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Neuroscience

प्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस रेटिना में फोटोरिसेप्टर सेल डिब्बों के अलगाव के लिए दो छीलने के तरीके

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन विश्लेषण के लिए मुरीन रॉड फोटोरिसेप्टर के उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने के लिए दो तकनीकों को प्रस्तुत करता है। पहली विधि रॉड बाहरी खंडों को अलग करने के लिए लाइव रेटिना और सेल्यूलोज फिल्टर पेपर का उपयोग करती है, जबकि दूसरी रॉड आंतरिक और बाहरी खंड परतों को छीलने के लिए लायोफिलाइज्ड रेटिना और चिपकने वाले टेप को नियोजित करती है।

Abstract

रॉड फोटोरिसेप्टर अलग-अलग डिब्बों के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत संवेदी न्यूरॉन्स हैं। माउस छड़ें लंबी (~ 80 μm) और पतली (~ 2 μm) होती हैं और रेटिना की सबसे बाहरी परत, फोटोरिसेप्टर परत में पार्श्व रूप से पैक की जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनुरूप उपकोशिकीय डिब्बों का संरेखण होता है। परंपरागत रूप से, जमे हुए फ्लैट-माउंटेड रेटिना के स्पर्शरेखा सेक्शनिंग का उपयोग विभिन्न रॉड डिब्बों के भीतर प्रोटीन के आंदोलन और स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए किया गया है। हालांकि, रॉड-प्रमुख माउस रेटिना की उच्च वक्रता स्पर्शरेखा सेक्शनिंग को चुनौतीपूर्ण बनाती है। डिब्बों के बीच प्रोटीन परिवहन के अध्ययन से प्रेरित होकर, हमने दो छीलने के तरीके विकसित किए जो पश्चिमी धब्बों के लिए रॉड बाहरी खंड (आरओएस) और अन्य उपकोशिकीय डिब्बों को मज़बूती से अलग करते हैं। हमारी अपेक्षाकृत त्वरित और सरल तकनीकें सामान्य छड़ों में महत्वपूर्ण फोटोरिसेप्टर प्रोटीन के वितरण और पुनर्वितरण को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए समृद्ध और उपकोशिकीय-विशिष्ट अंश प्रदान करती हैं। इसके अलावा, इन अलगाव तकनीकों को भी आसानी से अलग करने और मात्रात्मक रूप से स्वस्थ और विघटित रेटिना दोनों के भीतर अन्य सेलुलर परतों की प्रोटीन संरचना की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

रॉड फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं, तंत्रिका रेटिना की सबसे बाहरी परत में कसकर पैक की जाती हैं, मंद प्रकाश दृष्टि का एक अभिन्न अंग हैं। वफादार फोटॉन काउंटर के रूप में कार्य करने के लिए, छड़ें एकल फोटॉन कैप्चर के लिए तेजी से, प्रवर्धित और पुन: प्रस्तुत करने योग्य प्रतिक्रियाओं को उत्पन्न करने के लिए एक जी-प्रोटीन-आधारित सिग्नलिंग मार्ग का उपयोग करती हैं, जिसे फोटोट्रांसडक्शन कहा जाता है। प्रकाश के लिए यह प्रतिक्रिया अंततः प्लाज्मा झिल्ली पर वर्तमान में परिवर्तन को ट्रिगर करती है और बाद में दृश्य प्रणाली के बाकी हिस्सों को संकेत दिया जाता है1। जैसा कि उनके नाम का तात्पर्य है, प्रत्येक रॉड सेल में एक अलग रॉड जैसी आकृति होती है और एक अत्यधिक ध्रुवीकृत सेलुलर आकृति विज्ञान प्रदर्शित करती है, जिसमें एक बाहरी खंड (ओएस), आंतरिक खंड (आईएस), सेल बॉडी (सीबी), और सिनैप्टिक टर्मिनल (एसटी) शामिल होते हैं। प्रत्येक उपकोशिकीय डिब्बे में विशिष्ट प्रोटीन मशीनरी (झिल्ली-बाध्य और घुलनशील), बायोमोलेक्यूलर विशेषताएं, और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स होते हैं जो दृश्य फोटोट्रांसडक्शन, सामान्य हाउसकीपिंग और प्रोटीन संश्लेषण और सिनैप्टिक ट्रांसमिशन 2,3 जैसी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

30 साल पहले, उपकोशिकीय प्रोटीन के प्रकाश-निर्भर पारस्परिक आंदोलन, विशेष रूप से ट्रांसड्यूसिन (ओएस से दूर) और अरेस्टिन (ओएस की ओर), पहली बार 4,5,6,7 देखा गया था। शुरुआती दिनों में, इस मनाया घटना संदेह के साथ प्राप्त किया गया था, कुछ हद तक एपिटोप मास्किंग 8 के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री की भेद्यता के कारण। 2000 के दशक की शुरुआत में, एक कठोर और कठिन भौतिक सेक्शनिंग तकनीक का उपयोग करके उत्तेजना-निर्भर प्रोटीन ट्रांसलोकेशन की पुष्टि की गई थी। जमे हुए फ्लैट-माउंटेड कृंतक रेटिना के सीरियल स्पर्शरेखा सेक्शनिंग के बाद इम्यूनोब्लॉटिंग से पता चला कि ट्रांसड्यूसिन 9, 10, 11,12 में गिरफ्तार, और 13 में रिकवरी सभी प्रकाश के जवाब में उपकोशिकीय पुनर्वितरण से गुजरते हैं। यह माना जाता है कि इन प्रमुख सिग्नलिंग प्रोटीनों का प्रकाश-संचालित स्थानांतरण न केवल फोटोट्रांसडक्शन कैस्केड 9,14,15 की संवेदनशीलता को नियंत्रित करता है, बल्कि प्रकाश क्षति 16,17,18 के खिलाफ न्यूरोप्रोटेक्टिव भी हो सकता है। क्योंकि छड़ में प्रकाश-संचालित प्रोटीन परिवहन रॉड सेल जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान के लिए बहुत महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, इसलिए प्रोटीन वितरण निर्धारित करने के लिए विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के अलगाव की अनुमति देने वाली तकनीकें मूल्यवान अनुसंधान उपकरण हैं।

वर्तमान में, रॉड उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने के उद्देश्य से कुछ तरीके हैं। हालांकि, इन तरीकों को पुन: उत्पन्न करने के लिए लंबा और कठिन हो सकता है, या रेटिना आइसोलेट की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। घनत्व ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूगेशन 19 के माध्यम से रॉड बाहरी खंड (आरओएस) तैयारी, उदाहरण के लिए, आमतौर पर आरओएस को रेटिना होमोजेनेट से अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है। इस विधि का व्यापक रूप से पश्चिमी धब्बा के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन प्रक्रिया बहुत समय लेने वाली है और इसके लिए कम से कम 8-12 म्यूरीन रेटिना 20 की आवश्यकता होती है। दूसरी ओर, जमे हुए मुरीन और चूहे रेटिना के सीरियल स्पर्शरेखा सेक्शनिंग को ओएस, आईएस, सीबी और एसटी 9, 11,13 को अलग करने में सफलतापूर्वक लागू किया गया है। हालांकि, स्पर्शरेखा सेक्शनिंग से पहले रेटिना परतों को संरेखित करने के लिए छोटे और अत्यधिक घुमावदार मुरीन रेटिना को पूरी तरह से समतल करने की आवश्यकता के कारण यह विधि तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। चूंकि माउस मॉडल और ट्रांसजेनिक चूहों की बहुतायत है, इसलिए दृश्य प्रणाली की बीमारियों को दोहराने वाली तकनीक का निर्माण जो मज़बूती से, जल्दी से, और आसानी से अलग हो जाता है व्यक्तिगत रॉड डिब्बों को प्रत्येक विशेष डिब्बे में होने वाली शारीरिक प्रक्रियाओं और तंत्र ों को प्रकट करने में वादा करता है जो स्वास्थ्य और बीमारी में दृश्य प्रक्रियाओं को रेखांकित करते हैं।

इन जांचों को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम दो छीलने के तरीकों का वर्णन करते हैं जो वर्तमान प्रोटोकॉल की तुलना में रॉड उपकोशिकीय डिब्बों को अधिक आसानी से अलग करते हैं। पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग 21 के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल द्विध्रुवी कोशिकाओं को उजागर करने के लिए एक तकनीक से अनुकूलित पहली छीलने की विधि, एक जीवित, अलग-थलग मुरीन रेटिना (चित्रा 1) से आरओएस को क्रमिक रूप से हटाने के लिए सेल्यूलोज फिल्टर पेपर को नियोजित करती है। दूसरी विधि, एक प्रक्रिया से अनुकूलित है जो एक चिक 22 और फ्रॉग 23 रेटिना से तीन प्राथमिक रेटिना सेल परतों को अलग करती है, एक लायोफिलाइज्ड रेटिना (चित्रा 2) से आरओएस और रॉड आंतरिक खंड (आरआईएस) को हटाने के लिए चिपकने वाले टेप का उपयोग करती है। दोनों प्रक्रियाओं को 1 घंटे में पूरा किया जा सकता है और काफी उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं। हम रॉड ट्रांसड्यूसिन (GNAT1) और अरेस्टिन (ARR1) के प्रकाश-प्रेरित स्थानांतरण को प्रदर्शित करने के लिए C57BL / 6J चूहों से अंधेरे-अनुकूलित और प्रकाश-उजागर रेटिना का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा के लिए इन दो पृथक्करण प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का सत्यापन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, टेप छीलने की विधि का उपयोग करते हुए, हम अतिरिक्त सबूत प्रदान करते हैं कि हमारी तकनीक का उपयोग इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) और पश्चिमी धब्बों द्वारा अधिग्रहित प्रोटीन स्थानीयकरण डेटा के बीच विसंगतियों की जांच और समाधान करने के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, हमारी तकनीक से पता चला है कि: 1) प्रोटीन किनेज सी-अल्फा (पीकेसीα) आइसोफॉर्म न केवल द्विध्रुवी कोशिकाओं में मौजूद है, बल्कि मुरीन आरओएस और आरआईएस में भी मौजूद है, हालांकि कम सांद्रता में 24,25, और 2) रोडोप्सिन किनेज (जीआरके 1) मुख्य रूप से पृथक ओएस नमूने में मौजूद है। ये डेटा विशिष्ट रॉड और रेटिना प्रोटीन को अलग करने और परिमाणित करने के लिए हमारी दो छीलने की तकनीकों की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं।

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Protocol

सभी प्रयोगों को दक्षिणी कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय (यूएससी) से अनुसंधान पशु देखभाल पर समिति के स्थानीय संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. लाइव सेल रेटिना छीलने विधि

  1. एम्स के बफर की तैयारी, कागज छीलने, और विच्छेदन पकवान
    1. कुंद टिप आईरिस कैंची (या समकक्ष कैंची प्रकार) का उपयोग करते हुए, सेल्यूलोज फिल्टर पेपर (ग्रेड 413) को लगभग 5 मिमी x 2.5 मिमी मापने वाले आयतों में काट लें। भविष्य के उपयोग के लिए कटिंग को स्टोर करें।
    2. एम्स के मध्यम की एक बोतल, 2.38 ग्राम HEPES, और NaCl के 0.877 ग्राम के संयोजन से एम्स के HEPES बफर के 1 एल तैयार करें। आसुत ultrapure पानी के साथ एक बाँझ कांच की बोतल में अभिकर्मकों भंग और osmolarity और पीएच क्रमशः 280 mOsm और 7.4 करने के लिए समायोजित करें। निष्फल (ताकना आकार 0.2 μm) करने के लिए फ़िल्टर करें, पैराफिन फिल्म के साथ ढक्कन को सील करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. एम्स के मध्यम की एक बोतल और NaHCO3 के 1.9 ग्राम के संयोजन से एम्स के बाइकार्बोनेट बफर का 1 एल तैयार करें। आसुत ultrapure पानी के साथ एक बाँझ कांच की बोतल में अभिकर्मकों भंग और osmolarity और पीएच क्रमशः 280 mOsm और 7.4 करने के लिए समायोजित करें। निष्फल (ताकना आकार 0.2 μm) करने के लिए फ़िल्टर करें, पैराफिन फिल्म के साथ ढक्कन को सील करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: एम्स के HEPES और एम्स के बाइकार्बोनेट बफ़र्स को अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 4 °C पर 1 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश के तल पर, एक स्केलपेल (ब्लेड नंबर 11, 40 मिमी) के साथ एक जाली या चेकरबोर्ड पैटर्न बनाएं।
      नोट: पेट्री डिश के बनावट वाले तल रेटिना विच्छेदन के दौरान अलग-थलग, मुक्त-फ्लोटिंग आंख को जगह में रखते हैं।
  2. रेटिना का विच्छेदन
    नोट:: इस प्रक्रिया के लिए, बफ़र लाने के लिए और कमरे के तापमान (RT) पर रखा जाना चाहिए। विच्छेदन के दौरान ताजा carbogenated एम्स 'बाइकार्बोनेट बफर के साथ हर 15 मिनट एम्स 'बाइकार्बोनेट बफर ताज़ा करें। यह आवश्यक शारीरिक पीएच को बनाए रखता है।
    1. विच्छेदन से लगभग 15-20 मिनट पहले, एक टयूबिंग कैप एडाप्टर से सुसज्जित 100 मिलीलीटर प्रयोगशाला या मीडिया बोतल में एम्स के एचईपीईएस बफर को ऑक्सीजनेट करें और एक ऊतक इनक्यूबेशन कक्ष में 95% O2 और 5% CO2 के साथ एम्स के बाइकार्बोनेट बफर को बुलबुला करें और एक टयूबिंग कैप एडाप्टर से सुसज्जित 100 मिलीलीटर प्रयोगशाला या मीडिया बोतल में।
    2. C57BL / 6J चूहों (2-3 महीने की उम्र) के दोनों लिंगों की एक समान संख्या को Euthanize या तो isoflurane साँस लेना या कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) ग्रीवा अव्यवस्था के बाद। घुमावदार कैंची के साथ आंखों को न्यूक्लिएट करें और आंखों को बनावट वाले 35 x 10 मिमी पेट्री डिश में रखें जो बुलबुले वाले एम्स के बाइकार्बोनेट बफर से भरा हुआ है।
    3. एक 18 जी सुई के साथ कॉर्निया-लिम्बस जंक्शन पर एक छेद puncturing द्वारा एक आंख कप (चित्रा 1A) बनाएँ। प्रत्येक आंख के कॉर्निया को हटाने के लिए सूक्ष्म-विच्छेदन आईरिस कैंची का उपयोग करके इस जंक्शन की परिधि के साथ काटें। चिमटी का उपयोग करके प्रत्येक आंख से लेंस और विट्रियस हास्य को अलग करें और त्याग दें।
    4. रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) को ध्यान से छीलकर आंखों के कप से रेटिना को अलग करें- स्क्लेरा-कोरॉइड कॉम्प्लेक्स तंत्रिका रेटिना से दूर। RPE-sclera-choroid परिसर को छोड़ दें। सुनिश्चित करें कि रेटिना केवल किनारों को संभालने से विच्छेदन के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं होता है।
    5. एक 60 x 15 मिमी के ढक्कन में एक विस्तृत बोर स्थानांतरण पिपेट का उपयोग कर अलग रेटिना स्थानांतरण बुलबुले एम्स 'बाइकार्बोनेट बफर के साथ भरा पकवान.
    6. गोलार्ध के आकार के रेटिना अवतल को उन्मुख करें (फोटोरिसेप्टर डिश के नीचे की ओर नीचे की ओर सामना कर रहे हैं) और आईरिस कैंची या एक स्केलपेल (ब्लेड नंबर 10, 40 मिमी) का उपयोग करके प्रत्येक रेटिना (ऑप्टिक तंत्रिका के माध्यम से) को विभाजित करें। दो आयत बनाने के लिए प्रत्येक आधे रेटिना के घुमावदार किनारों को ट्रिम करें (चित्र1ए)।
      नोट: प्रत्येक आधे रेटिना की वक्रता को कम करने से रेटिना को बाद के छीलने के चरणों में बेहतर ढंग से समतल करने की अनुमति मिलती है और रॉड बाहरी खंड (आरओएस) परत का एक सटीक छील पैदा होता है।
    7. ऊतक इनक्यूबेशन कक्ष में आधे रेटिना को स्टोर करें जो लगातार 95% O2 और 5% CO2 के साथ बुलबुला होता है।
      नोट: अलग रेटिना carbogenated एम्स 'बाइकार्बोनेट बफर में ~ 24 ज के लिए रखा जा सकता है.
  3. रॉड बाहरी खंड (ROS) फ़िल्टर कागज छीलने द्वारा संग्रह
    नोट: आवश्यक शारीरिक पीएच को बनाए रखने के लिए छीलने की प्रक्रिया के दौरान हर 15-20 मिनट में आरटी ऑक्सीजनयुक्त एम्स के HEPES बफर को ताज़ा करें।
    1. एक विस्तृत बोर स्थानांतरण पिपेट और एक 5 मिमी x 2.5 मिमी फिल्टर कागज के टुकड़े के साथ ऊतक कक्ष से एक रेटिना आयत स्थानांतरण एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश में एम्स 'HEPES बफर 100% O2 के साथ bubbled के साथ भरा पकवान.
    2. विभाजित रेटिना अवतल को उन्मुख करें और सुनिश्चित करें कि फोटोरिसेप्टर डिश के नीचे की ओर नीचे का सामना कर रहे हैं। हल्के से चिमटी के साथ आधे रेटिना के किनारों को समझें और इसे फ़िल्टर पेपर के शीर्ष पर ले जाएं। एक बार जब रेटिना फ़िल्टर पेपर पर केंद्रित हो जाता है, तो फ़िल्टर पेपर को ऊपर की ओर ले जाएं ताकि आधा रेटिना आरओएस-टू-फिल्टर पेपर आसंजन (चित्रा 1 बी) बनाने के लिए फ़िल्टर पेपर को छू सके।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि फोटोरिसेप्टर परत फ़िल्टर पेपर के साथ सीधे संपर्क बनाता है।
    3. एम्स के HEPES बफर से संलग्न रेटिना के साथ फ़िल्टर पेपर को ध्यान से उठाएं। फ़िल्टर पेपर के निचले हिस्से (रेटिना के बिना साइड) को एक पेपर तौलिया पर रखें और सूखने के लिए 2-3 बार थपकी दें (चित्रा 1 बी)।
    4. रेटिना के साथ फिल्टर पेपर के किनारे पर एम्स के HEPES की एक बूंद जोड़ें। फ़िल्टर पेपर को सूखने के लिए फिर से पेपर तौलिया पर रखें, जैसा कि अभी वर्णित है। इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं।
    5. रेटिना के साथ फिल्टर पेपर को पेट्री डिश में वापस रखें। चिमटी का उपयोग करते हुए, धीरे से आधे रेटिना के सभी किनारों को ऊपर और सभी पक्षों पर फ़िल्टर पेपर से दूर धक्का दें।
    6. नाजुक रूप से रेटिना को फिल्टर पेपर से दूर छील लें। रेटिना की संरचनात्मक अखंडता को संरक्षित करने के लिए छीलने की प्रक्रिया के दौरान रेटिना की केवल चरम परिधि को स्पर्श करें।
    7. पेट्री डिश से फिल्टर पेपर उठाएं और एक पेपर तौलिया पर अतिरिक्त तरल निकालें। सुनिश्चित करें कि रेटिना के संपर्क में आने वाला पक्ष पेपर तौलिया से संपर्क नहीं करता है।
    8. आंशिक ROS परत के साथ फ़िल्टर पेपर को बर्फ पर एक लेबल ट्यूब में रखें (चित्रा 1 B)। छीले हुए रेटिना को एम्स के HEPES बफर में डूबा रखें।
    9. पूरे आरओएस परत को हटाने के लिए लगभग 7-8 बार इस आधे रेटिना के लिए छीलने की प्रक्रिया को दोहराएं। प्रत्येक छीलने के बाद, फिल्टर पेपर को एक ही ट्यूब में रखें, जिसमें एक आधे रेटिना से अलग आरओएस होगा।
      नोट: ध्यान रखें कि फ़िल्टर पेपर से इसे छीलते समय आधे रेटिना को न फाड़ें, क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान रेटिना पतला हो जाता है।
    10. तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर अलग आरओएस के सभी फिल्टर पेपर के छिलके वाली ट्यूब रखें या सीधे सूखी बर्फ पर फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    11. बचे हुए छिलके वाले रेटिना (आरओएस की कमी) को उचित रूप से लेबल की गई ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। तत्काल उपयोग के लिए ट्यूब को बर्फ पर रखें या सूखी बर्फ के साथ फ्रीज करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    12. प्रत्येक आधे रेटिना के लिए छीलने की प्रक्रिया को दोहराएं और प्रत्येक ट्यूब को सटीक रूप से लेबल करें।

2. Lyophilized रेटिना छीलने की विधि

  1. Buffers, छीलने मध्यम, विच्छेदन पकवान तैयारी, और lyophilizer सेट-अप
    1. एक 1 एल भंडारण बोतल में, आसुत ultrapure पानी के 500 मिलीलीटर जोड़कर रिंगर के समाधान को तैयार करें। अभिकर्मकों को 130 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, 1.2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, और 0.02 mM EDTA की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए भंग करें। NaOH के साथ पीएच को 7.4 पर समायोजित करें, अंतिम मात्रा को 1 एल तक लाने के लिए अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें, और 313 mOsm पर osmolarity को समायोजित करें।
    2. उपयोग से पहले, एक बाँझ फिल्टर (रंध्र आकार 0.2 μm) के साथ रिंगर के समाधान को फ़िल्टर करें, पैराफिन फिल्म के साथ ढक्कन को सील करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. कुंद टिप आईरिस कैंची (या समकक्ष कैंची प्रकार) का उपयोग करते हुए, सेल्यूलोज फिल्टर पेपर को लगभग 5 मिमी x 2.5 मिमी मापने वाले आयतों में काटें। एक अद्वितीय लेबल बनाने के लिए फ़िल्टर पेपर के एक तरफ लिखने के लिए एक पेंसिल का उपयोग करें।
    4. एक 35 x 10 मिमी पेट्री डिश के तल में एक जाली या चेकरबोर्ड पैटर्न बनाएं जो एक स्केलपेल (ब्लेड नंबर 11, 40 मिमी) का उपयोग करता है।
    5. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार lyophilizer चालू करें।
    6. एक देवर फ्लास्क या इसी तरह के इन्सुलेट वैक्यूम फ्लास्क में तरल नाइट्रोजन प्राप्त करें।
  2. रेटिना विच्छेदन
    1. प्रोटोकॉल के अनुभाग 1 (चित्रा 1A) में वर्णित रेटिना विच्छेदन को पूरा करें। एम्स के बफर के बजाय ठंडे रिंगर के समाधान का उपयोग करें।
    2. विच्छेदन के बाद, ठंडे रिंगर के समाधान और बर्फ पर जगह से भरे 35 x 10 मिमी पेट्री डिश में आधे, आयताकार रेटिना को स्टोर करें।
  3. lyophilization के लिए रेटिना नमूना तैयारी
    1. फिल्टर पेपर का एक 5 x 2.5 मिमी टुकड़ा रखें और ठंडे रिंगर के बफर से भरे टेक्स्ट्यूराइज्ड 35 x 10 मिमी पेट्री डिश में एक आधा रेटिना स्थानांतरित करें। व्यंजनों के बीच प्रत्येक रेटिना को स्थानांतरित करने के लिए एक विस्तृत बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें।
    2. रेटिना को सावधानीपूर्वक फ्लिप करने के लिए चिमटी का उपयोग करें ताकि यह अवतल को उन्मुख कर सके (फोटोरिसेप्टर ऊपर की ओर इशारा कर रहे हैं) और इसे स्थानांतरित करें ताकि यह फ़िल्टर पेपर (चित्रा 2 ए) के शीर्ष पर टिके रहे।
      नोट: सुनिश्चित करें कि फोटोरिसेप्टर फ़िल्टर पेपर से संपर्क नहीं करते हैं (रेटिना गैंग्लियन सेल परत फ़िल्टर पेपर के साथ सीधे संपर्क में होनी चाहिए) और अद्वितीय लेबल दिखाई देता है। रेटिना आइसोलेट को आसानी से और जल्दी से पहचानने के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि अद्वितीय लेबल फ़िल्टर पेपर के नीचे स्थित होना चाहिए।
    3. किनारों से फ़िल्टर पेपर को ऊपर की ओर उठाएं ताकि रेटिना का आधा टुकड़ा फ़िल्टर पेपर को छू सके और फ़िल्टर पेपर को रिंगर के समाधान से बाहर निकालना जारी रखे।
    4. एक पेपर तौलिया पर फ़िल्टर पेपर (उस पर रेटिना के बिना साइड) के नीचे की ओर रखें और अतिरिक्त तरल (चित्रा 2 ए) को हटाने के लिए सावधानीपूर्वक 2-3 बार थपकी दें।
    5. चिमटी के साथ फिल्टर पेपर उठाएं और रेटिना के साथ फिल्टर पेपर के किनारे पर ठंडे रिंगर की एक बूंद जोड़ें। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए पेपर तौलिया पर फ़िल्टर पेपर को फिर से रखें। इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं।
      नोट: ये वैकल्पिक गीला और सुखाने के चरण यह सुनिश्चित करते हैं कि ऊतक फ़िल्टर पेपर से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है।
    6. सभी नमूनों को फ्रीज करने के लिए तैयार होने तक ठंडे रिंगर से भरे पेट्री डिश में प्रत्येक चिपके हुए रेटिना / फ़िल्टर पेपर नमूने को स्टोर करें। सभी आधे रेटिना के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    7. एक साफ और सूखी 35 x 10 मिमी पेट्री डिश (नीचे केवल) और एल्यूमीनियम पन्नी का एक टुकड़ा प्राप्त करें जो 3.5 x 3.5 इंच वर्ग में काटा गया है।
    8. चिमटी के साथ ठंडे रिंगर के बफर से प्रत्येक नमूने को उठाएं। सुनिश्चित करें कि चिमटी केवल फ़िल्टर पेपर किनारों से संपर्क करती है, आधे रेटिना से बचती है।
    9. प्रत्येक फिल्टर पेपर के निचले हिस्से (उस पर रेटिना के बिना साइड) को एक पेपर तौलिया पर रखें और अतिरिक्त तरल को हटा दें।
    10. फिल्टर पेपर के किनारे पर ठंडे 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) की एक बूंद जोड़ें जहां रेटिना का पालन किया जाता है। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए कागज तौलिया पर फिल्टर पेपर को दबाएं।
      नोट:: सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर पेपर से नमी पर्याप्त रूप से ठंड से पहले निकाल दिया गया है।
    11. 35 x 10 मिमी पेट्री पकवान में सभी फिल्टर कागज के टुकड़े जगह. फिल्टर पेपर के आसपास के किसी भी अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए एक लिंट मुक्त टिशू पेपर का उपयोग करें।
      नोट: नमूनों के साथ पेट्री डिश भीड़ मत करो. यदि चार से अधिक मुरीन आंखों का उपयोग किया जाता है, तो रेटिना / फिल्टर पेपर नमूनों को पकड़ने के लिए एक बड़े पेट्री डिश या कई छोटे पेट्री व्यंजनों का उपयोग करने पर विचार करें।
    12. कसकर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पूरे पकवान लपेटो. सुनिश्चित करें कि एल्यूमीनियम पन्नी के किनारों को सुरक्षित किया जाता है और पेट्री डिश के तल में आसानी से दबाया जाता है। एल्यूमीनियम पन्नी ढक्कन (चित्रा 2A) में 0.1-0.2 मिमी छेद की एक मुट्ठी भर पंचर.
    13. धातु tongs का उपयोग कर, धीरे-धीरे एल्यूमीनियम पन्नी तरल नाइट्रोजन में पेट्री पकवान कवर कम. तरल नाइट्रोजन (<10 मिनट) में नमूनों को तब तक रखें जब तक कि लायोफिलाइज़ करने के लिए तैयार न हो जाएं।
  4. लायोफिलीकरण
    1. एल्यूमीनियम पन्नी कवर पेट्री डिश को फ्रीज-सुखाने वाले फ्लास्क में रखें और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए इसे लाइओफिलाइज़र मशीन से संलग्न करें। 30 मिनट के लिए रेटिना को Lyophilize.
    2. फ्लास्क को लायोफिलाइज़र से अलग करें और निर्माता के अनुसार मशीन को बंद कर दें।
    3. एल्यूमीनियम पन्नी निकालें और या तो फ्रीज-सूखे नमूनों के साथ उसी दिन काम करें या उन्हें ठीक से लेबल किए गए 1 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्टोर करें। इन ट्यूबों को एक कंटेनर (जैसे कि 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब) में रखें जो एक निर्जल डेसिकेंट से भरा हुआ है और नमूनों को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है।
  5. चिपकने वाला टेप छीलने द्वारा रॉड बाहरी और भीतरी खंड संग्रह.
    1. स्पष्ट चिपकने वाला टेप (1-2 सेमी) की कट स्ट्रिप्स और त्वरित उपयोग के लिए टेप डिस्पेंसर / लैब बेंच / आदि के किनारे पर स्ट्रिप्स स्टोर करें।
    2. छीलने के लिए एक प्लास्टिक 60 x 15 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन के लिए एक रेटिना नमूना ले जाएँ। केवल फ़िल्टर पेपर के सबसे बाहरी किनारों को पकड़ना सुनिश्चित करें और रेटिना को छूने से बचें।
    3. कुंद टिप आईरिस कैंची (या समकक्ष कैंची प्रकार) का उपयोग करके, ऊतक के अनुमानित आकार (1.5 x 2.5 मिमी) के लिए टेप के एक छोटे आयताकार टुकड़े को काटें।
    4. ध्यान से lyophilized रेटिना (चित्रा 2B) के शीर्ष पर टेप का एक छोटा सा टुकड़ा रखना और चिमटी के साथ मामूली दबाव लागू करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह फोटोरिसेप्टर परत (नारंगी / गुलाबी रंग की शीर्ष परत) के साथ बांड करता है।
    5. धीरे-धीरे टेप को छील लें। रॉड बाहरी खंड (आरओएस) और रॉड इनर सेगमेंट (आरआईएस) दोनों को टेप (चित्रा 2 बी) का पालन किया जाएगा।
    6. सुनिश्चित करें कि खंडित सतह पर एक पतली सफेद फिल्म है। यह आरआईएस को अलग RIS.To है, टेप का एक और टुकड़ा रखें और टेप को खंडित सतह (चित्रा 2 बी) पर नीचे धकेलें।
      नोट: यह पूरे पतली सफेद परत को हटाने के लिए टेप के एक से अधिक टुकड़े ले सकता है।
    7. केवल नारंगी / गुलाबी परत के साथ टेप के टुकड़े को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, जिसे + आरओएस लेबल किया गया है।
    8. पतली सफेद परत के साथ टेप या टेप के टुकड़ों को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल + आरआईएस में रखें।
      नोट: टेप के साथ lyophilized रेटिना को अलग करने के लिए अभ्यास लेता है। टेप पर लागू दबाव की मात्रा प्रभावित करेगी कि लायोफिलाइज्ड नमूना कैसे भिन्न होगा। यदि नमूने पर टेप पर बहुत अधिक दबाव डाला जाता है, तो पूरे लायोफिलाइज्ड रेटिना फ़िल्टर पेपर को छील देगा और टेप से चिपक जाएगा। यदि टेप में बहुत कम दबाव जोड़ा जाता है, तो नारंगी / गुलाबी शीर्ष परत (+ आरओएस) टेप से चिपक नहीं जाएगी।
    9. टेप का उपयोग कर फिल्टर पेपर से मोटी, सफेद परत को छीलकर फ़िल्टर पेपर पर स्थित बचे हुए रेटिना ऊतक (आरओएस और आरआईएस परतों, -ओआईएस से वंचित) को इकट्ठा करें। अलग-अलग को एक ट्यूब लेबल -OIS में रखें।
    10. प्रत्येक आधे रेटिना नमूने के लिए इन चरणों को दोहराएं।
    11. लायोफिलाइज्ड रेटिना से अलग-अलग परतों को कमरे के तापमान पर स्टोर करें यदि उसी दिन प्रोटीन परिमाणीकरण, जेल वैद्युतकणसंचलन, और प्रोटीन इम्यूनोब्लॉट्स का प्रदर्शन करते हैं, या बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर निर्जल डेसिकेंट से भरे कंटेनर (जैसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब) में स्टोर करते हैं।

3. छीलने अलगाव के लिए पश्चिमी धब्बा नमूना तैयारी

  1. RIPA lysis बफर तैयार करें
    1. एक 100 mL भंडारण बोतल में, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS, और 1 mM EDTA की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अभिकर्मक जोड़ें। विआयनीकृत अल्ट्राप्योर पानी के 100 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: RIPA lysis बफर 2-3 सप्ताह के लिए 2-8 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है। लंबे समय तक भंडारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऐलीकोट और स्टोर करें।
    2. प्रयोग के दिन, RIPA लाइसिस बफर में एक प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल (0.1 M PMSF, 1:1000 Aprotinin, और 1:1000 Leupeptin) जोड़ें और बर्फ पर रखें।
  2. फ़िल्टर कागज छीलने पश्चिमी धब्बा के लिए lysate तैयारी
    1. सुनिश्चित करें कि फिल्टर पेपर के छिलके और बचे हुए छिले रेटिना वाली ट्यूबों को बर्फ पर बनाए रखा जाता है (उसी दिन प्रयोग के लिए) या -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर भंडारण से हटा दिया जाता है और बर्फ पर रखा जाता है।
    2. फिल्टर कागज के छिलके युक्त microcentrifuge ट्यूबों के नीचे से किसी भी अतिरिक्त तरल निकालें। जल्दी से 2-4 s के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में स्पिन और किसी भी शेष तरल को त्याग दें।
    3. Pipette 45-55 μL ठंडे RIPA बफर के फिल्टर कागज अलग युक्त ट्यूबों में.
    4. 1 मिनट के लिए एक साफ, autoclaved पेस्टल मिक्सर के साथ प्रत्येक नमूने homogenize. सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर पेपर पेस्टल मिक्सर के संपर्क में रहता है। फिल्टर पेपर को नीचे की बजाय प्रत्येक ट्यूब के किनारे पर रखें।
    5. चिमटी के साथ, फ़िल्टर पेपर को प्रत्येक ट्यूब के पक्ष में ले जाएं और 2-4 सेकंड के लिए मिनी सेंट्रीफ्यूज में स्पिन करें। यह फ़िल्टर पेपर से RIPA बफ़र निकाल देगा।
    6. सूखे फिल्टर पेपर को निकालें और यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक ट्यूब के भीतर सभी फिल्टर पेपर के लिए दोहराएं।
    7. एक नई ट्यूब के लिए homogenate स्थानांतरित करें और इसे उचित रूप से लेबल।
      नोट: यह सबसे अधिक समय लेने वाला चरण है, और यदि ठीक से पूरा नहीं हुआ है, तो अधिकांश नमूना फ़िल्टर पेपर द्वारा अवशोषित हो जाएगा।
    8. पिपेट 60-80 μL ठंडे RIPA बफर के बचे हुए छिले रेटिना के साथ व्यक्तिगत ट्यूबों में।
    9. 1 मिनट के लिए एक साफ, autoclaved पेस्टल मिक्सर के साथ प्रत्येक नमूने homogenize.
  3. पश्चिमी धब्बा के लिए टेप छीलने Lysate तैयारी
    1. आरटी lyophilized नमूने या बर्फ पर -80 डिग्री सेल्सियस नमूने रखें।
    2. पिपेट 50-70 μL ठंडे RIPA बफर के प्रत्येक ट्यूब में + ROS और + आरआईएस टेप peels युक्त.
    3. पिपेट 60-80 μL ठंडे lysis बफर के -OIS ट्यूबों में शेष lyophilized रेटिना युक्त, ROS और RIS के साथ हटा दिया.
    4. 1 मिनट के लिए एक साफ पेस्टल मिक्सर के साथ प्रत्येक नमूने homogenize. सुनिश्चित करें कि अलग-अलग ट्यूबों में टेप पेस्टल मिक्सर और लाइसिस बफर के संपर्क में रहता है।
    5. निष्फल चिमटी के साथ, टेप को ट्यूबों के किनारे पर ले जाएं और 2-4 सेकंड के लिए एक मिनी सेंट्रीफ्यूज के साथ स्पिन करें। यह टेप से तरल को हटा देगा। ट्यूबों से सूखे टेप को हटा दें।
      नोट: इस बिंदु पर, आप या तो 'फिल्टर पेपर छीलने' या 'टेप छीलने' विधि के लिए एक ही रेटिना से दो आधे रेटिना आइसोलेट्स गठबंधन कर सकते हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आपके पास एक bicinchoninic एसिड परख (बीसीए) करने के लिए पर्याप्त मात्रा है।

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Representative Results

वर्तमान रणनीतियों को पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए विशिष्ट रॉड उपकोशिकीय डिब्बों के बीच प्रोटीन को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए अपेक्षाकृत तेज और सरल तरीके प्रदान करने के लिए विकसित किया गया था। हमने दो अनुक्रमिक छीलने की तकनीकों (चित्रा 1 और चित्रा 2) को लागू किया, जिसके बाद इम्यूनोब्लॉटिंग ने यह प्रदर्शित किया कि इन तरीकों का उपयोग अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित जानवरों दोनों में रॉड ट्रांसड्यूसिन (GNAT1) और अरेस्टिन (ARR1) के ज्ञात वितरण का पता लगाने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है। अन्य सेलुलर परतों से संदूषण के बिना रॉड उपकोशिकीय डिब्बों को ठीक से अलग करने में हमारे दो प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को मान्य करने के लिए, इम्युनोब्लॉट्स को साइटोक्रोम सी (साइट सी), एक्टिन, और गो5एस / गि5एल 26 के लिए एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। उपयोग किए गए एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने की एक सूची तालिका 1 में प्रस्तुत की गई है। साइट सी और एक्टिन ने आरओएस शुद्धता का संकेत दिया, क्योंकि वे समीपस्थ रेटिना में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन हैं लेकिन आरओएस में अनुपस्थित हैं। Gó5L, GNAT127 के लिए GTPase सक्रिय प्रोटीन (GAP) का एक घटक, ROS और RIS में मौजूद है और इन अलगावों के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। Gí5S, छोटा स्प्लिस आइसोफोर्म जो ROS या RIS में मौजूद नहीं है, लेकिन अन्य सभी रॉड डिब्बों में है, गैर-ROS / RIS पृथक उपकोशिकीय डिब्बों के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

सबसे पहले, हमारे अनुक्रमिक लाइव सेल रेटिना छीलने की विधि की प्रभावशीलता का मूल्यांकन अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित चूहों (चित्रा 3) की छड़ों में GNAT1 और ARR1 के वितरण का विश्लेषण करके किया गया था। आरओएस (+ आरओएस) वाले फिल्टर पेपरों को कुल एक पूरे रेटिना से पूल किया गया था, और संबंधित अवशिष्ट ऊतक (-आरओएस) को भी जोड़ा गया था। संकेतित प्रोटीन से संकेतों को बाद में + आरओएस नमूनों और -आरओएस नमूनों के बीच तुलना की गई थी, और एक पूरे पृथक रेटिना ने इनपुट नियंत्रण के रूप में कार्य किया। इन नमूनों के लिए प्रोटीन सांद्रता और समरूपता मात्रा को तालिका 2 में प्रस्तुत किया गया है। चित्रा 3 ए में प्रस्तुत परिणाम बताते हैं कि, अंधेरे-अनुकूलित जानवरों में, GNAT1 और ARR128 का वितरण बारीकी से उनके ज्ञात अंधेरे-राज्य वितरण से मेल खाता है जहां GNAT1 सिग्नल स्पष्ट रूप से + ROS अलगाव में सबसे मजबूत था, जबकि ARR1 सिग्नल -ROS अलगाव में अधिक मजबूत था। तदनुसार, प्रकाश-उजागर रेटिना में, GNAT1 सिग्नल को + आरओएस अलगाव में उल्लेखनीय रूप से कम कर दिया गया था और -ROS नमूने में एक बढ़ा हुआ संकेत था, जबकि प्रकाश-प्रेरित ARR1 ट्रांसलोकेशन को + ROS और -ROS नमूनों में देखा जा सकता था। छह अलग-अलग प्रयोगों के परिणामों को परिमाणित किया गया था, और सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर GNAT1 और ARR1 के लिए अंधेरे / प्रकाश की स्थिति के बीच + ROS और -ROS नमूनों (चित्रा 3 B) में पाए गए थे। ये निष्कर्ष रॉड उपकोशिकीय डिब्बों के भीतर पहले से ज्ञात प्रोटीन प्रकाश / अंधेरे आंदोलन के अनुरूप हैं और दृढ़ता से संकेत देते हैं कि यह तकनीक समृद्ध + आरओएस अंशों को अलग कर सकती है।

आगे हमारे लाइव सेल छीलने की विधि को मान्य करने के लिए, हमने + आरओएस और -आरओएस नमूनों दोनों में ज्ञात आरओएस शुद्धता मार्कर वितरण की जांच की। अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित दोनों नमूनों में, Gó5S, Cyt C, और actin संकेतों को + ROS नमूनों (चित्रा 3A) से बाहर रखा गया है, जो अन्य सेलुलर परतों से संदूषण की अनुपस्थिति का प्रदर्शन करता है। इसके अतिरिक्त, Gó5L संकेत स्पष्ट रूप से + ROS नमूनों (चित्रा 3A) में दिखाई दे रहा था। इसके अलावा, एक्टिन और Gí5L संकेतों ने न केवल +ROS और -ROS अंशों की शुद्धता की पुष्टि की, बल्कि सामान्यीकरण के लिए नियंत्रण के रूप में भी कार्य किया, + ROS नमूनों के संकेतों को Gó5L और -ROS नमूनों के खिलाफ सामान्यीकृत किया जा रहा है। जैसा कि चित्रा 3 ए में प्रस्तुत किया गया है, यह अनुशंसा की जाती है कि लाइव सेल छीलने वाले आइसोलेट्स को इष्टतम इम्यूनोब्लोटिंग सामान्यीकरण और विश्लेषण के लिए लोडिंग नियंत्रण, विशेष रूप से एक पूरे रेटिना होमोजेनेट के साथ लोड किया जाता है। साथ में, ये डेटा सत्यापित करते हैं कि हमारी लाइव सेल छीलने की विधि प्रोटीन विश्लेषण के लिए रॉड और रेटिना के बाकी हिस्सों से आरओएस उपकोशिकीय परत को अलग करने के लिए एक तेजी से और पुन: प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण प्रदान कर सकती है।

हमने यह सत्यापित करने के लिए हमारी लायोफिलाइज्ड छीलने की तकनीक का मूल्यांकन किया कि यह विधि आरओएस और आरआईएस डिब्बों को अलग कर सकती है। इम्यूनोब्लॉटिंग से पहले, हमने स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) का उपयोग करके बरकरार और छिलके वाले लायोफिलाइज्ड माउस रेटिना की सतहों को चित्रित किया ताकि यह विश्लेषण किया जा सके कि टेप छीलने वाले फोटोरिसेप्टर उपकोशिकीय परत (चित्रा 4)। चिपकने वाले टेप के साथ छीलने से पहले, बरकरार lyophilized रेटिना (नारंगी / गुलाबी-टिंटेड परत) की सतह बारीकी से विशेषता बेलनाकार ROS (चित्रा 4A) की प्रोफ़ाइल से मेल खाती है। प्रारंभिक टेप छीलने के बाद, आरओएस और आरआईएस को पूरी तरह से हटा दिया गया था, जैसा कि बचे हुए छिलके वाले लायोफिलाइज्ड रेटिना (चित्रा 4 सी) की सतह पर मौजूद समान परमाणु परत से स्पष्ट है। बाद के टेप छिलकों ने छिलके वाली परत की मुक्त सतह से आरआईएस (पतली सफेद परत, चित्रा 4 बी) को हटा दिया, एक प्रक्रिया जो आंतरिक और बाहरी खंडों को जोड़ने वाले सिलियम को जोड़ने वाले संकीर्ण और नाजुक कनेक्टिंग सिलियम द्वारा सहायता प्राप्त है। इन परिणामों ने पुष्टि की कि लाइओफिलाइज्ड रेटिना ऊतक से रॉड उपकोशिकीय परतों को विशेष रूप से टेप का उपयोग करके भिन्न किया जा सकता है।

नेत्रहीन रूप से इस विधि की प्रभावशीलता को मान्य करने के बाद, अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित छिले हुए रेटिना को हमारे लाइव सेल छीलने की विधि (चित्रा 3) के लिए उल्लिखित विभिन्न डिब्बों के लिए प्रोटीन मार्करों का उपयोग करके एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करके इम्युनोब्लोटिंग के अधीन किया गया था। आरओएस अलगाव (+ आरओएस), आरआईएस अलगाव (+ आरआईएस), और शेष रेटिना परतों (-ओआईएस) के लिए प्रोटीन एकाग्रता और समरूपता की मात्रा को तालिका 2 में प्रस्तुत किया गया है। जैसा कि अपेक्षित था, आरओएस से आरआईएस तक जीएनएटी 1 के लिए एक स्पष्ट प्रकाश-प्रेरित बदलाव था, साथ ही आरआईएस से आरओएस (चित्रा 5 ए) तक एआरआर 1 भी था। GNAT1 अंधेरे में + ROS नमूने और प्रकाश में + RIS नमूने में सबसे प्रचुर मात्रा में था, जबकि ARR1 सिग्नल को उलट दिया गया था (चित्रा 5A)। हम अगले सामान्यीकृत और + ROS, + RIS, और -OIS अलगाव (चित्रा 5B) से translocating प्रोटीन संकेतों की मात्रा, लाइव छीलने की पद्धति के रूप में एक ही नियंत्रण और दृष्टिकोण का उपयोग कर. हमने अपने लाइव सेल फिल्टर पेपर छीलने की विधि (चित्रा 3 बी) की अधिक सीधी तुलना के लिए +RIS और -OIS नमूनों (चित्रा 5C) को भी जोड़ा। दोनों रेखांकन GNAT1 और ARR1 दोनों के अच्छी तरह से स्थापित और विशिष्ट प्रकाश-प्रेरित स्थानांतरण दिखाते हैं। इन टिप्पणियों के आधार पर, टेप छीलने की तैयारी समृद्ध आरओएस और आरआईएस अंशों को उत्पन्न करने के लिए प्रकट होती है, जैसा कि इन अलगावों में एआरआर 1 और जीएनएटी 1 की प्रोटीन संरचना से स्पष्ट है।

इसके बाद, व्यक्तिगत उपकोशिकीय अलगाव की शुद्धता का मूल्यांकन किया गया था। चित्रा 3A में दिखाए गए परिणामों के समान, + ROS नमूनों में एक मजबूत Gí5L सिग्नल (चित्रा 5) प्रदर्शित करते समय एक्टिन, साइटोक्रोम C, और Gó5S के लिए संकेतों की कमी थी। यह खोज हमारे + आरओएस नमूना तैयारी में अन्य उपकोशिकीय डिब्बों से संदूषण की कमी को दर्शाती है। रॉड की बाद की उपकोशिकीय परत की प्रोटीन सामग्री, +आरआईएस अलगाव, तब मूल्यांकन किया गया था। हमने पाया कि + आरआईएस नमूना साइट सी, गि5एल और एक्टिन के लिए सकारात्मक था। यह खोज आरआईएस की ज्ञात संरचना के अनुरूप है, जो माइटोकॉन्ड्रिया और साइटोस्केलेटल तत्वों में समृद्ध है। अंतिम परत, -OIS आइसोलेट, में चित्र 3A में दिखाए गए -ROS नमूनों के अनुरूप प्रोटीन वितरण था।

रॉड उपकोशिकीय डिब्बों की प्रोटीन रचनाओं की जांच में हमारे चिपकने वाले टेप छीलने की विधि की उपयोगिता का आकलन करने के लिए, हमने विशेष रूप से हमारे + आरओएस, + आरआईएस और -ओआईएस नमूनों में रोडोप्सिन किनेज (जीआरके 1) और प्रोटीन किनेज सी-अल्फा (पीकेसीα) की अस्पष्टता की जांच की। विभिन्न प्रयोगात्मक तरीके, जैसे कि इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी) और पश्चिमी धब्बा, अक्सर छड़ और रेटिना में इन प्रोटीनों के सटीक स्थानीयकरण के बारे में परस्पर विरोधी परिणाम देते हैं। उदाहरण के लिए, GRK1 को रॉड और शंकु ओएस में अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में माना जाता है ताकि प्रकाश-सक्रिय ऑप्सिन 29 के फॉस्फोराइलेशन की मध्यस्थता की जा सके। हालांकि, रेटिना स्लाइस के इम्युनोलेबलिंग ने GRK1 के स्थानीयकरण को विशेष रूप से OS30,31 में या पूरे फोटोरिसेप्टर लेयर 32 में प्रकट किया है। दूसरी ओर, PKCα, एक प्रोटीन है जिसका उपयोग आमतौर पर द्विध्रुवी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए ICC के लिए किया जाता है। रेटिना स्लाइस 25 में रॉड-विशिष्ट PKCα इम्युनोलेबलिंग के कोई स्पष्ट सबूत नहीं होने के बावजूद, काफी जैव रासायनिक 24,25 और कार्यात्मक 33,34,35 सबूत हैं जो ROS में PKCα की उपस्थिति और फॉस्फोराइलेटिंग भूमिका का समर्थन करते हैं। हमारी तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि GRK1 प्रकाश-उजागर रेटिना में + आरओएस नमूनों में सबसे तीव्र था और -OIS नमूनों (चित्रा 6 ए) में अनुपस्थित था। इसके विपरीत, हम दिखाते हैं कि +ROS और +RIS नमूनों ने PKCα के लिए एक बेहोश संकेत प्रदर्शित किया। जैसा कि चित्रा 6B में देखा जा सकता है, PKCα आमतौर पर ROS या RIS में रेटिना वर्गों के immunofluorescence धुंधला द्वारा पता नहीं लगाया जाता है। हालांकि, PKCα पश्चिमी धब्बा (चित्रा 6A, D) द्वारा immunodetected था। क्योंकि + ROS और + RIS अलगाव एक मजबूत Gó5L संकेत और Gó5S (चित्रा 6A) की अनुपस्थिति प्रदर्शित करते हैं, हमें विश्वास है कि ROS और RIS दोनों नमूनों में मंद PKCα संकेत वास्तविक है और अन्य परतों से संदूषण के कारण नहीं है। +ROS, +RIS, और -OIS अलगाव में अलग-अलग संकेतों की कल्पना करने के लिए, GRK1 और PKCα धब्बों को संयुक्त किया गया था और तुलना के लिए प्लॉट किया गया था (चित्रा 6 C)।

अंत में, एक उप-इष्टतम छीलने के सत्र (चित्रा 6 डी) का एक उदाहरण दर्शाता है कि विभिन्न उप-परतों से संदूषण परिणामों को कैसे तिरछा कर सकता है, डेटा व्याख्या के महत्व को और अधिक दर्शाता है और प्रयोगात्मक छीलने की त्रुटियों के लिए स्क्रीन के लिए उपयुक्त नियंत्रण एंटीबॉडी को शामिल करता है। इस टेप छीलने अलगाव उदाहरण में, एक बेहोश Gó5S संकेत आरआईएस अलगाव लेन में स्पष्ट है, जो -OIS नमूने से मामूली संदूषण का संकेत देता है। उपयोगकर्ता के लक्ष्य के आधार पर, यह मामूली संदूषण एक मुद्दा नहीं हो सकता है। हालांकि, इस मामले में, हम + आरओएस और + आरआईएस नमूनों में पीकेसीα सिग्नल की जांच कर रहे थे, और पीकेसीα सिग्नल आरओएस लेन (चित्रा 6 ए, डी) की तुलना में आरआईएस लेन में थोड़ा अधिक है, शायद संदूषण के कारण। इस प्रकार, एक सटीक अलगाव सुनिश्चित करने और संदूषण को कम करने के लिए छीलने की प्रक्रिया के दौरान देखभाल की जानी चाहिए। व्यक्तिगत त्रुटि के कारण न्यूनतम संदूषण के बावजूद, ये डेटा ठोस सबूत प्रदान करते हैं कि टेप छीलने की पद्धति प्रोटीन विश्लेषण के लिए रॉड फोटोरिसेप्टर परतों के सटीक अनुक्रमिक अलगाव उत्पन्न कर सकती है।

Figure 1
चित्र 1: लाइव सेल छीलने के चरणों की योजनाबद्ध। (A) आरेख पृथक आंख को विच्छेदन और अर्धविच्छेदित करने के लिए मुख्य चरणों को दर्शाता है। (बी) फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों को फ़िल्टर पेपर का उपयोग करके अनुक्रमिक छीलने से वृद्धिशील रूप से हटा दिया जाता है। सबसे पहले, रेटिना को उन्मुख किया जाता है ताकि फोटोरिसेप्टर परत फ़िल्टर पेपर के संपर्क में हो। इसके बाद, फिल्टर पेपर को एक पेपर तौलिया पर ब्लोटिंग करके सुखाया जाता है, और रेटिना को फिल्टर पेपर से दूर छील दिया जाता है। यह छिलका हुआ आइसोलेट बर्फ पर रखी एक ट्यूब में एकत्र किया जाता है। रॉड बाहरी खंड (+ आरओएस) को पूरी तरह से हटाने के लिए इस प्रक्रिया को सात से आठ बार दोहराया जाता है। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: Lyophilized रेटिना छीलने की प्रक्रिया. (A) lyophilized रेटिना के लिए नमूना तैयारी का प्रवाह आरेख. रेटिना को उन्मुख किया जाता है ताकि रेटिना गैंग्लियन सेल परत फिल्टर पेपर के संपर्क में हो और फोटोरिसेप्टर ऊपर का सामना कर रहे हों। (बी) लायोफिलाइजेशन के बाद, फ्रीज-सूखे रेटिना को टेप के शीर्ष पर मामूली दबाव जोड़ने के बाद टेप के एक टुकड़े का पालन किया जाता है। टेप को दूर छील दिया जाता है, रॉड बाहरी खंड (आरओएस) और रॉड आंतरिक खंड (आरआईएस) परतों को हटा दिया जाता है। आरआईएस परत को अधिक टेप छिलके द्वारा हटा दिया जाता है जब तक कि आरओएस परत दिखाई नहीं देती (नारंगी / गुलाबी परत)। यह आंकड़ा BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र3: अनुक्रमिक फ़िल्टर पेपर छीलने के बाद अलग-थलग रॉड फोटोरिसेप्टर में GNAT1 और ARR1 की अभिव्यक्ति। (A) +ROS और -ROS (ROS-depleted) नमूनों के Immunoblots अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित रेटिना से अधिग्रहित फ़िल्टर पेपर छीलने की विधि द्वारा एकत्र किए गए। धब्बों को प्रकाश-ट्रिगर प्रोटीन (ट्रांसड्यूसिन (GNAT1) और अरेस्टिन (ARR1)) और गुणवत्ता नियंत्रण मार्करों (GTPase सक्रिय प्रोटीन (Gó5L / S) साइटोक्रोम सी (साइट सी), और एक्टिन) के लिए एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। इन प्रतिनिधि धब्बों के लिए दो आधे रेटिना को जोड़ा गया था। (बी) अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित रेटिना से GNAT1 और ARR1 के परिमाणित संकेत। +ROS और -ROS आइसोलेट्स से GNAT1 और ARR का पारस्परिक प्रकाश-ट्रिगर आंदोलन है। वायलिन भूखंडों + ROS और -ROS नमूनों की सामान्यीकृत अभिव्यक्ति को दर्शाते हैं। इस आंकड़े को Rose et al.36 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: lyophilized रेटिना के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों को स्कैन करना। (ए) टेप छीलने से पहले लायोफिलाइज्ड रेटिना की सतह (फोटोरिसेप्टर साइड अप)। (बी) भीतरी खंड परत पोस्ट टेप छीलने. (सी) टेप छीलने के बाद कोशिका शरीर परत एक समान परमाणु उपस्थिति दिखाती है। इस आंकड़े को रोज़ एट अल.36 से संशोधित किया गया है और BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: lyophilized रेटिना से ROS और RIS को अलग करने के लिए टेप छीलने की विधि का सत्यापन. (A) +ROS, +RIS, और -OIS (ROS/RIS-depleted) के पश्चिमी धब्बे टेप छीलने की विधि द्वारा एकत्र किए गए नमूनों। Immunoblots ट्रांसड्यूसिन (GNAT1), arrestin (ARR1), GTPase सक्रिय प्रोटीन (Gó5L / S), साइटोक्रोम सी (साइट सी), और एक्टिन एंटीबॉडी के साथ जांच की गई थी। नमूने अंधेरे से प्राप्त किए गए थे- और प्रकाश-अनुकूलित रेटिना और आधे रेटिना आइसोलेट्स (+ आरओएस, + आरआईएस, -ओआईएस) को अधिक केंद्रित सामग्री के लिए जोड़ा गया था। (बी) जीएनएटी 1 और एआरआर 1 के मात्रात्मक संकेतों को विभिन्न पृथक रेटिना परतों के लिए वायलिन भूखंडों के रूप में प्लॉट किया जाता है, जो अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित रेटिना से प्राप्त किए गए थे। (सी) +RIS और -OIS से सामान्यीकृत अभिव्यक्ति के स्तर को संयुक्त किया गया था और टेप और फ़िल्टर पेपर छीलने के तरीकों की तुलना करने के लिए प्लॉट किया गया था। अंधेरे और प्रकाश-अनुकूलित नमूनों ने प्रमुख फोटोट्रांसडक्शन प्रोटीन के ज्ञात आंदोलन को प्रदर्शित किया। इस आंकड़े को Rose et al.36 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: फोटोरिसेप्टर में GRK1 और PKCα के उपकोशिकीय स्थानीयकरण की जांच करने के लिए लायोफिलाइज्ड रेटिना का टेप छीलना। (A) प्रकाश-अनुकूलित C57BL/6J चूहों से छीले हुए नमूनों का एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा रोडोप्सिन किनेज (GRK1), प्रोटीन किनेज C-alpha (PKCα), GTPase सक्रिय प्रोटीन (Gó5L/S), और एक्टिन के सापेक्ष स्तर का प्रदर्शन करता है। (बी) पीकेसीα एंटीबॉडी (हरे, 1: 100) के साथ इनक्यूबेट किए गए प्रकाश-उजागर चूहों से तैयार जमे हुए रेटिना अनुभाग। आरपीई, रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम; ओएस, बाहरी खंड; IS, आंतरिक खंड; सीबी, सेल शरीर; एसटी, सिनैप्टिक टर्मिनल। स्केल बार = 10 μm. (C) PKCα और GRK1 +ROS, +RIS, -OIS नमूनों के लिए सामान्यीकृत अभिव्यक्ति के स्तर को वायलिन भूखंडों के रूप में प्लॉट किया गया है। (डी) उप-इष्टतम टेप छीलने से संभावित रूप से थोड़ा दूषित नमूने प्राप्त हो सकते हैं। लाल वर्ग कुछ -OIS नमूने के साथ दूषित + RIS नमूने पर प्रकाश डाला गया है, दोनों Gó5L / S बैंड और एक उच्च PKCα संकेत का उत्पादन। सभी धब्बों के लिए दो आधे रेटिना को जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

लक्ष्य रोग-प्रतिकारक तनूकरण निर्माता
Arrestin खरगोश विरोधी ARR1 1:1000 चेन, एट अल, 2006।
ट्रांसड्यूसिन माउस विरोधी GNAT (TF-15) 1:1000 साइटोसिग्नल।
• एक्टिन खरगोश विरोधी एक्टिन 1:5000 GeneTex इंक।
साइटोक्रोम C खरगोश विरोधी साइटोक्रोम सी 1:500 सांता क्रूज़, एससी -7159।
GAP (Gó5L/S) खरगोश विरोधी Gó5L/S (CT2-15) 1:2000 वाटसन, एट अल, 1996।
प्रोटीन किनेज सी अल्फा (PKC) खरगोश विरोधी PKC (# 2050) 1:1000 सेल सिग्नलिंग प्रौद्योगिकी.
रोडोप्सिन किनेज (GRK1) माउस विरोधी GRK1 (G-8) 1:200 सांता क्रूज़, एससी -8004।

तालिका 1: पृथक्करण तकनीकों के पश्चिमी धब्बा सत्यापन के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की सूची।

फ़िल्टर पेपर रेटिना अलगाव
+ROS* -ROS* पूरे रेटिना
औसत प्रोटीन सांद्रता (μg/mL) 700 1,500 1,500
RIPA बफ़र आयतन (μL) 90 150 200
टेप छीलने रेटिना अलगाव
+ROS* +RIS* -ROS* पूरे रेटिना
औसत प्रोटीन सांद्रता (μg/mL) 520 440 1,200 1,600
RIPA बफ़र आयतन (μL) 100 100 125 150
* संयुक्त दो आधे रेटिना अलगाव.

तालिका 2: रेटिना अलगाव homogenates में प्रोटीन एकाग्रता.

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Discussion

कई रेटिना रोग रॉड फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं, जिससे रॉड की मृत्यु हो जाती है और अंततः, पूर्ण दृष्टि हानि होती है37। मानव रेटिना अध: पतन के आनुवंशिक और यांत्रिक मूल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा सफलतापूर्वक वर्षों से कई माउस मॉडल में recapitulated किया गया है। उस संदर्भ में, छोटे माउस रेटिना से व्यक्तिगत रॉड उपकोशिकीय डिब्बों को आसानी से और चुनिंदा रूप से अलग करने की क्षमता रेटिना रोगों के स्थानीयकृत जैव रासायनिक और आणविक आधार की हमारी समझ को बहुत बढ़ाएगी। इसके अलावा, तंत्रिका रेटिना की स्तरित प्रकृति, रॉड फोटोरिसेप्टर की अद्वितीय, अत्यधिक ध्रुवीकृत व्यवस्था के साथ संयुक्त, चयनात्मक छीलने से रॉड डिब्बों के अलगाव की अनुमति देती है। यह पांडुलिपि इम्यूनोब्लोटिंग के लिए रॉड फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अलग-अलग उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दो प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। स्पर्शरेखा सेक्शनिंग 9 की मौजूदा विधि की तुलना में न केवल दोनों तरीके काफी तेज और कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होते हैं, बल्कि उन्हें घनत्व ग्रेडिएंट 19 का उपयोग करके आरओएस के सामान्य जैव रासायनिक अलगाव की तुलना में काफी छोटे नमूना आकार की भी आवश्यकता होती है। इस तरह की आरओएस ग्रेडिएंट शुद्धिकरण तकनीकों को विश्वसनीय रूप से पर्याप्त आरओएस को पुनर्प्राप्त करने के लिए 8-10 म्यूरीन रेटिना की आवश्यकता होती है, जबकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एकल रेटिना के लिए उपयुक्त हैं।

प्रस्तावित तकनीकों की समग्र सादगी के बावजूद, दोनों प्रोटोकॉल के लिए आम मुख्य चुनौतियों में से एक विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के उचित अलगाव के लिए आवश्यक फिल्टर पेपर पर घुमावदार रेटिना के सपाट होने की चिंता करता है। अलग रेटिना कर्ल करने के लिए जाता है और एक क्लैम की तरह आकार पर ले जाता है। यदि रेटिना ने फ़िल्टर पेपर (फोटोरिसेप्टर साइड या तो ऊपर या नीचे) पर रखे जाने पर किनारों को मोड़ा है, तो यह वांछित अलग-थलग रॉड परतों की उपज को कम कर सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यदि रेटिना को ठीक से चपटा नहीं किया जाता है, तो अन्य उपकोशिकीय डिब्बों और रेटिना कोशिकाओं से परत misalignment और संदूषण एक संभावित परिणाम है (चित्रा 6 डी)। आधे रेटिना आयत की वक्रता को सीमित करने और रॉड और रेटिना परतों के अपूर्ण संरेखण को ठीक करने के लिए, रेटिना आयत को दो रेटिना वर्गों का उत्पादन करने के लिए आधे में काटा जा सकता है। तंत्रिका रेटिना को छोटे टुकड़ों में काटने से, रेटिना की प्राकृतिक वक्रता कम हो जाती है, और ऊतक फिल्टर पेपर पर फ्लैट रखने की अधिक संभावना है।

यह पहचानना कि जब विभिन्न रॉड डिब्बों को शारीरिक रूप से अलग किया गया है, तो इन तकनीकों के साथ अनुभवहीन किसी के लिए मुश्किल हो सकता है। हम सलाह देते हैं कि जैविक रूप से महत्वपूर्ण प्रयोग शुरू करने से पहले, उपयोगकर्ता को एक या दो घंटे के लिए नमूना रेटिना के साथ प्रक्रिया के माध्यम से चलना चाहिए। अभ्यास के परिणामस्वरूप ऑपरेटर के कौशल और विधियों में प्रवीणता में पर्याप्त सुधार होना चाहिए। एक लाइव रेटिना से आरओएस को छीलने के लिए फ़िल्टर पेपर का उपयोग करते समय, कोई स्पष्ट दृश्य संकेत इंगित नहीं करता है कि आरओएस परत को अलग कर दिया गया है। जबकि रेटिना पतला और अधिक नाजुक हो जाता है, उपयोगकर्ता को आरओएस को सटीक रूप से अलग करने के लिए छिलके की संख्या को आत्म-निगरानी और मान्य करना होगा। इसके अलावा, विभिन्न फाइबर मोटाई और मोटाई के साथ फिल्टर पेपर का उपयोग आरओएस छीलने के समय को बदल देगा। मोटे फाइबर (जैसे वीडब्ल्यूआर ग्रेड 413) के साथ फ़िल्टर पेपर रेटिना परतों को तेजी से (6-8 छिलके) को अलग करेगा, लेकिन चयनात्मक नहीं हो सकता है और अन्य परतों से संदूषण का कारण बन सकता है। पतले फाइबर (जैसे कि व्हाटमैन ग्रेड 1) के साथ फ़िल्टर पेपर रेटिना परतों को धीमा (12-15 छिलके) को अलग करेगा और फोटोरिसेप्टर परतों का एक साफ अलगाव देगा। हम छीलने के समय को कम करने और संग्रह शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए मोटे और पतले फिल्टर पेपर दोनों का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

उसी समय, दृश्य सन्निकटन और टेप नमूना हैंडलिंग दोनों लायोफिलाइज्ड रेटिना से उपकोशिकीय डिब्बों को अलग करने की सफलता की कुंजी हैं। यदि टेप में बहुत अधिक दबाव जोड़ा जाता है, तो पूरे लायोफिलाइज्ड रेटिना टेप का पालन करेगा। एक बार ऐसा होने के बाद, आरओएस को अलग करना लंबा और अधिक कठिन हो जाता है, लेकिन असंभव नहीं है: रेटिना की मुक्त सतह (गैंग्लियन सेल साइड पर) पर टेप का एक दूसरा टुकड़ा रखें और धीरे-धीरे टेप के साथ परतों को तब तक खींचें जब तक कि टेप के शुरुआती टुकड़े पर केवल नारंगी / गुलाबी परत दिखाई न दे। हालांकि, इस बिंदु पर आरआईएस को अलग करना असंभव है। यदि टेप में बहुत कम दबाव जोड़ा जाता है, तो आरओएस का एक बड़ा हिस्सा टेप का पालन नहीं करेगा। उचित आरओएस-टेप आसंजन सुनिश्चित करने के लिए, हम उन क्षेत्रों पर चिमटी के साथ धीरे से दबाने की सलाह देते हैं जो टेप से चिपके नहीं हैं। आमतौर पर, थोड़ा सा दबाव ROS और RIS परतों को हटाने में परिणाम देता है, हालांकि, दबाव की मात्रा अनुभव के आधार पर निर्धारित की जानी चाहिए। पृथक आरआईएस की उपस्थिति का पता लगाया जा सकता है कि क्या एक पतली, सफेद परत (बर्फ के हल्के डस्टिंग के समान) प्रारंभिक आरओएस टेप छील पर दिखाई देती है, जबकि अलग-थलग आरओएस की उपस्थिति को टेप पर रॉड फोटोरिसेप्टर परत (अंधेरे-अनुकूलित के लिए नारंगी, प्रकाश-अनुकूलित के लिए गुलाबी) के रंग की जांच करके आसानी से निर्धारित किया जा सकता है।

एक अंतिम चुनौती तब उत्पन्न होती है जब लाइव रेटिना से फिल्टर पेपर छिलके (+ आरओएस) को homogenizing। फ़िल्टर पेपर आसानी से तरल को अवशोषित करता है, और प्रोटोकॉल के इस चरण के दौरान homogenizing बफर की काफी मात्रा को भिगोया जाएगा। प्रत्येक ट्यूब के किनारे पर छीलने वाले कागज को रखने के बाद एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में तरल को नीचे कताई करने से नमूने के नुकसान को रोकने में मदद मिलती है। दुर्भाग्य से, फ़िल्टर पेपर के कई टुकड़ों को कताई करना एक समय लेने वाली प्रक्रिया हो सकती है, और नमूने का नुकसान अपरिहार्य है। इस समस्या को हल करने के लिए, फ़िल्टर पेपर के कुछ टुकड़ों को हटा दें और एक समय में कम टुकड़ों को homogenizing पर ध्यान केंद्रित करें। साथ ही, इस चरण के दौरान नमूने के नुकसान से बचने के लिए, ROS को अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फ़िल्टर पेपर की कुल मात्रा को कम करने पर विचार करें।

जबकि हमारे दोनों तरीकों को रेटिना को अनुभाग करने के लिए एक बड़े नमूना आकार, या ब्लेड के सटीक संरेखण की आवश्यकता नहीं होती है, हमारे फोटोरिसेप्टर छीलने की तकनीकों के लिए कुछ सीमाएं हैं जो ध्यान देने योग्य हैं। सबसे पहले, lyophilized murine रेटिना ROS और RIS से परे बाद के फोटोरिसेप्टर परतों को छीलने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है। दूसरा, हमारे छीलने के तरीके व्यक्तिगत रेटिना को संसाधित करने के लिए अधिक उपयुक्त हैं और एक बैठक में बड़े बैच प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त नहीं हैं। तीसरा, प्रयोग की सफलता पश्चिमी धब्बा में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की संवेदनशीलता सीमा पर निर्भर करती है। इन सीमाओं के बावजूद, हमारे प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि हमारी दो अलगाव छीलने की तकनीकें विशिष्ट रॉड फोटोरिसेप्टर डिब्बों को कुशलतापूर्वक अलग कर सकती हैं। इसके अतिरिक्त, ये दो विधियां सस्ती और सामान्य प्रयोगशाला सामग्री (फिल्टर पेपर और चिपकने वाला टेप) का उपयोग करती हैं, जिससे उन्हें अत्यधिक सुलभ बनाया जा सकता है। हमारे अध्ययन में, हमने सीधे आकलन नहीं किया कि क्या अन्य रेटिना कोशिकाओं को इम्युनोब्लॉटिंग के लिए अलग किया जा सकता है; हालांकि, हमारा मानना है कि इन तरीकों को रेटिना अनुसंधान समुदाय के व्यापक क्रॉस-सेक्शन की जरूरतों को लाभ पहुंचाने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को NIH अनुदान EY12155, EY027193, और EY027387 द्वारा जेसी के लिए समर्थित किया गया था। हम डॉ Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, संयुक्त राज्य अमेरिका) और नताली चेन (यूएससी, लॉस एंजिल्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) पांडुलिपि proofreading के लिए आभारी हैं. हम डॉ सेठ रफिंस (यूएससी, लॉस एंजिल्स, यूएसए) और डॉ जानोस पेटी-पीटरडी (यूएससी, लॉस एंजिल्स, यूएसए) को लेखक द्वारा प्रदान किए गए फुटेज को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। से सामग्री: Kasey Rose et al, प्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस रेटिना में फोटोरिसेप्टर सेल डिब्बों का पृथक्करण, आणविक Neurodegeneration, प्रकाशित [2017], [Springer प्रकृति].।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 178
प्रोटीन विश्लेषण के लिए माउस रेटिना में फोटोरिसेप्टर सेल डिब्बों के अलगाव के लिए दो छीलने के तरीके
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Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

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