Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنيتين لعزل المقصورات تحت الخلوية للمستقبلات الضوئية لقضيب الفئران لتحليل البروتين. تستخدم الطريقة الأولى الشبكية الحية وورق ترشيح السليلوز لفصل الأجزاء الخارجية للقضيب ، بينما تستخدم الطريقة الثانية شبكية العين المجففة بالتجميد والشريط اللاصق لتقشير طبقات القضبان الداخلية والخارجية.

Abstract

المستقبلات الضوئية رود هي خلايا عصبية حسية عالية الاستقطاب مع مقصورات متميزة. قضبان الماوس طويلة (~ 80 ميكرومتر) ورقيقة (~ 2 ميكرومتر) ويتم تعبئتها أفقيا في الطبقة الخارجية من شبكية العين ، طبقة المستقبلات الضوئية ، مما يؤدي إلى محاذاة المقصورات تحت الخلوية المماثلة. تقليديا ، تم استخدام التقسيم العرضي للشبكية المسطحة المجمدة لدراسة حركة وتوطين البروتينات داخل مقصورات قضيب مختلفة. ومع ذلك ، فإن الانحناء العالي لشبكية العين الفأر المهيمنة على القضيب يجعل التقسيم العرضي أمرا صعبا. بدافع من دراسة انتقال البروتين بين المقصورات ، قمنا بتطوير طريقتين للتقشير تعزلان بشكل موثوق الجزء الخارجي للقضيب (ROS) والمقصورات تحت الخلوية الأخرى للبقع الغربية. توفر تقنياتنا السريعة والبسيطة نسبيا كسور غنية ومحددة تحت الخلايا لقياس توزيع وإعادة توزيع بروتينات المستقبلات الضوئية المهمة في القضبان العادية كميا. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تكييف تقنيات العزل هذه بسهولة لعزل تكوين البروتين للطبقات الخلوية الأخرى والتحقيق فيه كميا داخل كل من شبكية العين السليمة والمتدهورة.

Introduction

تعد خلايا المستقبلات الضوئية القضيبية ، المعبأة بإحكام في الطبقة الخارجية من شبكية العين العصبية ، جزءا لا يتجزأ من رؤية الضوء الخافت. للعمل كعدادات فوتون مخلصة ، تستخدم القضبان مسار إشارات قائم على بروتين G ، يسمى النقل الضوئي ، لتوليد استجابات سريعة وتضخيمية وقابلة للتكرار لالتقاط فوتون واحد. تؤدي هذه الاستجابة للضوء في النهاية إلى حدوث تغيير في التيار في غشاء البلازما ويتم الإشارة إليها لاحقا إلى بقية النظام البصري1. كما يوحي اسمها ، فإن كل خلية قضيب لها شكل مميز يشبه القضيب وتظهر مورفولوجيا خلوية شديدة الاستقطاب ، تتكون من جزء خارجي (OS) ، وجزء داخلي (IS) ، وجسم خلية (CB) ، ومحطة متشابكة (ST). تحتوي كل حجرة تحت الخلية على آلات بروتين محددة (مرتبطة بالغشاء وقابلة للذوبان) ، وميزات جزيئية حيوية ، ومجمعات بروتينية تلعب أدوارا حاسمة مثل النقل الضوئي البصري ، والتدبير المنزلي العام وتخليق البروتين ، والانتقال المشبكي 2,3.

منذ أكثر من 30 عاما ، لوحظت لأول مرة الحركة المتبادلة المعتمدة على الضوء للبروتينات دون الخلوية ، وتحديدا transducin (بعيدا عن نظام التشغيل) و arrestin (نحو نظام التشغيل) ، 4،5،6،7. في وقت مبكر، تم استقبال هذه الظاهرة المرصودة بتشكك، ويرجع ذلك جزئيا إلى ضعف الكيمياء النسيجية المناعية لإخفاء الظهارة8. في أوائل عام 2000 ، تم تأكيد نقل البروتين المعتمد على التحفيز باستخدام تقنية تقسيم فيزيائية صارمة وشاقة9. كشف التقسيم العرضي التسلسلي لشبكية القوارض المجمدة المسطحة المثبتة متبوعة بالنشاف المناعي أن transducin9,10 و arrestin11,12 و recoverin13 كلها تخضع لإعادة توزيع تحت الخلايا استجابة للضوء. ويعتقد أن النقل المدفوع بالضوء لبروتينات الإشارات الرئيسية هذه لا ينظم فقط حساسية سلسلة النقل الضوئي9،14،15 ، ولكن قد يكون أيضا واقيا عصبيا ضد تلف الضوء16،17،18. نظرا لأن نقل البروتين المدفوع بالضوء في القضبان يبدو مهما جدا لبيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء ، فإن التقنيات التي تسمح بعزل المقصورات تحت الخلوية المختلفة لتحديد توزيع البروتين هي أدوات بحثية قيمة.

حاليا ، هناك عدد قليل من الطرق التي تهدف إلى عزل المقصورات تحت الخلوية قضيب. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه الطرق طويلة ويصعب استنساخها ، أو تتطلب كمية كبيرة من عزل الشبكية. على سبيل المثال، تستخدم مستحضرات الجزء الخارجي للقضيب (ROS) عن طريق الطرد المركزي بتدرج الكثافة19 لفصل ROS عن تجانس الشبكية. تستخدم هذه الطريقة على نطاق واسع للبقع الغربية ، ولكن الإجراء يستغرق وقتا طويلا للغاية ويتطلب ما لا يقل عن 8-12 شبكية العين الفئران20. من ناحية أخرى ، تم تنفيذ التقسيم العرضي التسلسلي للفئران المجمدة وشبكية العين الفئران بنجاح في عزل OS ، IS ، CB ، و ST9,11,13. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة صعبة تقنيا بسبب ضرورة تسطيح شبكية العين الفئرانية الصغيرة والمنحنية للغاية بالكامل لمحاذاة طبقات الشبكية قبل التقسيم العرضي. نظرا لوجود عدد كبير من نماذج الفئران والفئران المعدلة وراثيا التي تلخص أمراض الجهاز البصري ، فإن إنشاء تقنية تفصل بشكل موثوق وسريع وسهل بين مقصورات القضبان الفردية يبشر بالخير في الكشف عن العمليات الفسيولوجية التي تحدث في كل حجرة متخصصة والآليات التي تكمن وراء العمليات البصرية في الصحة والمرض.

لتسهيل هذه التحقيقات ، نصف طريقتين للتقشير تعزلان المقصورات تحت الخلوية للقضيب بسهولة أكبر من البروتوكولات الحالية. تستخدم طريقة التقشير الأولى، المقتبسة من تقنية لفضح الخلايا ثنائية القطب المصنفة بالفلورسنت لتسجيل مشبك التصحيح21، ورق ترشيح السليلوز لإزالة ROS بالتتابع من شبكية العين الفئرانية الحية والمعزولة (الشكل 1). الطريقة الثانية، المقتبسة من إجراء يعزل طبقات خلايا الشبكية الأساسية الثلاث من شبكية العين chick22 و frog23، تستخدم شريطا لاصقا لإزالة الجزء الداخلي من ROS وقضيب (RIS) من شبكية العين المجففة بالتجميد (الشكل 2). يمكن إكمال كلا الإجراءين في 1 ساعة وهما سهل الاستخدام إلى حد كبير. نحن نقدم التحقق من فعالية هذين البروتوكولين للفصل للبقع الغربية من خلال استخدام شبكية العين المتكيفة مع الظلام والمعرضة للضوء من الفئران C57BL/6J لإثبات النقل الناجم عن الضوء لترانسدوكين القضيب (GNAT1) والاعتقالين (ARR1). علاوة على ذلك ، باستخدام طريقة تقشير الشريط ، نقدم أدلة إضافية على أنه يمكن استخدام تقنيتنا لفحص ومعالجة التناقضات بين بيانات توطين البروتين التي تم الحصول عليها بواسطة الكيمياء المناعية (ICC) والبقع الغربية. على وجه التحديد ، أظهرت تقنيتنا أن: 1) بروتين كيناز C-alpha (PKCα) isoform موجود ليس فقط في الخلايا ثنائية القطب ، ولكن أيضا في الفئران ROS و RIS ، وإن كان بتركيزات منخفضة24،25 ، و 2) رودوبسين كيناز (GRK1) موجود في الغالب في عينة نظام التشغيل المعزول. توضح هذه البيانات فعالية تقنيتي التقشير لدينا لفصل وتحديد كمية محددة من بروتينات القضيب والشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المحلية للجنة رعاية الحيوانات البحثية من جامعة جنوب كاليفورنيا (USC).

1. طريقة تقشير شبكية العين للخلايا الحية

  1. تحضير مخازن أميس المؤقتة، وأوراق التقشير، وطبق التشريح
    1. باستخدام مقص قزحية العين ذو الطرف الحاد (أو نوع مقص مكافئ)، قم بقص ورق ترشيح السليلوز (الصف 413) إلى مستطيلات بقياس 5 مم × 2.5 مم تقريبا. تخزين قصاصات للاستخدام في المستقبل.
    2. قم بإعداد 1 لتر من مخزن HEPES العازل من Ames من خلال الجمع بين زجاجة واحدة من Ames' Medium و 2.38 جم HEPES و 0.877 جم من كلوريد الصوديوم. قم بإذابة الكواشف في زجاجة زجاجية معقمة بالماء المقطر فائق النقاء واضبط الأسمولية والرقم الهيدروجيني إلى 280 mOsm و 7.4 ، على التوالي. مرشح للتعقيم (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، وختم الغطاء مع فيلم البارافين ، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
    3. قم بإعداد 1 لتر من عازل البيكربونات من Ames من خلال الجمع بين زجاجة واحدة من Ames' Medium و 1.9 جم من NaHCO3. قم بإذابة الكواشف في زجاجة زجاجية معقمة بالماء المقطر فائق النقاء واضبط الأسمولية والرقم الهيدروجيني إلى 280 mOsm و 7.4 ، على التوالي. مرشح للتعقيم (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، وختم الغطاء مع فيلم البارافين ، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تحضير مخازن AMES و Ames البيكربونات مسبقا وتخزينها لمدة 1 أسبوع عند 4 درجات مئوية.
    4. في الجزء السفلي من طبق بتري 35 × 10 مم ، قم بإنشاء نمط شعري أو رقعة شطرنج باستخدام مشرط (شفرة رقم 11 ، 40 مم).
      ملاحظة: الجزء السفلي المحكم من طبق بتري يثبت العين المعزولة العائمة بحرية في مكانها أثناء تشريح الشبكية.
  2. تشريح الشبكية
    ملاحظة: بالنسبة لهذا الإجراء، يجب إحضار المخزن المؤقت والاحتفاظ به في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتحديث المخزن المؤقت للبيكربونات من Ames كل 15 دقيقة باستخدام المخزن المؤقت للبيكربونات من Ames الطازج أثناء التشريح. هذا يحافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية اللازمة.
    1. قبل حوالي 15-20 دقيقة من التشريح ، قم بأكسجة مخزن HEPES المؤقت من Ames في مختبر 100 مل أو زجاجة وسائط مجهزة بمحول غطاء أنابيب وفقاعة المخزن المؤقت للبيكربونات من Ames مع 95٪ O2 و 5٪ CO2 في غرفة حضانة الأنسجة وفي مختبر 100 مل أو زجاجة وسائط مجهزة بمحول غطاء الأنابيب.
    2. القتل الرحيم لعدد متساو من كلا الجنسين من الفئران C57BL/6J (2-3 أشهر) إما عن طريق استنشاق الأيزوفلوران أو ثاني أكسيد الكربون (CO2) تليها خلع عنق الرحم. قم بنزع العينين بمقص منحني ووضع العينين في طبق بتري المحكم 35 × 10 مم المليء بعازل بيكربونات Ames الفقاعي.
    3. قم بإنشاء كوب عين (الشكل 1A) عن طريق ثقب ثقب عند تقاطع القرنية الطرفية بإبرة 18 G. قطع على طول محيط هذا التقاطع باستخدام مقص القزحية تشريح دقيق لإزالة القرنية من كل عين. افصل العدسة والفكاهة الزجاجية عن كل عين باستخدام ملاقط وتخلص منها.
    4. عزل الشبكية عن كأس العين عن طريق تقشير الظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE)-الصلبة-المشيمية بعناية بعيدا عن الشبكية العصبية. تخلص من مجمع RPE-sclera-choroid. تأكد من عدم تلف شبكية العين أثناء التشريح من خلال التعامل مع الحواف فقط.
    5. انقل شبكية العين المعزولة باستخدام ماصة نقل واسعة التجويف إلى غطاء طبق 60 × 15 مم مملوء بمخزن بيكربونات Ames الزجاجي الفقاعي.
    6. قم بتوجيه شبكية العين على شكل نصف الكرة الأرضية مقعرة لأعلى (المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل نحو أسفل الطبق) وقم بتقطيع كل شبكية (من خلال العصب البصري) باستخدام مقص القزحية أو مشرط (الشفرة رقم 10 ، 40 مم). قم بقص الحواف المنحنية لكل نصف شبكية العين لإنشاء مستطيلين (الشكل 1A).
      ملاحظة: إن تقليل انحناء كل شبكية منقطعة إلى النصف يسمح للشبكية بالتسطيح بشكل أفضل في خطوات التقشير اللاحقة وينتج تقشيرا دقيقا لطبقة الجزء الخارجي من القضيب (ROS).
    7. قم بتخزين الشبكية المقطعة إلى النصف في غرفة حضانة الأنسجة التي يتم فقاعتها باستمرار بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالشبكية المعزولة في المخزن المؤقت للبيكربونات في Ames المكربن لمدة 24 ساعة تقريبا.
  3. جمع الجزء الخارجي من قضيب (ROS) عن طريق تقشير ورق الترشيح
    ملاحظة: قم بتحديث المخزن المؤقت ل HEPES من Ames المؤكسج RT كل 15-20 دقيقة أثناء عملية التقشير للحفاظ على درجة الحموضة الفسيولوجية اللازمة.
    1. انقل مستطيلا واحدا للشبكية من غرفة الأنسجة باستخدام ماصة نقل واسعة التجويف وقطعة من ورق الترشيح مقاس 5 مم × 2.5 مم إلى طبق بتري 35 × 10 مم مملوء بمخزن مؤقت HEPES من Ames مع فقاعات O2 بنسبة 100٪.
    2. قم بتوجيه مقعر شبكية العين المقسمة لأعلى وتأكد من أن المستقبلات الضوئية متجهة لأسفل نحو أسفل الطبق. أمسك برفق جوانب شبكية العين المقطعة إلى نصفين باستخدام ملاقط وحركها فوق ورق الترشيح. بمجرد تمركز شبكية العين على ورق الترشيح، حرك ورقة الترشيح لأعلى حتى تلمس شبكية العين المقطعة إلى النصف ورقة الترشيح لإنشاء التصاق ROS إلى ورقة الترشيح (الشكل 1B).
      ملاحظة: تأكد من أن طبقة المستقبلات الضوئية تتلامس مباشرة مع ورق التصفية.
    3. ارفع ورقة الترشيح بعناية مع شبكية العين المرفقة خارج المخزن المؤقت HEPES من Ames. ضع الجانب السفلي من ورق الترشيح (الجانب بدون شبكية العين) على منشفة ورقية وربت 2-3 مرات حتى تجف (الشكل 1B).
    4. أضف قطرة من HEPES من Ames على جانب ورقة الترشيح مع شبكية العين. ضع ورقة الترشيح على المنشفة الورقية مرة أخرى حتى تجف ، كما هو موضح للتو. كرر هذه العملية مرتين أخريين.
    5. ضع ورقة الترشيح مع شبكية العين مرة أخرى في طبق بتري. باستخدام ملاقط ، ادفع بلطف جميع حواف شبكية العين المقطعة إلى النصف لأعلى وبعيدا عن ورق الترشيح من جميع الجوانب.
    6. قشر شبكية العين بدقة بعيدا عن ورق الترشيح. المس فقط المحيط الأقصى للشبكية أثناء عملية التقشير للحفاظ على السلامة الهيكلية للشبكية.
    7. ارفع ورقة الترشيح من طبق بتري وأزل السائل الزائد على منشفة ورقية. تأكد من أن الجانب الذي كان على اتصال مع شبكية العين لا يتصل بالمنشفة الورقية.
    8. ضع ورقة الترشيح مع طبقة ROS الجزئية في أنبوب ملصق على الجليد (الشكل 1B). حافظ على شبكية العين المقشرة مغمورة في مخزن HEPES المؤقت من Ames.
    9. كرر عملية التقشير لهذه الشبكية المقطعة إلى النصف حوالي 7-8 مرات لإزالة طبقة ROS بأكملها. بعد كل تقشير ، ضع ورقة الترشيح في نفس الأنبوب ، والذي سيحتوي على ROS المعزول من شبكية العين المقطعة إلى نصفين.
      ملاحظة: احرص على عدم تمزيق الشبكية المقطعة إلى نصفين عند تقشيرها بعيدا عن ورقة الترشيح، حيث تصبح الشبكية أرق أثناء هذه العملية.
    10. ضع الأنبوب الذي يحتوي على جميع قشور ورق الترشيح من ROS المعزول على الثلج للاستخدام الفوري أو قم بتجميده مباشرة على الثلج الجاف وخزنه على درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    11. استخدم ملاقط لنقل بقايا الشبكية المقشرة (التي تفتقر إلى ROS) إلى أنبوب يحمل علامة مناسبة. ضع الأنبوب على الثلج للاستخدام الفوري أو قم بتجميده بالثلج الجاف وخزنه على درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    12. كرر عملية التقشير لكل شبكية مقطعة إلى نصفين وقم بتسمية كل أنبوب بدقة.

2. طريقة تقشير الشبكية المجمدة

  1. المخازن المؤقتة، ووسائط التقشير، وإعداد أطباق التشريح، وإعداد المسكنات
    1. في زجاجة تخزين سعة 1 لتر ، قم بإعداد محلول Ringer بإضافة 500 مل من الماء المقطر فائق النقاء. قم بإذابة الكواشف للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 130 ملليمتر كلوريد الصوديوم ، و 3.6 ملليمتر KCl ، و 2.4 ملليمتر MgCl2 ، و 1.2 ملم CaCl2 ، و 10 ملليمتر HEPES ، و 0.02 ملليمتر EDTA. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaOH ، وأضف ماء فائق النقاء ليصل الحجم النهائي إلى 1 لتر ، واضبط الأسمولية على 313 mOsm.
    2. قبل الاستخدام ، قم بتصفية محلول Ringer بفلتر معقم (حجم المسام 0.2 ميكرومتر) ، وأغلق الغطاء بفيلم البارافين ، وخزنه عند 4 درجات مئوية.
    3. باستخدام مقص قزحية العين ذو الطرف الحاد (أو نوع مقص مكافئ) ، قم بقص ورق ترشيح السليلوز إلى مستطيلات بقياس 5 مم × 2.5 مم تقريبا. استخدم قلم رصاص للكتابة على جانب واحد من ورقة الترشيح لإنشاء ملصق فريد.
    4. قم بإنشاء نمط شعري أو رقعة شطرنج في الجزء السفلي من طبق بتري 35 × 10 مم باستخدام مشرط (شفرة رقم 11 ، 40 مم).
    5. قم بتشغيل lyophilizer وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
    6. احصل على النيتروجين السائل في قارورة ديوار أو قارورة فراغ عازلة مماثلة.
  2. تشريح الشبكية
    1. أكمل تشريح الشبكية كما هو موضح في القسم 1 من البروتوكول (الشكل 1A). استخدم حل Ringer البارد بدلا من المخزن المؤقت ل Ames.
    2. بعد التشريح ، قم بتخزين الشبكية المستطيلة إلى نصفين في طبق بتري 35 × 10 مم مملوء بمحلول رينجر البارد وضعه على الثلج.
  3. إعداد عينة شبكية العين من أجل التجفيد
    1. ضع قطعة من ورق الترشيح مقاس 5 × 2.5 مم وانقل شبكية العين المقطعة إلى النصف في طبق بتري 35 × 10 مم المملوء بمخزن Ringer العازل البارد. استخدم ماصة نقل واسعة التجويف لنقل كل شبكية بين الأطباق.
    2. استخدم الملقط لقلب شبكية العين بعناية بحيث تكون مقعرة لأعلى (المستقبلات الضوئية تشير إلى الأعلى) وحركها بحيث تستقر فوق ورقة الترشيح (الشكل 2A).
      ملاحظة: تأكد من أن المستقبلات الضوئية لا تلامس ورقة الترشيح (يجب أن تكون طبقة الخلايا العقدية الشبكية على اتصال مباشر مع ورقة الترشيح) وأن الملصق الفريد مرئي. لتحديد عزل الشبكية بسهولة وسرعة، يوصى بوضع الملصق الفريد على الجانب السفلي من ورقة الترشيح.
    3. ارفع ورق الترشيح من الحواف لأعلى حتى تلمس قطعة شبكية العين المقطعة إلى النصف ورقة الترشيح واستمر في رفع ورق الترشيح من محلول رينجر.
    4. ضع الجانب السفلي من ورقة الترشيح (الجانب بدون شبكية العين عليه) على منشفة ورقية وربت بعناية 2-3 مرات لإزالة السائل الزائد (الشكل 2A).
    5. التقط ورق الترشيح باستخدام ملاقط وأضف قطرة من Ringer البارد على جانب ورق الترشيح مع شبكية العين. ضع ورقة الترشيح على المنشفة الورقية مرة أخرى لإزالة السائل الزائد. كرر العملية مرتين أخريين.
      ملاحظة: تضمن خطوات الترطيب والتجفيف بالتناوب هذه تثبيت الأنسجة بإحكام على ورق الترشيح.
    6. قم بتخزين كل عينة من ورق الشبكية / الترشيح الملتصق في طبق بتري مملوء ب Ringer's البارد حتى يصبح جاهزا لتجميد جميع العينات. كرر هذه العملية لجميع شبكية العين المقطعة إلى النصف.
    7. احصل على طبق بتري نظيف وجاف 35 × 10 مم (أسفل فقط) وقطعة من رقائق الألومنيوم مقطعة إلى مربع 3.5 × 3.5 بوصة.
    8. ارفع كل عينة من المخزن المؤقت ل Ringer البارد باستخدام ملاقط. تأكد من أن الملقط يلامس حواف ورق الترشيح فقط ، وتجنب شبكية العين المقطعة إلى النصف.
    9. ضع الجانب السفلي من كل ورقة ترشيح (الجانب بدون شبكية العين عليها) على منشفة ورقية وقم بإزالة السائل الزائد.
    10. أضف قطرة من PBS 1x البارد (137 mM NaCl ، 2.7 mM KCl ، 10 mM Na2HPO4 ، 2 mM KH2PO4 ، الرقم الهيدروجيني 7.4) على جانب ورقة الترشيح حيث يتم التصاق شبكية العين. ضع ورقة الترشيح على المنشفة الورقية لإزالة السائل الزائد.
      ملاحظة: تأكد من إزالة الرطوبة من ورق الترشيح بشكل كاف قبل التجميد.
    11. ضع جميع قطع ورق الترشيح في طبق بتري 35 × 10 مم. استخدم مناديل ورقية خالية من الوبر للتخلص من أي سائل زائد يحيط بورق الترشيح.
      ملاحظة: لا تكدس طبق بتري بالعينات. إذا تم استخدام أكثر من أربع عيون فئران ، ففكر في استخدام طبق بتري أكبر أو عدة أطباق بتري أصغر حجما للاحتفاظ بعينات شبكية العين / ورق التصفية.
    12. لف الطبق بالكامل بإحكام بورق الألومنيوم. تأكد من تأمين حواف رقائق الألومنيوم وضغطها بسلاسة في الجزء السفلي من طبق بتري. ثقب حفنة من ثقوب 0.1-0.2 مم في غطاء رقائق الألومنيوم (الشكل 2A).
    13. باستخدام ملقط معدني ، قم بخفض طبق بتري المغطى بورق الألومنيوم تدريجيا إلى النيتروجين السائل. احتفظ بالعينات في النيتروجين السائل (<10 دقائق) حتى تصبح جاهزة للتجميد.
  4. التجفيد
    1. ضع طبق بتري المغطى بورق الألمنيوم في قارورة تجفيف بالتجميد وقم بإرفاقها بآلة lyophilizer وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بتجميف شبكية العين لمدة 30 دقيقة.
    2. افصل القارورة عن lyophilizer وأغلق الجهاز وفقا للشركة المصنعة.
    3. قم بإزالة رقائق الألومنيوم وإما العمل مع العينات المجففة بالتجميد في نفس اليوم أو تخزينها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1 مل المصنفة بشكل صحيح. ضع هذه الأنابيب في حاوية (مثل أنبوب مخروطي سعة 50 مل) مملوء بمجفف لامائي وخزن العينات عند -80 درجة مئوية.
  5. جمع الجزء الخارجي والداخلي من قضيب عن طريق تقشير الشريط اللاصق.
    1. قم بقص شرائط من الشريط اللاصق الشفاف (1-2 سم) وقم بتخزين الشرائط على حافة موزع الشريط / مقعد المختبر / إلخ للاستخدام السريع.
    2. انقل عينة شبكية واحدة إلى غطاء طبق بتري بلاستيكي 60 × 15 مم للتقشير. تأكد من الإمساك فقط بالحواف الخارجية لورق الترشيح وتجنب لمس شبكية العين.
    3. باستخدام مقص القزحية ذو الطرف الحاد (أو نوع مقص مكافئ) ، قم بقص قطعة صغيرة مستطيلة من الشريط إلى الحجم التقريبي للنسيج (1.5 × 2.5 مم).
    4. ضع بعناية قطعة صغيرة من الشريط فوق شبكية العين المجففة بالتجميد (الشكل 2B) وقم بتطبيق ضغط طفيف مع الملقط للتأكد من ارتباطها بطبقة المستقبلات الضوئية (الطبقة العليا ذات اللون البرتقالي / الوردي).
    5. قشر الشريط ببطء. سيتم الالتزام بكل من الجزء الخارجي للقضيب (ROS) والجزء الداخلي للقضيب (RIS) بالشريط (الشكل 2B).
    6. تأكد من وجود طبقة بيضاء رقيقة على السطح المكسور. هذا هو RIS.To فصل RIS ، ووضع قطعة أخرى من الشريط ودفع الشريط لأسفل على السطح المكسور (الشكل 2B).
      ملاحظة: قد يستغرق الأمر أكثر من قطعة واحدة من الشريط لإزالة الطبقة البيضاء الرقيقة بالكامل.
    7. ضع قطعة الشريط مع الطبقة البرتقالية / الوردية فقط في أنبوب طرد مركزي دقيق يحمل علامة +ROS.
    8. ضع الشريط أو قطع الشريط مع الطبقة البيضاء الرقيقة في أنبوب طرد مركزي دقيق يحمل علامة +RIS.
      ملاحظة: يتطلب فصل شبكية العين المجففة بالتجميد بشريط تدريبي. سيؤثر مقدار الضغط المطبق على الشريط على كيفية كسر العينة المجففة بالتجميد. إذا تم وضع الكثير من الضغط على الشريط فوق العينة ، فإن شبكية العين المجففة بالتجميد بالكامل سوف تقشر ورقة الترشيح وستلتصق بالشريط. إذا تمت إضافة ضغط قليل جدا إلى الشريط ، فلن تلتصق الطبقة العليا البرتقالية / الوردية (+ROS) بالشريط.
    9. اجمع أنسجة الشبكية المتبقية (المجردة من طبقات ROS و RIS ، -OIS) الموجودة على ورق الترشيح عن طريق تقشير الطبقة البيضاء السميكة من ورق الترشيح باستخدام الشريط. ضع العزل في أنبوب يحمل علامة -OIS.
    10. كرر هذه الخطوات لكل عينة شبكية مقطعة إلى نصفين.
    11. قم بتخزين الطبقات المعزولة من شبكية العين المجففة بالتجميد إما في درجة حرارة الغرفة إذا كان إجراء قياس كمي للبروتين ، والرحلان الكهربائي الهلامي ، وبقع مناعية للبروتين في نفس اليوم ، أو تخزينها في حاوية (مثل أنبوب مخروطي 50 مل) مملوء بمجفف لامائي عند -80 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.

3. إعداد عينة لطخة غربية لعزل التقشير

  1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل RIPA
    1. في زجاجة تخزين 100 مل ، أضف الكواشف للحصول على تركيز نهائي من 50 mM Tris-HCl pH 7.4 ، 150 mM NaCl ، 1٪ Triton X-100 ، 1٪ Sodium deoxycholate ، 0.1٪ SDS ، و 1 mM EDTA. أضف 100 مل من الماء فائق النقاء منزوع الأيونات واخلطه جيدا.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت لتحلل RIPA عند 2-8 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع. للتخزين لفترة أطول ، قم بتخزينه وتخزينه في الفريزر -20 درجة مئوية.
    2. في يوم التجربة ، أضف كوكتيل مثبط للأنزيم البروتيني (0.1 M PMSF و 1:1000 Aprotinin و 1:1000 Leupeptin) إلى مخزن RIPA العازل للتحلل واحتفظ به على الجليد.
  2. ورقة تصفية تقشير ليسات التحضير لبقعة الغربية
    1. تأكد من الحفاظ على الأنابيب التي تحتوي على قشور ورق الترشيح والشبكية المقشرة المتبقية على الجليد (للتجربة في نفس اليوم) أو إزالتها من تخزين الفريزر -80 درجة مئوية ووضعها على الجليد.
    2. قم بإزالة أي سائل زائد من أسفل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على قشور ورق الترشيح. قم بالدوران بسرعة في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 2-4 ثوان وتخلص من أي سائل متبقي.
    3. ماصة 45-55 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA البارد في أنابيب تحتوي على ورقة تصفية معزولة.
    4. قم بتجانس كل عينة باستخدام خلاط مدقة نظيف ومعقم لمدة 1 دقيقة. تأكد من بقاء ورق الترشيح على اتصال بخلاط المدقة. احتفظ بورقة الترشيح على جانب كل أنبوب بدلا من أسفلها.
    5. باستخدام الملقط ، حرك أوراق الترشيح إلى جانب كل أنبوب وقم بالدوران في جهاز الطرد المركزي الصغير لمدة 2-4 ثوان. سيؤدي ذلك إلى إزالة المخزن المؤقت RIPA من ورقة التصفية.
    6. قم بإزالة ورق الترشيح المجفف وكرر ذلك لجميع أوراق الترشيح داخل كل أنبوب إذا لزم الأمر.
    7. انقل المتجانس إلى أنبوب جديد وقم بتسميته بشكل مناسب.
      ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر استهلاكا للوقت ، وإذا لم تكتمل بشكل صحيح ، امتصاص الكثير من العينة بواسطة ورقة الترشيح.
    8. ماصة 60-80 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA الباردة في الأنابيب الفردية مع بقايا شبكية العين المقشرة.
    9. قم بتجانس كل عينة باستخدام خلاط مدقة نظيف ومعقم لمدة 1 دقيقة.
  3. شريط تقشير Lysate التحضير لبقعة الغربية
    1. ضع عينات RT المجففة بالتجميد أو عينات -80 درجة مئوية على الجليد.
    2. ماصة 50-70 ميكرولتر من المخزن المؤقت RIPA البارد في كل أنبوب يحتوي على + ROS و + RIS قشور الشريط.
    3. ماصة 60-80 ميكرولتر من التحلل البارد المخزن المؤقت في أنابيب -OIS التي تحتوي على الشبكية المجمدة المتبقية ، مع إزالة ROS و RIS.
    4. تجانس كل عينة باستخدام خلاط مدقة نظيف لمدة 1 دقيقة. تأكد من أن الشريط الموجود في الأنابيب الفردية يبقى على اتصال بخلاط المدقة والمخزن المؤقت للتحليل.
    5. باستخدام ملاقط معقمة ، حرك الشريط إلى جانب الأنابيب وقم بالدوران باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لمدة 2-4 ثوان. سيؤدي ذلك إلى إزالة السائل من الشريط. قم بإزالة الشريط المجفف من الأنابيب.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكنك الجمع بين عزلين نصف شبكية العين من نفس الشبكية إما لطريقة "تقشير ورق التصفية" أو "تقشير الشريط" لضمان حصولك على حجم كاف لإجراء فحص حمض البيتشينكونينيك (BCA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطوير الاستراتيجيات الحالية لتوفير طرق سريعة وبسيطة نسبيا لعزل وتحليل البروتينات بين مقصورات دون خلية قضيب محددة لتحليل اللطخة الغربية. طبقنا تقنيتين متتابعتين للتقشير (الشكل 1 والشكل 2) متبوعتين بالنشاف المناعي لإثبات أنه يمكن استخدام هذه الطرق بشكل موثوق للكشف عن التوزيع المعروف لترانسدوكين القضيب (GNAT1) والاعتقالين (ARR1) في كل من الحيوانات المظلمة والخفيفة. للتحقق من فعالية بروتوكولينا في عزل المقصورات تحت الخلوية للقضيب بدقة دون تلوث من الطبقات الخلوية الأخرى ، تم فحص البقع المناعية بالأجسام المضادة للسيتوكروم C (Cyt C) والأكتين و Gß5S / Gß5L26. وترد في الجدول 1 قائمة بالأجسام المضادة والتخفيفات المستخدمة. أشار Cyt C والأكتين إلى نقاء ROS ، حيث أنهما بروتينات وفيرة في شبكية العين القريبة ولكنها غائبة في ROS. Gß5L ، أحد مكونات بروتين تنشيط GTPase (GAP) ل GNAT127 ، موجود في ROS و RIS وكان بمثابة عنصر تحكم في هذه العزلات. Gß5S ، وهو شكل متساوي الربط الأقصر غير الموجود في ROS أو RIS ولكنه موجود في جميع مقصورات القضبان الأخرى ، بمثابة عنصر تحكم للمقصورات دون الخلوية المعزولة غير ROS / RIS.

أولا، تم تقييم فعالية طريقة تقشير شبكية العين المتسلسلة للخلايا الحية من خلال تحليل توزيع GNAT1 و ARR1 في قضبان الفئران المظلمة والخفيفة (الشكل 3). تم تجميع أوراق الترشيح التي تحتوي على ROS (+ROS) من إجمالي شبكية العين بأكملها ، كما تم دمج الأنسجة المتبقية المقابلة (-ROS). تمت مقارنة الإشارات من البروتينات المشار إليها لاحقا بين عينات +ROS وعينات -ROS ، وكانت شبكية العين المعزولة بأكملها بمثابة التحكم في المدخلات. ويرد في الجدول 2 تركيز البروتين وحجم التجانس لهذه العينات. تظهر النتائج المعروضة في الشكل 3A أنه في الحيوانات المتكيفة مع الظلام ، يتطابق توزيع GNAT1 و ARR128 بشكل وثيق مع توزيعات الحالة المظلمة المعروفة حيث كانت إشارة GNAT1 هي الأقوى بشكل واضح في عزل +ROS ، في حين كانت إشارة ARR1 أكثر قوة في عزل -ROS. وبناء على ذلك، في شبكية العين المعرضة للضوء، انخفضت إشارة GNAT1 بشكل ملحوظ في عزل +ROS وكان لها إشارة متزايدة في عينة -ROS، في حين يمكن تصور نقل ARR1 الناجم عن الضوء في عينات +ROS و-ROS. تم تحديد نتائج ست تجارب مختلفة، وتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية بين الظروف المظلمة/الضوئية ل GNAT1 و ARR1 في عينات +ROS و -ROS (الشكل 3B). تتوافق هذه النتائج مع حركة الضوء / الظلام البروتينية المعروفة سابقا داخل المقصورات تحت الخلوية للقضيب وتشير بقوة إلى أن هذه التقنية يمكنها عزل كسور +ROS المخصبة.

لمزيد من التحقق من صحة طريقة تقشير الخلايا الحية لدينا ، قمنا بالتحقيق في توزيعات علامات نقاء ROS المعروفة في كل من عينات +ROS و -ROS. في كل من العينات المظلمة والخفيفة ، يتم استبعاد إشارات Gß5S و Cyt C والأكتين من عينات +ROS (الشكل 3A) ، مما يدل على عدم وجود تلوث من الطبقات الخلوية الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، كانت إشارة Gß5L مرئية بوضوح في عينات +ROS (الشكل 3A). علاوة على ذلك ، لم تؤكد إشارات الأكتين و Gß5L نقاء كسور +ROS و -ROS فحسب ، بل عملت أيضا كعناصر تحكم للتطبيع ، حيث يتم تطبيع الإشارات من عينات +ROS ضد عينات Gß5L و -ROS ضد الأكتين. كما هو موضح في الشكل 3A ، يوصى بتحميل عزلات تقشير الخلايا الحية جنبا إلى جنب مع التحكم في التحميل ، وتحديدا تجانس الشبكية بالكامل ، من أجل تطبيع وتحليل النشاف المناعي الأمثل. معا ، تثبت هذه البيانات أن طريقة تقشير الخلايا الحية لدينا يمكن أن توفر نهجا سريعا وقابلا للتكرار لعزل الطبقة دون الخلوية ROS عن بقية القضيب والشبكية لتحليل البروتين.

قمنا بعد ذلك بتقييم تقنية التقشير المجمدة بالتجميد للتحقق من أن هذه الطريقة يمكن أن تعزل مقصورات ROS و RIS بشكل متكرر. قبل النشاف المناعي ، قمنا بتصوير أسطح شبكية العين للفئران المجمدة سليمة ومقشرة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتحليل الطبقة دون الخلوية المستقبلة للضوء التي أنتجها تقشير الشريط (الشكل 4). قبل التقشير بشريط لاصق ، تطابق سطح شبكية العين المجمدة بالتجميد السليمة (الطبقة البرتقالية / الوردية الملونة) بشكل وثيق مع ملف تعريف ROS الأسطواني المميز (الشكل 4A). بعد تقشير الشريط الأولي ، بدا أن ROS و RIS قد تمت إزالتهما بالكامل ، كما يتضح من الطبقة النووية الموحدة الموجودة على سطح الشبكية المجففة بالتجميد المقشر المتبقي (الشكل 4C). أزالت قشور الشريط اللاحقة RIS (طبقة بيضاء رقيقة ، الشكل 4B) من السطح الحر للطبقة المقشرة ، وهي عملية من المحتمل أن يساعدها سيليوم الربط الضيق والهش الذي يربط الأجزاء الداخلية والخارجية. أكدت هذه النتائج أن الطبقات دون الخلوية من أنسجة الشبكية المجففة بالتجميد يمكن تقسيمها على وجه التحديد باستخدام الشريط.

بعد التحقق من فعالية هذه الطريقة بصريا ، تعرضت الشبكية المقشرة الداكنة والمكيفة للضوء للنشاف المناعي باستخدام نفس النهج باستخدام علامات البروتين لمقصورات مختلفة كما هو موضح في طريقة تقشير الخلايا الحية لدينا (الشكل 3). ويعرض الجدول 2 تركيز البروتين وحجم التجانس لعزل ROS (+ROS) وعزل RIS (+RIS) وطبقات الشبكية المتبقية (-OIS). وكما كان متوقعا، كان هناك تحول واضح ناجم عن الضوء ل GNAT1 من ROS إلى RIS، وكذلك ARR1 من RIS إلى ROS (الشكل 5A). كان GNAT1 أكثر وفرة في عينة +ROS في الظلام وعينة +RIS في الضوء ، في حين تم عكس إشارة ARR1 (الشكل 5A). قمنا بعد ذلك بتطبيع وتحديد كمية إشارات البروتين المنقولة من عزلات +ROS و +RIS و -OIS (الشكل 5B) ، باستخدام نفس الضوابط والنهج مثل منهجية التقشير الحي. قمنا أيضا بدمج عينات +RIS و -OIS (الشكل 5C) لإجراء مقارنة أكثر مباشرة مع طريقة تقشير ورق ترشيح الخلايا الحية (الشكل 3B). يوضح كلا الرسمين البيانيين النقل الراسخ والمميز الناجم عن الضوء لكل من GNAT1 و ARR1. واستنادا إلى هذه الملاحظات، يبدو أن إعداد تقشير الشريط ينتج عنه كسور ROS و RIS مخصبة، كما يتضح من تكوين البروتين ل ARR1 و GNAT1 في هذه العزلات.

بعد ذلك ، تم تقييم نقاء العزلات الفردية تحت الخلوية. على غرار النتائج الموضحة في الشكل 3A ، افتقرت عينات +ROS إلى إشارات للأكتين والسيتوكروم C و Gß5S أثناء عرض إشارة Gß5L قوية (الشكل 5). تظهر هذه النتيجة عدم وجود تلوث من المقصورات تحت الخلوية الأخرى في إعداد عينة +ROS لدينا. ثم تم تقييم محتوى البروتين في الطبقة دون الخلوية اللاحقة من القضيب ، عزل +RIS. وجدنا أن عينة +RIS كانت إيجابية ل Cyt C و Gß5L و actin. تتوافق هذه النتيجة مع التركيب المعروف ل RIS ، وهو غني بالميتوكوندريا والعناصر الخلوية. أما الطبقة الأخيرة، وهي عزل -OIS، فكانت لها توزيعات بروتين تتفق مع عينات -ROS المبينة في الشكل 3A.

لمزيد من التقييم لفائدة طريقة تقشير الشريط اللاصق لدينا في التحقيق في تركيبات البروتين في مقصورات القضيب تحت الخلوية ، قمنا على وجه التحديد بفحص التفاعل المناعي لرودوبسين كيناز (GRK1) وبروتين كيناز C-alpha (PKCα) في عينات +ROS و +RIS و -OIS. غالبا ما تسفر الطرق التجريبية المختلفة ، مثل الكيمياء المناعية (ICC) واللطخة الغربية ، عن نتائج متضاربة حول التوطين الدقيق لهذه البروتينات في القضبان والشبكية. على سبيل المثال، يعتقد أن GRK1 وفيرة نسبيا في نظام التشغيل المخروطي والمخروط للتوسط في فسفرة opsins29 المنشطة بالضوء29. ومع ذلك ، فقد كشف وضع العلامات المناعية لشرائح الشبكية عن توطين GRK1 إما على وجه التحديد في OS30,31 أو في جميع أنحاء طبقة المستقبلات الضوئية بأكملها32. PKCα ، من ناحية أخرى ، هو بروتين يستخدم عادة في ICC لتسمية الخلايا ثنائية القطب. على الرغم من عدم وجود دليل واضح على وجود علامات مناعية PKCα خاصة بالقضيب في شرائح الشبكية25 ، إلا أن هناك أدلة كيميائية حيوية كبيرة24,25 ووظيفية33,34,35 تدعم وجود ودور الفسفرة ل PKCα في ROS. باستخدام تقنيتنا ، وجدنا أن التفاعل المناعي GRK1 كان الأكثر كثافة في عينات +ROS في شبكية العين المعرضة للضوء وكان غائبا في عينات -OIS (الشكل 6A). على العكس من ذلك ، نظهر أن عينات +ROS و +RIS عرضت إشارة باهتة ل PKCα. كما يتضح من الشكل 6B ، لا يتم اكتشاف PKCα عادة في ROS أو RIS عن طريق تلطيخ التألق المناعي لأقسام الشبكية. ومع ذلك ، تم الكشف عن PKCα المناعي بواسطة اللطخة الغربية (الشكل 6A ، D). نظرا لأن عزلات +ROS و +RIS تعرض إشارة Gß5L قوية وغياب Gß5S (الشكل 6A) ، فنحن واثقون من أن إشارة PKCα الخافتة في كل من عينات ROS و RIS حقيقية وليست بسبب التلوث من الطبقات الأخرى. لتصور الإشارات الفردية في عزلات +ROS و +RIS و -OIS ، تم دمج بقع GRK1 و PKCα ورسمها للمقارنة (الشكل 6C).

وأخيرا، يوضح مثال على جلسة تقشير دون المستوى الأمثل (الشكل 6D) كيف يمكن للتلوث من طبقات فرعية مختلفة أن يشوه النتائج، مما يوضح بشكل أكبر أهمية تفسير البيانات وإدراج الأجسام المضادة الضابطة المناسبة للكشف عن أخطاء التقشير التجريبية. في مثال عزل تقشير الشريط هذا، تظهر إشارة Gß5S باهتة في ممر عزل RIS، مما يشير إلى تلوث طفيف من عينة -OIS. اعتمادا على هدف المستخدم ، قد لا يكون هذا التلوث الطفيف مشكلة. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، كنا نحقق في إشارة PKCα في عينات +ROS و +RIS ، وإشارة PKCα أعلى قليلا في ممر RIS مقارنة بممر ROS (الشكل 6A ، D) ، ربما بسبب التلوث. وبالتالي ، يجب توخي الحذر أثناء عملية التقشير لضمان عزل دقيق وتقليل التلوث. على الرغم من الحد الأدنى من التلوث بسبب الخطأ الفردي ، توفر هذه البيانات أدلة مقنعة على أن منهجية تقشير الشريط يمكن أن تسفر عن عزلات متسلسلة دقيقة لطبقات المستقبلات الضوئية للقضيب لتحليل البروتين.

Figure 1
الشكل 1: مخطط لخطوات تقشير الخلايا الحية . (أ) يوضح الرسم البياني الخطوات الرئيسية لتشريح العين المعزولة وتحطيمها. (ب) تتم إزالة الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية بشكل تدريجي عن طريق التقشير المتسلسل باستخدام ورق الترشيح. أولا ، يتم توجيه شبكية العين بحيث تكون طبقة المستقبلات الضوئية على اتصال مع ورقة الترشيح. بعد ذلك ، يتم تجفيف ورقة الترشيح عن طريق النشاف على منشفة ورقية ، ويتم تقشير شبكية العين بعيدا عن ورقة التصفية. يتم جمع هذا العزل المقشر في أنبوب محفوظ على الجليد. تتكرر هذه العملية من سبع إلى ثماني مرات لإزالة الجزء الخارجي للقضيب بالكامل (+ROS). تم إنشاء هذا الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عملية تقشير الشبكية المجمدة . (أ) مخطط تدفق لإعداد العينة للشبكية المجففة بالتجميد. يتم توجيه الشبكية بحيث تكون طبقة الخلايا العقدية الشبكية على اتصال مع ورقة الترشيح والمستقبلات الضوئية متجهة لأعلى. (ب) بعد التجفيد ، يتم لصق شبكية العين المجففة بالتجميد بقطعة من الشريط بعد إضافة ضغط طفيف إلى الجزء العلوي من الشريط. يتم تقشير الشريط بعيدا ، مما يؤدي إلى إزالة طبقات الجزء الخارجي للقضيب (ROS) والجزء الداخلي للقضيب (RIS). تتم إزالة طبقة RIS بواسطة المزيد من قشور الشريط حتى تصبح طبقة ROS مرئية (طبقة برتقالية / وردية). تم إنشاء هذا الرقم مع BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التعبير عن GNAT1 و ARR1 في المستقبلات الضوئية المعزولة للقضيب بعد تقشير ورق الترشيح التسلسلي . (أ) البقع المناعية لعينات +ROS و -ROS (المستنفدة من ROS) التي تم جمعها بواسطة طريقة تقشير ورق الترشيح المكتسبة من شبكية العين المظلمة والمتكيفة مع الضوء. تم فحص البقع باستخدام الأجسام المضادة للبروتينات التي يسببها الضوء (transducin (GNAT1) و arrestin (ARR1)) وعلامات مراقبة الجودة (بروتين GTPase المنشط (Gß5L / S) والسيتوكروم C (Cyt C) والأكتين). تم الجمع بين اثنين من شبكية العين المقطعة إلى نصفين لهذه البقع التمثيلية. (ب) الإشارات الكمية ل GNAT1 و ARR1 من شبكية العين المظلمة والمتكيفة مع الضوء. هناك حركة متبادلة ناجمة عن الضوء ل GNAT1 و ARR من عزلات +ROS و -ROS. تصور مؤامرات الكمان التعبير الطبيعي لعينات +ROS و -ROS. وقد عدل هذا الرقم من روز وآخرون.36. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صور المجهر الإلكتروني الماسح للشبكية المجففة بالتجميد. (أ) سطح شبكية العين المجففة بالتجميد قبل تقشير الشريط (جانب المستقبلات الضوئية لأعلى). (ب) طبقة الجزء الداخلي بعد تقشير الشريط. (ج) يظهر تقشير طبقة جسم الخلية بعد الشريط مظهرا نوويا موحدا. تم تعديل هذا الرقم من Rose et al.36 وتم إنشاؤه باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التحقق من صحة طريقة تقشير الشريط لعزل ROS و RIS من شبكية العين المجففة بالتجميد . (أ) بقع غربية من العينات +ROS و +RIS و -OIS (ROS / RIS-المستنفدة) التي تم جمعها بواسطة طريقة تقشير الشريط. تم فحص اللطخات المناعية باستخدام الترانسدوكين (GNAT1) ، والاعتقالين (ARR1) ، وبروتين تنشيط GTPase (Gß5L / S) ، والسيتوكروم C (Cyt C) ، والأجسام المضادة للأكتين. تم الحصول على عينات من شبكية العين المظلمة والمكيفة مع الضوء وتم الجمع بين عزلات الشبكية المخفضة إلى النصف (+ROS ، + RIS، -OIS) للحصول على مواد أكثر تركيزا. (ب) يتم رسم الإشارات الكمية ل GNAT1 و ARR1 كقطع كمان لطبقات الشبكية المعزولة المختلفة ، والتي تم الحصول عليها من شبكية العين المظلمة والمتكيفة مع الضوء. (ج) تم دمج مستويات التعبير العادية من +RIS و -OIS ورسمها لمقارنة طرق تقشير الأشرطة وورق الترشيح. أظهرت العينات المظلمة والمكيفة مع الضوء حركة معروفة لبروتينات النقل الضوئي الرئيسية. وقد عدل هذا الرقم من روز وآخرون.36. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تقشير شريط من شبكية العين المجففة بالتجميد للتحقيق في التوطين تحت الخلوي ل GRK1 و PKCα في المستقبلات الضوئية . (أ) لطخة غربية تمثيلية من العينات المقشرة من الفئران C57BL / 6J المكيفة مع الضوء توضح المستويات النسبية لرودوبسين كيناز (GRK1) ، بروتين كيناز C-alpha (PKCα) ، بروتين تنشيط GTPase (Gß5L / S) ، والأكتين. (ب) قسم الشبكية المجمد المحضر من الفئران المعرضة للضوء المحتضنة بالجسم المضاد PKCα (أخضر ، 1:100). RPE ، ظهارة مصطبغة شبكية العين ؛ نظام التشغيل ، الجزء الخارجي ؛ هو ، الجزء الداخلي ؛ CB ، جسم الخلية. ST ، محطة متشابكة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. (C) PKCα و GRK1 مستويات التعبير الطبيعية ل +ROS ، +RIS ، -OIS يتم رسمها كقطع كمان. (دال) يمكن أن يؤدي تقشير الشريط دون المستوى الأمثل إلى عينات ملوثة قليلا. يسلط المربع الأحمر الضوء على عينة +RIS الملوثة ببعض عينات -OIS ، مما ينتج كلا من نطاقات Gß5L / S وإشارة PKCα أعلى. تم الجمع بين اثنين من شبكية العين المقطعة إلى النصف لجميع الكتل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هدف جسم التخفيف الشركه المصنعه
الاعتقال أرنب مضاد ل ARR1 1:1000 تشن ، وآخرون ، 2006.
ترانسدوكين الماوس المضادة للجنات (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß أكتين أرنب مضاد ß أكتين 1:5000 شركة جينيتكس
سيتوكروم C أرنب مضاد للسيتوكروم C 1:500 سانتا كروز ، sc-7159.
GAP (Gß5L/S) أرنب مضاد ل Gß5L / S (CT2-15) 1:2000 واتسون، وآخرون، 1996.
بروتين كيناز سي ألفا (PKC) أرنب مكافحة PKC (# 2050) 1:1000 تقنية إشارات الخلايا.
رودوبسين كيناز (GRK1) ماوس مضاد ل GRK1 (G-8) 1:200 سانتا كروز ، sc-8004.

الجدول 1: قائمة الأجسام المضادة المستخدمة للتحقق من صحة اللطخة الغربية لتقنيات الفصل.

ورق ترشيح عزل الشبكية
+ROS* -ROS* الشبكية الكاملة
متوسط تركيز البروتين (ميكروغرام/مل) 700 1,500 1,500
حجم المخزن المؤقت RIPA (ميكرولتر) 90 150 200
عزل الشبكية بتقشير الشريط
+ROS* +ريس* -ROS* الشبكية الكاملة
متوسط تركيز البروتين (ميكروغرام/مل) 520 440 1,200 1,600
حجم المخزن المؤقت RIPA (ميكرولتر) 100 100 125 150
* الجمع بين اثنين من عزل الشبكية إلى النصف.

الجدول 2: تركيز البروتين في متجانسات عزل الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تؤثر العديد من أمراض الشبكية على خلايا المستقبلات الضوئية للقضيب ، مما يؤدي إلى موت القضيب ، وفي النهاية ، فقدان البصر الكامل37. تم تلخيص جزء كبير من الأصول الجينية والميكانيكية لتنكس الشبكية البشري بنجاح في العديد من نماذج الفئران على مر السنين. وفي هذا السياق، فإن القدرة على فصل المقصورات تحت الخلوية الفردية للقضيب بسهولة وانتقائية عن شبكية العين الصغيرة للفأر من شأنها أن تعزز إلى حد كبير فهمنا للأسس البيوكيميائية والجزيئية الموضعية لأمراض الشبكية. علاوة على ذلك ، فإن الطبيعة الطبقية للشبكية العصبية ، جنبا إلى جنب مع الترتيب الفريد والمستقطب للغاية للمستقبلات الضوئية للقضيب ، تسمح بعزل مقصورات القضيب عن طريق التقشير الانتقائي. تصف هذه المخطوطة بروتوكولين يستخدمان لعزل المقصورات تحت الخلوية الفردية لخلايا المستقبلات الضوئية للقضيب من أجل النشاف المناعي. وكلتا الطريقتين ليستا أسرع بكثير وأقل تحديا من الناحية التقنية عند مقارنتهما بالطريقة الحالية للتقسيم العرضي9 فحسب، بل إنهما تتطلبان أيضا حجم عينة أصغر بكثير من العزل الكيميائي الحيوي الشائع ل ROS باستخدام تدرجات الكثافة19. تتطلب تقنيات تنقية التدرج ROS هذه 8-10 شبكية فئران لاستعادة ROS وافرة بشكل موثوق به ، في حين أن البروتوكولات المعروضة هنا مناسبة للشبكية المفردة.

على الرغم من البساطة الشاملة للتقنيات المقترحة، فإن أحد التحديات الرئيسية المشتركة بين كلا البروتوكولين يتعلق بتسطيح شبكية العين المنحنية على ورقة الترشيح المطلوبة للعزل السليم للمقصورات تحت الخلوية المختلفة. تميل شبكية العين المعزولة إلى التجعد واتخاذ شكل يشبه البطلينوس. إذا كانت شبكية العين تحتوي على حواف مطوية عند وضعها على ورق الترشيح (جانب المستقبلات الضوئية إما لأعلى أو لأسفل) ، فقد يقلل ذلك من إنتاجية طبقات القضيب المعزولة المطلوبة. الأهم من ذلك ، إذا لم يتم تسطيح شبكية العين بشكل صحيح ، فإن اختلال محاذاة الطبقة والتلوث من المقصورات تحت الخلوية الأخرى وخلايا الشبكية هي نتيجة محتملة (الشكل 6D). للحد من انحناء مستطيل الشبكية النصفي وتصحيح المحاذاة غير الكاملة للقضيب وطبقات الشبكية ، يمكن قطع مستطيل الشبكية إلى نصفين لإنتاج مربعين من الشبكية. عن طريق قطع شبكية العين العصبية إلى قطع أصغر ، يتم تقليل الانحناء الطبيعي للشبكية ، ومن المرجح أن توضع الأنسجة مسطحة على ورق الترشيح.

قد يكون التعرف على الوقت الذي تم فيه فصل مقصورات القضيب المختلفة جسديا أمرا صعبا لشخص عديم الخبرة في هذه التقنيات. ننصح أنه قبل البدء في تجربة مهمة بيولوجيا ، يجب على المستخدم تشغيل العملية باستخدام عينة شبكية العين لمدة ساعة أو ساعتين. يجب أن تؤدي الممارسة إلى تحسن كبير في مهارات المشغل وكفاءته في الأساليب. عند استخدام ورق الترشيح لتقشير ROS من شبكية العين الحية، لا توجد إشارات بصرية واضحة تشير إلى متى تم عزل طبقة ROS. في حين أن شبكية العين تصبح أرق وأكثر هشاشة ، سيتعين على المستخدم المراقبة الذاتية والتحقق من صحة عدد التقشير لعزل ROS بدقة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام ورق الترشيح بسماكات ألياف مختلفة وخشونة سيغير وقت تقشير ROS. ورقة الترشيح ذات الألياف السميكة (مثل VWR Grade 413) ستعزل طبقات الشبكية بشكل أسرع (6-8 قشور) ، ولكنها قد لا تكون انتقائية ويمكن أن تؤدي إلى تلوث من طبقات أخرى. ورقة الترشيح ذات الألياف الأرق (مثل Whatman Grade 1) ستعزل طبقات الشبكية بشكل أبطأ (12-15 قشرا) وستعطي عزلا نظيفا لطبقات المستقبلات الضوئية. نوصي باستخدام ورق ترشيح أكثر سمكا وأرق لتقليل وقت التقشير وضمان نقاء التجميع.

وفي الوقت نفسه، يعد التقريب البصري ومعالجة عينات الشريط مفتاحا لنجاح عزل المقصورات تحت الخلوية عن شبكية العين المجمدة. إذا تمت إضافة الكثير من الضغط إلى الشريط ، فإن شبكية العين المجففة بالتجميد بالكامل سوف تلتصق بالشريط. بمجرد حدوث ذلك ، يصبح فصل ROS أطول وأكثر صعوبة ، ولكنه ليس مستحيلا: ضع قطعة ثانية من الشريط على السطح الحر (على جانب الخلية العقدية) من شبكية العين واسحب الطبقات ببطء بعيدا بشريط حتى تظهر الطبقة البرتقالية / الوردية فقط على القطعة الأولية من الشريط. ومع ذلك ، فإن عزل RIS في هذه المرحلة أمر مستحيل. إذا تمت إضافة ضغط قليل جدا إلى الشريط ، فلن يلتصق جزء كبير من ROS بالشريط. لضمان التصاق شريط ROS بشكل صحيح ، ننصح بالضغط بلطف باستخدام ملاقط على المناطق التي لا تلتصق بالشريط. عادة ، يؤدي أدنى ضغط إلى إزالة طبقات ROS و RIS ، ومع ذلك ، يجب تحديد مقدار الضغط بناء على الخبرة. يمكن التأكد من وجود RIS معزول عن طريق التحقق مما إذا كانت طبقة رقيقة بيضاء (تشبه غبار الثلج الخفيف) مرئية على قشر شريط ROS الأولي ، في حين يمكن تحديد وجود ROS المعزول بسهولة عن طريق التحقق من لون طبقة المستقبلات الضوئية للقضيب (برتقالي للتكيف مع الظلام ، وردي للتكيف مع الضوء) على الشريط.

ينشأ تحد أخير عند تجانس قشور ورق الترشيح (+ROS) من شبكية العين الحية. يمتص ورق الترشيح السائل بسهولة ، وسيتم امتصاص كمية كبيرة من المخزن المؤقت المتجانس خلال هذه الخطوة من البروتوكول. يساعد تدوير السائل لأسفل في جهاز طرد مركزي صغير بعد وضع ورق التقشير على جانب كل أنبوب على منع فقدان العينة. لسوء الحظ ، يمكن أن يكون تدوير قطع متعددة من ورق الترشيح عملية تستغرق وقتا طويلا ، وفقدان العينة أمر لا مفر منه. لمعالجة هذه المشكلة، قم بإزالة بعض قطع ورق الترشيح وركز على تجانس عدد أقل من القطع في المرة الواحدة. بالإضافة إلى ذلك، لتجنب فقدان العينة أثناء هذه الخطوة، ضع في اعتبارك تقليل إجمالي كمية ورق الترشيح المستخدمة لعزل ROS.

في حين أن كلتا الطريقتين لا تتطلبان حجم عينة كبير ، أو محاذاة دقيقة لشفرة لتقسيم شبكية العين ، إلا أن هناك بعض القيود على تقنيات تقشير المستقبلات الضوئية التي تستحق الملاحظة. أولا ، قد لا تكون شبكية العين الفئرانية المجففة بالتجميد قابلة لتقشير طبقات المستقبلات الضوئية اللاحقة خارج ROS و RIS. ثانيا ، طرق التقشير لدينا أكثر ملاءمة لمعالجة شبكية العين الفردية وليست قابلة لمعالجة الدفعات الكبيرة في جلسة واحدة. ثالثا ، يعتمد نجاح التجربة على حد حساسية الجسم المضاد المستخدم في اللطخة الغربية. على الرغم من هذه القيود، تظهر نتائجنا التمثيلية أن تقنيتي تقشير العزل لدينا يمكنهما عزل مقصورات مستقبلات ضوئية محددة للقضيب بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم هاتان الطريقتان مواد مختبرية غير مكلفة وشائعة (ورق ترشيح وشريط لاصق) ، مما يجعلها في متناول الجميع. في دراستنا ، لم نقيم مباشرة ما إذا كان يمكن عزل خلايا الشبكية الأخرى للنشاف المناعي. ومع ذلك ، نعتقد أنه يمكن تعديل هذه الأساليب بسهولة للاستفادة من احتياجات قطاع عريض من مجتمع أبحاث الشبكية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant EY12155 و EY027193 و EY027387 إلى JC. نحن ممتنون للدكتور سبيريدون ميشالاكيس (معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا، باسادينا، الولايات المتحدة الأمريكية) وناتالي تشن (جامعة جنوب كاليفورنيا، لوس أنجلوس، الولايات المتحدة الأمريكية) لتدقيق المخطوطة. نود أيضا أن نشكر الدكتور سيث روفينز (USC ، لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية) والدكتور يانوس بيتي بيتردي (USC ، لوس أنجلوس ، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير المعدات اللازمة لجمع اللقطات المقدمة من المؤلف. مادة من: كاسي روز وآخرون ، فصل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين الفأر لتحليل البروتين ، التنكس العصبي الجزيئي ، نشر [2017] ، [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 178 ،
طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter