 방법이 단백질 분석을 위해 ROS 하위 세포층을 나머지 막대 및 망막으로부터 분리하는 신속하고 재현 가능한 접근법을 제공 할 수 있음을 검증합니다.
다음으로 동결건조된 박리 기술을 평가하여 이 방법이 ROS 및 RIS 구획을 재현 가능하게 분리할 수 있는지 확인했습니다. 면역블롯팅에 앞서, 우리는 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 무손상되고 박리된 동결건조된 마우스 망막의 표면을 이미지화하여 테이프 박리가 산출된 광수용체 아세포층을 분석하였다(도 4). 접착 테이프로 박리하기 전에, 손상되지 않은 동결건조된 망막(주황색/분홍색 착색 층)의 표면은 특징적인 원통형 ROS의 프로파일과 밀접하게 일치한다(그림 4A). 초기 테이프 박리 후, ROS 및 RIS는 남은 박리된 동결건조된 망막의 표면 상에 존재하는 균일한 핵층에 의해 입증된 바와 같이 완전히 제거되는 것으로 나타났다(도 4C). 후속 테이프 박리는 박리된 층의 자유 표면으로부터 RIS(얇은 백색 층, 도 4B)를 제거하였고, 이는 내부 및 외부 세그먼트를 연결하는 좁고 깨지기 쉬운 연결 실륨에 의해 보조될 가능성이 있는 공정이다. 이러한 결과는 동결건조된 망막 조직으로부터의 막대 세포하층이 테이프를 사용하여 특이적으로 분획될 수 있음을 확인하였다.
이 방법의 효과를 시각적으로 검증한 후, 어둡고 광-적응된 박리된 망막은 우리의 살아있는 세포 박리 방법에 대해 개략적으로 설명된대로 상이한 구획에 대한 단백질 마커를 이용하는 동일한 접근법을 사용하여 면역블롯팅을 실시하였다(도 3). ROS 단리(+ROS), RIS 단리(+RIS), 및 나머지 망막층(-OIS)을 위한 단백질 농도 및 균질화 부피가 표 2에 제시되어 있다. 예상한 바와 같이, ROS에서 RIS로의 GNAT1 및 ARR1에 대한 명확한 광 유도 시프트가 RIS에서 ROS로 나타났다(도 5A). GNAT1은 어둠 속에서의 +ROS 샘플과 빛에서 +RIS 샘플에서 가장 풍부했던 반면, ARR1 신호는 역전되었다(도 5A). 다음으로 우리는 라이브 필링 방법론과 동일한 대조군 및 접근법을 사용하여 +ROS, +RIS 및 -OIS 단리로부터 전좌 단백질 신호를 정규화하고 정량화했습니다 (그림 5B). 우리는 또한 +RIS 및 -OIS 샘플 (그림 5C)을 결합하여 우리의 살아있는 세포 여과지 박리 방법과보다 직접적인 비교를했습니다 (그림 3B). 두 그래프 모두 GNAT1 및 ARR1 모두의 잘 정립되고 특징적인 광 유도 전좌를 보여줍니다. 이러한 관찰에 기초하여, 테이프 박리 제제는 이들 단리에서 ARR1 및 GNAT1의 단백질 조성에 의해 입증된 바와 같이 농축된 ROS 및 RIS 분획을 산출하는 것으로 보인다.
다음으로, 개별 세포내 단리의 순도를 평가하였다. 도 3A에 도시된 결과와 유사하게, +ROS 샘플은 강한 Gß5L 신호를 표시하면서 액틴, 시토크롬 C 및 Gß5S에 대한 신호가 부족하였다(도 5). 이 발견은 우리의 +ROS 샘플 준비에서 다른 세포 하부 구획으로부터의 오염의 부족을 보여준다. 이어서, 로드의 후속 세포층의 단백질 함량, +RIS 단리를 평가하였다. 우리는 +RIS 샘플이 Cyt C, Gß5L 및 actin에 대해 양성이라는 것을 발견했습니다. 이 발견은 미토콘드리아 및 세포 골격 요소가 풍부한 RIS의 알려진 조성과 일치합니다. 최종 층인 -OIS 단리물은 도 3A에 도시된 -ROS 샘플과 일치하는 단백질 분포를 가졌다.
막대 세포 구획의 단백질 조성물을 조사하는 데 있어 접착 테이프 박리 방법의 유용성을 더욱 평가하기 위해, 우리는 +ROS, +RIS 및 -OIS 샘플에서 로돕신 키나아제(GRK1) 및 단백질 키나아제 C-알파(PKCα)의 면역반응성을 구체적으로 조사했습니다. 면역 세포 화학 (ICC) 및 웨스턴 블롯과 같은 다른 실험 방법은 종종 막대와 망막에서 이러한 단백질의 정확한 국소화에 대한 상충되는 결과를 산출합니다. GRK1은, 예를 들어, 광활성화된 옵신29의 인산화를 매개하는 로드 및 콘 OS에 비교적 풍부한 것으로 생각된다. 그러나, 망막 절편의 면역표지는 OS30,31 또는 전체 광수용체 층(32)에 걸쳐 GRK1의 국소화를 구체적으로 밝혀냈다. 반면에 PKCα는 양극성 세포를 표지하기 위해 ICC에 일반적으로 사용되는 단백질입니다. 망막 절편25에서 막대 특이적 PKCα 면역표지의 명확한 증거는 없음에도 불구하고, ROS에서 PKCα의 존재 및 인산화 역할을 뒷받침하는 상당한 생화학 적24,25 및 기능적33,34,35 증거가 있다. 우리의 기술을 활용하여, 우리는 GRK1 면역 반응성이 광-노출된 망막에서 +ROS 샘플에서 가장 강렬하고 -OIS 샘플에는 결석하였다는 것을 발견하였다(도 6A). 반대로, +ROS 및 +RIS 샘플이 PKCα에 대해 희미한 신호를 표시했음을 보여줍니다. 도 6B에서 알 수 있는 바와 같이, PKCα는 일반적으로 망막 절편의 면역형광 염색에 의해 ROS 또는 RIS에서 검출되지 않는다. 그러나, PKCα는 웨스턴 블롯에 의해 면역검출되었다(도 6A,D). +ROS 및 +RIS 분리는 강력한 Gß5L 신호와 Gß5S의 부재를 표시하기 때문에(그림 6A), ROS 및 RIS 샘플 모두에서 희미한 PKCα 신호가 정품이며 다른 층의 오염으로 인한 것이 아니라고 확신합니다. +ROS, +RIS 및 -OIS 분리에서 개별 신호를 시각화하기 위해 GRK1 및 PKCα 블롯을 결합하고 비교를 위해 플롯팅하였다(도 6C).
마지막으로, 차선책의 박리 세션의 예(도 6D)는 상이한 하위층으로부터의 오염이 어떻게 결과를 왜곡시킬 수 있는지를 보여주며, 실험 박리 오류를 스크리닝하기 위한 적절한 대조군 항체의 데이터 해석 및 포함의 중요성을 추가로 예시한다. 이 테이프 필링 분리 예에서, 희미한 Gß5S 신호는 RIS 분리 레인에서 명백하며, 이는 -OIS 샘플로부터의 약간의 오염을 나타낸다. 사용자의 목표에 따라이 약간의 오염은 문제가되지 않을 수 있습니다. 그러나이 경우 +ROS 및 +RIS 샘플에서 PKCα 신호를 조사하고 PKCα 신호는 ROS 레인에 비해 RIS 레인에서 약간 더 높습니다 (그림 6A, D), 아마도 오염으로 인한 것일 수 있습니다. 따라서 박리 과정에서 정확한 분리를 보장하고 오염을 최소화하기 위해주의를 기울여야합니다. 개별 오류로 인한 오염을 최소화했음에도 불구하고, 이러한 데이터는 테이프 필링 방법론이 단백질 분석을 위한 막대 광수용체 층의 정확한 순차적 분리를 산출할 수 있다는 설득력 있는 증거를 제공한다.
도 1: 살아있는 세포 박리 단계의 개략도. (A) 다이어그램은 분리된 눈을 해부 및 반류하기 위한 주요 단계를 보여준다. (b) 광수용체 외부 세그먼트는 여과지를 이용한 순차적 박리에 의해 증분적으로 제거된다. 첫째, 망막은 광수용체 층이 여과지와 접촉하도록 배향된다. 다음으로, 여과지는 종이 타월에 블롯팅하여 건조되고, 망막은 여과지로부터 벗겨진다. 이 박리된 분리물은 얼음 위에 보관된 튜브에 수집됩니다. 이 과정은 막대 외부 세그먼트 (+ROS)를 완전히 제거하기 위해 일곱 번 내지 여덟 번 반복된다. 이 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 동결건조된 망막 박리 과정. (A) 동결건조된 망막을 위한 샘플 제제의 흐름도. 망막은 망막 신경절 세포층이 여과지와 접촉하고 광수용체가 위를 향하도록 배향된다. (b) 동결건조 후, 동결건조된 망막은 테이프의 상부에 약간의 압력을 가한 후에 테이프 조각에 부착된다. 테이프를 벗겨 막대 외부 세그먼트(ROS) 및 로드 내부 세그먼트(RIS) 층을 제거합니다. RIS 층은 ROS 층이 보일 때까지 더 많은 테이프 껍질에 의해 제거됩니다 (주황색 / 분홍색 층). 이 그림은 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 순차적 여과지 박리 후 단리된 막대 광수용체에서의 GNAT1 및 ARR1의 발현 . (A) 어둡고 광적응된 망막으로부터 획득한 여과지 박리 방법에 의해 수집된 +ROS 및 -ROS(ROS-depleted) 샘플의 면역블롯. 블롯을 광촉발 단백질(트랜스듀신(GNAT1) 및 어레스틴(ARR1)) 및 품질 관리 마커(GTPase 활성화 단백질(Gß5L/S) 시토크롬 C(Cyt C) 및 액틴)에 대한 항체로 프로브하였다. 두 개의 반으로 줄어든 망막이 이 대표적인 덩어리를 위해 결합되었다. (B) 어둠과 빛에 적응된 망막으로부터의 GNAT1 및 ARR1의 정량화된 신호. +ROS 및 -ROS 단리물로부터의 GNAT1 및 ARR의 상호 광 트리거 이동이 있다. 바이올린 플롯은 +ROS 및 -ROS 샘플의 정규화된 발현을 묘사한다. 이 수치는 Rose et al.36에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 동결건조된 망막의 주사전자현미경 이미지. (A) 테이프 박리 전에 동결건조된 망막의 표면(광수용체 측면 위로). (B) 내부 세그먼트층은 테이프 박리 후. (c) 테이프 박리 후 세포체층은 균일한 핵 외관을 나타낸다. 이 그림은 Rose et al.36 에서 수정되었으며 BioRender.com 로 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 동결건조된 망막에서 ROS 및 RIS를 분리하기 위한 테이프 박리 방법의 검증 . (A) 테이프 박리 방법으로 수집한 +ROS, +RIS 및 -OIS(ROS/RIS-고갈된) 샘플의 웨스턴 블롯. 면역블롯을 트랜스듀신 (GNAT1), 어레스틴 (ARR1), GTPase 활성화 단백질 (Gß5L/S), 시토크롬 C (Cyt C) 및 액틴 항체로 프로브하였다. 샘플을 암흑 및 광-적응된 망막으로부터 수득하고, 반으로 줄인 망막 단리물 (+ROS, +RIS, -OIS)을 더 농축된 물질을 위해 합하였다. (b) GNAT1 및 ARR1의 정량화된 신호는 암흑 및 광-적응된 망막으로부터 수득된 상이한 분리된 망막층에 대한 바이올린 플롯으로서 플롯팅된다. (c) +RIS 및 -OIS로부터의 정규화된 발현 수준을 조합하고, 테이프 및 여과지 박리 방법을 비교하기 위해 플롯팅하였다. 어둡고 빛에 적응된 샘플은 주요 광전달 단백질의 알려진 움직임을 표시했다. 이 수치는 Rose et al.36에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 광수용체에서 GRK1 및 PKCα의 세포내 국소화를 조사하기 위한 동결건조된 망막의 테이프 박리. (A) 광적응형 C57BL/6J 마우스로부터 박리된 샘플의 대표적인 웨스턴 블롯은 로돕신 키나아제(GRK1), 단백질 키나아제 C-알파(PKCα), GTPase 활성화 단백질(Gß5L/S) 및 액틴의 상대적 수준을 입증한다. (b) PKCα 항체와 함께 인큐베이션된 광노출 마우스로부터 제조된 냉동된 망막 절편(녹색, 1:100). RPE, 망막 색소 상피; OS, 외부 세그먼트; IS, 내부 세그먼트; CB, 세포체; ST, 시냅스 말단. 스케일 바 = 10 μm. (C) +ROS, +RIS, -OIS 샘플에 대한 PKCα 및 GRK1 정규화된 발현 수준은 바이올린 플롯으로서 플롯팅된다. (D) 최적이 아닌 테이프 필링은 잠재적으로 약간 오염된 샘플을 산출할 수 있다. 빨간색 사각형은 일부 -OIS 샘플로 오염된 +RIS 샘플을 강조 표시하여 Gß5L/S 대역과 더 높은 PKCα 신호를 모두 생성합니다. 두 개의 반으로 줄어든 망막이 모든 블로트에 결합되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 과녁 | 항체 | 희석 | 생산자 |
| 체포 | 토끼 안티 ARR1 | 1:1000 | Chen, et al., 2006. |
| 트랜스듀신 | 마우스 안티 GNAT (TF-15) | 1:1000 | 세포 신호. |
| ß 액틴 | 토끼 안티 ß 액틴 | 1:5000 | 제네텍스 주식회사 |
| 시토크롬 C | 토끼 항시토크롬 C | 1:500 | 산타 크루즈, sc-7159. |
| 갭 (Gß5L / S) | 토끼 안티 Gß5L / S (CT2-15) | 1:2000 | Watson, et. al., 1996. |
| 단백질 키나아제 C 알파 (PKC) | 토끼 안티 PKC (#2050) | 1:1000 | 세포 신호 기술. |
| 로돕신 키나아제 (GRK1) | 마우스 안티 GRK1 (G-8) | 1:200 | 산타 크루즈, sc-8004. |
표 1: 분리 기술의 웨스턴 블롯 검증에 사용되는 항체 목록.
| 여과지 망막 분리 | ||||||
| +ROS* | -로스* | 전체 망막 | ||||
| 평균 단백질 농도(μg/mL) | 700 | 1,500 | 1,500 | |||
| RIPA 버퍼 부피(μL) | 90 | 150 | 200 | |||
| 테이프 필링 망막 분리 | ||||||
| +ROS* | +RIS* | -로스* | 전체 망막 | |||
| 평균 단백질 농도(μg/mL) | 520 | 440 | 1,200 | 1,600 | ||
| RIPA 버퍼 부피(μL) | 100 | 100 | 125 | 150 | ||
| * 두 개의 반으로 줄어든 망막 분리를 결합했습니다. | ||||||
표 2: 망막 분리 균질물에서의 단백질 농도.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
많은 망막 질환이 막대 광수용체 세포에 영향을 미쳐 막대 사망으로 이어지고 궁극적으로 완전한 시력 상실37로 이어집니다. 인간 망막 변성의 유전 적 및 기계론적 기원의 상당 부분이 수년에 걸쳐 수많은 마우스 모델에서 성공적으로 재생산되었습니다. 이러한 맥락에서, 작은 마우스 망막으로부터 개별 막대 하부 세포 구획을 쉽고 선택적으로 분리하는 능력은 망막 질환의 국부적 인 생화학 적 및 분자 토대에 대한 우리의 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 또한, 신경 망막의 층상 특성은 막대 광수용체의 독특하고 고도로 편광 된 배열과 결합되어 선택적 박리에 의해로드 구획의 분리를 허용합니다. 이 원고는 면역 블롯팅을 위해 막대 광수용체 세포의 개별 세포 하위 구획을 분리하는 데 사용되는 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 두 방법 모두 기존의 접선 단면화 방법과 비교할 때 상당히 빠르고 기술적으로 덜 어려울 뿐만 아니라9, 밀도 구배를 사용하는 ROS의 일반적인 생화학적 분리보다 실질적으로 더 작은 샘플 크기를 필요로 합니다19. 이러한 ROS 구배 정제 기술은 충분한 ROS를 안정적으로 회수하기 위해 8-10 뮤린 망막을 필요로 하는 반면, 여기에 제시된 프로토콜은 단일 망막에 적합하다.
제안 된 기술의 전반적인 단순성에도 불구하고, 두 프로토콜에 공통적 인 주요 과제 중 하나는 다른 세포 하부 구획의 적절한 분리에 필요한 여과지 상으로의 곡선 망막의 평탄화에 관한 것입니다. 고립 된 망막은 말리고 조개와 같은 모양을 취하는 경향이 있습니다. 망막이 여과지 (감광체 쪽이 위 또는 아래로)에 놓일 때 가장자리가 접히면 원하는 격리 막대 층의 수율이 감소 할 수 있습니다. 더 중요한 것은, 망막이 적절하게 평평해지지 않으면, 다른 세포하 구획 및 망막 세포로부터의 층 정렬 불량 및 오염이 가능한 결과이다(도 6D). 반으로 줄어든 망막 사각형의 곡률을 제한하고 막대와 망막 층의 불완전한 정렬을 교정하기 위해 망막 사각형을 반으로 잘라 두 개의 망막 사각형을 생성 할 수 있습니다. 신경 망막을 더 작은 조각으로 절단함으로써 망막의 자연 곡률이 감소하고 조직이 여과지에 평평하게 놓일 가능성이 더 큽니다.
서로 다른 막대 구획이 물리적으로 분리 된 때를 인식하는 것은 이러한 기술에 익숙하지 않은 사람에게는 까다로울 수 있습니다. 생물학적으로 중요한 실험을 시작하기 전에 사용자는 한두 시간 동안 샘플 망막으로 프로세스를 진행해야합니다. 연습은 운영자의 기술과 방법의 숙련도를 크게 향상시켜야합니다. 여과지를 사용하여 살아있는 망막에서 ROS를 떼어낼 때, ROS 층이 분리되었을 때를 나타내는 명백한 시각적 단서는 없습니다. 망막이 더 얇아지고 깨지기 쉽지만 사용자는 ROS를 정확하게 분리하기 위해 껍질 수를 자체 모니터링하고 검증해야합니다. 또한, 다른 섬유 두께와 굵은 여과지를 사용하면 ROS 박리 시간이 변경됩니다. 더 두꺼운 섬유를 가진 여과지 (예 : VWR 등급 413)는 망막 층을 더 빨리 분리하지만 (6-8 박리), 선택적이지 않을 수 있으며 다른 층으로부터 오염을 유발할 수 있습니다. 더 얇은 섬유를 가진 여과지 (예 : Whatman Grade 1)는 망막 층을 더 느리게 분리하고 (12-15 껍질) 광수용체 층을 깨끗하게 격리시킵니다. 박리 시간을 최소화하고 수집 순도를 보장하기 위해 더 두껍고 얇은 여과지를 모두 사용하는 것이 좋습니다.
동시에, 시각적 근사 및 테이프 샘플 취급은 모두 동결건조된 망막으로부터 세포 하부 구획을 분리하는 성공의 열쇠이다. 테이프에 너무 많은 압력이 가해지면 동결 건조 된 망막 전체가 테이프에 부착됩니다. 일단 이것이 발생하면 ROS를 분리하는 것이 더 길고 어렵지만 불가능하지는 않습니다 : 망막의 자유 표면 (신경절 세포 측)에 두 번째 테이프를 놓고 테이프의 초기 조각에 주황색 / 분홍색 층 만 보일 때까지 테이프로 레이어를 천천히 당깁니다. 그러나 이 시점에서 RIS를 격리하는 것은 불가능합니다. 테이프에 너무 적은 압력이 가해지면 ROS의 상당 부분이 테이프에 부착되지 않습니다. 적절한 ROS 테이프 접착을 보장하려면 테이프에 달라 붙지 않는 부위의 핀셋으로 부드럽게 누르는 것이 좋습니다. 전형적으로, 가장 작은 압력은 ROS 및 RIS 층의 제거를 초래하지만, 압력의 양은 경험에 기초하여 결정되어야 한다. 고립 된 RIS의 존재는 얇은 흰색 층 (눈의 가벼운 먼지와 유사)이 초기 ROS 테이프 껍질에서 보이는지 여부를 확인함으로써 확인할 수 있으며, 분리 된 ROS의 존재는 막대 광수용체 층 (어두운 적응의 경우 주황색, 빛 적응의 경우 분홍색)의 색상을 테이프에서 확인함으로써 쉽게 결정할 수 있습니다.
한 가지 마지막 도전은 살아있는 망막에서 여과지 껍질 (+ ROS)을 균질화 할 때 발생합니다. 여과지는 액체를 쉽게 흡수하고, 프로토콜의이 단계 동안 상당한 양의 균질화 버퍼가 흡수 될 것입니다. 각 튜브의 측면에 박리 용지를 놓은 후 미니 원심 분리기에서 액체를 아래로 방사하면 샘플의 손실을 방지하는 데 도움이됩니다. 불행히도, 여과지의 여러 조각을 회전시키는 것은 시간이 많이 걸리는 과정이 될 수 있으며 샘플의 손실은 불가피합니다. 이 문제를 해결하려면 일부 여과지 조각을 제거하고 한 번에 더 적은 조각을 균질화하는 데 집중하십시오. 추가적으로, 이 단계 동안 샘플의 손실을 피하려면, ROS를 분리하는데 사용되는 여과지의 총량을 최소화하는 것을 고려한다.
우리의 두 방법 모두 큰 샘플 크기 또는 망막을 절개하기 위해 블레이드의 정확한 정렬을 필요로하지 않지만, 주목할 가치가있는 광수용체 필링 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 동결건조된 뮤린 망막은 ROS 및 RIS를 넘어 후속 광수용체 층을 박리하는 데 대해 수정가능하지 않을 수 있다. 둘째, 우리의 필링 방법은 개별 망막 처리에 더 적합하며 한 번에 큰 배치 처리에 적합하지 않습니다. 셋째, 실험의 성공은 웨스턴 블롯에 사용된 항체의 민감도 한계에 의존한다. 이러한 한계에도 불구하고, 우리의 대표적인 결과는 우리의 두 가지 분리 박리 기술이 특정 막대 광수용체 구획을 효율적으로 분리 할 수 있음을 보여줍니다. 또한이 두 가지 방법은 저렴하고 평범한 실험실 재료 (여과지 및 접착 테이프)를 사용하므로 접근성이 뛰어납니다. 우리의 연구에서, 우리는 다른 망막 세포가 면역 블롯팅을 위해 분리 될 수 있는지 여부를 직접 평가하지 않았다. 그러나 우리는 이러한 방법이 망막 연구 공동체의 광범위한 단면의 요구에 도움이되도록 쉽게 수정 될 수 있다고 믿습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자들은 그들이 경쟁하는 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH Grant EY12155, EY027193 및 EY027387에서 JC에 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Spyridon Michalakis 박사(Caltech, Pasadena, USA)와 Natalie Chen(USC, Los Angeles, USA)에게 감사드립니다. 또한 저자가 제공한 영상을 수집하는 데 필요한 장비를 제공해 주신 Seth Ruffins 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)와 Janos Peti-Peterdi 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)에게도 감사드립니다. 소재지: Kasey Rose et al., 단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 분리, 분자 신경변성, [2017], [Springer Nature].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
References
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N.
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
