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Neuroscience

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Abstract

I fotorecettori a bastoncello sono neuroni sensoriali altamente polarizzati con compartimenti distinti. Le aste di topo sono lunghe (~80 μm) e sottili (~2 μm) e sono impacchettate lateralmente nello strato più esterno della retina, lo strato di fotorecettore, con conseguente allineamento di compartimenti subcellulari analoghi. Tradizionalmente, il sezionamento tangenziale della retina piatta congelata è stato utilizzato per studiare il movimento e la localizzazione delle proteine all'interno di diversi compartimenti del bastoncello. Tuttavia, l'elevata curvatura della retina del topo dominante rende difficile il sezionamento tangenziale. Motivati dallo studio del trasporto proteico tra compartimenti, abbiamo sviluppato due metodi di peeling che isolano in modo affidabile il segmento esterno dell'asta (ROS) e altri compartimenti subcellulari per le macchie occidentali. Le nostre tecniche relativamente rapide e semplici forniscono frazioni arricchite e subcellulari specifiche per misurare quantitativamente la distribuzione e la ridistribuzione di importanti proteine fotorecettrici in barre normali. Inoltre, queste tecniche di isolamento possono anche essere facilmente adattate per isolare e studiare quantitativamente la composizione proteica di altri strati cellulari all'interno della retina sia sana che degenerata.

Introduction

Le cellule fotorecettrici a bastoncello, strettamente impacchettate nello strato più esterno della retina neurale, sono parte integrante della visione a luce fioca. Per funzionare come contatori di fotoni fedeli, le barre utilizzano una via di segnalazione basata sulla proteina G, chiamata fototrasduzione, per generare risposte rapide, amplificate e riproducibili alla cattura di singoli fotoni. Questa risposta alla luce alla fine innesca un cambiamento nella corrente sulla membrana plasmatica e viene successivamente segnalata al resto del sistema visivo1. Come suggerisce il nome, ogni cellula a bastoncello ha una forma distinta simile a un'asta e presenta una morfologia cellulare altamente polarizzata, costituita da un segmento esterno (OS), un segmento interno (IS), un corpo cellulare (CB) e un terminale sinaptico (ST). Ogni compartimento subcellulare ha specifici macchinari proteici (legati alla membrana e solubili), caratteristiche biomolecolari e complessi proteici che svolgono ruoli cruciali come la fototrasduzione visiva, la pulizia generale e la sintesi proteica e la trasmissione sinaptica2,3.

Oltre 30 anni fa, il movimento reciproco dipendente dalla luce delle proteine subcellulari, in particolare la trasducina (lontano dalla OS) e l'arrestina (verso la OS), è stato osservato per la prima volta4,5,6,7. All'inizio, questo fenomeno osservato è stato accolto con scetticismo, dovuto in parte alla vulnerabilità dell'immunoistochimica al mascheramento dell'epitopo8. Nei primi anni 2000, la traslocazione proteica dipendente dallo stimolo è stata confermata utilizzando una rigorosa e ardua tecnica di sezionamento fisico9. Il sezionamento tangenziale seriale della retina di roditore piatta congelata seguito da immunoblotting ha rivelato che la transtracina9,10, l'arrestina11,12 e la recuperina13 subiscono tutte una ridistribuzione subcellulare in risposta alla luce. Si ritiene che la traslocazione guidata dalla luce di queste proteine chiave di segnalazione non solo regoli la sensibilità della cascata di fototrasduzione9,14,15, ma possa anche essere neuroprotettiva contro i danni alla luce16,17,18. Poiché il trasporto di proteine guidato dalla luce nelle barre sembra essere molto significativo per la biologia e la fisiologia delle cellule dei bastoncelli, le tecniche che consentono l'isolamento di diversi compartimenti subcellulari per determinare la distribuzione delle proteine sono preziosi strumenti di ricerca.

Attualmente, ci sono alcuni metodi volti a isolare i compartimenti subcellulari dell'asta. Tuttavia, questi metodi possono essere lunghi e difficili da riprodurre, o richiedono una quantità considerevole di isolato retinico. I preparati del segmento esterno dell'asta (ROS) tramite centrifugazione a gradiente di densità19, ad esempio, sono comunemente usati per separare il ROS dall'omogeneizzato retinico. Questo metodo è ampiamente utilizzato per western blot, ma la procedura richiede molto tempo e richiede un minimo di 8-12 retina murina20. D'altra parte, il sezionamento tangenziale seriale della retina murina e di ratto congelata è stato implementato con successo nell'isolamento del sistema operativo, IS, CB e ST9,11,13. Tuttavia, questo metodo è tecnicamente impegnativo a causa della necessità di appiattire completamente la retina murina piccola e altamente curva per allineare gli strati retinici prima della sezione tangenziale. Poiché ci sono una pletora di modelli murini e topi transgenici che ricapitolano le malattie del sistema visivo, la creazione di una tecnica che separa in modo affidabile, rapido e facile i singoli compartimenti delle aste è promettente nel rivelare i processi fisiologici che si verificano in ciascun compartimento specializzato e i meccanismi che sono alla base dei processi visivi in salute e malattia.

Per facilitare queste indagini, descriviamo due metodi di peeling che isolano i compartimenti subcellulari delle aste più facilmente rispetto ai protocolli attuali. Il primo metodo di peeling, adattato da una tecnica per esporre cellule bipolari marcate fluorescentemente per la registrazione del patch clamp21, impiega carta da filtro in cellulosa per rimuovere sequenzialmente il ROS da una retina murina isolata e viva (Figura 1). Il secondo metodo, adattato da una procedura che isola i tre strati primari di cellule retiniche da una retina chick22 e frog23, utilizza nastro adesivo per rimuovere il ROS e il segmento interno dell'asta (RIS) da una retina liofilizzata (Figura 2). Entrambe le procedure possono essere completate in 1 ora e sono notevolmente facili da usare. Forniamo la convalida dell'efficacia di questi due protocolli di separazione per western blot utilizzando retina adattata al buio ed esposta alla luce da topi C57BL / 6J per dimostrare la traslocazione indotta dalla luce di transducina rod (GNAT1) e arrestina (ARR1). Inoltre, utilizzando il metodo di peeling del nastro, forniamo ulteriori prove che la nostra tecnica può essere utilizzata per esaminare e affrontare le incongruenze tra i dati di localizzazione delle proteine acquisiti dall'immunocitochimica (ICC) e i western blots. Nello specifico, la nostra tecnica ha dimostrato che: 1) l'isoforma della proteina chinasi C-alfa (PKCα) è presente non solo nelle cellule bipolari, ma anche nei ROS murini e nei RIS, anche se in basse concentrazioni24,25, e 2) la rodopsina chinasi (GRK1) è presente prevalentemente nel campione isolato di OS. Questi dati dimostrano l'efficacia delle nostre due tecniche di peeling per separare e quantificare specifiche proteine del bastoncello e della retina.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali locali del comitato per la cura degli animali da ricerca della University of Southern California (USC).

1. Metodo di peeling retinico a cellule vive

  1. Preparazione di tamponi di Ames, carte da peeling e piatto di dissezione
    1. Utilizzando forbici a punta smussata (o tipo a forbice equivalente), tagliare la carta da filtro in cellulosa (grado 413) in rettangoli di circa 5 mm x 2,5 mm. Conservare le talee per un uso futuro.
    2. Preparare 1 L di tampone HEPES di Ames combinando una bottiglia di Ames' Medium, 2,38 g di HEPES e 0,877 g di NaCl. Sciogliere i reagenti in una bottiglia di vetro sterile con acqua ultrapura distillata e regolare l'osmolarità e il pH rispettivamente a 280 mOsm e 7,4. Filtrare per sterilizzare (dimensione dei pori 0,2 μm), sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a 4 °C.
    3. Preparare 1 L di tampone bicarbonato di Ames combinando una bottiglia di Ames' Medium e 1,9 g di NaHCO3. Sciogliere i reagenti in una bottiglia di vetro sterile con acqua ultrapura distillata e regolare l'osmolarità e il pH rispettivamente a 280 mOsm e 7,4. Filtrare per sterilizzare (dimensione dei pori 0,2 μm), sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a 4 °C.
      NOTA: I tamponi hepes e bicarbonato di Ames possono essere preparati in anticipo e conservati per 1 settimana a 4 °C.
    4. Nella parte inferiore di una piastra di Petri da 35 x 10 mm, creare un reticolo o un motivo a scacchiera con un bisturi (lama n. 11, 40 mm).
      NOTA: Il fondo strutturato della capsula di Petri mantiene l'occhio isolato e fluttuante in posizione durante la dissezione retinica.
  2. Dissezione della retina
    NOTA: per questa procedura, il tampone deve essere portato e mantenuto a temperatura ambiente (RT). Rinfrescare il tampone in bicarbonato di Ames ogni 15 minuti con il tampone di bicarbonato di Ames fresco carbogenato durante la dissezione. Questo mantiene il pH fisiologico necessario.
    1. Circa 15-20 minuti prima della dissezione, ossigenare il tampone HEPES di Ames in una bottiglia da laboratorio o media da 100 ml dotata di un adattatore per tappo per tubi e bollare il tampone bicarbonato di Ames con il 95% di O2 e il 5% di CO2 in una camera di incubazione tissutale e in una bottiglia da laboratorio o di supporto da 100 ml dotata di un adattatore per tappo di tubo.
    2. Eutanasia di un numero uguale di entrambi i sessi di topi C57BL / 6J (2-3 mesi) per inalazione di isoflurano o anidride carbonica (CO2) seguita da lussazione cervicale. Enucleare gli occhi con le forbici curve e posizionare gli occhi nella capsula di Petri strutturata di 35 x 10 mm riempita con tampone bicarbonato di Ames a bolle.
    3. Creare un oculare (Figura 1A) perforando un foro alla giunzione cornea-limbus con un ago da 18 G. Tagliare lungo il perimetro di questa giunzione usando forbici per l'iride a micro-dissezione per rimuovere la cornea di ciascun occhio. Separare la lente e l'umore vitreo da ciascun occhio usando una pinzetta e scartare.
    4. Isolare la retina dalla coppa dell'occhio staccando accuratamente il complesso epitelio pigmentato retinico (RPE)-sclera-coroide lontano dalla retina neurale. Scartare il complesso RPE-sclera-coroide. Assicurarsi che la retina non sia danneggiata durante la dissezione maneggiando solo i bordi.
    5. Trasferire la retina isolata utilizzando una pipetta di trasferimento ad ampio foro nel coperchio di un piatto da 60 x 15 mm riempito con tampone in bicarbonato di Ames a bolle.
    6. Orientare la retina a forma di emisfero concava verso l'alto (i fotorecettori sono rivolti verso il basso verso il fondo del piatto) e tagliare in due ogni retina (attraverso il nervo ottico) usando forbici per l'iride o un bisturi (lama n. 10, 40 mm). Tagliare i bordi curvi di ogni mezza retina per creare due rettangoli (Figura 1A).
      NOTA: Ridurre al minimo la curvatura di ogni retina dimezzata consente alla retina di appiattirsi meglio nelle successive fasi di peeling e produce un peeling accurato dello strato del segmento esterno dell'asta (ROS).
    7. Conservare la retina dimezzata nella camera di incubazione dei tessuti che viene continuamente bollata con il 95% di O2 e il 5% di CO2.
      NOTA: La retina isolata può essere conservata nel tampone di bicarbonato di Ames carbogenato per ~ 24 ore.
  3. Raccolta del segmento esterno dell'asta (ROS) mediante peeling della carta da filtro
    NOTA: Aggiornare il tampone HEPES di Ames ossigenato RT ogni 15-20 minuti durante il processo di peeling per mantenere il pH fisiologico necessario.
    1. Trasferire un rettangolo retinico dalla camera tissutale con una pipetta di trasferimento ad ampio foro e un pezzo di carta da filtro da 5 mm x 2,5 mm in una capsula di Petri da 35 x 10 mm riempita con il tampone HEPES di Ames con il 100% di O2.
    2. Orientare la retina partizionata concava verso l'alto e assicurarsi che i fotorecettori siano rivolti verso il basso verso il fondo del piatto. Afferrare leggermente i lati della retina dimezzata con una pinzetta e spostarla sopra la carta da filtro. Una volta che la retina è centrata sulla carta da filtro, spostare la carta da filtro verso l'alto in modo che la retina dimezzata tocchi la carta da filtro per creare l'adesione ROS-carta da filtro (Figura 1B).
      NOTA: Assicurarsi che lo strato di fotorecettore entri in contatto diretto con la carta da filtro.
    3. Sollevare con attenzione la carta da filtro con la retina attaccata dal buffer HEPES di Ames. Posizionare il lato inferiore della carta da filtro (il lato senza la retina) su un tovagliolo di carta e tamponare 2-3 volte per asciugare (Figura 1B).
    4. Aggiungere una goccia di HEPES di Ames sul lato della carta da filtro con la retina. Posizionare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta per asciugare, come appena descritto. Ripeti questo processo altre due volte.
    5. Riposizionare la carta da filtro con la retina nella capsula di Petri. Usando una pinzetta, spingere delicatamente tutti i bordi della retina dimezzata verso l'alto e lontano dalla carta da filtro su tutti i lati.
    6. Staccare delicatamente la retina dalla carta da filtro. Toccare solo il perimetro estremo della retina durante il processo di peeling per preservare l'integrità strutturale della retina.
    7. Sollevare la carta da filtro dalla capsula di Petri e rimuovere il liquido in eccesso su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il lato che era in contatto con la retina non contatti il tovagliolo di carta.
    8. Posizionare la carta da filtro con lo strato ROS parziale in un tubo etichettato su ghiaccio (Figura 1B). Tenere la retina sbucciata immersa nel tampone HEPES di Ames.
    9. Ripetere il processo di peeling per questa retina dimezzata circa 7-8 volte per rimuovere l'intero strato ROS. Dopo ogni peeling, posizionare la carta da filtro nello stesso tubo, che conterrà il ROS isolato da una retina dimezzata.
      NOTA: Fare attenzione a non strappare la retina dimezzata quando la si stacca dalla carta da filtro, poiché la retina diventa più sottile durante questo processo.
    10. Posizionare il tubo contenente tutte le bucce di carta da filtro del ROS isolato su ghiaccio per un uso immediato o congelare direttamente sul ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
    11. Utilizzare una pinzetta per trasferire la retina pelata rimanente (priva di ROS) in un tubo opportunamente etichettato. Posizionare il tubo su ghiaccio per un uso immediato o congelare con ghiaccio secco e conservare a -80 °C.
    12. Ripetere il processo di peeling per ogni retina dimezzata ed etichettare accuratamente ogni tubo.

2. Metodo di peeling della retina liofilizzata

  1. Tamponi, mezzo peeling, preparazione del piatto di dissezione e set-up liofilizzatore
    1. In una bottiglia da 1 L, preparare la soluzione di Ringer aggiungendo 500 ml di acqua ultrapura distillata. Sciogliere i reagenti per raggiungere una concentrazione finale di 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES e 0,02 mM EDTA. Regolare il pH a 7,4 con NaOH, aggiungere acqua ultrapura per portare il volume finale a 1 L e regolare l'osmolarità a 313 mOsm.
    2. Prima dell'uso, filtrare la soluzione di Ringer con un filtro sterile (dimensione dei pori 0,2 μm), sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a 4 °C.
    3. Utilizzando forbici a punta smussata (o tipo a forbice equivalente), tagliare la carta da filtro di cellulosa in rettangoli di circa 5 mm x 2,5 mm. Usa una matita per scrivere su un lato della carta da filtro per creare un'etichetta unica.
    4. Creare un reticolo o un motivo a scacchiera nella parte inferiore di una capsula di Petri di 35 x 10 mm usando un bisturi (lama n. 11, 40 mm).
    5. Accendere il liofilizzatore secondo le specifiche del produttore.
    6. Acquisire azoto liquido in un pallone Dewar o in un pallone sottovuoto isolante simile.
  2. Dissezione retinica
    1. Completare la dissezione retinica come descritto nella sezione 1 del protocollo (Figura 1A). Utilizzare la soluzione di Cold Ringer invece del buffer di Ames.
    2. Dopo la dissezione, conservare la retina rettangolare tagliata a metà in una capsula di Petri da 35 x 10 mm riempita con la soluzione fredda di Ringer e metterla sul ghiaccio.
  3. Preparazione del campione retinico per la liofilizzazione
    1. Posizionare un pezzo di carta da filtro da 5 x 2,5 mm e trasferire una retina dimezzata nella capsula di Petri texturizzata da 35 x 10 mm riempita con il tampone di Ringer freddo. Utilizzare una pipetta di trasferimento ad ampio foro per spostare ogni retina tra i piatti.
    2. Usa una pinzetta per capovolgere attentamente la retina in modo che sia orientata concava verso l'alto (i fotorecettori sono rivolti verso l'alto) e spostala in modo che riposi sopra la carta da filtro (Figura 2A).
      NOTA: Assicurarsi che i fotorecettori non contattino la carta da filtro (lo strato di cellule gangliari retiniche deve essere a diretto contatto con la carta da filtro) e che l'etichetta univoca sia visibile. Per identificare facilmente e rapidamente l'isolato retinico, si consiglia di posizionare l'etichetta univoca sul lato inferiore della carta da filtro.
    3. Sollevare la carta da filtro dai bordi verso l'alto in modo che il pezzo di retina dimezzato tocchi la carta da filtro e continuare a sollevare la carta da filtro dalla soluzione di Ringer.
    4. Posizionare il lato inferiore della carta da filtro (il lato senza la retina su di esso) su un tovagliolo di carta e tamponare con attenzione 2-3 volte per rimuovere il liquido in eccesso (Figura 2A).
    5. Raccogliere la carta da filtro con una pinzetta e aggiungere una goccia di Ringer freddo sul lato della carta da filtro con la retina. Posizionare nuovamente la carta da filtro sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Ripeti il processo altre due volte.
      NOTA: queste fasi alternate di bagnatura e asciugatura assicurano che il tessuto sia saldamente attaccato alla carta da filtro.
    6. Conservare ogni campione di retina/carta da filtro aderente in una capsula di Petri riempita con suonerie fredde fino al momento di congelare tutti i campioni. Ripeti questo processo per tutta la retina dimezzata.
    7. Ottenere una capsula di Petri di 35 x 10 mm pulita e asciutta (solo in basso) e un pezzo di foglio di alluminio tagliato in un quadrato da 3,5 x 3,5 pollici.
    8. Sollevare ogni campione dal buffer della suoneria fredda con una pinzetta. Assicurarsi che le pinzette contattino solo i bordi della carta da filtro, evitando la retina dimezzata.
    9. Posizionare il lato inferiore di ogni carta da filtro (il lato senza la retina su di esso) su un tovagliolo di carta e rimuovere il liquido in eccesso.
    10. Aggiungere una goccia di 1x PBS freddo (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) sul lato della carta da filtro in cui viene aderita la retina. Tamponare la carta da filtro sul tovagliolo di carta per rimuovere il liquido in eccesso.
      NOTA: Assicurarsi che l'umidità della carta da filtro sia sufficientemente rimossa prima del congelamento.
    11. Posizionare tutti i pezzi di carta da filtro nella piastra di Petri da 35 x 10 mm. Utilizzare una carta velina priva di lanugine per allontanare il liquido in eccesso che circonda la carta da filtro.
      NOTA: Non sovraffollare la capsula di Petri con campioni. Se vengono utilizzati più di quattro occhi murini, prendere in considerazione l'utilizzo di una capsula di Petri più grande o di più piastre di Petri più piccole per contenere i campioni di retina / carta da filtro.
    12. Avvolgere strettamente l'intero piatto con un foglio di alluminio. Assicurarsi che i bordi del foglio di alluminio siano fissati e premuti senza intoppi sul fondo della capsula di Petri. Forare una manciata di fori da 0,1-0,2 mm nel coperchio del foglio di alluminio (Figura 2A).
    13. Usando pinze metalliche, abbassare gradualmente il foglio di alluminio coperto dalla capsula di Petri nell'azoto liquido. Conservare i campioni nell'azoto liquido (<10 min) fino al momento della liofilizzazione.
  4. Liofilizzazione
    1. Posizionare il foglio di alluminio coperto dalla capsula di Petri in un pallone di liofilizzazione e collegarlo alla macchina liofilizzatore seguendo il protocollo del produttore. Liofilizzare la retina per 30 min.
    2. Staccare il pallone dal liofilizzatore e spegnere la macchina secondo il produttore.
    3. Rimuovere il foglio di alluminio e lavorare con i campioni liofilizzati lo stesso giorno o conservarli in tubi microcentrifuga da 1 mL opportunamente etichettati. Collocare questi tubi in un contenitore (ad esempio un tubo conico da 50 ml) riempito con un essiccante anidro e conservare i campioni a -80 °C.
  5. Collezione di segmenti esterni e interni a stelo mediante peeling con nastro adesivo.
    1. Tagliare strisce di nastro adesivo trasparente (1-2 cm) e conservare le strisce sul bordo del distributore di nastro / banco da laboratorio / ecc. per un uso rapido.
    2. Spostare un campione retinico sul coperchio di una capsula di Petri di plastica 60 x 15 mm per il peeling. Assicurarsi di afferrare solo i bordi più esterni della carta da filtro ed evitare di toccare la retina.
    3. Usando forbici dell'iride a punta smussata (o un tipo di forbice equivalente), tagliare un piccolo pezzo rettangolare di nastro adesivo alle dimensioni approssimative del tessuto (1,5 x 2,5 mm).
    4. Posare con cura un piccolo pezzo di nastro adesivo sulla retina liofilizzata (Figura 2B) e applicare una leggera pressione con le pinzette per assicurarsi che si leghi con lo strato di fotorecettore (lo strato superiore arancione / rosa).
    5. Staccare lentamente il nastro. Sia il segmento esterno dell'asta (ROS) che il segmento interno dell'asta (RIS) saranno aderenti al nastro (Figura 2B).
    6. Assicurarsi che ci sia un sottile film bianco sulla superficie fratturata. Questo è RIS.To separare il RIS, posizionare un altro pezzo di nastro e spingere il nastro verso il basso sulla superficie fratturata (Figura 2B).
      NOTA: potrebbe essere necessario più di un pezzo di nastro adesivo per rimuovere l'intero sottile strato bianco.
    7. Posizionare il pezzo di nastro con solo lo strato arancione/rosa in un tubo microcentrifuga etichettato +ROS.
    8. Posizionare il nastro o i pezzi di nastro con il sottile strato bianco in un tubo microcentrifuga con l'etichetta +RIS.
      NOTA: Separare la retina liofilizzata con il nastro richiede pratica. La quantità di pressione applicata al nastro influenzerà il modo in cui il campione liofilizzato si fractionrà. Se viene esercitata troppa pressione sul nastro sopra il campione, l'intera retina liofilizzata si stacca dalla carta da filtro e si attacca al nastro. Se al nastro viene aggiunta troppa poca pressione, lo strato superiore arancione/rosa (+ROS) non si attaccherà al nastro.
    9. Raccogliere il tessuto retinico residuo (privo di strati ROS e RIS, -OIS) situato sulla carta da filtro staccando lo spesso strato bianco dalla carta da filtro con del nastro adesivo. Posizionare l'isolato in un tubo etichettato -OIS.
    10. Ripetere questi passaggi per ogni campione retinico dimezzato.
    11. Conservare gli strati isolati dalla retina liofilizzata a temperatura ambiente se si esegue la quantificazione proteica, l'elettroforesi su gel e gli immunoblot proteici lo stesso giorno, oppure conservare in un contenitore (come un tubo conico da 50 ml) riempito con essiccante anidro a -80 °C per un uso successivo.

3. Preparazione del campione Western blot per gli isolamenti di peeling

  1. Preparare il tampone di lisi RIPA
    1. In un flacone da 100 mL, aggiungere reagenti per ottenere una concentrazione finale di 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desossicolato di sodio, 0,1% SDS e 1 mM EDTA. Aggiungere 100 ml di acqua ultrapura deionizzata e mescolare accuratamente.
      NOTA: il tampone di lisi RIPA può essere conservato a 2-8 °C per 2-3 settimane. Per una conservazione più lunga, aliquota e conservazione nel congelatore a -20 °C.
    2. Il giorno dell'esperimento, aggiungere un cocktail inibitore della proteasi (0,1 M PMSF, 1:1000 aprotinina e 1:1000 Leupeptin) al tampone di lisi RIPA e mantenere il ghiaccio.
  2. Preparazione lisato peeling della carta da filtro per western blot
    1. Assicurarsi che i tubi contenenti le bucce di carta da filtro e la retina pelata rimanente siano mantenuti sul ghiaccio (per l'esperimento lo stesso giorno) o rimossi dalla conservazione in congelatore a -80 °C e posti sul ghiaccio.
    2. Rimuovere il liquido in eccesso dal fondo dei tubi di microcentrifuga contenenti le bucce di carta da filtro. Ruotare rapidamente in una mini centrifuga per 2-4 s e scartare il liquido rimanente.
    3. Pipettare 45-55 μL di tampone RIPA freddo in tubi contenenti l'isolato di carta da filtro.
    4. Omogeneizzare ogni campione con un miscelatore di pestelli pulito e autoclavato per 1 minuto. Assicurarsi che la carta da filtro rimanga a contatto con il miscelatore di pestelli. Tenere la carta da filtro sul lato di ciascun tubo piuttosto che sul fondo.
    5. Con una pinzetta, spostare le carte da filtro sul lato di ciascun tubo e girare nella mini centrifuga per 2-4 s. Questo rimuoverà il buffer RIPA dalla carta da filtro.
    6. Rimuovere la carta da filtro essiccata e ripetere per tutte le carte da filtro all'interno di ciascun tubo, se necessario.
    7. Trasferire l'omogeneizzato in un nuovo tubo ed etichettarlo in modo appropriato.
      NOTA: questo è il passaggio più dispendioso in termini di tempo e, se non completato correttamente, gran parte del campione finirà per essere assorbito dalla carta da filtro.
    8. Pipettare 60-80 μL di tampone RIPA freddo nei singoli tubi con la retina pelata rimanente.
    9. Omogeneizzare ogni campione con un miscelatore di pestelli pulito e autoclavato per 1 minuto.
  3. Preparazione al lisato per peeling del nastro per western blot
    1. Posizionare i campioni liofilizzati RT o i campioni a -80 °C sul ghiaccio.
    2. Pipettare 50-70 μL di tampone RIPA freddo in ogni tubo contenente +ROS e +RIS peeling del nastro.
    3. Pipetta 60-80 μL di tampone di lisi fredda nei tubi -OIS contenenti la retina liofilizzata rimanente, con ROS e RIS rimossi.
    4. Omogeneizzare ogni campione con un miscelatore di pestelli pulito per 1 minuto. Assicurarsi che il nastro nei singoli tubi rimanga a contatto con il miscelatore di pestelli e il tampone di lisi.
    5. Con una pinzetta sterilizzata, spostare il nastro sul lato dei tubi e girare con una mini centrifuga per 2-4 s. Questo rimuoverà il liquido dal nastro. Rimuovere il nastro essiccato dai tubi.
      NOTA: A questo punto, è possibile combinare due isolati di mezza retina dalla stessa retina per il metodo di "peeling della carta da filtro" o "peeling del nastro" per assicurarsi di avere un volume sufficiente per eseguire un test dell'acido bicinchoninico (BCA).

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Representative Results

Le attuali strategie sono state sviluppate per fornire metodi relativamente rapidi e semplici per isolare e analizzare le proteine tra specifici compartimenti subcellulari di bastoncelli per l'analisi western blot. Abbiamo applicato due tecniche di peeling sequenziale (Figura 1 e Figura 2) seguite da immunoblotting per dimostrare che questi metodi potrebbero essere utilizzati in modo affidabile per rilevare la distribuzione nota di transducina a bastoncello (GNAT1) e arrestina (ARR1) in animali sia scuri che adattati alla luce. Per convalidare l'efficacia dei nostri due protocolli nell'isolare con precisione i compartimenti subcellulari delle aste senza contaminazione da altri strati cellulari, gli immunoblot sono stati sondati con anticorpi per il citocromo C (Cyt C), l'actina e Gß5S / Gß5L26. Un elenco degli anticorpi e delle diluizioni utilizzati è presentato nella Tabella 1. Cyt C e actina hanno indicato la purezza dei ROS, in quanto sono proteine abbondanti nella retina prossimale ma sono assenti nei ROS. Gß5L, un componente della proteina attivante la GTPasi (GAP) per GNAT127, è presente nei ROS e nei RIS e funge da controllo per questi isolamenti. Gß5S, l'isoforma di giunzione più corta che non è presente in ROS o RIS ma è in tutti gli altri compartimenti dell'asta, serviva come controllo per i compartimenti subcellulari isolati non ROS / RIS.

In primo luogo, l'efficacia del nostro metodo sequenziale di peeling retinico a cellule vive è stata valutata analizzando la distribuzione di GNAT1 e ARR1 in barre di topi scuri e adattati alla luce (Figura 3). Le carte da filtro contenenti il ROS (+ROS) sono state raggruppate da un totale di un'intera retina e anche il corrispondente tessuto residuo (-ROS) è stato combinato. I segnali delle proteine indicate sono stati successivamente confrontati tra i campioni +ROS e i campioni -ROS, e un'intera retina isolata è servita come controllo di input. La concentrazione proteica e il volume di omogeneizzazione per questi campioni sono presentati nella Tabella 2. I risultati presentati nella Figura 3A mostrano che, negli animali adattati al buio, la distribuzione di GNAT1 e ARR128 corrispondeva strettamente alle loro distribuzioni di stato oscuro conosciute in cui il segnale GNAT1 era visibilmente il più forte nell'isolamento +ROS, mentre il segnale ARR1 era più robusto nell'isolamento -ROS. Di conseguenza, nella retina esposta alla luce, il segnale GNAT1 è stato notevolmente ridotto nell'isolamento +ROS e ha avuto un aumento del segnale nel campione -ROS, mentre la traslocazione ARR1 indotta dalla luce poteva essere visualizzata in campioni +ROS e -ROS. Sono stati quantificati i risultati di sei diversi esperimenti e sono state trovate differenze statisticamente significative tra le condizioni di buio / luce per GNAT1 e ARR1 nei campioni +ROS e -ROS (Figura 3B). Questi risultati sono coerenti con il movimento luce/buio della proteina precedentemente noto all'interno dei compartimenti subcellulari delle aste e indicano fortemente che questa tecnica può isolare frazioni +ROS arricchite.

Per convalidare ulteriormente il nostro metodo di peeling delle cellule vive, abbiamo studiato le distribuzioni note dei marcatori di purezza ROS in entrambi i campioni +ROS e -ROS. Sia nei campioni scuri che in quelli adattati alla luce, i segnali Gß5S, Cyt C e actina sono esclusi dai campioni +ROS (Figura 3A), dimostrando un'assenza di contaminazione da altri strati cellulari. Inoltre, il segnale Gß5L era chiaramente visibile nei campioni +ROS (Figura 3A). Inoltre, i segnali di actina e Gß5L non solo hanno confermato la purezza delle frazioni +ROS e -ROS, ma hanno anche agito come controlli per la normalizzazione, con i segnali dei campioni +ROS normalizzati contro i campioni Gß5L e -ROS normalizzati contro l'actina. Come presentato nella Figura 3A, si raccomanda che gli isolati di peeling delle cellule vive siano caricati insieme a un controllo del carico, in particolare un omogeneizzato retinico intero, per una normalizzazione e un'analisi ottimali dell'immunoblotting. Insieme, questi dati confermano che il nostro metodo di peeling delle cellule vive può fornire un approccio rapido e riproducibile per isolare lo strato subcellulare ROS dal resto del bastoncello e della retina per l'analisi delle proteine.

Successivamente abbiamo valutato la nostra tecnica di peeling liofilizzato per verificare che questo metodo potesse isolare in modo riproducibile i compartimenti ROS e RIS. Prima dell'immunoblotting, abbiamo ripreso le superfici della retina di topo liofilizzata intatta e sbucciata utilizzando un microscopio elettronico a scansione (SEM) per analizzare quale strato subcellulare di fotorecettore ha prodotto il peeling del nastro (Figura 4). Prima del peeling con nastro adesivo, la superficie della retina liofilizzata intatta (strato arancione / rosa) corrispondeva strettamente al profilo del caratteristico ROS cilindrico (Figura 4A). Dopo la buccia iniziale del nastro, il ROS e il RIS sembravano essere completamente rimossi, come evidenziato dallo strato nucleare uniforme presente sulla superficie della retina liofilizzata sbucciata rimanente (Figura 4C). Le successive sbucciature del nastro hanno rimosso il RIS (strato bianco sottile, Figura 4B) dalla superficie libera dello strato pelato, un processo probabilmente aiutato dallo stretto e fragile cilio di collegamento che collega i segmenti interno ed esterno. Questi risultati hanno confermato che gli strati subcellulari del bastoncello del tessuto retinico liofilizzato possono essere specificamente frazionati usando il nastro.

Dopo aver convalidato l'efficacia di questo metodo visivamente, la retina pelata scura e adattata alla luce è stata sottoposta a immunoblotting utilizzando lo stesso approccio utilizzando marcatori proteici per diversi compartimenti come delineato per il nostro metodo di peeling delle cellule vive (Figura 3). La concentrazione proteica e il volume di omogeneizzazione per l'isolamento ROS (+ROS), l'isolamento RIS (+RIS) e i restanti strati retinici (-OIS) sono presentati nella Tabella 2. Come previsto, c'è stato un chiaro spostamento indotto dalla luce per GNAT1 dal ROS al RIS, così come ARR1 dal RIS al ROS (Figura 5A). GNAT1 è stato più abbondante nel campione +ROS al buio e nel campione +RIS alla luce, mentre il segnale ARR1 è stato invertito (Figura 5A). Successivamente abbiamo normalizzato e quantificato i segnali proteici traslocanti dagli isolamenti +ROS, +RIS e -OIS (Figura 5B), utilizzando gli stessi controlli e lo stesso approccio della metodologia di peeling dal vivo. Abbiamo anche combinato campioni +RIS e -OIS (Figura 5C) per un confronto più diretto con il nostro metodo di peeling della carta da filtro a cellule vive (Figura 3B). Entrambi i grafici mostrano la ben consolidata e caratteristica traslocazione indotta dalla luce sia di GNAT1 che di ARR1. Sulla base di queste osservazioni, la preparazione per il peeling del nastro sembra produrre frazioni ROS e RIS arricchite, come evidenziato dalla composizione proteica di ARR1 e GNAT1 in questi isolamenti.

Successivamente, è stata valutata la purezza dei singoli isolamenti subcellulari. Simile ai risultati mostrati nella Figura 3A, i campioni +ROS mancavano di segnali per actina, citocromo C e Gß5S mentre mostravano un forte segnale Gß5L (Figura 5). Questa scoperta mostra una mancanza di contaminazione da altri compartimenti subcellulari nella nostra preparazione del campione +ROS. È stato quindi valutato il contenuto proteico del successivo strato subcellulare dell'asta, l'isolamento +RIS. La Corte ha riscontrato che il campione +RIS era positivo per Cyt C, Gß5L e actina. Questa scoperta è coerente con la composizione nota di RIS, che è ricca di mitocondri ed elementi citoscheletrici. Lo strato finale, l'isolato -OIS, aveva distribuzioni proteiche coerenti con i campioni -ROS mostrati nella Figura 3A.

Per valutare ulteriormente l'utilità del nostro metodo di peeling del nastro adesivo nello studio delle composizioni proteiche dei compartimenti subcellulari dell'asta, abbiamo esaminato specificamente l'immunoreattività della rodopsina chinasi (GRK1) e della proteina chinasi C-alfa (PKCα) nei nostri campioni +ROS, +RIS e -OIS. Diversi metodi sperimentali, come l'immunocitochimica (ICC) e il western blot, spesso producono risultati contrastanti sulla localizzazione precisa di queste proteine nei bastoncelli e nella retina. GRK1, ad esempio, si pensa che sia relativamente abbondante nel sistema operativo a bastoncello e cono per mediare la fosforilazione delle opsine attivate dalla luce29. Tuttavia, l'immunolabeling delle fette retiniche ha rivelato la localizzazione di GRK1 in particolare nell'OS30,31 o in tutto lo strato di fotorecettore32. PKCα, d'altra parte, è una proteina comunemente usata per ICC per etichettare le cellule bipolari. Nonostante non vi siano chiare evidenze di immunolabeling PKCα rod-specific nelle fette retiniche25, vi sono considerevoli evidenze biochimiche24,25 e funzionali33,34,35 che supportano la presenza e il ruolo fosforilante di PKCα nei ROS. Utilizzando la nostra tecnica, abbiamo scoperto che l'immunoreattività GRK1 era più intensa nei campioni +ROS nella retina esposta alla luce ed era assente nei campioni -OIS (Figura 6A). Al contrario, mostriamo che i campioni +ROS e +RIS hanno mostrato un debole segnale per PKCα. Come si può vedere nella Figura 6B, PKCα non è comunemente rilevato nel ROS o RIS mediante colorazione immunofluorescenza delle sezioni retiniche. Tuttavia, PKCα è stato immunotecato da Western blot (Figura 6A,D). Poiché gli isolamenti +ROS e +RIS mostrano un forte segnale Gß5L e un'assenza di Gß5S (Figura 6A), siamo certi che il segnale PKCα debole in entrambi i campioni ROS e RIS sia autentico e non dovuto alla contaminazione da altri strati. Per visualizzare i singoli segnali negli isolamenti +ROS, +RIS e -OIS, le macchie GRK1 e PKCα sono state combinate e tracciate per il confronto (Figura 6C).

Infine, un esempio di una sessione di peeling sub-ottimale (Figura 6D) dimostra come la contaminazione da diversi sottostrati possa distorcere i risultati, illustrando ulteriormente l'importanza dell'interpretazione dei dati e dell'inclusione degli anticorpi di controllo appropriati per lo screening degli errori di peeling sperimentale. In questo esempio di isolamento del peeling del nastro, un debole segnale Gß5S è evidente nella corsia di isolamento RIS, indicando una leggera contaminazione dal campione -OIS. A seconda dell'obiettivo dell'utente, questa leggera contaminazione potrebbe non essere un problema. Tuttavia, in questo caso, stavamo studiando il segnale PKCα nei campioni +ROS e +RIS, e il segnale PKCα è leggermente più alto nella corsia RIS rispetto alla corsia ROS (Figura 6A,D), forse a causa della contaminazione. Pertanto, è necessario prestare attenzione durante il processo di peeling per garantire un isolamento accurato e ridurre al minimo la contaminazione. Nonostante la contaminazione minima dovuta a errori individuali, questi dati forniscono prove convincenti che la metodologia di peeling del nastro può produrre accurati isolamenti sequenziali degli strati di fotorecettori a bastoncello per l'analisi delle proteine.

Figure 1
Figura 1: Schema delle fasi di peeling delle cellule vive. (A) Il diagramma mostra i passaggi principali per sezionare ed emisezionare l'occhio isolato. (B) I segmenti esterni dei fotorecettori vengono rimossi in modo incrementale mediante peeling sequenziale utilizzando carta da filtro. In primo luogo, le retine sono orientate in modo che lo strato di fotorecettore sia in contatto con la carta da filtro. Successivamente, la carta da filtro viene asciugata tamponando su un tovagliolo di carta e la retina viene staccata dalla carta da filtro. Questo isolato sbucciato viene raccolto in un tubo tenuto sul ghiaccio. Questo processo viene ripetuto da sette a otto volte per rimuovere completamente il segmento esterno dell'asta (+ROS). Questa figura è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Processo di peeling della retina liofilizzata. (A) Diagramma di flusso della preparazione del campione per la retina liofilizzata. Le retine sono orientate in modo che lo strato di cellule gangliari retiniche sia in contatto con la carta da filtro e i fotorecettori siano rivolti verso l'alto. (B) Dopo la liofilizzazione, la retina liofilizzata viene fatta aderire a un pezzo di nastro dopo aver aggiunto una leggera pressione alla parte superiore del nastro. Il nastro viene staccato, rimuovendo gli strati del segmento esterno dell'asta (ROS) e del segmento interno dell'asta (RIS). Lo strato RIS viene rimosso da più peeling del nastro fino a quando lo strato ROS è visibile (strato arancione / rosa). Questa figura è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Espressione di GNAT1 e ARR1 in fotorecettori isolati dopo peeling sequenziale della carta da filtro. (A) Immunoblot di campioni +ROS e -ROS (ROS-depleted) raccolti con il metodo di peeling della carta da filtro acquisito da retina scura e adattata alla luce. Blots è stato sondato con anticorpi per proteine innescate dalla luce (transducina (GNAT1) e arrestina (ARR1)) e marcatori di controllo qualità (gtPasi attivante la proteina (Gß5L/S), citocromo C (Cyt C) e actina). Due retine dimezzate sono state combinate per queste macchie rappresentative. (B) Segnali quantificati di GNAT1 e ARR1 da retina scura e adattata alla luce. C'è un movimento reciproco innescato dalla luce di GNAT1 e ARR da isolati +ROS e -ROS. Le trame per violino raffigurano l'espressione normalizzata di campioni +ROS e -ROS. Questa cifra è stata modificata da Rose et al.36. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini al microscopio elettronico a scansione della retina liofilizzata. (A) Superficie della retina liofilizzata prima del peeling del nastro (lato del fotorecettore verso l'alto). (B) Lo strato di segmento interno post peeling del nastro. (C) Il peeling post nastro dello strato del corpo cellulare mostra un aspetto nucleare uniforme. Questa figura è stata modificata da Rose et al.36 ed è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Validazione del metodo di peeling del nastro per isolare ROS e RIS dalla retina liofilizzata. (A) Macchie occidentali di campioni +ROS, +RIS e -OIS (ROS/RIS-depleted) raccolti con il metodo di peeling del nastro. Gli immunoblot sono stati sondati con transucina (GNAT1), arrestina (ARR1), proteina attivante gtPasi (Gß5L/S), citocromo C (Cyt C) e anticorpi actina. I campioni sono stati ottenuti da retina scura e adattata alla luce e isolati retinici dimezzati (+ROS, +RIS, -OIS) sono stati combinati per un materiale più concentrato. (B) I segnali quantificati di GNAT1 e ARR1 sono tracciati come trame di violino per i diversi strati retinici isolati, che sono stati ottenuti da retina scura e adattata alla luce. (C) I livelli di espressione normalizzati da +RIS e -OIS sono stati combinati e tracciati per confrontare i metodi di peeling del nastro e della carta da filtro. Campioni scuri e adattati alla luce hanno mostrato il movimento noto delle principali proteine di fototrasduzione. Questa cifra è stata modificata da Rose et al.36. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Peeling a nastro della retina liofilizzata per studiare la localizzazione subcellulare di GRK1 e PKCα nei fotorecettori. (A) Una macchia occidentale rappresentativa di campioni sbucciati da topi C57BL/6J adattati alla luce che dimostrano i livelli relativi di rodopsina chinasi (GRK1), proteina chinasi C-alfa (PKCα), proteina attivante gtpasi (Gß5L/S) e actina. (B) Sezione retinica congelata preparata da topi esposti alla luce incubati con anticorpo PKCα (verde, 1:100). RPE, epitelio pigmentato retinico; Sistema operativo, segmento esterno; IS, segmento interno; CB, corpo cellulare; ST, terminale sinaptico. Barra di scala = 10 μm. (C) I livelli di espressione normalizzati PKCα e GRK1 per i campioni +ROS, +RIS, -OIS sono tracciati come trame per violino. (D) Il peeling del nastro non ottimale potrebbe potenzialmente produrre campioni leggermente contaminati. Il quadrato rosso evidenzia il campione +RIS contaminato da un campione -OIS, producendo sia bande Gß5L/S che un segnale PKCα più alto. Due retine dimezzate sono state combinate per tutti i blot. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Bersaglio Anticorpo Diluizione Fabbricante
Arrestin Coniglio anti-ARR1 1:1000 Chen, et. al., 2006.
Traducina Topo anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Actin Coniglio anti-ß Actin 1:5000 GeneTex Inc.
Citocromo C Coniglio anti-citocromo C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
GAP (Gß5L/S) Coniglio anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et. al., 1996.
Proteina chinasi C alfa (PKC) Coniglio anti-PKC (#2050) 1:1000 Tecnologia di segnalazione cellulare.
Rodopsina Chinasi (GRK1) Topo anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tabella 1: Elenco degli anticorpi utilizzati per la convalida western blot delle tecniche di separazione.

Isolamento retinico della carta da filtro
+ROS* -ROS* Retina intera
Concentrazione media di proteine (μg/mL) 700 1,500 1,500
Volume tampone RIPA (μL) 90 150 200
Isolamento retinico a peeling del nastro
+ROS* +RIS* -ROS* Retina intera
Concentrazione media di proteine (μg/mL) 520 440 1,200 1,600
Volume tampone RIPA (μL) 100 100 125 150
* Combinati due isolamenti retinici dimezzati.

Tabella 2: Concentrazione proteica negli omogeneizzati di isolamento retinico.

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Discussion

Molte malattie della retina colpiscono le cellule dei fotorecettori dei bastoncelli, portando alla morte dei bastoncelli e, in definitiva, alla completa perdita della vista37. Una parte significativa delle origini genetiche e meccanicistiche della degenerazione retinica umana è stata ricapitolata con successo in numerosi modelli murini nel corso degli anni. In tale contesto, la capacità di separare facilmente e selettivamente i singoli compartimenti subcellulari dei bastoncelli dalla retina del piccolo topo migliorerebbe notevolmente la nostra comprensione delle basi biochimiche e molecolari localizzate delle malattie retiniche. Inoltre, la natura stratificata della retina neurale, combinata con la disposizione unica e altamente polarizzata dei fotorecettori dei bastoncelli, consente l'isolamento dei compartimenti dei bastoncelli mediante peeling selettivo. Questo manoscritto descrive due protocolli utilizzati per isolare i singoli compartimenti subcellulari delle cellule dei fotorecettori a bastoncello per l'immunoblotting. Non solo entrambi i metodi sono considerevolmente più veloci e meno impegnativi dal punto di vista tecnico rispetto al metodo esistente di sezionamento tangenziale9, ma richiedono anche una dimensione del campione sostanzialmente inferiore rispetto al comune isolamento biochimico del ROS utilizzando gradienti di densità19. Tali tecniche di purificazione del gradiente ROS richiedono 8-10 retine murine per recuperare in modo affidabile ampi ROS, mentre i protocolli qui presentati sono adatti per la retina singola.

Nonostante la semplicità complessiva delle tecniche proposte, una delle principali sfide comuni ad entrambi i protocolli riguarda l'appiattimento della retina curva sulla carta da filtro necessaria per un corretto isolamento dei diversi compartimenti subcellulari. La retina isolata tende ad arricciarsi e ad assumere una forma simile a una vongola. Se la retina ha bordi piegati quando viene posizionata sulla carta da filtro (lato fotorecettore verso l'alto o verso il basso), ciò può ridurre la resa degli strati isolati desiderati. Ancora più importante, se la retina non è adeguatamente appiattita, il disallineamento dello strato e la contaminazione da altri compartimenti subcellulari e cellule retiniche è un risultato probabile (Figura 6D). Per limitare la curvatura del rettangolo retinico dimezzato e per rettificare l'allineamento imperfetto dell'asta e degli strati retinici, il rettangolo retinico può essere tagliato a metà per produrre due quadrati retinici. Tagliando la retina neurale in pezzi più piccoli, la curvatura naturale della retina si riduce e il tessuto ha maggiori probabilità di rimanere piatto sulla carta da filtro.

Riconoscere quando i diversi compartimenti dell'asta sono stati fisicamente separati può essere complicato per qualcuno inesperto con queste tecniche. Consigliamo che prima di iniziare un esperimento biologicamente significativo, l'utente dovrebbe eseguire il processo con retina campione per un'ora o due. La pratica dovrebbe comportare un sostanziale miglioramento delle capacità dell'operatore e della competenza nei metodi. Quando si utilizza carta da filtro per staccare il ROS da una retina viva, nessun segnale visivo evidente indica quando lo strato ROS è stato isolato. Mentre la retina diventa più sottile e più fragile, l'utente dovrà auto-monitorare e convalidare il numero di peeling per isolare accuratamente il ROS. Inoltre, l'utilizzo di carta da filtro con diversi spessori di fibra e grossolanità altererà il tempo di peeling ROS. La carta da filtro con fibre più spesse (come VWR Grade 413) isola gli strati retinici più velocemente (6-8 peeling), ma potrebbe non essere così selettiva e può portare alla contaminazione da altri strati. La carta da filtro con fibre più sottili (come Whatman Grade 1) isolerà gli strati retinici più lentamente (12-15 peeling) e darà un isolamento pulito degli strati dei fotorecettori. Si consiglia di utilizzare carta da filtro sia più spessa che più sottile per ridurre al minimo il tempo di peeling e garantire la purezza della raccolta.

Allo stesso tempo, l'approssimazione visiva e la gestione del campione di nastro sono entrambe la chiave per il successo dell'isolamento dei compartimenti subcellulari dalla retina liofilizzata. Se viene aggiunta troppa pressione al nastro, l'intera retina liofilizzata aderirà al nastro. Una volta che ciò accade, separare il ROS diventa più lungo e più difficile, ma non impossibile: posizionare un secondo pezzo di nastro sulla superficie libera (sul lato delle cellule gangliari) della retina e tirare via lentamente gli strati con del nastro adesivo fino a quando solo lo strato arancione / rosato è visibile sul pezzo iniziale di nastro. Isolare il RIS a questo punto, tuttavia, è impossibile. Se al nastro viene aggiunta troppa poca pressione, gran parte del ROS non aderirà al nastro. Per garantire una corretta adesione del nastro ROS, si consiglia di premere delicatamente con una pinzetta sulle regioni che non si attaccano al nastro. In genere, la minima pressione comporta la rimozione degli strati ROS e RIS, tuttavia, la quantità di pressione deve essere determinata in base all'esperienza. La presenza di RIS isolati può essere accertata verificando se un sottile strato bianco (simile a una leggera spolverata di neve) è visibile sulla buccia iniziale del nastro ROS, mentre la presenza di ROS isolati può essere facilmente determinata controllando il colore dello strato di fotorecettore dell'asta (arancione per adattato al buio, rosato per adattato alla luce) sul nastro.

Un'ultima sfida sorge quando si omogeneizzano i peeling di carta da filtro (+ROS) dalla retina viva. La carta da filtro assorbe facilmente il liquido e una notevole quantità di tampone omogeneizzante verrà assorbita durante questa fase del protocollo. La rotazione del liquido in una mini centrifuga dopo aver posizionato la carta scrostata sul lato di ciascun tubo aiuta a prevenire la perdita del campione. Sfortunatamente, la rotazione di più pezzi di carta da filtro può essere un processo che richiede tempo e la perdita di campione è inevitabile. Per risolvere questo problema, rimuovere alcuni dei pezzi di carta da filtro e concentrarsi sull'omogeneizzazione di un minor numero di pezzi alla volta. Inoltre, per evitare la perdita di campione durante questa fase, considerare di ridurre al minimo la quantità totale di carta da filtro utilizzata per isolare il ROS.

Mentre entrambi i nostri metodi non richiedono una grande dimensione del campione, o l'allineamento preciso di una lama per sezionare la retina, ci sono alcune limitazioni alle nostre tecniche di peeling dei fotorecettori che vale la pena notare. In primo luogo, la retina murina liofilizzata potrebbe non essere suscettibile di peeling degli strati di fotorecettori successivi oltre il ROS e il RIS. In secondo luogo, i nostri metodi di peeling sono più adatti per l'elaborazione della retina individuale e non sono suscettibili di elaborazione di grandi lotti in una sola seduta. In terzo luogo, il successo dell'esperimento dipende dal limite di sensibilità dell'anticorpo utilizzato nel western blot. Nonostante queste limitazioni, i nostri risultati rappresentativi dimostrano che le nostre due tecniche di peeling di isolamento possono isolare in modo efficiente specifici compartimenti fotorecettori di bastoncello. Inoltre, questi due metodi utilizzano materiali di laboratorio economici e comuni (carta da filtro e nastro adesivo), rendendoli altamente accessibili. Nel nostro studio, non abbiamo valutato direttamente se altre cellule retiniche potessero essere isolate per l'immunoblotting; tuttavia, riteniamo che questi metodi possano essere facilmente modificati per soddisfare le esigenze di un'ampia sezione trasversale della comunità di ricerca retinica.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant EY12155, EY027193 e EY027387 a JC. Siamo grati al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) e Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) per la correzione del manoscritto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) e il Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) per aver fornito l'attrezzatura necessaria per raccogliere i filmati forniti dall'autore. Materiale da: Kasey Rose et al, Separazione dei compartimenti cellulari dei fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine, Neurodegenerazione molecolare, pubblicato [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuroscienze Numero 178
Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine
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Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

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