이 프로토콜은 단백질 분석을 위해 뮤린 막대 광수용체의 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 기술을 제시합니다. 첫 번째 방법은 살아있는 망막과 셀룰로오스 여과지를 사용하여 막대 외부 세그먼트를 분리하는 반면, 두 번째 방법은 동결 건조 된 망막과 접착 테이프를 사용하여 막대 내부 및 외부 세그먼트 층을 제거합니다.
막대 광수용체는 뚜렷한 구획을 가진 고도로 편광 된 감각 뉴런입니다. 마우스 막대는 길고 (∼80 μm) 얇고 (~2 μm) 망막의 최외곽층, 광수용체 층에 측방으로 패킹되어, 유사한 세포 하부 구획의 정렬을 초래한다. 전통적으로, 동결된 평탄한 망막의 접선 절편은 상이한 막대 구획 내의 단백질의 이동 및 국소화를 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 막대 지배적 마우스 망막의 높은 곡률은 접선 단면화를 어렵게 만든다. 구획 사이의 단백질 수송에 대한 연구에 동기를 부여하여, 우리는 막대 외부 세그먼트 (ROS)와 서부 블로트를위한 다른 세포 하부 구획을 안정적으로 분리하는 두 가지 박리 방법을 개발했습니다. 우리의 비교적 빠르고 간단한 기술은 농축 및 아세포 특이적 분획을 제공하여 정상 막대에서 중요한 광수용체 단백질의 분포 및 재분포를 정량적으로 측정합니다. 더욱이, 이러한 분리 기술은 또한 건강한 망막 및 퇴행성 망막 내의 다른 세포층의 단백질 조성을 분리하고 정량적으로 조사하기 위해 쉽게 적응될 수 있다.
신경 망막의 최외곽층에 단단히 포장 된 막대 광수용체 세포는 희미한 빛 시력의 필수적인 부분입니다. 충실한 광자 카운터 역할을 하기 위해 로드는 광형질도입(phototransduction)이라고 불리는 G-단백질 기반 신호전달 경로를 활용하여 단일 광자 포획에 대한 신속하고 증폭되며 재현 가능한 반응을 생성합니다. 빛에 대한 이러한 반응은 궁극적으로 원형질막에서 전류의 변화를 촉발시키고 그 후 시각 시스템의 나머지 부분에 신호를 보냅니다1. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, 각 막대 세포는 뚜렷한 막대 모양의 모양을 가지며 외부 세그먼트 (OS), 내부 세그먼트 (IS), 세포체 (CB) 및 시냅스 말단 (ST)으로 구성된 고도로 편광 된 세포 형태를 나타냅니다. 각 세포 하부 구획에는 특정 단백질 기계 (막 결합 및 용해성), 생체 분자 특징 및 시각적 광형질도입, 일반적인 하우스 키핑 및 단백질 합성, 시냅스 전달과 같은 중요한 역할을하는 단백질 복합체가 있습니다2,3.
30여 년 전, 아세포 단백질, 특히 트랜스듀신(OS로부터 멀어짐)과 어레스틴(OS를 향하여)의 광의존적 상호 이동이 처음 관찰되었다4,5,6,7. 초기에, 이 관찰된 현상은 부분적으로는 에피토프 마스킹에 대한 면역조직화학의 취약성 때문에 회의론으로 받아들여졌다8. 2000년대 초에, 자극-의존성 단백질 전좌는 엄격하고 힘든 물리적 절편 기술9을 사용하여 확인되었다. 면역블롯팅에 이어 동결된 평탄한 설치류 망막의 직렬 접선 절편은 트랜스듀신9,10, arrestin11,12 및 recoverin13이 모두 빛에 반응하여 세포하 재분배를 겪는다는 것을 밝혀냈다. 이러한 주요 신호전달 단백질의 광구동 전좌는 광형질도입 캐스케이드9,14,15의 감도를 조절할 뿐만 아니라, 광손상에 대한 신경보호가 될 수도 있다고 여겨진다16,17,18. 막대에서의 광 구동 단백질 수송은 막대 세포 생물학 및 생리학에 매우 중요한 것으로 보이기 때문에 단백질 분포를 결정하기 위해 다른 세포 하위 구획을 분리 할 수있는 기술은 귀중한 연구 도구입니다.
현재, 막대 세포 하부 구획을 분리하기위한 몇 가지 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 길고 재현하기 어렵거나 상당한 양의 망막 분리가 필요할 수 있습니다. 밀도 구배 원심분리19를 통한 막대 외부 세그먼트(ROS) 제제는 예를 들어, 망막 균질물로부터 ROS를 분리하는데 일반적으로 사용된다. 이 방법은 웨스턴 블롯에 널리 사용되지만 절차는 매우 시간이 많이 걸리고 최소 8-12 뮤린 레티네20이 필요합니다. 한편, 냉동 뮤린 및 래트 망막의 직렬 접선 절편은 OS, IS, CB, 및 ST9,11,13을 단리하는데 성공적으로 구현되었다. 그러나이 방법은 접선 절편화 전에 망막 층을 정렬하기 위해 작고 고도로 구부러진 뮤린 망막을 완전히 평평하게 할 필요가 있기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 시각 시스템의 질병을 되풀이하는 마우스 모델과 트랜스제닉 마우스가 과다하기 때문에 개별 막대 구획을 안정적이고 신속하며 쉽게 분리하는 기술의 생성은 각 특수 구획에서 발생하는 생리 학적 과정과 건강 및 질병의 시각적 과정의 기초가되는 메커니즘을 드러내는 데 공약을 가지고 있습니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해, 우리는 현재의 프로토콜보다 더 쉽게 막대 세포 하부 구획을 분리하는 두 가지 박리 방법을 설명합니다. 패치 클램프 기록21을 위해 형광 표지된 양극성 세포를 노출시키는 기술로부터 적응된 첫 번째 박리 방법은 셀룰로오스 여과지를 사용하여 살아있는 분리된 뮤린 망막으로부터 ROS를 순차적으로 제거한다(도 1). 병아리22 및 개구리23 망막으로부터 3개의 일차 망막 세포층을 분리하는 절차에서 적응된 두 번째 방법은 접착 테이프를 사용하여 동결건조된 망막으로부터 ROS 및 막대 내부 세그먼트(RIS)를 제거한다(그림 2). 두 절차 모두 1 시간 내에 완료 할 수 있으며 상당히 사용자 친화적입니다. 우리는 로드 트랜스듀신(GNAT1) 및 어레스틴(ARR1)의 광유도 전좌를 입증하기 위해 C57BL/6J 마우스로부터의 어두운 적응 및 광노출 망막을 활용하여 웨스턴 블롯에 대한 이러한 두 가지 분리 프로토콜의 효과에 대한 검증을 제공합니다. 또한, 테이프 필링 방법을 사용하여, 우리는 우리의 기술이 면역 세포 화학 (ICC)에 의해 획득 된 단백질 국소화 데이터와 서양 블로트 사이의 불일치를 조사하고 해결하는 데 사용될 수 있다는 추가적인 증거를 제공합니다. 구체적으로, 우리의 기술은 1) 단백질 키나아제 C-알파 (PKCα) 이소형이 양극성 세포뿐만 아니라 뮤린 ROS 및 RIS에도 존재하며, 낮은 농도임에도 불구하고24,25, 및 2) 로돕신 키나아제 (GRK1)가 단리된 OS 샘플에 우세하게 존재한다는 것을 보여주었다. 이 데이터는 특정 막대와 망막 단백질을 분리하고 정량화하기위한 두 가지 박리 기술의 효과를 보여줍니다.
많은 망막 질환이 막대 광수용체 세포에 영향을 미쳐 막대 사망으로 이어지고 궁극적으로 완전한 시력 상실37로 이어집니다. 인간 망막 변성의 유전 적 및 기계론적 기원의 상당 부분이 수년에 걸쳐 수많은 마우스 모델에서 성공적으로 재생산되었습니다. 이러한 맥락에서, 작은 마우스 망막으로부터 개별 막대 하부 세포 구획을 쉽고 선택적으로 분리하는 능력은 망막 질환의 국?…
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 NIH Grant EY12155, EY027193 및 EY027387에서 JC에 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Spyridon Michalakis 박사(Caltech, Pasadena, USA)와 Natalie Chen(USC, Los Angeles, USA)에게 감사드립니다. 또한 저자가 제공한 영상을 수집하는 데 필요한 장비를 제공해 주신 Seth Ruffins 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)와 Janos Peti-Peterdi 박사(USC, 로스앤젤레스, 미국)에게도 감사드립니다. 소재지: Kasey Rose et al., 단백질 분석을 위한 마우스 망막에서 광수용체 세포 구획의 분리, 분자 신경변성, [2017], [Springer Nature].
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
100% O2 tank | N/A | N/A | |
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |