Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Dieses Protokoll stellt zwei Techniken vor, um die subzellulären Kompartimente von murinen Stäbchen-Photorezeptoren für die Proteinanalyse zu isolieren. Die erste Methode verwendet lebendes Netzhaut- und Zellulosefilterpapier, um die äußeren Segmente der Stäbchen zu trennen, während die zweite Methode lyophilisierte Netzhaut und Klebeband verwendet, um die inneren und äußeren Segmentschichten der Stäbchen abzuziehen.

Abstract

Stäbchen-Photorezeptoren sind hochpolarisierte sensorische Neuronen mit unterschiedlichen Kompartimenten. Mausstäbchen sind lang (~80 μm) und dünn (~2 μm) und sind seitlich in der äußersten Schicht der Netzhaut, der Photorezeptorschicht, verpackt, was zu einer Ausrichtung analoger subzellulärer Kompartimente führt. Traditionell wurde der tangentiale Schnitt der gefrorenen, flach montierten Netzhaut verwendet, um die Bewegung und Lokalisation von Proteinen in verschiedenen Stäbchenkompartimenten zu untersuchen. Die hohe Krümmung der stäbchendominanten Mausnetzhaut macht die tangentiale Sektionierung jedoch zu einer Herausforderung. Motiviert durch die Untersuchung des Proteintransports zwischen Kompartimenten haben wir zwei Peeling-Methoden entwickelt, die das äußere Stäbchensegment (ROS) und andere subzelluläre Kompartimente für westliche Blots zuverlässig isolieren. Unsere relativ schnellen und einfachen Techniken liefern angereicherte und subzellulär-spezifische Fraktionen, um die Verteilung und Umverteilung wichtiger Photorezeptorproteine in normalen Stäbchen quantitativ zu messen. Darüber hinaus können diese Isolationstechniken auch leicht angepasst werden, um die Proteinzusammensetzung anderer Zellschichten sowohl in gesunden als auch in degenerierenden Netzhäuten zu isolieren und quantitativ zu untersuchen.

Introduction

Stäbchen-Photorezeptorzellen, dicht gepackt in der äußersten Schicht der neuronalen Netzhaut, sind ein integraler Bestandteil des Dimmlichts. Um als treue Photonenzähler zu fungieren, verwenden Stäbchen einen G-Protein-basierten Signalweg, der als Phototransduktion bezeichnet wird, um schnelle, verstärkte und reproduzierbare Reaktionen auf den Einfang einzelner Photonen zu erzeugen. Diese Reaktion auf Licht löst letztendlich eine Änderung des Stroms an der Plasmamembran aus und wird anschließend dem Rest des visuellen Systems signalisiert1. Wie der Name schon sagt, hat jede Stäbchenzelle eine ausgeprägte stäbchenartige Form und weist eine stark polarisierte zelluläre Morphologie auf, die aus einem äußeren Segment (OS), einem inneren Segment (IS), einem Zellkörper (CB) und einem synaptischen Terminal (ST) besteht. Jedes subzelluläre Kompartiment hat spezifische Proteinmaschinen (membrangebunden und löslich), biomolekulare Merkmale und Proteinkomplexe, die eine entscheidende Rolle spielen, wie visuelle Phototransduktion, allgemeine Haushaltsführung und Proteinsynthese sowie synaptische Übertragung2,3.

Vor über 30 Jahren wurde erstmals die lichtabhängige reziproke Bewegung subzellulärer Proteine, insbesondere Transducin (weg vom OS) und Arrestin (in Richtung OS), beobachtet4,5,6,7. Schon früh wurde dieses beobachtete Phänomen mit Skepsis aufgenommen, was zum Teil auf die Anfälligkeit der Immunhistochemie für die Epitopmaskierung zurückzuführen ist8. In den frühen 2000er Jahren wurde die stimulusabhängige Proteintranslokation durch die Verwendung einer rigorosen und mühsamen physikalischen Schnitttechnik bestätigt9. Serielle tangentiale Abschnitte der gefrorenen flach montierten Nagetiernetzhaut, gefolgt von Immunoblotting, zeigten, dass Transducin9,10, Arrestin11,12 und Recoverin13 alle eine subzelluläre Umverteilung als Reaktion auf Licht erfahren. Es wird angenommen, dass die lichtgetriebene Translokation dieser wichtigen Signalproteine nicht nur die Empfindlichkeit der Phototransduktionskaskade reguliert9,14,15, sondern auch neuroprotektiv gegen Lichtschäden16,17,18 sein kann. Da der lichtgetriebene Proteintransport in Stäbchen für die Biologie und Physiologie der Stäbchenzellen von großer Bedeutung zu sein scheint, sind Techniken, die die Isolierung verschiedener subzellulärer Kompartimente zur Bestimmung der Proteinverteilung ermöglichen, wertvolle Forschungsinstrumente.

Derzeit gibt es einige Methoden, die darauf abzielen, die subzellulären Kompartimente des Stäbchens zu isolieren. Diese Methoden können jedoch langwierig und schwer zu reproduzieren sein oder eine beträchtliche Menge an Netzhautisolat erfordern. ROS-Präparate (Rod Outer Segment) über Dichtegradientenzentrifugation19 werden beispielsweise häufig verwendet, um das ROS vom retinalen Homogenat zu trennen. Diese Methode wird häufig für Western Blot verwendet, aber das Verfahren ist sehr zeitaufwendig und erfordert mindestens 8-12 murine Retinae20. Auf der anderen Seite wurde die serielle tangentiale Schnittführung von gefrorenen murinen und Rattennetzhaut erfolgreich bei der Isolierung von OS, IS, CB und ST9,11,13 implementiert. Diese Methode ist jedoch technisch anspruchsvoll, da die kleine und stark gekrümmte murine Netzhaut vollständig abgeflacht werden muss, um die Netzhautschichten vor dem tangentialen Schnitt auszurichten. Da es eine Fülle von Mausmodellen und transgenen Mäusen gibt, die Krankheiten des visuellen Systems rekapitulieren, ist die Schaffung einer Technik, die zuverlässig, schnell und einfach einzelne Stäbchenkompartimente trennt, vielversprechend, um die physiologischen Prozesse aufzudecken, die in jedem spezialisierten Kompartiment auftreten, und die Mechanismen, die visuellen Prozessen in Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen.

Um diese Untersuchungen zu erleichtern, beschreiben wir zwei Peeling-Methoden, die subzelluläre Kompartimente von Stäbchen leichter isolieren als aktuelle Protokolle. Die erste Peeling-Methode, die von einer Technik zur Freilegung fluoreszierend markierter bipolarer Zellen für die Aufzeichnung von Patch-Clampen21 angepasst wurde, verwendet Zellulosefilterpapier, um das ROS nacheinander aus einer lebenden, isolierten murinen Netzhaut zu entfernen (Abbildung 1). Die zweite Methode, angepasst an ein Verfahren, das die drei primären retinalen Zellschichten von einer Chick22- und frog23-Netzhaut isoliert, verwendet Klebeband, um das ROS- und Stäbcheninnensegment (RIS) von einer lyophilisierten Netzhaut zu entfernen (Abbildung 2). Beide Verfahren können in 1 h abgeschlossen werden und sind erheblich benutzerfreundlich. Wir bieten eine Validierung der Wirksamkeit dieser beiden Trennprotokolle für Western Blot, indem wir dunkel angepasste und lichtexponierte Netzhaut von C57BL/6J-Mäusen verwenden, um die lichtinduzierte Translokation von Stäbchentransducin (GNAT1) und Arrestin (ARR1) zu demonstrieren. Darüber hinaus liefern wir mit der Tape-Peeling-Methode zusätzliche Beweise dafür, dass unsere Technik verwendet werden kann, um Inkonsistenzen zwischen Proteinlokalisierungsdaten, die durch Immunzytochemie (ICC) und westliche Blots gewonnen wurden, zu untersuchen und zu beheben. Insbesondere zeigte unsere Technik, dass: 1) die Proteinkinase C-alpha (PKCα) Isoform nicht nur in bipolaren Zellen, sondern auch in murinem ROS und RIS vorhanden ist, wenn auch in niedrigen Konzentrationen24,25, und 2) Rhodopsinkinase (GRK1) ist überwiegend in der isolierten OS-Probe vorhanden. Diese Daten zeigen die Wirksamkeit unserer beiden Peeling-Techniken zur Trennung und Quantifizierung spezifischer Stäbchen- und Netzhautproteine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Experimente wurden gemäß den lokalen institutionellen Richtlinien des Ausschusses für Forschung Tierpflege der University of Southern California (USC) durchgeführt.

1. Lebendzell-Netzhautpeeling-Methode

  1. Zubereitung von Ames' Puffern, Peelingpapieren und Sezierschale
    1. Schneiden Sie das Zellulosefilterpapier (Grade 413) mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) in Rechtecke mit den Maßen ca. 5 mm x 2,5 mm. Lagern Sie die Stecklinge für die zukünftige Verwendung.
    2. Bereiten Sie 1 l HEPES-Puffer von Ames vor, indem Sie eine Flasche Ames' Medium, 2,38 g HEPES und 0,877 g NaCl kombinieren. Lösen Sie die Reagenzien in einer sterilen Glasflasche mit destilliertem Reinstwasser auf und stellen Sie die Osmolarität und den pH-Wert auf 280 mOsm bzw. 7,4 ein. Zum Sterilisieren filtern (Porengröße 0,2 μm), den Deckel mit Paraffinfolie verschließen und bei 4 °C lagern.
    3. Bereiten Sie 1 l Ames' Bicarbonatpuffer vor, indem Sie eine Flasche Ames' Medium und 1,9 g NaHCO3 kombinieren. Lösen Sie die Reagenzien in einer sterilen Glasflasche mit destilliertem Reinstwasser auf und stellen Sie die Osmolarität und den pH-Wert auf 280 mOsm bzw. 7,4 ein. Zum Sterilisieren filtern (Porengröße 0,2 μm), den Deckel mit Paraffinfolie verschließen und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Die BICARBONATPUFFER von Ames und Ames können im Voraus vorbereitet und 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.
    4. Erstellen Sie am Boden einer 35 x 10 mm großen Petrischale ein Gitter- oder Schachbrettmuster mit einem Skalpell (Klinge Nr. 11, 40 mm).
      HINWEIS: Der strukturierte Boden der Petrischale hält das isolierte, frei schwebende Auge während der Netzhautdissektion an Ort und Stelle.
  2. Dissektion der Netzhaut
    HINWEIS: Für dieses Verfahren sollte der Puffer gebracht und bei Raumtemperatur (RT) aufbewahrt werden. Erfrischen Sie den Bicarbonatpuffer von Ames während der Dissektion alle 15 Minuten mit frischem karbogeniertem Ames-Bicarbonatpuffer. Dadurch bleibt der notwendige physiologische pH-Wert erhalten.
    1. Etwa 15-20 Minuten vor der Dissektion den HEPES-Puffer von Ames in einer 100-ml-Labor- oder Medienflasche, die mit einem Schlauchverschlussadapter ausgestattet ist, mit Sauerstoff versorgen und den Ames-Bicarbonatpuffer mit 95% O2 und 5% CO2 in einer Gewebeinkubationskammer und in einer 100-ml-Labor- oder Medienflasche mit einem Schlauchverschlussadapter blasen.
    2. Euthanasieren Sie eine gleiche Anzahl beider Geschlechter von C57BL / 6J-Mäusen (2-3 Monate alt), entweder durch Isofluran-Inhalation oder Kohlendioxid (CO2), gefolgt von zervikaler Dislokation. Enukleieren Sie die Augen mit einer gebogenen Schere und legen Sie die Augen in die strukturierte 35 x 10 mm große Petrischale, die mit dem Bicarbonatpuffer von Ames gefüllt ist.
    3. Erstellen Sie eine Augenmuschel (Abbildung 1A), indem Sie ein Loch an der Hornhaut-Limbus-Verbindung mit einer 18-G-Nadel punktieren. Schneiden Sie entlang des Umfangs dieser Verbindung mit einer Mikrodissektions-Irisschere, um die Hornhaut jedes Auges zu entfernen. Trennen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette von jedem Auge und werfen Sie sie weg.
    4. Isolieren Sie die Netzhaut von der Augenmuschel, indem Sie den retinalen pigmentierten Epithelkomplex (RPE) vorsichtig von der neuronalen Netzhaut abziehen. Verwerfen Sie den RPE-Sklera-Aderhaut-Komplex. Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut während der Dissektion nicht beschädigt wird, indem Sie nur die Kanten behandeln.
    5. Isolierte Netzhaut wird mit einer breiten Transferpipette in den Deckel einer 60 x 15 mm großen Schale gebracht, die mit dem Bicarbonatpuffer von Ames gefüllt ist.
    6. Richten Sie die hemisphärenförmige Netzhaut konkav aus (die Photorezeptoren sind nach unten zum Boden der Schale gerichtet) und halbieren Sie jede Netzhaut (durch den Sehnerv) mit einer Irisschere oder einem Skalpell (Klinge Nr. 10, 40 mm). Schneiden Sie die gekrümmten Kanten jeder halben Netzhaut zu, um zwei Rechtecke zu bilden (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Durch die Minimierung der Krümmung jeder halbierten Netzhaut kann die Netzhaut in nachfolgenden Schälschritten besser abflachen und erzeugt eine genaue Schalung der ROS-Schicht (Rod Outer Segment).
    7. Lagern Sie die halbierte Netzhaut in der Gewebeinkubationskammer, die kontinuierlich mit 95% O2 und 5% CO2 gesprudelt ist.
      HINWEIS: Isolierte Netzhaut kann im karbogenierten Ames-Bicarbonatpuffer für ~ 24 h gehalten werden.
  3. Rod Outer Segment (ROS) Kollektion durch Filterpapierpeeling
    HINWEIS: Aktualisieren Sie den mit RT angereicherten HEPES-Puffer von Ames während des Peeling-Prozesses alle 15-20 Minuten, um den erforderlichen physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten.
    1. Übertragen Sie ein retinales Rechteck aus der Gewebekammer mit einer breiten Bohrungstransferpipette und einem 5 mm x 2,5 mm großen Stück Filterpapier in eine 35 x 10 mm große Petrischale, die mit Ames' HEPES-Puffer gefüllt ist, der mit 100% O2 aufgeblasen ist.
    2. Richten Sie die unterteilte Netzhaut konkav aus und stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren nach unten zum Boden der Schale zeigen. Greifen Sie die Seiten der halbierten Netzhaut leicht mit einer Pinzette und bewegen Sie sie auf das Filterpapier. Sobald die Netzhaut auf dem Filterpapier zentriert ist, bewegen Sie das Filterpapier nach oben, so dass die halbierte Netzhaut das Filterpapier berührt, um die ROS-zu-Filter-Papierhaftung zu erzeugen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptorschicht direkten Kontakt mit dem Filterpapier hat.
    3. Heben Sie das Filterpapier mit der angebrachten Netzhaut vorsichtig aus dem HEPES-Puffer von Ames heraus. Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) auf ein Papiertuch und tupfen Sie es 2-3 Mal zum Trocknen ab (Abbildung 1B).
    4. Fügen Sie einen Tropfen von Ames' HEPES auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier wieder zum Trocknen auf das Papiertuch, wie gerade beschrieben. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch zwei weitere Male.
    5. Legen Sie das Filterpapier mit der Netzhaut zurück in die Petrischale. Drücken Sie mit einer Pinzette alle Kanten der halbierten Netzhaut vorsichtig nach oben und weg vom Filterpapier auf allen Seiten.
    6. Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Filterpapier ab. Berühren Sie während des Peeling-Prozesses nur den extremen Umfang der Netzhaut, um die strukturelle Integrität der Netzhaut zu erhalten.
    7. Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit auf einem Papiertuch. Stellen Sie sicher, dass die Seite, die mit der Netzhaut in Berührung kam, das Papiertuch nicht berührt.
    8. Legen Sie das Filterpapier mit der partiellen ROS-Schicht in ein beschriftetes Rohr auf Eis (Abbildung 1B). Halten Sie die geschälte Netzhaut in Ames' HEPES-Puffer getaucht.
    9. Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für diese halbierte Netzhaut ca. 7-8 Mal, um die gesamte ROS-Schicht zu entfernen. Legen Sie nach jedem Peeling das Filterpapier in das gleiche Röhrchen, das das isolierte ROS aus einer halbierten Netzhaut enthält.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die halbierte Netzhaut nicht zu zerreißen, wenn Sie sie vom Filterpapier abziehen, da die Netzhaut während dieses Vorgangs dünner wird.
    10. Das Röhrchen mit allen Filterpapierschalen des isolierten ROS zur sofortigen Verwendung auf Eis legen oder direkt auf Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.
    11. Verwenden Sie eine Pinzette, um die übrig gebliebene geschälte Netzhaut (ohne ROS) in eine entsprechend gekennzeichnete Tube zu übertragen. Das Rohr zur sofortigen Verwendung auf Eis legen oder mit Trockeneis einfrieren und bei -80 °C lagern.
    12. Wiederholen Sie den Peeling-Vorgang für jede halbierte Netzhaut und kennzeichnen Sie jede Tube genau.

2. Lyophilisierte Netzhautpeeling-Methode

  1. Puffer, Schälmedium, Dissektionsschalenzubereitung und Lyophilisatoraufbau
    1. Bereiten Sie in einer 1-Liter-Vorratsflasche die Ringer-Lösung vor, indem Sie 500 ml destilliertes Reinstwasser hinzufügen. Die Reagenzien werden aufgelöst, um eine Endkonzentration von 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES und 0,02 mM EDTA zu erreichen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein, fügen Sie Reinstwasser hinzu, um das endgültige Volumen auf 1 l zu bringen, und stellen Sie die Osmolarität auf 313 mOsm ein.
    2. Vor dem Gebrauch die Ringerlösung mit einem sterilen Filter (Porengröße 0,2 μm) filtrieren, den Deckel mit Paraffinfolie verschließen und bei 4 °C lagern.
    3. Schneiden Sie das Zellstofffilterpapier mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) in Rechtecke mit den Maßen ca. 5 mm x 2,5 mm. Verwenden Sie einen Bleistift, um auf eine Seite des Filterpapiers zu schreiben, um ein einzigartiges Etikett zu erstellen.
    4. Erstellen Sie ein Gitter- oder Schachbrettmuster im Boden einer 35 x 10 mm großen Petrischale mit einem Skalpell (Klinge Nr. 11, 40 mm).
    5. Schalten Sie den Lyophilisator gemäß den Herstellerangaben ein.
    6. Flüssigen Stickstoff in einem Dewar-Kolben oder einem ähnlichen Isoliersaugkolben erwerben.
  2. Netzhautdissektion
    1. Schließen Sie die Netzhautdissektion wie in Abschnitt 1 des Protokolls beschrieben ab (Abbildung 1A). Verwenden Sie die Lösung von Cold Ringer anstelle des Puffers von Ames.
    2. Nach der Dissektion die halbierte, rechteckige Netzhaut in einer 35 x 10 mm großen Petrischale aufbewahren, die mit kalter Ringerlösung gefüllt ist, und auf Eis legen.
  3. Netzhautprobenvorbereitung für die Lyophilisation
    1. Legen Sie ein 5 x 2,5 mm großes Stück Filterpapier und geben Sie eine halbierte Netzhaut in die texturierte 35 x 10 mm Petrischale, die mit kaltem Ringerpuffer gefüllt ist. Verwenden Sie eine Transferpipette mit breiter Bohrung, um jede Netzhaut zwischen den Schalen zu bewegen.
    2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Netzhaut vorsichtig so umzudrehen, dass sie konkav ausgerichtet ist (die Photorezeptoren zeigen nach oben) und bewegen Sie sie, so dass sie auf dem Filterpapier aufliegt (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Photorezeptoren das Filterpapier nicht berühren (die retinale Ganglienzellschicht sollte in direktem Kontakt mit dem Filterpapier stehen) und das eindeutige Etikett sichtbar ist. Um das Netzhautisolat einfach und schnell zu identifizieren, wird empfohlen, dass sich das eindeutige Etikett auf der Unterseite des Filterpapiers befindet.
    3. Heben Sie das Filterpapier an den Rändern nach oben, so dass das halbierte Stück Netzhaut das Filterpapier berührt, und heben Sie das Filterpapier weiterhin aus der Lösung des Ringers heraus.
    4. Legen Sie die Unterseite des Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) auf ein Papiertuch und tupfen Sie vorsichtig 2-3 Mal ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen (Abbildung 2A).
    5. Nehmen Sie das Filterpapier mit einer Pinzette auf und fügen Sie einen Tropfen kalter Ringer auf die Seite des Filterpapiers mit der Netzhaut hinzu. Legen Sie das Filterpapier erneut auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang noch zwei weitere Male.
      HINWEIS: Diese abwechselnden Benetzungs- und Trocknungsschritte sorgen dafür, dass das Tissue fest mit dem Filterpapier verbunden ist.
    6. Lagern Sie jede geklebte Retina-/Filterpapierprobe in einer Petrischale, die mit kalten Ringern gefüllt ist, bis alle Proben eingefroren werden können. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle halbierten Netzhäute.
    7. Besorgen Sie sich eine saubere und trockene 35 x 10 mm Petrischale (nur unten) und ein Stück Aluminiumfolie, das in ein 3,5 x 3,5 Zoll großes Quadrat geschnitten ist.
    8. Heben Sie jede Probe mit einer Pinzette aus dem kalten Ringerpuffer heraus. Stellen Sie sicher, dass die Pinzette nur die Filterpapierränder berührt und die halbierte Netzhaut vermeidet.
    9. Legen Sie die Unterseite jedes Filterpapiers (die Seite ohne Netzhaut) auf ein Papiertuch und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit.
    10. Geben Sie einen Tropfen kaltes 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) auf die Seite des Filterpapiers, wo die Netzhaut haftet. Tupfen Sie das Filterpapier auf das Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Feuchtigkeit aus dem Filterpapier vor dem Einfrieren ausreichend entfernt ist.
    11. Legen Sie alle Filterpapierstücke in die 35 x 10 mm große Petrischale. Verwenden Sie ein fusselfreies Seidenpapier, um überschüssige Flüssigkeit, die das Filterpapier umgibt, abzuleiten.
      HINWEIS: Überfüllen Sie die Petrischale nicht mit Proben. Wenn mehr als vier Mausaugen verwendet werden, sollten Sie eine größere Petrischale oder mehrere kleinere Petrischalen verwenden, um die Netzhaut- / Filterpapierproben zu halten.
    12. Wickeln Sie die gesamte Schale mit Alufolie ein. Stellen Sie sicher, dass die Kanten der Aluminiumfolie gesichert und sanft in den Boden der Petrischale gedrückt werden. Eine Handvoll 0,1-0,2 mm große Löcher werden in den Deckel der Aluminiumfolie eingraviert (Abbildung 2A).
    13. Mit einer Metallzange die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale allmählich in den flüssigen Stickstoff absenken. Bewahren Sie die Proben im flüssigen Stickstoff (<10 min) auf, bis sie zur Lyophilisation bereit sind.
  4. Gefriertrocknung
    1. Legen Sie die mit Aluminiumfolie überzogene Petrischale in einen Gefriertrocknungskolben und befestigen Sie sie gemäß dem Protokoll des Herstellers an der Lyophilisatormaschine. Lyophilisieren Sie die Netzhaut für 30 min.
    2. Lösen Sie den Kolben vom Lyophilisator und schalten Sie die Maschine laut Hersteller aus.
    3. Entfernen Sie die Aluminiumfolie und arbeiten Sie entweder noch am selben Tag mit den gefriergetrockneten Proben oder lagern Sie sie in ordnungsgemäß beschrifteten 1-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie diese Röhrchen in einen Behälter (z. B. ein 50 ml konisches Rohr), der mit einem wasserfreien Trockenmittel gefüllt ist, und lagern Sie die Proben bei -80 ° C.
  5. Stab-Außen- und Innensegmentsammlung durch Klebeband-Peeling.
    1. Schneiden Sie Streifen aus klarem Klebeband (1-2 cm) und lagern Sie die Streifen am Rand des Bandspenders / Labortischs / etc. für eine schnelle Verwendung.
    2. Bewegen Sie eine Netzhautprobe zum Schälen auf den Deckel einer 60 x 15 mm großen Petrischale aus Kunststoff. Achten Sie darauf, nur die äußersten Kanten des Filterpapiers zu greifen und die Netzhaut nicht zu berühren.
    3. Schneiden Sie mit einer Irisschere mit stumpfer Spitze (oder einem gleichwertigen Scherentyp) ein kleines rechteckiges Stück Klebeband auf die ungefähre Größe des Gewebes (1,5 x 2,5 mm).
    4. Legen Sie vorsichtig ein kleines Stück Klebeband auf die lyophilisierte Netzhaut (Abbildung 2B) und üben Sie leichten Druck mit der Pinzette aus, um sicherzustellen, dass sie sich mit der Photorezeptorschicht (der orange / rosa getönten obersten Schicht) verbindet.
    5. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab. Sowohl das äußere Segment (ROS) als auch das innere Segment des Stabs (RIS) werden auf das Band geklebt (Abbildung 2B).
    6. Stellen Sie sicher, dass sich an der gebrochenen Oberfläche ein dünner weißer Film befindet. Dies ist RIS.To den RIS trennen, ein weiteres Stück Klebeband platzieren und das Band auf die gebrochene Oberfläche drücken (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Es kann mehr als ein Stück Klebeband benötigen, um die gesamte dünne weiße Schicht zu entfernen.
    7. Legen Sie das Stück Klebeband nur mit der orange/rosa Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift +ROS.
    8. Legen Sie das Band oder die Klebebänder mit der dünnen weißen Schicht in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit der Aufschrift +RIS.
      HINWEIS: Das Trennen der lyophilisierten Netzhaut mit Klebeband erfordert Übung. Die Menge an Druck, die auf das Band ausgeübt wird, beeinflusst, wie die lyophilisierte Probe fraktioniert wird. Wenn zu viel Druck auf das Band über die Probe ausgeübt wird, löst sich die gesamte lyophilisierte Netzhaut vom Filterpapier ab und haftet am Band. Wenn zu wenig Druck auf das Band aufgebracht wird, haftet die orange/rosa oberste Schicht (+ROS) nicht am Band.
    9. Sammeln Sie das übrig gebliebene Netzhautgewebe (ohne ROS- und RIS-Schichten, -OIS), das sich auf dem Filterpapier befindet, indem Sie die dicke, weiße Schicht mit Klebeband vom Filterpapier abziehen. Legen Sie das Isolat in ein Röhrchen mit der Bezeichnung -OIS.
    10. Wiederholen Sie diese Schritte für jede halbierte Netzhautprobe.
    11. Lagern Sie die isolierten Schichten der lyophilisierten Netzhaut entweder bei Raumtemperatur, wenn Sie am selben Tag eine Proteinquantifizierung, Gelelektrophorese und Proteinimmunoblots durchführen, oder lagern Sie sie in einem Behälter (z. B. 50 ml konischem Röhrchen), der mit wasserfreiem Trockenmittel bei -80 ° C für die spätere Verwendung gefüllt ist.

3. Western Blot Probenvorbereitung für Peeling-Isolierungen

  1. RIPA-Lysepuffer vorbereiten
    1. In einer 100-ml-Lagerflasche fügen Sie Reagenzien hinzu, um eine Endkonzentration von 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS und 1 mM EDTA zu erhalten. Fügen Sie 100 ml deionisiertes Reinstwasser hinzu und mischen Sie es gründlich.
      HINWEIS: RIPA Lysepuffer kann bei 2-8 °C für 2-3 Wochen gelagert werden. Für längere Lagerung aliquotieren und im -20 °C Gefrierschrank lagern.
    2. Am Tag des Experiments einen Proteasehemmer-Cocktail (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotinin und 1:1000 Leupeptin) in den RIPA-Lysepuffer geben und auf Eis halten.
  2. Filterpapier abblätternde Lysatzubereitung für Western Blot
    1. Stellen Sie sicher, dass Röhrchen, die die Filterpapierschalen und übrig gebliebene geschälte Netzhaut enthalten, auf Eis gehalten werden (für das Experiment am selben Tag) oder aus dem Gefrierlager von -80 ° C entfernt und auf Eis gelegt werden.
    2. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit vom Boden der Mikrozentrifugenröhrchen, die die Filterpapierschalen enthalten. Schnell in einer Mini-Zentrifuge für 2-4 s drehen und verbleibende Flüssigkeit entsorgen.
    3. Pipette 45-55 μL kalter RIPA-Puffer in Röhrchen, die das Filterpapierisolat enthalten.
    4. Homogenisieren Sie jede Probe mit einem sauberen, autoklavierten Stößelmischer für 1 min. Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier mit dem Stößelmischer in Kontakt bleibt. Bewahren Sie das Filterpapier an der Seite jedes Rohres auf und nicht auf der Unterseite auf.
    5. Bewegen Sie mit einer Pinzette die Filterpapiere an die Seite jedes Rohres und drehen Sie sie in der Minizentrifuge für 2-4 s. Dadurch wird der RIPA-Puffer aus dem Filterpapier entfernt.
    6. Entfernen Sie getrocknetes Filterpapier und wiederholen Sie dies bei Bedarf für alle Filterpapiere in jedem Röhrchen.
    7. Übertragen Sie das Homogenat auf ein neues Röhrchen und kennzeichnen Sie es entsprechend.
      HINWEIS: Dies ist der zeitaufwendigste Schritt, und wenn er nicht ordnungsgemäß abgeschlossen wird, wird ein Großteil der Probe vom Filterpapier absorbiert.
    8. Pipette 60-80 μL kalten RIPA-Puffer in die einzelnen Röhrchen mit den übrig gebliebenen geschälten Netzhäuten.
    9. Homogenisieren Sie jede Probe mit einem sauberen, autoklavierten Stößelmischer für 1 min.
  3. Tape Peeling Lysat-Zubereitung für Western Blot
    1. Die lyophilisierten RT-Proben oder die -80 °C-Proben auf Eis legen.
    2. Pipette 50-70 μL kalten RIPA-Puffer in jedes Röhrchen, das +ROS- und +RIS-Klebebandschalen enthält.
    3. Pipette 60-80 μL kalter Lysepuffer in die -OIS-Röhrchen, die die verbleibende lyophilisierte Netzhaut enthalten, wobei ROS und RIS entfernt werden.
    4. Homogenisieren Sie jede Probe mit einem sauberen Stößelmischer für 1 min. Stellen Sie sicher, dass das Band in den einzelnen Röhrchen in Kontakt mit dem Stößelmischer und dem Lysepuffer bleibt.
    5. Bewegen Sie das Klebeband mit einer sterilisierten Pinzette an die Seite der Röhrchen und drehen Sie es mit einer Minizentrifuge für 2-4 s. Dadurch wird die Flüssigkeit vom Band entfernt. Entfernen Sie das getrocknete Klebeband aus den Röhrchen.
      HINWEIS: An dieser Stelle können Sie zwei halbe retinale Isolate aus derselben Netzhaut kombinieren, um entweder die Methode "Filterpapierablösung" oder "Bandpeeling" durchzuführen, um sicherzustellen, dass Sie genügend Volumen haben, um einen Bicchinchinsäure-Assay (BCA) durchzuführen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Die vorliegenden Strategien wurden entwickelt, um relativ schnelle und einfache Methoden zur Isolierung und Analyse von Proteinen unter spezifischen subzellulären Stäbchenkompartimenten für die Western-Blot-Analyse bereitzustellen. Wir wandten zwei sequentielle Peeling-Techniken (Abbildung 1 und Abbildung 2) an, gefolgt von Immunoblotting, um zu zeigen, dass diese Methoden zuverlässig verwendet werden können, um die bekannte Verteilung von Stäbchentransducin (GNAT1) und Arrestin (ARR1) sowohl bei dunkel- als auch bei lichtangepassten Tieren nachzuweisen. Um die Wirksamkeit unserer beiden Protokolle bei der präzisen Isolierung von subzellulären Stäbchenkompartimenten ohne Kontamination durch andere Zellschichten zu validieren, wurden Immunoblots mit Antikörpern für Cytochrom C (Cyt C), Aktin und Gß5S / Gß5L26 untersucht. Eine Liste der verwendeten Antikörper und Verdünnungen ist in Tabelle 1 dargestellt. Cyt C und Aktin zeigten ROS-Reinheit an, da sie in der proximalen Netzhaut reichlich Proteine sind, aber im ROS fehlen. Gß5L, eine Komponente des GTPase aktivierenden Proteins (GAP) für GNAT127, ist im ROS und RIS vorhanden und diente als Kontrolle für diese Isolierungen. Gß5S, die kürzere Spleißisoform, die in ROS oder RIS, aber in allen anderen Stabkompartimenten vorkommt, diente als Kontrolle für Nicht-ROS/RIS-isolierte subzelluläre Kompartimente.

Zunächst wurde die Wirksamkeit unserer sequenziellen Lebendzell-Netzhautpeeling-Methode durch Analyse der Verteilung von GNAT1 und ARR1 in Stäbchen von dunkel- und lichtangepassten Mäusen bewertet (Abbildung 3). Die Filterpapiere, die das ROS (+ROS) enthielten, wurden aus insgesamt einer ganzen Netzhaut gepoolt, und das entsprechende Restgewebe (-ROS) wurde ebenfalls kombiniert. Die Signale der angegebenen Proteine wurden anschließend zwischen den +ROS-Proben und den -ROS-Proben verglichen, und eine ganze isolierte Netzhaut diente als Eingangskontrolle. Die Proteinkonzentration und das Homogenisierungsvolumen für diese Proben sind in Tabelle 2 dargestellt. Die in Abbildung 3A dargestellten Ergebnisse zeigen, dass bei dunkel angepassten Tieren die Verteilung von GNAT1 und ARR128 eng mit ihren bekannten Dunkelzustandsverteilungen übereinstimmte, wobei das GNAT1-Signal in der +ROS-Isolierung sichtbar am stärksten war, während das ARR1-Signal in der -ROS-Isolierung robuster war. Dementsprechend war in den lichtexponierten Netzhäuten das GNAT1-Signal in der +ROS-Isolierung merklich reduziert und hatte ein erhöhtes Signal in der -ROS-Probe, während die lichtinduzierte ARR1-Translokation in +ROS- und -ROS-Proben visualisiert werden konnte. Die Ergebnisse von sechs verschiedenen Experimenten wurden quantifiziert, und statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Dunkel-/Lichtbedingungen für GNAT1 und ARR1 wurden in den +ROS- und -ROS-Proben gefunden (Abbildung 3B). Diese Ergebnisse stimmen mit der bisher bekannten Hell-Dunkel-Bewegung des Proteins innerhalb der subzellulären Kompartimente der Stäbchen überein und deuten stark darauf hin, dass diese Technik angereicherte +ROS-Fraktionen isolieren kann.

Um unsere Lebendzell-Peeling-Methode weiter zu validieren, untersuchten wir bekannte ROS-Reinheitsmarkerverteilungen sowohl in +ROS- als auch in -ROS-Proben. Sowohl in dunkel- als auch in lichtangepassten Proben werden die Gß5S-, Cyt C- und Aktinsignale aus den +ROS-Proben ausgeschlossen (Abbildung 3A), was eine Abwesenheit von Kontamination durch andere Zellschichten zeigt. Zusätzlich war das Gß5L-Signal in den +ROS-Samples deutlich sichtbar (Abbildung 3A). Darüber hinaus bestätigten Aktin- und Gß5L-Signale nicht nur die Reinheit der +ROS- und -ROS-Fraktionen, sondern fungierten auch als Kontrollen für die Normalisierung, wobei die Signale der +ROS-Proben gegen Gß5L- und -ROS-Proben gegen Aktin normalisiert wurden. Wie in Abbildung 3A dargestellt, wird empfohlen, dass die Lebendzell-Peeling-Isolate zusammen mit einer Belastungskontrolle, insbesondere einem ganzen retinalen Homogenat, für eine optimale Immunblotting-Normalisierung und -Analyse geladen werden. Zusammen bestätigen diese Daten, dass unsere Lebendzell-Peeling-Methode einen schnellen und reproduzierbaren Ansatz zur Isolierung der ROS-subzellulären Schicht vom Rest des Stäbchens und der Netzhaut für die Proteinanalyse bieten kann.

Als nächstes haben wir unsere lyophilisierte Peeling-Technik evaluiert, um zu überprüfen, ob diese Methode die ROS- und RIS-Kompartimente reproduzierbar isolieren kann. Vor dem Immunoblotting haben wir die Oberflächen intakter und geschälter lyophilisierter Mausnetzhaut mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) abgebildet, um zu analysieren, welche photorezeptorische subzelluläre Schicht das Bandpeeling ergab (Abbildung 4). Vor dem Ablösen mit Klebeband stimmte die Oberfläche der intakten lyophilisierten Netzhaut (orange/rosafarbene Schicht) eng mit dem Profil des charakteristischen zylindrischen ROS überein (Abbildung 4A). Nach der anfänglichen Bandablösung schienen ROS und RIS vollständig entfernt zu sein, wie die gleichmäßige Kernschicht auf der Oberfläche der übrig gebliebenen geschälten lyophilisierten Netzhaut zeigt (Abbildung 4C). Nachfolgende Bandpeelings entfernten die RIS (dünne weiße Schicht, Abbildung 4B) von der freien Oberfläche der geschälten Schicht, ein Prozess, der wahrscheinlich durch das schmale und zerbrechliche verbindende Cilium unterstützt wird, das die inneren und äußeren Segmente verbindet. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Stäbchen-subzelluläre Schichten aus lyophilisiertem Netzhautgewebe mit Klebeband spezifisch fraktioniert werden können.

Nachdem die Wirksamkeit dieser Methode visuell validiert wurde, wurden dunkel- und lichtangepasste geschälte Netzhaut einem Immunoblotting unterzogen, wobei derselbe Ansatz verwendet wurde, bei dem Proteinmarker für verschiedene Kompartimente verwendet wurden, wie für unsere Lebendzellpeeling-Methode beschrieben (Abbildung 3). Die Proteinkonzentration und das Homogenisierungsvolumen für die ROS-Isolierung (+ROS), die RIS-Isolierung (+RIS) und die verbleibenden Netzhautschichten (-OIS) sind in Tabelle 2 dargestellt. Wie erwartet, gab es eine deutliche lichtinduzierte Verschiebung für GNAT1 vom ROS zum RIS sowie ARR1 vom RIS zum ROS (Abbildung 5A). GNAT1 war in der +ROS-Probe im Dunkeln und der +RIS-Probe im Licht am häufigsten, während das ARR1-Signal umgekehrt war (Abbildung 5A). Als nächstes normalisierten und quantifizierten wir die translozierenden Proteinsignale aus +ROS-, +RIS- und -OIS-Isolationen (Abbildung 5B), wobei wir die gleichen Kontrollen und den gleichen Ansatz wie die Live-Peeling-Methodik verwendeten. Wir kombinierten auch +RIS- und -OIS-Proben (Abbildung 5C) für einen direkteren Vergleich mit unserer Lebendzellfilter-Papierschälmethode (Abbildung 3B). Beide Grafiken zeigen die gut etablierte und charakteristische lichtinduzierte Translokation von GNAT1 und ARR1. Basierend auf diesen Beobachtungen scheint das Bandpeelingpräparat angereicherte ROS- und RIS-Fraktionen zu liefern, wie die Proteinzusammensetzung von ARR1 und GNAT1 in diesen Isolationen zeigt.

Als nächstes wurde die Reinheit einzelner subzellulärer Isolierungen bewertet. Ähnlich wie in Abbildung 3A gezeigten Ergebnissen fehlten den +ROS-Proben Signale für Aktin, Cytochrom C und Gß5S, während sie ein starkes Gß5L-Signal zeigten (Abbildung 5). Dieser Befund zeigt einen Mangel an Kontamination durch andere subzelluläre Kompartimente in unserer +ROS-Probenvorbereitung. Der Proteingehalt der nachfolgenden subzellulären Schicht des Stäbchens, die +RIS-Isolation, wurde dann bewertet. Wir fanden heraus, dass die +RIS-Probe für Cyt C, Gß5L und Aktin positiv war. Dieser Befund steht im Einklang mit der bekannten Zusammensetzung von RIS, das reich an Mitochondrien und Zytoskelettelementen ist. Die letzte Schicht, das -OIS-Isolat, wies Proteinverteilungen auf, die mit den in Abbildung 3A gezeigten -ROS-Proben übereinstimmten.

Um den Nutzen unserer Klebeband-Peeling-Methode bei der Untersuchung der Proteinzusammensetzungen subzellulärer Stäbchenkompartimente weiter zu bewerten, untersuchten wir speziell die Immunreaktivität von Rhodopsinkinase (GRK1) und Proteinkinase C-alpha (PKCα) in unseren +ROS-, +RIS- und -OIS-Proben. Verschiedene experimentelle Methoden, wie die Immunzytochemie (ICC) und Western Blot, liefern oft widersprüchliche Ergebnisse über die genaue Lokalisation dieser Proteine in Stäbchen und der Netzhaut. Es wird angenommen, dass GRK1 zum Beispiel in Stäbchen- und Kegel-OS relativ häufig vorkommt, um die Phosphorylierung von lichtaktivierten Opsinen zu vermitteln29. Die Immunmarkierung von Netzhautschnitten hat jedoch die Lokalisation von GRK1 entweder spezifisch im OS30,31 oder in der gesamten Photorezeptorschicht32 gezeigt. PKCα hingegen ist ein Protein, das häufig für ICC verwendet wird, um bipolare Zellen zu markieren. Obwohl es keine eindeutigen Hinweise auf eine stäbchenspezifische PKCα-Immunmarkierung in Netzhautschnitten gibt25, gibt es beträchtliche biochemische24,25- und funktionelle33,34,35-Beweise, die das Vorhandensein und die phosphorylierende Rolle von PKCα im ROS unterstützen. Unter Verwendung unserer Technik fanden wir heraus, dass die GRK1-Immunreaktivität in den +ROS-Proben in lichtexponierten Netzhaut am intensivsten war und in -OIS-Proben fehlte (Abbildung 6A). Umgekehrt zeigen wir, dass die +ROS- und +RIS-Samples ein schwaches Signal für PKCα zeigten. Wie in Abbildung 6B zu sehen ist, wird PKCα im ROS oder RIS häufig nicht durch Immunfluoreszenzfärbung von Netzhautabschnitten nachgewiesen. PKCα wurde jedoch durch Western Blot immunodetektiert (Abbildung 6A,D). Da die +ROS- und +RIS-Isolierungen ein starkes Gß5L-Signal und eine Abwesenheit von Gß5S anzeigen (Abbildung 6A), sind wir zuversichtlich, dass das schwache PKCα-Signal sowohl in ROS- als auch in RIS-Proben echt ist und nicht auf Kontamination durch andere Schichten zurückzuführen ist. Um die einzelnen Signale in +ROS-, +RIS- und -OIS-Isolierungen zu visualisieren, wurden GRK1- und PKCα-Blots kombiniert und für den Vergleich dargestellt (Abbildung 6C).

Schließlich zeigt ein Beispiel für eine suboptimale Schälsitzung (Abbildung 6D), wie Kontaminationen aus verschiedenen Unterschichten die Ergebnisse verzerren können, was die Bedeutung der Dateninterpretation und der Einbeziehung der geeigneten Kontrollantikörper für das Screening auf experimentelle Schälfehler weiter veranschaulicht. In diesem Beispiel für die Tape-Peeling-Isolierung ist ein schwaches Gß5S-Signal in der RIS-Isolationsspur zu erkennen, das auf eine leichte Kontamination durch die -OIS-Probe hinweist. Abhängig vom Ziel des Benutzers ist diese leichte Kontamination möglicherweise kein Problem. In diesem Fall untersuchten wir jedoch das PKCα-Signal in +ROS- und +RIS-Proben, und das PKCα-Signal ist in der RIS-Spur im Vergleich zur ROS-Spur etwas höher (Abbildung 6A, D), möglicherweise aufgrund einer Kontamination. Daher sollte während des Peeling-Prozesses darauf geachtet werden, eine genaue Isolierung zu gewährleisten und die Kontamination zu minimieren. Trotz minimaler Kontamination aufgrund individueller Fehler liefern diese Daten überzeugende Beweise dafür, dass die Bandpeeling-Methodik genaue sequentielle Isolierungen von Stäbchen-Photorezeptorschichten für die Proteinanalyse liefern kann.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Live-Cell-Peeling-Schritte . (A) Das Diagramm zeigt die wichtigsten Schritte zum Sezieren und Hemisektieren des isolierten Auges. (B) Photorezeptor-Außensegmente werden inkrementell durch sequentielles Abziehen unter Verwendung von Filterpapier entfernt. Zunächst werden Netzhäute so ausgerichtet, dass die Photorezeptorschicht in Kontakt mit dem Filterpapier steht. Als nächstes wird das Filterpapier durch Sprühen auf ein Papiertuch getrocknet, und die Netzhaut wird vom Filterpapier abgezogen. Dieses geschälte Isolat wird in einem auf Eis gehaltenen Schlauch gesammelt. Dieser Vorgang wird sieben- bis achtmal wiederholt, um das äußere Segment des Stabes vollständig zu entfernen (+ROS). Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Peeling-Prozess der lyophilisierten Netzhaut. (A) Flussdiagramm der Probenvorbereitung für die lyophilisierte Netzhaut. Netzhäute sind so ausgerichtet, dass die retinale Ganglienzellschicht in Kontakt mit dem Filterpapier steht und die Photorezeptoren nach oben zeigen. (B) Nach der Lyophilisation wird die gefriergetrocknete Netzhaut an ein Stück Klebeband geklebt, nachdem auf der Oberseite des Bandes leichter Druck ausgeübt wurde. Das Band wird abgeschält, wodurch die Schichten des äußeren Stabsegments (ROS) und des inneren Stabsegments (RIS) entfernt werden. Die RIS-Schicht wird durch weitere Bandpeelings entfernt, bis die ROS-Schicht sichtbar ist (orange/rosa Schicht). Diese Figur wurde mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Expression von GNAT1 und ARR1 in isolierten Stäbchen-Photorezeptoren nach sequentiellem Filterpapier-Peeling. (A) Immunoblots von +ROS- und -ROS-Proben (ROS-deplised), die mit der Filterpapierschälmethode aus dunkel- und lichtangepassten Netzhäuten gewonnen wurden. Blots wurden mit Antikörpern für lichtgetriggerte Proteine (Transducin (GNAT1) und Arrestin (ARR1)) und Qualitätskontrollmarker (GTPase aktivierendes Protein (Gß5L/S), Cytochrom C (Cyt C) und Aktin) untersucht. Zwei halbierte Netzhaut wurden für diese repräsentativen Blots kombiniert. (B) Quantifizierte Signale von GNAT1 und ARR1 von dunkel- und lichtangepassten Netzhäuten. Es gibt eine reziproke lichtgesteuerte Bewegung von GNAT1 und ARR von +ROS- und -ROS-Isolaten. Geigendiagramme stellen den normalisierten Ausdruck von +ROS- und -ROS-Beispielen dar. Diese Zahl wurde von Rose et al.36 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen lyophilisierter Netzhaut. (A) Oberfläche der lyophilisierten Netzhaut vor dem Bandpeeling (Photorezeptorseite nach oben). (B) Die innere Segmentschicht nach dem Abziehen des Bandes. (C) Die Zellkörperschicht nach dem Tape Peeling zeigt ein einheitliches nukleares Erscheinungsbild. Diese Figur wurde von Rose et al.36 modifiziert und mit BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Validierung der Bandpeeling-Methode zur Isolierung von ROS und RIS von lyophilisierter Netzhaut. (A) Westliche Kleckse von +ROS-, +RIS- und -OIS-PROBEN (ROS/RIS-erschöpft), die mit der Bandpeeling-Methode gesammelt wurden. Immunoblots wurden mit Transducin (GNAT1), Arrestin (ARR1), GTPase aktivierendem Protein (Gß5L/S), Cytochrom C (Cyt C) und Aktin-Antikörpern untersucht. Proben wurden aus dunkel- und lichtangepassten Netzhaut gewonnen und halbierte Netzhautisolate (+ROS, +RIS, -OIS) wurden für konzentrierteres Material kombiniert. (B) Quantifizierte Signale von GNAT1 und ARR1 werden als Geigendiagramme für die verschiedenen isolierten Netzhautschichten dargestellt, die aus dunkel- und lichtangepassten Netzhäuten gewonnen wurden. (C) Normalisierte Expressionsniveaus von +RIS und -OIS wurden kombiniert und aufgetragen, um Band- und Filterpapierschälmethoden zu vergleichen. Dunkel- und lichtangepasste Proben zeigten die bekannte Bewegung wichtiger Phototransduktionsproteine. Diese Zahl wurde von Rose et al.36 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Bandpeeling von lyophilisierter Netzhaut zur Untersuchung der subzellulären Lokalisation von GRK1 und PKCα in Photorezeptoren . (A) Ein repräsentativer westlicher Klecks von geschälten Proben von lichtangepassten C57BL/6J-Mäusen, der die relativen Spiegel von Rhodopsinkinase (GRK1), Proteinkinase C-alpha (PKCα), GTPase-aktivierendem Protein (Gß5L/S) und Aktin zeigt. (B) Gefrorener Netzhautschnitt, hergestellt aus lichtexponierten Mäusen, die mit PKCα-Antikörpern inkubiert wurden (grün, 1:100). RPE, retinales pigmentiertes Epithel; Betriebssystem, äußeres Segment; IS, inneres Segment; CB, Zellkörper; ST, synaptisches Terminal. Skalenbalken = 10 μm. (C) Normalisierte PKCα- und GRK1-Ausdrucksebenen für +ROS-, +RIS-, -OIS-Samples werden als Geigendiagramme dargestellt. (D) Suboptimales Bandpeeling könnte möglicherweise leicht kontaminierte Proben ergeben. Das rote Quadrat hebt die +RIS-Probe hervor, die mit einer -OIS-Probe kontaminiert ist, und erzeugt sowohl Gß5L/S-Bänder als auch ein höheres PKCα-Signal. Zwei halbierte Netzhaut wurden für alle Flecken kombiniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ziel Antikörper Verdünnung Hersteller
Arrestin Kaninchen Anti-ARR1 1:1000 Chen, et al., 2006.
Transducin Maus Anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Aktin Kaninchen Anti-ß Actin 1:5000 GeneTex Inc.
Cytochrom C Kaninchen-Anti-Cytochrom C 1:500 Santa Cruz, SC-7159
GAP (Gß5L/S) Kaninchen Anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et al., 1996.
Proteinkinase C alpha (PKC) Kaninchen Anti-PKC (#2050) 1:1000 Zellsignalisierungstechnologie.
Rhodopsinkinase (GRK1) Maus Anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004

Tabelle 1: Liste der Antikörper, die für die Western-Blot-Validierung von Trenntechniken verwendet werden.

Filterpapier Netzhautisolierung
+ROS* -ROS* Ganze Netzhaut
Durchschnittliche Proteinkonzentration (μg/ml) 700 1,500 1,500
RIPA-Puffervolumen (μL) 90 150 200
Bandpeeling Netzhautisolierung
+ROS* +RIS* -ROS* Ganze Netzhaut
Durchschnittliche Proteinkonzentration (μg/ml) 520 440 1,200 1,600
RIPA-Puffervolumen (μL) 100 100 125 150
* Kombinierte zwei halbierte Netzhautisolationen.

Tabelle 2: Proteinkonzentration in retinalen Isolationshomogenaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Viele Netzhauterkrankungen betreffen Stäbchen-Photorezeptorzellen, was zum Tod des Stäbchens und letztendlich zum vollständigen Verlust des Sehvermögens führt37. Ein bedeutender Teil der genetischen und mechanistischen Ursprünge der menschlichen Netzhautdegeneration wurde im Laufe der Jahre in zahlreichen Mausmodellen erfolgreich rekapituliert. In diesem Zusammenhang würde die Fähigkeit, einzelne subzelluläre Stäbchenkompartimente einfach und selektiv von der kleinen Mausnetzhaut zu trennen, unser Verständnis der lokalisierten biochemischen und molekularen Grundlagen von Netzhauterkrankungen erheblich verbessern. Darüber hinaus ermöglicht die Schichtcharakteristik der neuronalen Netzhaut, kombiniert mit der einzigartigen, stark polarisierten Anordnung der Stäbchen-Photorezeptoren, die Isolierung von Stäbchenkompartimenten durch selektives Peeling. Dieses Manuskript beschreibt zwei Protokolle, die verwendet werden, um einzelne subzelluläre Kompartimente von Stäbchen-Photorezeptorzellen für das Immunoblotting zu isolieren. Beide Methoden sind nicht nur im Vergleich zur bestehenden Methode der tangentialen Schnittführung wesentlich schneller und technisch weniger anspruchsvoll9, sondern erfordern auch eine wesentlich kleinere Stichprobengröße als die übliche biochemische Isolierung des ROS unter Verwendung von Dichtegradienten19. Solche ROS-Gradientenreinigungstechniken erfordern 8-10 murine Netzhaut, um zuverlässig reichlich ROS wiederherzustellen, während die hier vorgestellten Protokolle für einzelne Netzhaut geeignet sind.

Trotz der allgemeinen Einfachheit der vorgeschlagenen Techniken besteht eine der größten Herausforderungen, die beiden Protokollen gemeinsam sind, darin, die gekrümmte Netzhaut auf das Filterpapier abzuflachen, das für die ordnungsgemäße Isolierung der verschiedenen subzellulären Kompartimente erforderlich ist. Die isolierte Netzhaut neigt dazu, sich zusammenzurollen und eine muschelartige Form anzunehmen. Wenn die Netzhaut gefaltete Kanten hat, wenn sie auf das Filterpapier gelegt wird (Photorezeptorseite entweder nach oben oder unten), kann dies die Ausbeute der gewünschten isolierten Stabschichten verringern. Noch wichtiger ist, dass, wenn die Netzhaut nicht richtig abgeflacht ist, eine Schichtfehlausrichtung und Kontamination durch andere subzelluläre Kompartimente und Netzhautzellen ein wahrscheinliches Ergebnis ist (Abbildung 6D). Um die Krümmung des halbierten retinalen Rechtecks zu begrenzen und die unvollkommene Ausrichtung der Stäbchen- und Netzhautschichten zu korrigieren, kann das retinale Rechteck in zwei Hälften geschnitten werden, um zwei retinale Quadrate zu erzeugen. Durch das Schneiden der neuronalen Netzhaut in kleinere Stücke wird die natürliche Krümmung der Netzhaut reduziert, und das Gewebe liegt eher flach auf dem Filterpapier.

Zu erkennen, wann die verschiedenen Rutenfächer physisch getrennt wurden, kann für jemanden, der mit diesen Techniken unerfahren ist, schwierig sein. Wir empfehlen, dass der Benutzer vor Beginn eines biologisch signifikanten Experiments den Prozess mit Probennetzhaut für ein oder zwei Stunden durchlaufen sollte. Die Praxis sollte zu einer wesentlichen Verbesserung der Fähigkeiten und Fähigkeiten des Bedieners in den Methoden führen. Wenn Filterpapier verwendet wird, um das ROS von einer lebenden Netzhaut abzuziehen, zeigen keine offensichtlichen visuellen Hinweise an, wann die ROS-Schicht isoliert wurde. Während die Netzhaut dünner und zerbrechlicher wird, muss der Benutzer die Anzahl der Peelings selbst überwachen und validieren, um das ROS genau zu isolieren. Darüber hinaus verändert die Verwendung von Filterpapier mit unterschiedlichen Faserdicken und Grobheit die ROS-Schälzeit. Filterpapier mit dickeren Fasern (z. B. VWR Grade 413) isoliert die Netzhautschichten schneller (6-8 Peelings), ist jedoch möglicherweise nicht so selektiv und kann zu einer Kontamination durch andere Schichten führen. Filterpapier mit dünneren Fasern (wie Whatman Grade 1) isoliert die Netzhautschichten langsamer (12-15 Peelings) und führt zu einer sauberen Isolierung der Photorezeptorschichten. Wir empfehlen, sowohl dickeres als auch dünneres Filterpapier zu verwenden, um die Abziehzeit zu minimieren und die Sammlungsreinheit zu gewährleisten.

Gleichzeitig sind visuelle Approximation und Bandprobenhandhabung der Schlüssel zum Erfolg der Isolierung der subzellulären Kompartimente von der lyophilisierten Netzhaut. Wenn dem Band zu viel Druck hinzugefügt wird, haftet die gesamte lyophilisierte Netzhaut am Band. Sobald dies geschieht, wird das Trennen des ROS langwieriger und schwieriger, aber nicht unmöglich: Legen Sie ein zweites Stück Klebeband auf die freie Oberfläche (auf der Ganglienzellseite) der Netzhaut und ziehen Sie die Schichten langsam mit Klebeband weg, bis nur noch die orange / rosa Schicht auf dem ersten Stück Klebeband sichtbar ist. Eine Isolierung des RIS an dieser Stelle ist jedoch unmöglich. Wenn zu wenig Druck auf das Band aufgebracht wird, haftet ein großer Teil des ROS nicht am Band. Um eine ordnungsgemäße ROS-Bandhaftung zu gewährleisten, empfehlen wir, vorsichtig mit einer Pinzette auf die Bereiche zu drücken, die nicht am Band haften. Typischerweise führt der geringste Druck zum Entfernen der ROS- und RIS-Schichten, jedoch muss die Höhe des Drucks auf der Grundlage von Erfahrungen bestimmt werden. Das Vorhandensein von isoliertem RIS kann festgestellt werden, indem überprüft wird, ob eine dünne, weiße Schicht (ähnlich einem leichten Schneestaub) auf der anfänglichen ROS-Bandablage sichtbar ist, während das Vorhandensein von isoliertem ROS leicht bestimmt werden kann, indem die Farbe der Stäbchen-Photorezeptorschicht (orange für dunkel angepasst, rosa für lichtangepasst) auf dem Band überprüft wird.

Eine letzte Herausforderung ergibt sich beim Homogenisieren des Filterpapiers (+ROS) von der lebenden Netzhaut. Filterpapier absorbiert leicht Flüssigkeit, und eine beträchtliche Menge des homogenisierenden Puffers wird während dieses Schritts des Protokolls aufgesaugt. Das Drehen der Flüssigkeit in einer Minizentrifuge nach dem Auflegen des Abziehpapiers an der Seite jedes Röhrchens hilft, den Verlust der Probe zu verhindern. Leider kann das Drehen mehrerer Stücke Filterpapier ein zeitaufwendiger Prozess sein, und der Verlust der Probe ist unvermeidlich. Um dieses Problem zu beheben, entfernen Sie einige der Filterpapierstücke und konzentrieren Sie sich darauf, weniger Stücke gleichzeitig zu homogenisieren. Um den Verlust der Probe während dieses Schritts zu vermeiden, sollten Sie außerdem die Gesamtmenge an Filterpapier minimieren, die zur Isolierung des ROS verwendet wird.

Während unsere beiden Methoden keine große Stichprobengröße oder die präzise Ausrichtung einer Klinge erfordern, um die Netzhaut zu schneiden, gibt es einige Einschränkungen für unsere Photorezeptor-Peeling-Techniken, die erwähnenswert sind. Erstens ist die lyophilisierte murine Netzhaut möglicherweise nicht für das Peeling nachfolgender Photorezeptorschichten jenseits von ROS und RIS geeignet. Zweitens eignen sich unsere Peeling-Methoden besser für die Verarbeitung einzelner Netzhäute und sind nicht für die Verarbeitung in großen Chargen in einer Sitzung geeignet. Drittens hängt der Erfolg des Experiments von der Empfindlichkeitsgrenze des Antikörpers ab, der im Western Blot verwendet wird. Trotz dieser Einschränkungen zeigen unsere repräsentativen Ergebnisse, dass unsere beiden Isolationspeeling-Techniken spezifische Stäbchen-Photorezeptorkompartimente effizient isolieren können. Darüber hinaus verwenden diese beiden Methoden kostengünstige und alltägliche Labormaterialien (Filterpapier und Klebeband), wodurch sie leicht zugänglich sind. In unserer Studie haben wir nicht direkt beurteilt, ob andere Netzhautzellen für Immunoblotting isoliert werden können; Wir glauben jedoch, dass diese Methoden leicht modifiziert werden können, um den Bedürfnissen eines breiten Querschnitts der Netzhautforschungsgemeinschaft gerecht zu werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH Grant EY12155, EY027193 und EY027387 to JC unterstützt. Wir danken Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) und Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) für das Korrekturlesen des Manuskripts. Wir möchten uns auch bei Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) und Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) für die Bereitstellung der notwendigen Ausrüstung bedanken, um das vom Autor bereitgestellte Filmmaterial zu sammeln. Material aus: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, veröffentlicht [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

Neuroscience Ausgabe 178
Zwei Peeling-Methoden zur Isolierung von Photorezeptor-Zellkompartimenten in der Netzhaut der Maus zur Proteinanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter