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Neuroscience

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Abstract

Les photorécepteurs de bâtonnets sont des neurones sensoriels hautement polarisés avec des compartiments distincts. Les bâtonnets de souris sont longs (~80 μm) et minces (~2 μm) et sont emballés latéralement dans la couche la plus externe de la rétine, la couche photoréceptrice, ce qui entraîne l’alignement de compartiments subcellulaires analogues. Traditionnellement, la section tangentielle de la rétine plate gelée a été utilisée pour étudier le mouvement et la localisation des protéines dans différents compartiments de tiges. Cependant, la courbure élevée de la rétine de souris à dominante bâtonnet rend la section tangentielle difficile. Motivés par l’étude du transport des protéines entre les compartiments, nous avons développé deux méthodes de peeling qui isolent de manière fiable le segment externe de la tige (ROS) et d’autres compartiments subcellulaires pour les transferts occidentaux. Nos techniques relativement rapides et simples fournissent des fractions enrichies et spécifiques aux subcellulaires pour mesurer quantitativement la distribution et la redistribution de protéines photoréceptrices importantes dans des bâtonnets normaux. De plus, ces techniques d’isolement peuvent également être facilement adaptées pour isoler et étudier quantitativement la composition protéique d’autres couches cellulaires dans la rétine saine et dégénérée.

Introduction

Les cellules photoréceptrices en bâtonnets, étroitement emballées dans la couche la plus externe de la rétine neurale, font partie intégrante de la vision en basse lumière. Pour fonctionner comme des compteurs de photons fidèles, les bâtonnets utilisent une voie de signalisation à base de protéine G, appelée phototransduction, pour générer des réponses rapides, amplifiées et reproductibles à la capture de photons uniques. Cette réponse à la lumière déclenche finalement un changement du courant au niveau de la membrane plasmique et est ensuite signalée au reste du système visuel1. Comme leur nom l’indique, chaque cellule de bâtonnet a une forme distincte en forme de bâtonnet et présente une morphologie cellulaire hautement polarisée, composée d’un segment externe (OS), d’un segment interne (IS), d’un corps cellulaire (CB) et d’un terminal synaptique (ST). Chaque compartiment subcellulaire a une machinerie protéique spécifique (liée à la membrane et soluble), des caractéristiques biomoléculaires et des complexes protéiques qui jouent des rôles cruciaux tels que la phototransduction visuelle, l’entretien ménager général et la synthèse des protéines, et la transmission synaptique2,3.

Il y a plus de 30 ans, le mouvement réciproque dépendant de la lumière des protéines subcellulaires, en particulier la transducine (loin de l’OS) et l’arrestine (vers l’OS), a été observé pour la première fois4,5,6,7. Très tôt, ce phénomène observé a été accueilli avec scepticisme, en partie à cause de la vulnérabilité de l’immunohistochimie au masquage de l’épitope8. Au début des années 2000, la translocation des protéines dépendantes des stimuli a été confirmée à l’aide d’une technique de sectionnement physique rigoureuse et ardue9. La section tangentielle en série de la rétine de rongeurs congelée montée à plat, suivie d’une immunobuvardage, a révélé que la transducine9,10, l’arrestine11,12 et la recoverine13 subissent toutes une redistribution subcellulaire en réponse à la lumière. On pense que la translocation par la lumière de ces protéines de signalisation clés régule non seulement la sensibilité de la cascade de phototransduction9,14,15, mais peut également être neuroprotectrice contre les dommages causés par la lumière16,17,18. Parce que le transport des protéines entraîné par la lumière dans les bâtonnets semble être très important pour la biologie et la physiologie des cellules des bâtonnets, les techniques qui permettent l’isolement de différents compartiments subcellulaires pour déterminer la distribution des protéines sont des outils de recherche précieux.

Actuellement, il existe quelques méthodes visant à isoler les compartiments subcellulaires des tiges. Cependant, ces méthodes peuvent être longues et difficiles à reproduire, ou nécessiter une quantité importante d’isolat rétinien. Les préparations de segment externe de tige (ROS) par centrifugation par gradient de densité19, par exemple, sont couramment utilisées pour séparer les ROS de l’homogénat rétinien. Cette méthode est largement utilisée pour le transfert western, mais la procédure prend beaucoup de temps et nécessite un minimum de 8 à 12 rétines murines20. D’autre part, la section tangentielle en série de la rétine murine et ratie congelée a été mise en œuvre avec succès pour isoler le système d’exploitation, l’IS, le CB et le ST9,11,13. Cependant, cette méthode est techniquement difficile en raison de la nécessité d’aplatir complètement la petite rétine murine très incurvée pour aligner les couches rétiniennes avant la section tangentielle. Puisqu’il existe une pléthore de modèles murins et de souris transgéniques récapitulant les maladies du système visuel, la création d’une technique qui sépare de manière fiable, rapide et facile les compartiments individuels des tiges est prometteuse en révélant les processus physiologiques qui se produisent dans chaque compartiment spécialisé et les mécanismes qui sous-tendent les processus visuels de santé et de maladie.

Pour faciliter ces recherches, nous décrivons deux méthodes de peeling qui isolent les compartiments subcellulaires des bâtonnets plus facilement que les protocoles actuels. La première méthode de peeling, adaptée d’une technique d’exposition de cellules bipolaires marquées par fluorescence pour l’enregistrement de la pince de patch21, utilise du papier filtre de cellulose pour éliminer séquentiellement le ROS d’une rétine murine vivante et isolée (Figure 1). La deuxième méthode, adaptée d’une procédure qui isole les trois couches primaires de cellules rétiniennes d’une rétine de poussin22 et de grenouille23, utilise du ruban adhésif pour enlever le ROS et le segment interne de la tige (RIS) d’une rétine lyophilisée (Figure 2). Les deux procédures peuvent être complétées en 1 h et sont considérablement conviviales. Nous fournissons une validation de l’efficacité de ces deux protocoles de séparation pour le transfert western en utilisant des rétines adaptées à l’obscurité et exposées à la lumière de souris C57BL / 6J pour démontrer la translocation induite par la lumière de la transducine en bâtonnet (GNAT1) et de l’arrestine (ARR1). De plus, en utilisant la méthode du peeling sur bande, nous fournissons des preuves supplémentaires que notre technique peut être utilisée pour examiner et corriger les incohérences entre les données de localisation des protéines acquises par l’immunocytochimie (ICC) et les transferts de Western. Plus précisément, notre technique a montré que: 1) l’isoforme de la protéine kinase C-alpha (PKCα) est présente non seulement dans les cellules bipolaires, mais aussi dans les ROS et RIS murins, bien qu’à de faibles concentrations24,25 et 2) la rhodopsine kinase (GRK1) est présente principalement dans l’échantillon isolé de SG. Ces données démontrent l’efficacité de nos deux techniques de peeling pour séparer et quantifier des protéines spécifiques de bâtonnets et de rétine.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles locales du comité de recherche sur les soins aux animaux de l’Université de Californie du Sud (USC).

1. Méthode de peeling de la rétine à cellules vivantes

  1. Préparation des tampons d’Ames, des papiers à peler et du plat de dissection
    1. À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou d’un type de ciseau équivalent), découpez le papier filtre en cellulose (grade 413) en rectangles mesurant environ 5 mm x 2,5 mm. Conservez les boutures pour une utilisation ultérieure.
    2. Préparer 1 L de tampon HEPES d’Ames en combinant une bouteille de Ames' Medium, 2,38 g de HEPES et 0,877 g de NaCl. Dissoudre les réactifs dans une bouteille en verre stérile avec de l’eau ultrapure distillée et ajuster l’osmolarité et le pH à 280 mOsm et 7,4, respectivement. Filtrer pour stériliser (taille des pores 0,2 μm), sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à 4 °C.
    3. Préparer 1 L de tampon de bicarbonate d’Ames en combinant une bouteille de Ames' Medium et 1,9 g de NaHCO3. Dissoudre les réactifs dans une bouteille en verre stérile avec de l’eau ultrapure distillée et ajuster l’osmolarité et le pH à 280 mOsm et 7,4, respectivement. Filtrer pour stériliser (taille des pores 0,2 μm), sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Les tampons HEPES et bicarbonate d’Ames peuvent être préparés à l’avance et stockés pendant 1 semaine à 4 ° C.
    4. Au fond d’une boîte de Petri de 35 x 10 mm, créez un motif en treillis ou en damier avec un scalpel (lame n° 11, 40 mm).
      REMARQUE: Le fond texturé de la boîte de Petri maintient l’œil isolé et flottant en place pendant la dissection rétinienne.
  2. Dissection de la rétine
    REMARQUE: Pour cette procédure, le tampon doit être amené et conservé à température ambiante (RT). Rafraîchissez le tampon de bicarbonate d’Ames toutes les 15 minutes avec le tampon de bicarbonate d’Ames fraîchement carbogéné pendant la dissection. Cela maintient le pH physiologique nécessaire.
    1. Environ 15 à 20 minutes avant la dissection, oxygéner le tampon HEPES d’Ames dans un laboratoire ou une bouteille de média de 100 mL équipé d’un adaptateur de bouchon de tube et faire bouillonner le tampon bicarbonate d’Ames avec 95% d’O2 et 5% de CO2 dans une chambre d’incubation tissulaire et dans un laboratoire ou un flacon de média de 100 mL équipé d’un adaptateur de bouchon de tuyau.
    2. Euthanasier un nombre égal des deux sexes de souris C57BL/6J (âgées de 2 à 3 mois) soit par inhalation d’isoflurane, soit par dioxyde de carbone (CO2) suivie d’une luxation cervicale. Énucléez les yeux avec des ciseaux incurvés et placez les yeux dans la boîte de Petri texturée de 35 x 10 mm remplie de tampon de bicarbonate d’Ames à bulles.
    3. Créer une coupe oculaire (Figure 1A) en perforant un trou à la jonction cornée-limbe avec une aiguille de 18 G. Couper le long du périmètre de cette jonction à l’aide de ciseaux à iris à micro-dissection pour enlever la cornée de chaque œil. Séparez la lentille et l’humeur vitrée de chaque œil à l’aide d’une pince à épiler et jetez-la.
    4. Isolez la rétine de la coupe oculaire en pelant soigneusement le complexe épithélium pigmenté rétinien (EPR),scléro-choroïde loin de la rétine neurale. Jetez le complexe RPE-scléro-choroïde. Assurez-vous que la rétine n’est pas endommagée pendant la dissection en ne manipulant que les bords.
    5. Transférer la rétine isolée à l’aide d’une pipette de transfert à large alésage dans le couvercle d’un plat de 60 x 15 mm rempli de tampon de bicarbonate d’Ames à bulles.
    6. Orientez la rétine en forme d’hémisphère concave vers le haut (les photorécepteurs sont orientés vers le bas vers le bas de la boîte) et coupez en deux chaque rétine (à travers le nerf optique) à l’aide de ciseaux à iris ou d’un scalpel (lame n ° 10, 40 mm). Ajustez les bords incurvés de chaque demi-rétine pour obtenir deux rectangles (Figure 1A).
      REMARQUE: Minimiser la courbure de chaque rétine coupée en deux permet à la rétine de mieux s’aplatir lors des étapes de peeling suivantes et produit un peeling précis de la couche du segment externe de la tige (ROS).
    7. Conservez la rétine coupée en deux dans la chambre d’incubation tissulaire qui est continuellement bouillonnée de 95% d’O2 et de 5% de CO2.
      REMARQUE: Les rétines isolées peuvent être conservées dans le tampon de bicarbonate d’Ames carbogenré pendant environ 24 h.
  3. Collecte du segment extérieur de la tige (ROS) par épluchage de papier filtre
    REMARQUE: Rafraîchissez le tampon HEPES d’Ames oxygéné RT toutes les 15-20 minutes pendant le processus de peeling pour maintenir le pH physiologique nécessaire.
    1. Transférez un rectangle rétinien de la chambre tissulaire avec une pipette de transfert à large alésage et un morceau de papier filtre de 5 mm x 2,5 mm dans une boîte de Petri de 35 x 10 mm remplie de tampon HEPES d’Ames bouillonné de 100% O2.
    2. Orientez la rétine cloisonnée concave vers le haut et assurez-vous que les photorécepteurs sont orientés vers le bas vers le bas de la boîte. Saisissez légèrement les côtés de la rétine coupée en deux avec une pince à épiler et déplacez-la sur le papier filtre. Une fois que la rétine est centrée sur le papier filtre, déplacez le papier filtre vers le haut afin que la rétine coupée en deux touche le papier filtre pour créer l’adhérence ROS-papier filtre (Figure 1B).
      REMARQUE: Assurez-vous que la couche de photorécepteur entre en contact direct avec le papier filtre.
    3. Soulevez délicatement le papier filtre avec la rétine attachée hors du tampon HEPES d’Ames. Placez la face inférieure du papier filtre (le côté sans la rétine) sur une serviette en papier et tamponnez 2 à 3 fois pour sécher (Figure 1B).
    4. Ajoutez une goutte de HEPES d’Ames sur le côté du papier filtre avec la rétine. Placez à nouveau le papier filtre sur l’essuie-tout pour le sécher, comme décrit ci-dessus. Répétez ce processus deux fois de plus.
    5. Replacez le papier filtre avec la rétine dans la boîte de Pétri. À l’aide d’une pince à épiler, poussez doucement tous les bords de la rétine coupée en deux vers le haut et loin du papier filtre de tous les côtés.
    6. Détachez délicatement la rétine du papier filtre. Ne touchez que le périmètre extrême de la rétine pendant le processus de peeling pour préserver l’intégrité structurelle de la rétine.
    7. Soulevez le papier filtre de la boîte de Pétri et retirez l’excès de liquide sur une serviette en papier. Assurez-vous que le côté qui était en contact avec la rétine n’entre pas en contact avec l’essuie-tout.
    8. Placez le papier filtre avec la couche ROS partielle dans un tube étiqueté sur de la glace (Figure 1B). Gardez la rétine pelée immergée dans le tampon HEPES d’Ames.
    9. Répétez le processus de peeling pour cette rétine coupée en deux environ 7 à 8 fois pour enlever toute la couche ros. Après chaque peeling, placez le papier filtre dans le même tube, qui contiendra le ROS isolé d’une rétine coupée en deux.
      REMARQUE: Veillez à ne pas déchirer la rétine coupée en deux lorsque vous la retirez du papier filtre, car la rétine devient plus mince au cours de ce processus.
    10. Placer le tube contenant tous les épluches de papier filtre du ROS isolé sur de la glace pour une utilisation immédiate ou congeler directement sur de la glace sèche et conserver à -80 °C.
    11. Utilisez une pince à épiler pour transférer les restes de rétine pelée (dépourvus de ROS) dans un tube étiqueté de manière appropriée. Placez le tube sur de la glace pour une utilisation immédiate ou congelez-le avec de la glace carbonique et conservez-le à -80 °C.
    12. Répétez le processus de peeling pour chaque rétine coupée en deux et étiquetez avec précision chaque tube.

2. Méthode de peeling de la rétine lyophilisée

  1. Tampons, milieu pelant, préparation du plat de dissection et installation du lyophilisateur
    1. Dans une bouteille de stockage de 1 L, préparez la solution de Ringer en ajoutant 500 ml d’eau distillée ultrapure. Dissoudre les réactifs pour atteindre une concentration finale de 130 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM de MgCl2, 1,2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES et 0,02 mM d’EDTA. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH, ajoutez de l’eau ultrapure pour porter le volume final à 1 L et ajustez l’osmolarité à 313 mOsm.
    2. Avant l’utilisation, filtrer la solution de Ringer avec un filtre stérile (taille des pores 0,2 μm), sceller le couvercle avec un film de paraffine et conserver à 4 °C.
    3. À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou de type ciseau équivalent), découpez le papier filtre en cellulose en rectangles mesurant environ 5 mm x 2,5 mm. Utilisez un crayon pour écrire sur un côté du papier filtre afin de créer une étiquette unique.
    4. Créez un motif en treillis ou en damier dans le fond d’une boîte de Petri de 35 x 10 mm à l’aide d’un scalpel (lame n° 11, 40 mm).
    5. Allumez le lyophilisateur selon les spécifications du fabricant.
    6. Acquérir de l’azote liquide dans une fiole Dewar ou une fiole sous vide isolante similaire.
  2. Dissection rétinienne
    1. Effectuer la dissection rétinienne comme décrit à la rubrique 1 du protocole (Figure 1A). Utilisez la solution froide de Ringer au lieu du tampon d’Ames.
    2. Après la dissection, stocker la rétine rectangulaire coupée en deux dans une boîte de Petri de 35 x 10 mm remplie de solution froide de Ringer et placer sur de la glace.
  3. Préparation d’échantillons rétiniens pour la lyophilisation
    1. Placez un morceau de papier filtre de 5 x 2,5 mm et transférez une rétine coupée en deux dans la boîte de Petri texturée de 35 x 10 mm remplie de tampon froid de Ringer. Utilisez une pipette de transfert à large alésage pour déplacer chaque rétine entre les plats.
    2. Utilisez une pince à épiler pour retourner soigneusement la rétine afin qu’elle soit orientée concave vers le haut (les photorécepteurs pointent vers le haut) et déplacez-la pour qu’elle repose sur le papier filtre (Figure 2A).
      REMARQUE: Assurez-vous que les photorécepteurs n’entrent pas en contact avec le papier filtre (la couche de cellules ganglionnaires rétiniennes doit être en contact direct avec le papier filtre) et que l’étiquette unique est visible. Pour identifier facilement et rapidement l’isolat rétinien, il est recommandé que l’étiquette unique soit située sur la face inférieure du papier filtre.
    3. Soulevez le papier filtre par les bords vers le haut afin que le morceau de rétine coupé en deux touche le papier filtre et continuez à soulever le papier filtre hors de la solution de Ringer.
    4. Placez la face inférieure du papier filtre (le côté sans la rétine dessus) sur une serviette en papier et tamponnez soigneusement 2 à 3 fois pour éliminer l’excès de liquide (Figure 2A).
    5. Prenez le papier filtre avec une pince à épiler et ajoutez une goutte de Ringer froid sur le côté du papier filtre avec la rétine. Placez à nouveau le papier filtre sur l’essuie-tout pour éliminer l’excès de liquide. Répétez le processus deux fois de plus.
      REMARQUE: Ces étapes alternées de mouillage et de séchage garantissent que le tissu est fermement attaché au papier filtre.
    6. Conservez chaque échantillon de rétine/papier filtre adhérent dans une boîte de Petri remplie de Ringer froids jusqu’à ce qu’ils soient prêts à congeler tous les échantillons. Répétez ce processus pour toutes les rétines réduites de moitié.
    7. Obtenez une boîte de Petri propre et sèche de 35 x 10 mm (en bas seulement) et un morceau de papier d’aluminium coupé dans un carré de 3,5 x 3,5 pouces.
    8. Soulevez chaque échantillon du tampon froid de Ringer avec une pince à épiler. Assurez-vous que la pince à épiler ne contacte que les bords du papier filtre, en évitant la rétine coupée de moitié.
    9. Placez la face inférieure de chaque papier filtre (le côté sans la rétine dessus) sur une serviette en papier et enlevez l’excès de liquide.
    10. Ajouter une goutte de PBS froid 1x (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) sur le côté du papier filtre où la rétine est collée. Tamponnez le papier filtre sur l’essuie-tout pour éliminer l’excès de liquide.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’humidité du papier filtre est suffisamment éliminée avant de congeler.
    11. Placez tous les morceaux de papier filtre dans la boîte de Petri de 35 x 10 mm. Utilisez un papier de soie non pelucheux pour évacuer tout excès de liquide entourant le papier filtre.
      REMARQUE: Ne pas surcharger la boîte de Petri avec des échantillons. Si plus de quatre yeux murins sont utilisés, envisagez d’utiliser une boîte de Petri plus grande ou plusieurs boîtes de Petri plus petites pour contenir les échantillons de rétine / papier filtre.
    12. Envelopper hermétiquement le plat entier avec du papier d’aluminium. Assurez-vous que les bords de la feuille d’aluminium sont fixés et pressés en douceur dans le fond de la boîte de Pétri. Perforez une poignée de trous de 0,1 à 0,2 mm dans le couvercle en papier d’aluminium (Figure 2A).
    13. À l’aide de pinces métalliques, abaissez progressivement la boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium dans l’azote liquide. Conserver les échantillons dans l’azote liquide (<10 min) jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être lyophilisés.
  4. Lyophilisation
    1. Placez la boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium dans une fiole de lyophilisation et fixez-la à la machine de lyophilisation en suivant le protocole du fabricant. Lyophiliser la rétine pendant 30 min.
    2. Détachez la fiole du lyophilisateur et éteignez la machine selon le fabricant.
    3. Retirez la feuille d’aluminium et travaillez avec les échantillons lyophilisés le jour même ou conservez-les dans des tubes de microcentrifugation de 1 mL correctement étiquetés. Placez ces tubes dans un récipient (tel qu’un tube conique de 50 mL) rempli d’un dessiccant anhydre et conservez les échantillons à -80 °C.
  5. Collecte des segments extérieurs et intérieurs des tiges par épluchage de ruban adhésif.
    1. Coupez des bandes de ruban adhésif transparent (1-2 cm) et rangez les bandes sur le bord du distributeur de ruban / banc de laboratoire / etc. pour une utilisation rapide.
    2. Déplacez un échantillon rétinien sur le couvercle d’une boîte de Petri en plastique de 60 x 15 mm pour le peler. Assurez-vous de ne saisir que les bords les plus extérieurs du papier filtre et évitez de toucher la rétine.
    3. À l’aide de ciseaux à iris à pointe émoussée (ou de type ciseau équivalent), coupez un petit morceau de ruban adhésif rectangulaire à la taille approximative du tissu (1,5 x 2,5 mm).
    4. Posez soigneusement un petit morceau de ruban adhésif sur la rétine lyophilisée (Figure 2B) et appliquez une légère pression avec la pince à épiler pour vous assurer qu’il adhère à la couche photoréceptrice (la couche supérieure teintée d’orange / rose).
    5. Retirez lentement le ruban adhésif. Le segment extérieur de la tige (ROS) et le segment intérieur de la tige (RIS) seront collés à la bande (Figure 2B).
    6. Assurez-vous qu’il y a un mince film blanc à la surface fracturée. Il s’agit RIS.To séparer le RIS, placer un autre morceau de ruban adhésif et pousser le ruban vers le bas sur la surface fracturée (Figure 2B).
      REMARQUE: Il peut prendre plus d’un morceau de ruban adhésif pour enlever toute la fine couche blanche.
    7. Placez le morceau de ruban adhésif avec seulement la couche orange/rose dans un tube de microcentrifugation étiqueté +ROS.
    8. Placez le ruban ou les morceaux de ruban adhésif avec la fine couche blanche dans un tube de microcentrifugation étiqueté +RIS.
      REMARQUE: Séparer la rétine lyophilisée avec du ruban adhésif nécessite de la pratique. La quantité de pression appliquée à la bande affectera la façon dont l’échantillon lyophilisé se fractionnera. Si trop de pression est exercée sur le ruban adhésif sur l’échantillon, toute la rétine lyophilisée se décollera du papier filtre et collera au ruban adhésif. Si trop peu de pression est ajoutée à la bande, la couche supérieure orange/rose (+ROS) ne collera pas à la bande.
    9. Recueillir les restes de tissu rétinien (dépourvu de couches ROS et RIS, -OIS) situés sur le papier filtre en décollant la couche épaisse et blanche du papier filtre à l’aide de ruban adhésif. Placez l’isolat dans un tube étiqueté -OIS.
    10. Répétez ces étapes pour chaque échantillon rétinien réduit de moitié.
    11. Conservez les couches isolées de la rétine lyophilisée soit à température ambiante si vous effectuez une quantification des protéines, une électrophorèse sur gel et des immunoblots protéiques le même jour, soit dans un récipient (tel qu’un tube conique de 50 mL) rempli de dessiccant anhydre à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

3. Préparation de l’échantillon par transfert Western pour les isolements de pelage

  1. Préparer le tampon de lyse RIPA
    1. Dans un flacon de stockage de 100 mL, ajouter des réactifs pour obtenir une concentration finale de 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 % de Triton X-100, 1 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de FDS et 1 mM d’EDTA. Ajouter 100 mL d’eau ultrapure désionisée et bien mélanger.
      REMARQUE: Le tampon de lyse RIPA peut être conservé à 2-8 ° C pendant 2-3 semaines. Pour un stockage plus long, aliquote et conserver dans le congélateur à -20 °C.
    2. Le jour de l’expérience, ajoutez un cocktail d’inhibiteurs de la protéase (0,1 M PMSF, 1:1000 aprotinine et 1:1000 leupeptine) au tampon de lyse RIPA et restez sur la glace.
  2. Préparation de lysat de pelage de papier filtre pour le transfert western
    1. S’assurer que les tubes contenant les pelures de papier filtre et les restes de rétine pelée sont maintenus sur de la glace (pour l’expérience du même jour) ou retirés du congélateur à -80 °C et placés sur de la glace.
    2. Retirez tout excès de liquide du fond des tubes de microcentrifugation contenant les pelures de papier filtre. Faites tourner rapidement une mini centrifugeuse pendant 2 à 4 s et jetez tout liquide restant.
    3. Pipette 45-55 μL de tampon RIPA froid dans des tubes contenant l’isolat de papier filtre.
    4. Homogénéiser chaque échantillon avec un pilon propre et autoclavé pendant 1 min. Assurez-vous que le papier filtre reste en contact avec le mélangeur de pilons. Gardez le papier filtre sur le côté de chaque tube plutôt qu’en bas.
    5. Avec une pince à épiler, déplacez les papiers filtres sur le côté de chaque tube et faites tourner la mini centrifugeuse pendant 2 à 4 s. Cela supprimera le tampon RIPA du papier filtre.
    6. Retirez le papier filtre séché et répétez l’opération pour tous les papiers filtres dans chaque tube si nécessaire.
    7. Transférer l’homogénat dans un nouveau tube et l’étiqueter de manière appropriée.
      REMARQUE: C’est l’étape la plus longue, et si elle n’est pas terminée correctement, une grande partie de l’échantillon finira par être absorbée par le papier filtre.
    8. Pipette 60-80 μL de tampon RIPA froid dans les tubes individuels avec les restes de rétine pelée.
    9. Homogénéiser chaque échantillon avec un pilon propre et autoclavé pendant 1 min.
  3. Peeling ruban adhésif Préparation de lysat pour western blot
    1. Placer les échantillons lyophilisés RT ou les échantillons à -80 °C sur de la glace.
    2. Pipette 50-70 μL de tampon RIPA froid dans chaque tube contenant des pelures de ruban +ROS et +RIS.
    3. Pipette 60-80 μL de tampon de lyse à froid dans les tubes -OIS contenant la rétine lyophilisée restante, avec les ROS et RIS enlevés.
    4. Homogénéiser chaque échantillon avec un pilon mélangeur propre pendant 1 min. Assurez-vous que le ruban dans les tubes individuels reste en contact avec le mélangeur de pilon et le tampon de lyse.
    5. Avec une pince à épiler stérilisée, déplacez le ruban sur le côté des tubes et faites tourner avec une mini centrifugeuse pendant 2 à 4 s. Cela enlèvera le liquide de la bande. Retirez le ruban séché des tubes.
      REMARQUE: À ce stade, vous pouvez combiner deux demi-isolats rétiniens de la même rétine pour la méthode de « peeling du papier filtre » ou du « peeling du ruban adhésif » pour vous assurer que vous avez suffisamment de volume pour effectuer un test à l’acide bicinchoninique (BCA).

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Representative Results

Les stratégies actuelles ont été développées pour fournir des méthodes relativement rapides et simples pour isoler et analyser des protéines parmi des compartiments subcellulaires de bâtonnets spécifiques pour l’analyse par transfert de Western. Nous avons appliqué deux techniques de peeling séquentiel (Figure 1 et Figure 2) suivies d’immunoblotting pour démontrer que ces méthodes pouvaient être utilisées de manière fiable pour détecter la distribution connue de transducine en bâtonnet (GNAT1) et d’arrestine (ARR1) chez les animaux adaptés à l’obscurité et à la lumière. Pour valider l’efficacité de nos deux protocoles à isoler avec précision les compartiments subcellulaires des bâtonnets sans contamination par d’autres couches cellulaires, les immunoblots ont été sondés avec des anticorps contre le cytochrome C (Cyt C), l’actine et Gß5S/Gß5L26. Une liste des anticorps et dilutions utilisés est présentée dans le tableau 1. Cyt C et actine ont indiqué la pureté ROS, car ce sont des protéines abondantes dans la rétine proximale mais sont absentes dans les ROS. Gß5L, un composant de la protéine activatrice de la GTPase (GAP) pour GNAT127, est présent dans les ROS et RIS et a servi de contrôle pour ces isolements. Gß5S, l’isoforme d’épissure plus courte qui n’est pas présente dans les ROS ou les RIS mais qui se trouve dans tous les autres compartiments de tiges, a servi de contrôle pour les compartiments subcellulaires isolés non ROS / RIS.

Tout d’abord, l’efficacité de notre méthode séquentielle de peeling rétinien à cellules vivantes a été évaluée en analysant la distribution de GNAT1 et ARR1 dans des bâtonnets de souris sensibles à l’obscurité et à la lumière (Figure 3). Les papiers filtres contenant les ROS (+ROS) ont été regroupés à partir d’un total d’une rétine entière, et le tissu résiduel correspondant (-ROS) a également été combiné. Les signaux des protéines indiquées ont ensuite été comparés entre les échantillons +ROS et les échantillons -ROS, et toute une rétine isolée a servi de contrôle d’entrée. La concentration en protéines et le volume d’homogénéisation de ces échantillons sont présentés dans le tableau 2. Les résultats présentés à la figure 3A montrent que, chez les animaux adaptés à l’obscurité, la distribution de GNAT1 et d’ARR128 correspondait étroitement à leurs distributions connues à l’état sombre où le signal GNAT1 était visiblement le plus fort dans l’isolement +ROS, tandis que le signal ARR1 était plus robuste dans l’isolement -ROS. En conséquence, dans la rétine exposée à la lumière, le signal GNAT1 a été sensiblement réduit dans l’isolement +ROS et a eu un signal accru dans l’échantillon -ROS, tandis que la translocation ARR1 induite par la lumière a pu être visualisée dans les échantillons +ROS et -ROS. Les résultats de six expériences différentes ont été quantifiés, et des différences statistiquement significatives ont été trouvées entre les conditions sombres/claires pour GNAT1 et ARR1 dans les échantillons +ROS et -ROS (Figure 3B). Ces résultats sont cohérents avec le mouvement lumière/obscurité des protéines précédemment connu dans les compartiments subcellulaires des bâtonnets et indiquent fortement que cette technique peut isoler des fractions +ROS enrichies.

Pour valider davantage notre méthode de peeling des cellules vivantes, nous avons étudié les distributions connues des marqueurs de pureté ROS dans les échantillons +ROS et -ROS. Dans les échantillons adaptés à l’obscurité et à la lumière, les signaux Gß5S, Cyt C et actin sont exclus des échantillons +ROS (Figure 3A), ce qui démontre une absence de contamination par d’autres couches cellulaires. De plus, le signal Gß5L était clairement visible dans les échantillons +ROS (Figure 3A). En outre, les signaux d’actine et de Gß5L ont non seulement confirmé la pureté des fractions +ROS et -ROS, mais ont également servi de contrôles de normalisation, les signaux des échantillons +ROS étant normalisés par rapport aux échantillons Gß5L et -ROS étant normalisés par rapport à l’actine. Comme le montre la figure 3A, il est recommandé que les isolats de peeling de cellules vivantes soient chargés parallèlement à un contrôle de charge, en particulier un homogénat rétinien entier, pour une normalisation et une analyse optimales de l’immunobuvardage. Ensemble, ces données confirment que notre méthode de peeling des cellules vivantes peut fournir une approche rapide et reproductible pour isoler la couche subcellulaire ROS du reste de la tige et de la rétine pour l’analyse des protéines.

Nous avons ensuite évalué notre technique de peeling lyophilisé pour vérifier que cette méthode pouvait isoler de manière reproductible les compartiments ROS et RIS. Avant l’immunoblotting, nous avons imagé les surfaces de la rétine de souris lyophilisée intacte et pelée à l’aide d’un microscope électronique à balayage (MEB) pour analyser quelle couche subcellulaire de photorécepteur le peeling de la bande a donné (Figure 4). Avant le pelage avec du ruban adhésif, la surface de la rétine lyophilisée intacte (couche teintée d’orange/rose) correspondait étroitement au profil du ROS cylindrique caractéristique (Figure 4A). Après le peeling initial du ruban, le ROS et le RIS ont semblé être complètement retirés, comme en témoigne la couche nucléaire uniforme présente à la surface des restes de rétine lyophilisée pelée (Figure 4C). Les pelures de ruban adhésif suivantes ont retiré le RIS (fine couche blanche, figure 4B) de la surface libre de la couche pelée, un processus probablement facilité par le cilium de connexion étroit et fragile reliant les segments interne et externe. Ces résultats ont confirmé que les couches subcellulaires en bâtonnets du tissu rétinien lyophilisé peuvent être spécifiquement fractionnées à l’aide de ruban adhésif.

Après avoir validé visuellement l’efficacité de cette méthode, les rétines pelées adaptées à l’obscurité et à la lumière ont été soumises à une immunobuvardage en utilisant la même approche utilisant des marqueurs protéiques pour différents compartiments, comme indiqué pour notre méthode de peeling des cellules vivantes (Figure 3). La concentration en protéines et le volume d’homogénéisation pour l’isolement ROS (+ROS), l’isolement RIS (+RIS) et les couches rétiniennes restantes (-OIS) sont présentés dans le tableau 2. Comme prévu, il y a eu un changement clair induit par la lumière pour GNAT1 du ROS vers le RIS, ainsi que pour ARR1 du RIS vers le ROS (Figure 5A). GNAT1 était le plus abondant dans l’échantillon +ROS dans l’obscurité et l’échantillon +RIS dans la lumière, tandis que le signal ARR1 était inversé (Figure 5A). Nous avons ensuite normalisé et quantifié les signaux protéiques de translocation des isolements +ROS, +RIS et -OIS (figure 5B), en utilisant les mêmes contrôles et la même approche que la méthodologie de peeling en direct. Nous avons également combiné des échantillons +RIS et -OIS (Figure 5C) pour une comparaison plus directe avec notre méthode de pelage du papier filtre à cellules vivantes (Figure 3B). Les deux graphiques montrent la translocation induite par la lumière bien établie et caractéristique de GNAT1 et D’ARR1. Sur la base de ces observations, la préparation de pelage de ruban semble produire des fractions ROS et RIS enrichies, comme en témoigne la composition protéique d’ARR1 et de GNAT1 dans ces isolements.

Ensuite, la pureté des isolements subcellulaires individuels a été évaluée. Semblable aux résultats présentés à la figure 3A, les échantillons +ROS manquaient de signaux pour l’actine, le cytochrome C et Gß5S tout en affichant un signal Gß5L fort (figure 5). Cette découverte montre un manque de contamination par d’autres compartiments subcellulaires dans notre préparation d’échantillon +ROS. La teneur en protéines de la couche subcellulaire suivante de la tige, l’isolement +RIS, a ensuite été évaluée. Nous avons constaté que l’échantillon +RIS était positif pour Cyt C, Gß5L et actine. Cette découverte est cohérente avec la composition connue de RIS, qui est riche en mitochondries et en éléments cytosquelettiques. La couche finale, l’isolat -OIS, avait des distributions protéiques cohérentes avec les échantillons -ROS montrés à la figure 3A.

Pour évaluer davantage l’utilité de notre méthode de pelage du ruban adhésif dans l’étude des compositions protéiques des compartiments subcellulaires des bâtonnets, nous avons spécifiquement examiné l’immunoréactivité de la rhodopsine kinase (GRK1) et de la protéine kinase C-alpha (PKCα) dans nos échantillons +ROS, +RIS et -OIS. Différentes méthodes expérimentales, telles que l’immunocytochimie (ICC) et le transfert western, donnent souvent des résultats contradictoires sur la localisation précise de ces protéines dans les bâtonnets et la rétine. GrK1, par exemple, est considéré comme relativement abondant dans la tige et le cône OS pour médier la phosphorylation des opsines activées par la lumière29. Cependant, l’immunomarquage des tranches rétiniennes a révélé la localisation de GRK1 soit spécifiquement dans l’OS30,31, soit dans toute la couche de photorécepteurs32. PKCα, d’autre part, est une protéine qui est couramment utilisée pour ICC pour marquer les cellules bipolaires. Malgré l’absence de preuves claires d’immunomarquage de pkCα spécifique à la tige dans les tranches rétiniennes25, il existe des preuves biochimiques 24,25 et fonctionnelles 33,34,35 qui soutiennent la présence et le rôle phosphorylant de PKCα dans le ROS. En utilisant notre technique, nous avons constaté que l’immunoréactivité GRK1 était plus intense dans les échantillons +ROS dans la rétine exposée à la lumière et était absente dans les échantillons -OIS (Figure 6A). Inversement, nous montrons que les échantillons +ROS et +RIS affichaient un faible signal pour PKCα. Comme on peut le voir à la figure 6B, la PKCα n’est généralement pas détectée dans le ROS ou le RIS par coloration par immunofluorescence des sections rétiniennes. Cependant, PKCα a été immunodétecté par transfert western (Figure 6A,D). Étant donné que les isolations +ROS et +RIS affichent un signal Gß5L fort et une absence de Gß5S (Figure 6A), nous sommes convaincus que le signal PKCα faible dans les échantillons ROS et RIS est authentique et non dû à une contamination provenant d’autres couches. Pour visualiser les signaux individuels dans les isolements +ROS, +RIS et -OIS, les transferts GRK1 et PKCα ont été combinés et tracés à des fins de comparaison (Figure 6C).

Enfin, un exemple de séance de peeling sous-optimale (figure 6D) montre comment la contamination par différentes sous-couches peut fausser les résultats, illustrant davantage l’importance de l’interprétation des données et de l’inclusion des anticorps témoins appropriés pour dépister les erreurs expérimentales de pelage. Dans cet exemple d’isolation de pelage de bande, un faible signal Gß5S est évident dans la voie d’isolement RIS, indiquant une légère contamination de l’échantillon -OIS. Selon l’objectif de l’utilisateur, cette légère contamination peut ne pas être un problème. Cependant, dans ce cas, nous avons étudié le signal PKCα dans des échantillons +ROS et +RIS, et le signal PKCα est légèrement plus élevé dans la voie RIS par rapport à la voie ROS (Figure 6A,D), peut-être en raison d’une contamination. Ainsi, des précautions doivent être prises pendant le processus de pelage pour assurer une isolation précise et minimiser la contamination. Malgré une contamination minimale due à une erreur individuelle, ces données fournissent des preuves convaincantes que la méthodologie de pelage du ruban adhésif peut produire des isolements séquentiels précis des couches de photorécepteurs de bâtonnets pour l’analyse des protéines.

Figure 1
Figure 1: Schéma des étapes de pelage des cellules vivantes. (A) Le diagramme montre les principales étapes de dissection et d’hémisection de l’œil isolé. (B) Les segments extérieurs des photorécepteurs sont éliminés progressivement par pelage séquentiel à l’aide de papier filtre. Tout d’abord, les rétines sont orientées de manière à ce que la couche photoréceptrice soit en contact avec le papier filtre. Ensuite, le papier filtre est séché par buvard sur une serviette en papier et la rétine est décollée du papier filtre. Cet isolat pelé est recueilli dans un tube conservé sur de la glace. Ce processus est répété sept à huit fois pour retirer complètement le segment extérieur de la tige (+ROS). Cette figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Processus de peeling de la rétine lyophilisée. (A) Organigramme de la préparation de l’échantillon pour la rétine lyophilisée. Les rétines sont orientées de manière à ce que la couche de cellules ganglionnaires rétiniennes soit en contact avec le papier filtre et que les photorécepteurs soient tournés vers le haut. (B) Après la lyophilisation, la rétine lyophilisée adhère à un morceau de ruban adhésif après avoir ajouté une légère pression sur le dessus du ruban. Le ruban est décollé, ce qui enlève les couches du segment extérieur de la tige (ROS) et du segment intérieur de la tige (RIS). La couche RIS est enlevée par plus de pelages de ruban jusqu’à ce que la couche ROS soit visible (couche orange/rose). Cette figure a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Expression de GNAT1 et d’ARR1 dans des photorécepteurs de bâtonnets isolés après pelage séquentiel du papier filtre. (A) Immunoblots d’échantillons +ROS et -ROS (ROS-épuisés) prélevés par la méthode de pelage du papier filtre acquise à partir de rétines adaptées à l’obscurité et à la lumière. Les blots ont été sondés avec des anticorps pour les protéines déclenchées par la lumière (transducine (GNAT1) et arrestine (ARR1)) et des marqueurs de contrôle de la qualité (GTPase activating protein (Gß5L /S), cytochrome C (Cyt C) et actine). Deux rétines réduites de moitié ont été combinées pour ces taches représentatives. (B) Signaux quantifiés de GNAT1 et ARR1 provenant de rétines adaptées à l’obscurité et à la lumière. Il y a un mouvement réciproque déclenché par la lumière de GNAT1 et ARR à partir d’isolats +ROS et -ROS. Les diagrammes de violon représentent l’expression normalisée des échantillons +ROS et -ROS. Ce chiffre a été modifié à partir de Rose et al.36. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Images au microscope électronique à balayage de la rétine lyophilisée. (A) Surface de la rétine lyophilisée avant le peeling du ruban adhésif (côté photorécepteur vers le haut). (B) La couche de segment interne après le pelage du ruban adhésif. (C) La couche de corps cellulaire après le pelage du ruban montre un aspect nucléaire uniforme. Cette figure a été modifiée à partir de Rose et al.36 et a été créée avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Validation de la méthode de peeling sur bande pour isoler les ROS et les RIS de la rétine lyophilisée. (A) Transferts occidentaux d’échantillons +ROS, +RIS et -OIS (ROS/RIS-épuisés) prélevés par la méthode de pelage sur bande. Les immunoblots ont été sondés avec de la transducine (GNAT1), de l’arrestine (ARR1), de la protéine activatrice de la GTPase (Gß5L/S), du cytochrome C (Cyt C) et des anticorps d’actine. Des échantillons ont été obtenus à partir de rétines adaptées à l’obscurité et à la lumière et des isolats rétiniens réduits de moitié (+ROS, +RIS, -OIS) ont été combinés pour obtenir des matériaux plus concentrés. (B) Les signaux quantifiés de GNAT1 et D’ARR1 sont tracés sous forme de diagrammes de violon pour les différentes couches rétiniennes isolées, qui ont été obtenues à partir de rétines adaptées à l’obscurité et à la lumière. (C) Les niveaux d’expression normalisés de +RIS et -OIS ont été combinés et tracés pour comparer les méthodes d’épluchage du ruban adhésif et du papier filtre. Des échantillons adaptés à l’obscurité et à la lumière ont montré un mouvement connu des principales protéines de phototransduction. Ce chiffre a été modifié à partir de Rose et al.36. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Peeling sur bande de la rétine lyophilisée pour étudier la localisation subcellulaire de GRK1 et PKCα dans les photorécepteurs. (A) Un transfert occidental représentatif d’échantillons pelés de souris C57BL/6J adaptées à la lumière démontrant les niveaux relatifs de rhodopsine kinase (GRK1), de protéine kinase C-alpha (PKCα), de protéine activatrice de GTPase (Gß5L/S) et d’actine. (B) Section rétinienne congelée préparée à partir de souris exposées à la lumière incubées avec un anticorps PKCα (vert, 1:100). EPR, épithélium pigmenté rétinien; OS, segment externe; IS, segment interne; CB, corps cellulaire; ST, terminal synaptique. Barre d’échelle = 10 μm. (C) Les niveaux d’expression normalisés PKCα et GRK1 pour les échantillons +ROS, +RIS, -OIS sont tracés sous forme de diagrammes de violon. (D) Un pelage sous-optimal du ruban adhésif pourrait potentiellement produire des échantillons légèrement contaminés. Le carré rouge met en évidence l’échantillon +RIS contaminé par un échantillon -OIS, produisant à la fois des bandes Gß5L/S et un signal PKCα plus élevé. Deux rétines coupées en deux ont été combinées pour toutes les taches. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cible Anticorps Dilution Fabricant
Arrestation Lapin anti-ARR1 1:1000 Chen , et al., 2006.
Transducine Souris anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Actine Lapin anti-ß Actine 1:5000 GeneTex Inc.
Cytochrome C Lapin anti-cytochrome C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
ÉCART (Gß5L/S) Lapin anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson et coll., 1996.
Protéine kinase C alpha (PKC) Lapin anti-PKC (#2050) 1:1000 Technologie de signalisation cellulaire.
Rhodopsine kinase (GRK1) Souris anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tableau 1 : Liste des anticorps utilisés pour la validation par transfert western des techniques de séparation.

Isolation rétinienne en papier filtre
+ROS* -ROS* Rétine entière
Concentration moyenne en protéines (μg/mL) 700 1,500 1,500
Volume tampon RIPA (μL) 90 150 200
Isolement rétinien peeling ruban adhésif
+ROS* +RIS* -ROS* Rétine entière
Concentration moyenne en protéines (μg/mL) 520 440 1,200 1,600
Volume tampon RIPA (μL) 100 100 125 150
* Combinaison de deux isolements rétiniens réduits de moitié.

Tableau 2 : Concentration en protéines dans les homogénats d’isolement rétinien.

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Discussion

De nombreuses maladies de la rétine affectent les cellules photoréceptrices des bâtonnets, entraînant la mort des bâtonnets et, en fin de compte, une perte de vision complète37. Une partie importante des origines génétiques et mécanistes de la dégénérescence rétinienne humaine ont été récapitulées avec succès dans de nombreux modèles murins au fil des ans. Dans ce contexte, la capacité de séparer facilement et sélectivement les compartiments subcellulaires individuels des bâtonnets de la petite rétine de la souris améliorerait considérablement notre compréhension des fondements biochimiques et moléculaires localisés des maladies de la rétine. De plus, la nature stratifiée de la rétine neurale, combinée à la disposition unique et hautement polarisée des photorécepteurs des bâtonnets, permet l’isolement des compartiments des bâtonnets par peeling sélectif. Ce manuscrit décrit deux protocoles utilisés pour isoler des compartiments subcellulaires individuels de cellules photoréceptrices en bâtonnets pour l’immunobuvardage. Non seulement les deux méthodes sont considérablement plus rapides et moins difficiles techniquement par rapport à la méthode existante de sectionnement tangentiel9, mais elles nécessitent également une taille d’échantillon considérablement plus petite que l’isolement biochimique commun du ROS à l’aide de gradients de densité19. De telles techniques de purification du gradient ROS nécessitent 8 à 10 rétines murines pour récupérer de manière fiable de nombreux ROS, alors que les protocoles présentés ici conviennent à une seule rétine.

Malgré la simplicité globale des techniques proposées, l’un des principaux défis communs aux deux protocoles concerne l’aplatissement de la rétine incurvée sur le papier filtre nécessaire à une isolation correcte des différents compartiments subcellulaires. La rétine isolée a tendance à se recroqueviller et à prendre une forme de palourde. Si la rétine a des bords repliés lorsqu’elle est placée sur le papier filtre (côté photorécepteur vers le haut ou vers le bas), cela peut diminuer le rendement des couches de bâtonnets isolées souhaitées. Plus important encore, si la rétine n’est pas correctement aplatie, le désalignement des couches et la contamination par d’autres compartiments subcellulaires et cellules rétiniennes sont un résultat probable (figure 6D). Pour limiter la courbure du rectangle rétinien coupé en deux et rectifier l’alignement imparfait de la tige et des couches rétiniennes, le rectangle rétinien peut être coupé en deux pour produire deux carrés rétiniens. En coupant la rétine neurale en plus petits morceaux, la courbure naturelle de la rétine est réduite et le tissu est plus susceptible de reposer à plat sur le papier filtre.

Reconnaître quand les différents compartiments de tige ont été physiquement séparés peut être délicat pour quelqu’un d’inexpérimenté avec ces techniques. Nous conseillons qu’avant de commencer une expérience biologiquement significative, l’utilisateur doit parcourir le processus avec un échantillon de rétine pendant une heure ou deux. La pratique devrait se traduire par une amélioration substantielle des compétences et de la maîtrise des méthodes de l’opérateur. Lorsque vous utilisez du papier filtre pour décoller le ROS d’une rétine vivante, aucun indice visuel évident n’indique quand la couche ROS a été isolée. Alors que la rétine devient plus mince et plus fragile, l’utilisateur devra s’auto-surveiller et valider le nombre de peelings pour isoler le ROS avec précision. De plus, l’utilisation de papier filtre avec différentes épaisseurs de fibres et grossièreté modifiera le temps de pelage ROS. Le papier filtre avec des fibres plus épaisses (comme vwR Grade 413) isolera les couches rétiniennes plus rapidement (6-8 peelings), mais peut ne pas être aussi sélectif et peut entraîner une contamination par d’autres couches. Le papier filtre avec des fibres plus minces (comme Whatman Grade 1) isolera les couches rétiniennes plus lentement (12-15 peelings) et donnera une isolation propre des couches photoréceptrices. Nous vous recommandons d’utiliser du papier filtre plus épais et plus mince pour minimiser le temps d’épluchage et assurer la pureté de la collecte.

Dans le même temps, l’approximation visuelle et la manipulation des échantillons de bande sont toutes deux essentielles au succès de l’isolement des compartiments subcellulaires de la rétine lyophilisée. Si trop de pression est ajoutée à la bande, toute la rétine lyophilisée adhérera à la bande. Une fois que cela se produit, la séparation des ROS devient plus longue et plus difficile, mais pas impossible: placez un deuxième morceau de ruban adhésif sur la surface libre (du côté des cellules ganglionnaires) de la rétine et retirez lentement les couches avec du ruban adhésif jusqu’à ce que seule la couche orange / rosâtre soit visible sur le morceau de ruban initial. Isoler le RIS à ce stade, cependant, est impossible. Si trop peu de pression est ajoutée à la bande, une grande partie du ROS n’adhérera pas à la bande. Pour assurer une bonne adhérence du ruban ROS, nous vous conseillons d’appuyer doucement avec une pince à épiler sur les régions qui ne collent pas au ruban adhésif. En règle générale, la moindre pression entraîne l’élimination des couches ROS et RIS, mais la quantité de pression doit être déterminée en fonction de l’expérience. La présence de RIS isolé peut être vérifiée en vérifiant si une fine couche blanche (semblable à un léger saupoudrage de neige) est visible sur le pelage initial du ruban ROS, tandis que la présence de ROS isolé peut être facilement déterminée en vérifiant la couleur de la couche photoréceptrice de la tige (orange pour foncé adapté, rosâtre pour adapté à la lumière) sur le ruban.

Un dernier défi se pose lors de l’homogénéisation des peelings de papier filtre (+ROS) de la rétine vivante. Le papier filtre absorbe facilement le liquide et une quantité considérable du tampon d’homogénéisation sera absorbée au cours de cette étape du protocole. Faire tourner le liquide dans une mini centrifugeuse après avoir placé le papier pelé sur le côté de chaque tube permet d’éviter la perte d’échantillon. Malheureusement, faire tourner plusieurs morceaux de papier filtre peut prendre beaucoup de temps, et la perte d’échantillon est inévitable. Pour résoudre ce problème, retirez certains des morceaux de papier filtre et concentrez-vous sur l’homogénéisation de moins de morceaux à la fois. De plus, pour éviter la perte d’échantillon au cours de cette étape, envisagez de minimiser la quantité totale de papier filtre utilisée pour isoler le ROS.

Bien que nos deux méthodes ne nécessitent pas une grande taille d’échantillon, ou l’alignement précis d’une lame pour sectionner la rétine, il y a quelques limitations à nos techniques de peeling des photorécepteurs qui méritent d’être notées. Tout d’abord, la rétine murine lyophilisée peut ne pas se prêter à la desquamation des couches photoréceptrices ultérieures au-delà des ROS et RIS. Deuxièmement, nos méthodes de peeling sont plus adaptées au traitement individuel de la rétine et ne se prêtent pas à un traitement par lots importants en une seule séance. Troisièmement, le succès de l’expérience dépend de la limite de sensibilité de l’anticorps utilisé dans le transfert western. Malgré ces limites, nos résultats représentatifs démontrent que nos deux techniques de peeling à l’isolement peuvent isoler efficacement des compartiments de photorécepteurs de tiges spécifiques. De plus, ces deux méthodes utilisent des matériaux de laboratoire peu coûteux et courants (papier filtre et ruban adhésif), ce qui les rend très accessibles. Dans notre étude, nous n’avons pas évalué directement si d’autres cellules rétiniennes pouvaient être isolées pour l’immunobuvardage; cependant, nous croyons que ces méthodes peuvent être facilement modifiées pour répondre aux besoins d’un large éventail de la communauté de recherche rétinienne.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par NIH Grant EY12155, EY027193 et EY027387 à JC. Nous remercions le Dr Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, États-Unis) et Natalie Chen (USC, Los Angeles, États-Unis) d’avoir relu le manuscrit. Nous tenons également à remercier le Dr Seth Ruffins (USC, Los Angeles, États-Unis) et le Dr Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, États-Unis) d’avoir fourni l’équipement nécessaire pour recueillir les images fournies par l’auteur. Matériel de: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartiments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, publié [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences numéro 178
Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines
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Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

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