Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Två peelingmetoder för isolering av fotoreceptorcellfack i mus näthinnan för proteinanalys

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Detta protokoll presenterar två tekniker för att isolera subcellulära fack av murine stång fotoreceptorer för protein analys. Den första metoden använder levande näthinne- och cellulosafilterpapper för att separera stångens yttre segment, medan den andra använder frystorkad näthinna och tejp för att skala bort stångens inre och yttre segmentskikt.

Abstract

Stångfotoreceptorer är mycket polariserade sensoriska nervceller med distinkta fack. Musstängerna är långa (~80 μm) och tunna (~2 μm) och packas i sidled i näthinnans yttersta lager, fotoreceptorskiktet, vilket resulterar i justering av analoga subcellulära fack. Traditionellt har tangentiell sektionering av den frusna plattmonterade näthinnan använts för att studera rörelse och lokalisering av proteiner inom olika stavfack. Den höga krökningen av den stavdominerande mushinnan gör dock tangentiell sektion utmanande. Motiverade av studien av proteintransport mellan fack utvecklade vi två peelingmetoder som på ett tillförlitligt sätt isolerar stångens yttre segment (ROS) och andra subcellulära fack för västra fläckar. Våra relativt snabba och enkla tekniker levererar berikade och subcellulära fraktioner för att kvantitativt mäta distribution och omfördelning av viktiga fotoreceptorproteiner i normala stavar. Dessutom kan dessa isoleringstekniker också enkelt anpassas för att isolera och kvantitativt undersöka proteinsammansättningen i andra cellulära skikt inom både friska och degenererande näthinnan.

Introduction

Stångfotoreceptorceller, tätt packade i det yttersta lagret av neural näthinnan, är en integrerad del av dim ljusseende. För att fungera som trogna fotonräknare använder stavar en G-proteinbaserad signalväg, så kallade fototransduktion, för att generera snabba, förstärkta och reproducerbara svar på en enda fotonfångst. Detta svar på ljus utlöser i slutändan en förändring i strömmen vid plasmamembranet och signaleras därefter till resten av det visuella systemet1. Som namnet antyder har varje stavcell en distinkt stavliknande form och uppvisar en mycket polariserad cellulär morfologi, bestående av ett yttre segment (OS), inre segment (IS), cellkropp (CB) och synaptisk terminal (ST). Varje subcellulärt fack har specifika proteinmaskiner (membranbunden och löslig), biomolekylära egenskaper och proteinkomplex som spelar avgörande roller som visuell fototransduktion, allmän hushållning och proteinsyntes och synaptisk överföring2,3.

För över 30 år sedan observerades den ljusberoende ömsesidiga rörelsen av subcellulära proteiner, särskilt transdukt (bort från operativsystemet) och arrestin (mot operativsystemet), först4,5,6,7. Tidigt mottogs detta observerade fenomen med skepsis, delvis på grund av immunohistokemis sårbarhet för epitopmaskering8. I början av 2000-talet bekräftades stimulansberoende protein flyttning med hjälp av en rigorös och mödosam fysisk sektionsteknik9. Seriell tangentiell avsnitt av frysta platt-monterade gnagare näthinnan följt av immunoblotting visade att transducin9,10, arrestin11,12 och recoverin13 alla genomgår subcellulära omfördelning som svar på ljus. Man tror att ljusdriven flyttning av dessa viktiga signalproteiner inte bara reglerar känsligheten hos fototransduktionskaskaden9,14,15, men kan också vara neuroprotektiva mot ljusskador16,17,18. Eftersom ljusdriven proteintransport i stavar verkar vara mycket betydelsefull för stavcellsbiologi och fysiologi, är tekniker som tillåter isolering av olika subcellulära fack för att bestämma proteinfördelning värdefulla forskningsverktyg.

För närvarande finns det några metoder som syftar till att isolera stångsubcellulära fack. Dessa metoder kan dock vara långa och svåra att reproducera, eller kräva en betydande mängd näthinneisolat. Stång yttre segment (ROS) preparat via densitet gradient centrifugation19, till exempel, används ofta för att separera ROS från retinal homogenate. Denna metod används ofta för västra blot, men förfarandet är mycket tidskrävande och kräver minst 8-12 murin retinae20. Å andra sidan har seriell tangentiell sektion av fryst murin och råtta näthinna framgångsrikt genomförts för att isolera operativsystemet, IS, CB och ST9,11,13. Denna metod är dock tekniskt utmanande på grund av behovet av att helt platta den lilla och mycket krökta murin näthinnan för att justera näthinnan lager före tangentiell avsnitting. Eftersom det finns en mängd musmodeller och transgena möss som rekapitulerar sjukdomar i det visuella systemet, är skapandet av en teknik som tillförlitligt, snabbt och enkelt separerar enskilda stavfack löfte om att avslöja de fysiologiska processer som förekommer i varje specialiserat fack och de mekanismer som ligger till grund för visuella processer inom hälsa och sjukdom.

För att underlätta dessa undersökningar beskriver vi två peeling metoder som isolerar stång subcellular fack lättare än nuvarande protokoll. Den första peelingmetoden, anpassad från en teknik för att exponera fluorescerande märkta bipolära celler för patchklämma inspelning21, använder cellulosafilterpapper för att sekventiellt ta bort ROS från en levande, isolerad murin näthinna (figur 1). Den andra metoden, anpassad från ett förfarande som isolerar de tre primära näthinnan celllagren från en chick22 och frog23 näthinna, använder tejp för att ta bort ROS och stav inre segment (RIS) från en frystorkad näthinna (figur 2). Båda procedurerna kan slutföras på 1 h och är betydligt användarvänliga. Vi ger validering av effektiviteten av dessa två separation protokoll för västra blot genom att använda mörk-anpassade och ljus-exponerade näthinnan från C57BL/6J möss att visa ljusinducerad flyttning av stång transducin (GNAT1) och arrestin (ARR1). Dessutom, med hjälp av tejp peeling metoden, vi ger ytterligare bevis för att vår teknik kan användas för att undersöka och ta itu med inkonsekvenser mellan protein lokalisering data förvärvas av immunocytochemistry (ICC) och västra blots. Specifikt visade vår teknik att: 1) proteinkinas C-alfa (PKCα) isoform finns inte bara i bipolära celler, men också i murin ROS och RIS, om än i låga koncentrationer24,25 och 2) rhodopsin kinas (GRK1) finns främst i det isolerade OS-provet. Dessa data visar effektiviteten av våra två peeling tekniker för att separera och kvantifiera specifika stav- och näthinneproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes enligt de lokala institutionella riktlinjerna från kommittén för forskning djurvård från University of Southern California (USC).

1. Levande cell retinal peeling metod

  1. Beredning av Ames buffertar, peelingpapper och dissekeringsfat
    1. Skär cellulosafilterpapperet (grad 413) med trubbig spetssax (eller motsvarande saxtyp) i rektanglar som mäter cirka 5 mm x 2,5 mm. Förvara sticklingarna för framtida användning.
    2. Förbered 1 L av Ames HEPES-buffert genom att kombinera en flaska Ames Medium, 2,38 g HEPES och 0,877 g NaCl. Lös upp reagenserna i en steril glasflaska med destillerat ultrapurvatten och justera osmolariteten och pH:et till 280 mOsm respektive 7,4. Filtrera för att sterilisera (porstorlek 0,2 μm), försegla locket med paraffinfilm och förvara vid 4 °C.
    3. Förbered 1 L ames bikarbonatbuffert genom att kombinera en flaska Ames Medium och 1,9 g NaHCO3. Lös upp reagenserna i en steril glasflaska med destillerat ultrapurvatten och justera osmolariteten och pH:et till 280 mOsm respektive 7,4. Filtrera för att sterilisera (porstorlek 0,2 μm), försegla locket med paraffinfilm och förvara vid 4 °C.
      OBS: Ames HEPES- och Ames bikarbonatbuffertar kan beredas i förväg och lagras i 1 vecka vid 4 °C.
    4. I botten av en 35 x 10 mm Petri-skål, skapa ett gitter eller rutmönster med en skalpell (blad nr 11, 40 mm).
      OBS: Petris texturerade botten håller det isolerade, fritt flytande ögat på plats under näthinne dissekeringen.
  2. Dissekering av näthinnan
    OBS: För denna procedur ska bufferten föras till och hållas vid rumstemperatur (RT). Uppdatera Ames bikarbonatbuffert var 15:e minut med färska karbonogenerade Ames bikarbonatbuffert under dissekeringen. Detta upprätthåller det nödvändiga fysiologiska pH.
    1. Cirka 15-20 min före dissekeringen syresätter Ames HEPES-buffert i ett 100 ml laboratorie- eller medieflaska utrustad med en tublockadapter och bubblar Ames bikarbonatbuffert med 95% O2 och 5% CO2 i en vävnadsinkubationskammare och i ett 100 ml-laboratorium eller medieflaska utrustad med en tublockadapter.
    2. Avliva lika många av båda könen av C57BL/6J möss (2-3 månader) antingen genom isofluran inandning eller koldioxid (CO2) följt av livmoderhalscancer förskjutning. Enucleate ögonen med böjd sax och placera ögonen i texturerad 35 x 10 mm Petri skål fylld med bubblade Ames bikarbonatbuffert.
    3. Skapa en ögonkopp (figur 1A) genom att punktera ett hål vid hornhinnan-limbuskorsningen med en 18 G nål. Skär längs omkretsen av denna korsning med hjälp av mikro-dissekering iris sax för att ta bort hornhinnan på varje öga. Separera linsen och glaskroppen från varje öga med pincett och kassera.
    4. Isolera näthinnan från ögonkoppen genom att försiktigt skala näthinnan pigmenterat epitel (RPE)-sclera-choroid komplex bort från neural näthinnan. Kassera RPE-sclera-choroid komplexet. Se till att näthinnan inte skadas under dissekeringen genom att endast hantera kanterna.
    5. Överför isolerad näthinna med hjälp av en bred borröverföringspipett i locket på en 60 x 15 mm skål fylld med bubblad Ames bikarbonatbuffert.
    6. Orientera den halvklotformade näthinnan konkava upp (fotoreceptorerna är vända ner mot botten av skålen) och bisect varje näthinna (genom synnerven) med iris sax eller en skalpell (blad nr 10, 40 mm). Trimma de böjda kanterna på varje halv näthinna för att göra två rektanglar (figur 1A).
      OBS: Genom att minimera krökningen på varje halverad näthinna kan näthinnan plattas ut bättre i efterföljande peelingsteg och ger en noggrann skalning av stångens yttre segment (ROS) lager.
    7. Förvara den halverade näthinnan i vävnadskubationskammaren som kontinuerligt bubblas med 95% O2 och 5% CO2.
      OBS: Isolerad näthinna kan förvaras i den karbonogena Ames bikarbonatbuffert i ~24 timmar.
  3. Stång yttre segment (ROS) samling genom filterpapper peeling
    OBS: Uppdatera RT syresatt Ames HEPES buffert var 15-20 min under peelingprocessen för att upprätthålla det nödvändiga fysiologiska pH.
    1. Överför en näthinnerektangel från vävnadskammaren med en bred borröverföringspipett och en 5 mm x 2,5 mm bit filterpapper till en 35 x 10 mm Petriskål fylld med Ames HEPES-buffert bubblad med 100% O2.
    2. Rikta den partitionerade näthinnan konkava upp och se till att fotoreceptorerna är vända ner mot botten av skålen. Ta lätt tag i sidorna av den halverade näthinnan med pincett och flytta den ovanpå filterpapperet. När näthinnan är centrerad på filterpapperet flyttar du filterpapperet uppåt så att den halverade näthinnan vidrör filterpapperet för att skapa ROS-till-filter-pappersupphäftningen (bild 1B).
      OBS: Se till att fotoreceptorskiktet kommer i direkt kontakt med filterpapperet.
    3. Lyft försiktigt filterpapperet med den bifogade näthinnan ur Ames HEPES-buffert. Placera undersidan av filterpapperet (sidan utan näthinnan) på en pappershandduk och doppa 2-3 gånger för att torka (figur 1B).
    4. Tillsätt en droppe Ames HEPES på sidan av filterpapperet med näthinnan. Placera filterpapperet på pappershandduken igen för att torka, som du just beskrivit. Upprepa den här processen två gånger till.
    5. Placera filterpapperet med näthinnan tillbaka i Petri-skålen. Tryck försiktigt upp alla kanter på den halverade näthinnan med pincett och bort från filterpapperet på alla sidor.
    6. Skala försiktigt bort näthinnan från filterpapperet. Rör endast näthinnans extrema omkrets under peelingprocessen för att bevara näthinnans strukturella integritet.
    7. Lyft filterpapperet från Petri-skålen och ta bort överflödig vätska på en pappershandduk. Se till att sidan som var i kontakt med näthinnan inte kommer i kontakt med pappershandduken.
    8. Placera filterpapperet med det partiella ROS-skiktet i ett märkt rör på is (bild 1B). Håll den skalade näthinnan nedsänkt i Ames HEPES-buffert.
    9. Upprepa peelingprocessen för denna halverade näthinna cirka 7-8 gånger för att ta bort hela ROS-skiktet. Efter varje skal, placera filterpapperet i samma rör, som kommer att innehålla den isolerade ROS från en halverad näthinna.
      OBS: Var noga med att inte riva den halverade näthinnan när du skalar bort den från filterpapperet, eftersom näthinnan blir tunnare under denna process.
    10. Placera röret som innehåller alla filterpappersskal av den isolerade ROS på is för omedelbar användning eller frys direkt på torris och förvara vid -80 °C.
    11. Använd pincett för att överföra den överblivna skalade näthinnan (som saknar ROS) till ett lämpligt märkt rör. Placera röret på is för omedelbar användning eller frys med torris och förvara vid -80 °C.
    12. Upprepa peelingprocessen för varje halverad näthinna och märk noggrant varje rör.

2. Frystorkad näthinneskalningsmetod

  1. Buffertar, peeling medium, dissekeringsfatberedning och lyofilizer-upplägg
    1. I en förvaringsflaska på 1 L bereder du Ringers lösning genom att tillsätta 500 ml destillerat ultrapurvatten. Lös upp reagenserna för att uppnå en slutlig koncentration på 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES och 0,02 mM EDTA. Justera pH till 7,4 med NaOH, tillsätt ultrapurvatten för att få den slutliga volymen till 1 L och justera osmolariteten till 313 mOsm.
    2. Före användning, filtrera Ringers lösning med ett sterilt filter (porstorlek 0,2 μm), försegla locket med paraffinfilm och förvara vid 4 °C.
    3. Skär cellulosafilterpapperet med trubbig spets (eller motsvarande saxtyp) i rektanglar som mäter cirka 5 mm x 2,5 mm. Använd en penna för att skriva på ena sidan av filterpapperet för att skapa en unik etikett.
    4. Skapa ett gitter- eller schackbrädemönster i botten av en 35 x 10 mm Petriskål med hjälp av en skalpell (blad nr 11, 40 mm).
    5. Slå på lyofilizern enligt tillverkarens specifikationer.
    6. Skaffa flytande kväve i en Dewarkolv eller liknande isolerande vakuumkolv.
  2. Näthinne dissekering
    1. Fullständig näthinne dissekering enligt beskrivningen i avsnitt 1 i protokollet (figur 1A). Använd cold Ringers lösning istället för Ames buffert.
    2. Efter dissekering, förvara den halverade, rektangulära näthinnan i en 35 x 10 mm Petri-skål fylld med kall Ringers lösning och placera på is.
  3. Retinal provpreparat för lyofilisering
    1. Placera ett 5 x 2,5 mm filterpapper och överför en halverad näthinna till den texturiserade 35 x 10 mm Petriskålen fylld med kall Ringers buffert. Använd en bred borröverföringspipett för att flytta varje näthinna mellan disken.
    2. Använd pincett för att försiktigt vända näthinnan så att den är orienterad konkav upp (fotoreceptorerna pekar uppåt) och flytta den så att den vilar ovanpå filterpapperet (bild 2A).
      OBS: Se till att fotoreceptorerna inte kommer i kontakt med filterpapperet (näthinnans ganglioncelllager ska vara i direkt kontakt med filterpapperet) och att den unika etiketten är synlig. För att enkelt och snabbt identifiera näthinneisolatet rekommenderas att den unika etiketten placeras på undersidan av filterpapperet.
    3. Lyft filterpapperet i kanterna uppåt så att den halverade näthinnan vidrör filterpapperet och fortsätter att lyfta filterpapperet ur Ringers lösning.
    4. Placera undersidan av filterpapperet (sidan utan näthinnan på den) på en pappershandduk och doppa försiktigt 2-3 gånger för att avlägsna överflödig vätska (figur 2A).
    5. Plocka upp filterpapperet med pincett och tillsätt en droppe kalla ringer på sidan av filterpapperet med näthinnan. Placera filterpapperet på pappershandduken igen för att avlägsna överflödig vätska. Upprepa processen två gånger till.
      OBS: Dessa alternerande vätnings- och torkningssteg säkerställer att vävnaden är ordentligt fastsatt på filterpapperet.
    6. Förvara varje fastsatt näthinne/filterpappersprov i en Petriskål fylld med kalla ringare tills de är klara att frysa alla prover. Upprepa denna process för all halverad näthinna.
    7. Få en ren och torr 35 x 10 mm Petri-skål (endast botten) och en bit aluminiumfolie skuren i en 3,5 x 3,5 tums kvadrat.
    8. Lyft ut varje prov ur den kalla ringerens buffert med pincett. Se till att pincetterna endast kommer i kontakt med filterpapperskanterna och undvik den halverade näthinnan.
    9. Placera undersidan av varje filterpapper (sidan utan näthinnan på det) på en pappershandduk och ta bort överflödig vätska.
    10. Tillsätt en droppe kallt 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) på sidan av filterpapperet där näthinnan är fastsatt. Doppa filterpapperet på pappershandduken för att avlägsna överflödig vätska.
      OBS: Se till att fukten från filterpapperet avlägsnas tillräckligt innan du fryser.
    11. Placera alla filterpappersbitar i 35 x 10 mm Petriskålen. Använd ett luddfritt vävnadspapper för att transportera bort överflödig vätska som omger filterpapperet.
      OBS: Överbefolka inte Petriskålen med prover. Om mer än fyra murinögon används, överväg att använda en större Petri-maträtt eller flera mindre Petri-rätter för att hålla näthinnan / filterpappersproverna.
    12. Linda in hela skålen med aluminiumfolie. Se till att aluminiumfoliens kanter är säkrade och smidigt pressade i botten av Petri-skålen. Punktera en handfull 0,1-0,2 mm hål i aluminiumfolielocket (figur 2A).
    13. Använd metalltänger, sänk gradvis aluminiumfolien täckt Petri-skålen i det flytande kvävet. Förvara proverna i det flytande kvävet (<10 min) tills de är klara att frystorkas.
  4. Frystorka
    1. Placera aluminiumfolien täckt Petri skål i en frystorkande kolv och fäst den på lyofilizer maskinen enligt tillverkarens protokoll. Frystorka näthinnan i 30 minuter.
    2. Ta bort kolven från frystorkaren och stäng av maskinen enligt tillverkaren.
    3. Ta bort aluminiumfolien och arbeta antingen med de frystorkade proverna samma dag eller förvara dem i korrekt märkta 1 mL mikrocentrifugerör. Placera dessa rör i en behållare (t.ex. ett koniskt rör på 50 ml) fyllt med ett vattenfritt torkmedel och förvara proverna vid -80 °C.
  5. Stång yttre och inre segmentsamling genom tejpskalning.
    1. Klipp remsor av klar tejp (1-2 cm) och förvara remsor på kanten av tejpdispensern / labbbänken / etc. för snabb användning.
    2. Flytta ett näthinneprov till locket på en plastskål på 60 x 15 mm Petri för peeling. Se till att endast ta tag i filterpapperets yttersta kanter och undvik att vidröra näthinnan.
    3. Använd trubbig spets iris sax (eller motsvarande saxtyp), skär en liten rektangulär bit tejp till den ungefärliga storleken på vävnaden (1,5 x 2,5 mm).
    4. Lägg försiktigt en liten bit tejp ovanpå den frystorkade näthinnan (figur 2B) och applicera lätt tryck med pincetterna för att se till att den binder till fotoreceptorskiktet (det orange/ rosafärgade toppskiktet).
    5. Skala långsamt bort tejpen. Både stångens yttre segment (ROS) och stavens inre segment (RIS) kommer att fästas på tejpen (figur 2B).
    6. Se till att det finns en tunn vit film på den brutna ytan. Detta är RIS.To separera RIS, placera en annan bit tejp och trycka ner tejpen på den brutna ytan (figur 2B).
      OBS: Det kan ta mer än en bit tejp för att ta bort hela det tunna vita lagret.
    7. Placera tejpbiten med endast det orange/rosa skiktet i ett mikrocentrifugerör märkt +ROS.
    8. Placera tejpen eller tejpbitarna med det tunna vita skiktet i ett mikrocentrifugerör märkt +RIS.
      OBS: Att separera den frystorkade näthinnan med tejp kräver övning. Mängden tryck som appliceras på bandet kommer att påverka hur det frystorkade provet kommer att fraktioneras. Om för mycket tryck läggs på tejpen över provet kommer hela fryshinnan att skala av filterpapperet och hålla fast vid tejpen. Om för lite tryck läggs till tejpen fastnar inte det orange/rosa toppskiktet (+ROS) på tejpen.
    9. Samla upp den överblivna näthinnevävnaden (utan ROS- och RIS-lager, -OIS) som finns på filterpapperet genom att skala av det tjocka, vita lagret från filterpapperet med tejp. Placera isolatet i ett rör märkt -OIS.
    10. Upprepa dessa steg för varje halverat näthinneprov.
    11. Förvara de isolerade lagren från den frystorkade näthinnan antingen i rumstemperatur om du utför proteinkvantifiering, gelelektrofores och proteinimmunblod samma dag, eller förvara i en behållare (t.ex. 50 ml koniskt rör) fylld med vattendystiskt torkmedel vid -80 °C för senare användning.

3. Western blot provberedning för peeling isolering

  1. Förbereda RIPA-lysbuffert
    1. I en lagringsflaska på 100 ml tillsätt reagenser för att erhålla en slutlig koncentration på 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxikolas, 0,1% SDS och 1 mM EDTA. Tillsätt 100 ml avjoniserat ultrapurvatten och blanda noggrant.
      OBS: RIPA-lysbufferten kan förvaras vid 2-8 °C i 2-3 veckor. För längre förvaring, alikvot och förvara i frysen -20 °C.
    2. På dagen för experimentet, tillsätt en proteashämmare cocktail (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotinin och 1:1000 Leupeptin) till RIPA lysbufferten och håll på is.
  2. Filterpapper peeling lysate förberedelse för västra blot
    1. Se till att rör som innehåller filterpappersskal och överbliven skalade näthinnor hålls kvar på is (för försöket samma dag) eller avlägsnas från frysförvaringen -80 °C och placeras på is.
    2. Ta bort överflödig vätska från botten av mikrocentrifugerören som innehåller filterpappersskalen. Snurra snabbt i en minicentrifuger i 2-4 s och kassera eventuell återstående vätska.
    3. Pipetter 45-55 μL kall RIPA-buffert i rör som innehåller filterpappersisolatet.
    4. Homogenisera varje prov med en ren, autoklaverad pestleblandare i 1 min. Se till att filterpappret håller kontakten med pestleblandaren. Håll filterpapperet på sidan av varje rör i stället för längst ner.
    5. Med pincett, flytta filterpapperen till sidan av varje rör och snurra i minicentrifugen i 2-4 s. Detta tar bort RIPA-bufferten från filterpapperet.
    6. Ta bort torkat filterpapper och upprepa för alla filterpapper i varje rör om det behövs.
    7. Överför homogenatet till ett nytt rör och märk det på lämpligt sätt.
      OBS: Detta är det mest tidskrävande steget, och om det inte slutförs korrekt kommer mycket av provet att absorberas av filterpapperet.
    8. Pipett 60-80 μL kall RIPA-buffert i de enskilda rören med den överblivna skalade näthinnan.
    9. Homogenisera varje prov med en ren, autoklaverad pestleblandare i 1 min.
  3. Tejpskalning Lysate förberedelse för västra blot
    1. Placera RT-frysproverna eller -80 °C-proverna på is.
    2. Pipett 50-70 μL kall RIPA-buffert i varje rör som innehåller +ROS och +RIS tejpskal.
    3. Pipetter 60-80 μL kalllysbuffert i -OIS-rören som innehåller den återstående frystorkade näthinnan, med ROS och RIS borttagna.
    4. Homogenisera varje prov med en ren pestleblandare i 1 min. Se till att tejpen i de enskilda rören håller kontakten med pestleblandaren och lysbufferten.
    5. Med steriliserade pincett, flytta tejpen till sidan av rören och snurra med en minicentrifug i 2-4 s. Detta tar bort vätskan från tejpen. Ta bort den torkade tejpen från rören.
      OBS: Vid denna tidpunkt kan du kombinera två halv näthinneisolat från samma näthinna för antingen "filterpapper peeling" eller "tejpskalning" -metoden för att säkerställa att du har tillräckligt med volym för att utföra en bicinchonnic syraanalys (BCA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De nuvarande strategierna utvecklades för att ge relativt snabba och enkla metoder för att isolera och analysera proteiner bland specifika stav subcellulära fack för västra blot analys. Vi tillämpade två sekventiella peeling tekniker (figur 1 och figur 2) följt av immunoblotting för att visa att dessa metoder på ett tillförlitligt sätt kunde användas för att upptäcka den kända fördelningen av stavtransducin (GNAT1) och arrestin (ARR1) i både mörka och ljusanpassade djur. För att validera effektiviteten av våra två protokoll i exakt isolera stång subcellulära fack utan förorening från andra cellulära lager, immunoblots undersöktes med antikroppar för cytokrom C (Cyt C), aktin och Gß5S/Gß5L26. En förteckning över använda antikroppar och utspädningar finns i tabell 1. Cyt C och aktin indikerade ROS renhet, eftersom de är rikliga proteiner i den proximala näthinnan men är frånvarande i ROS. Gß5L, en komponent i GTPaseaktiverande protein (GAP) för GNAT127, finns i ROS och RIS och fungerade som en kontroll för dessa isoleringar. Gß5S, den kortare skarvisoformen som inte finns i ROS eller RIS men som finns i alla andra stavfack, som fungerat som en kontroll för isolerade delcellsutrymmen som inte är ROS/RIS.

För det första bedömdes effektiviteten av vår sekventiella levande cell retinal peeling metod genom att analysera fördelningen av GNAT1 och ARR1 i stavar av mörka och ljusanpassade möss (figur 3). Filterpapperen som innehåller ROS (+ROS) poolades från totalt en hel näthinna, och motsvarande restvävnad (-ROS) kombinerades också. Signalerna från de angivna proteinerna jämfördes därefter mellan +ROS-proverna och -ROS-proverna, och en hel isolerad näthinna fungerade som inmatningskontroll. Proteinkoncentration och homogeniseringsvolym för dessa prover presenteras i tabell 2. Resultaten i figur 3A visar att fördelningen av GNAT1 och ARR128 i mörkanpassade djur nära överens matchade deras kända mörktillståndsfördelningar där GNAT1-signalen var synbart starkast i +ROS-isoleringen, medan ARR1-signalen var mer robust i isoleringen av ROS. Följaktligen minskade GNAT1-signalen i den ljusexponerade näthinnan märkbart i +ROS-isoleringen och hade en ökad signal i -ROS-provet, medan ljusinducerad ARR1-flyttning kunde visualiseras i +ROS- och -ROS-prover. Resultaten från sex olika experiment kvantifierades, och statistiskt signifikanta skillnader hittades mellan mörka/ljusa förhållanden för GNAT1 och ARR1 i +ROS- och ROS-proverna (figur 3B). Dessa resultat överensstämmer med den tidigare kända protein ljus/mörka rörelsen inom stång subcellulära fack och starkt indikerar att denna teknik kan isolera berikade +ROS fraktioner.

För att ytterligare validera vår levande cellskalningsmetod undersökte vi kända ROS renhetsmarkörfördelningar i både +ROS- och -ROS-prover. I både mörk- och ljusanpassade prover är Gß5S-, Cyt C- och aktinsignalerna undantagna från +ROS-proverna (figur 3A), vilket visar att det inte finns någon kontaminering från andra cellulära skikt. Dessutom var Gß5L-signalen tydligt synlig i +ROS-proverna (figur 3A). Dessutom bekräftade aktin- och Gß5L-signalerna inte bara renheten hos +ROS- och -ROS-fraktionerna, utan fungerade också som kontroller för normalisering, där signalerna från +ROS-proverna normaliserades mot att Gß5L- och ROS-proverna normaliserades mot aktin. Som presenteras i figur 3A rekommenderas att de levande cellskalningsisolaten laddas tillsammans med en belastningskontroll, särskilt ett helt näthinne homogenat, för optimal immunblåsande normalisering och analys. Tillsammans validerar dessa data att vår levande cell peeling metod kan ge en snabb och reproducerbar metod för att isolera ROS subcellulära skiktet från resten av staven och näthinnan för protein analys.

Vi utvärderade sedan vår lyofiliserade peeling teknik för att verifiera att denna metod kan reproducerbart isolera ROS och RIS fack. Före immunoblotting avbildade vi ytorna på intakt och skalade frystorkade mus näthinnor med hjälp av en scanning elektronmikroskop (SEM) för att analysera vilket fotoreceptor subcellulärt lager tejpskalning gav (figur 4). Före skalning med tejp matchade ytan på den intakta fryshinnan (orange/rosatonat skikt) nära profilen för den karakteristiska cylindriska ROS (figur 4A). Efter det första tejpskalet tycktes ROS och RIS vara helt borttagna, vilket framgår av det enhetliga kärnskiktet som finns på ytan av den överblivna skalade fryshinnan (figur 4C). Efterföljande tejpskal avlägsnade RIS (tunt vitt skikt, figur 4B) från det fria lagrets fria yta, en process som sannolikt underlättas av det smala och ömtåliga anslutningsciliumet som förbinder de inre och yttre segmenten. Dessa resultat bekräftade att stång subcellular lager från frysofiliserade retinal vävnad kan vara specifikt fraktionerad med tejp.

Efter att ha validerat effektiviteten av denna metod visuellt, utsattes mörk- och ljusanpassad skalad näthinna för immunoblotting med samma tillvägagångssätt med hjälp av proteinmarkörer för olika fack som beskrivs för vår levande cell peeling metod (figur 3). Proteinkoncentration och homogeniseringsvolym för ROS-isolering (+ROS), RIS-isolering (+RIS) och de återstående näthinneskikten (-OIS) presenteras i tabell 2. Som förväntat skedde en tydlig ljusinducerad förskjutning för GNAT1 från ros till RIS, liksom ARR1 från RIS till ROS (figur 5A). GNAT1 var vanligast i +ROS-provet i mörker och +RIS-provet i ljuset, medan ARR1-signalen var omvänd (figur 5A). Vi normaliserade och kvantifierade därefter de translokerande proteinsignalerna från +ROS, +RIS och -OIS-isoleringar (figur 5B), med samma kontroller och tillvägagångssätt som den levande peelingmetoden. Vi kombinerade också +RIS- och -OIS-prover (figur 5C) för en mer direkt jämförelse med vår live cellfilterpappersskalningsmetod (figur 3B). Båda graferna visar den väletablerade och karakteristiska ljusinducerade flyttning av både GNAT1 och ARR1. Baserat på dessa observationer verkar tejpskalningsberedningen ge berikad ROS och RIS-fraktioner, vilket framgår av proteinsammansättningen av ARR1 och GNAT1 i dessa isoleringar.

Därefter utvärderades renheten i enskilda subcellulära isoleringar. I likhet med resultaten i figur 3A saknade +ROS-proverna signaler för aktin, cytokrom C och Gß5S samtidigt som de visade en stark Gß5L-signal (figur 5). Detta konstaterande visar en brist på förorening från andra subcellulära fack i vår +ROS prov beredning. Proteinhalten i det efterföljande subcellulära skiktet av stången, +RIS-isoleringen, bedömdes sedan. Vi fann att +RIS-provet var positivt för Cyt C, Gß5L och actin. Detta konstaterande överensstämmer med den kända sammansättningen av RIS, som är rik på mitokondrier och cytoskeletal element. Det sista skiktet, -OIS-isolatet, hade proteinfördelningar som överensstämde med de -ROS-prover som visas i figur 3A.

För att ytterligare bedöma nyttan av vår tejp peeling metod för att undersöka stång subcellulära fack protein kompositioner, undersökte vi specifikt immunoreaktivitet av rhodopsin kinas (GRK1) och proteinkinas C-alfa (PKCα) i våra +ROS, +RIS och -OIS prover. Olika experimentella metoder, såsom immunocytokemi (ICC) och western blot, ger ofta motstridiga resultat om den exakta lokaliseringen av dessa proteiner i stavar och näthinnan. GRK1, till exempel, tros vara relativt riklig i stav och kon OS för att medla fosforylering av ljusaktiverade opsins29. Immunolabeling av retinal skivor har dock avslöjat lokalisering av GRK1 antingen specifikt i OS30,31 eller i hela fotoreceptor lager32. PKCα, å andra sidan, är ett protein som vanligtvis används för ICC för att märka bipolära celler. Trots inga tydliga bevis på stav-specifika PKCα immunolabeling i retinal skivor25, finns det betydande biokemiska24,25 och funktionella33,34,35 bevis som stöder förekomsten och fosforylerande roll PKCα i ROS. Med hjälp av vår teknik fann vi att GRK1 immunoreactivity var mest intensiv i +ROS prover i ljusexponerade näthinnan och var frånvarande i -OIS prover (figur 6A). Omvänt visar vi att +ROS- och +RIS-proverna visade en svag signal för PKCα. Som framgår av figur 6B detekteras PKCα vanligen inte i ROS eller RIS genom immunofluorescensfärgning av näthinnesektioner. PKCα var dock immunodetected av västra blot (figur 6A,D). Eftersom isoleringarna +ROS och +RIS visar en stark Gß5L-signal och avsaknaden av Gß5S (figur 6A) är vi övertygade om att den svaga PKCα-signalen i både ROS- och RISprover är äkta och inte på grund av kontaminering från andra lager. För att visualisera de enskilda signalerna i +ROS, +RIS och -OIS-isoleringar kombinerades grk1- och PKCα-fläckarna för jämförelse (figur 6C).

Slutligen visar ett exempel på en suboptimal peelingsession (figur 6D) hur kontaminering från olika underskikt kan skeva resultaten, vilket ytterligare illustrerar vikten av datatolkning och införande av lämpliga kontrollantikroppar för att screena för experimentella peelingfel. I detta exempel på tejpskalning är en svag Gß5S-signal uppenbar i RIS-isoleringsfilen, vilket indikerar liten förorening från -OIS-provet. Beroende på användarens mål kanske denna lilla förorening inte är ett problem. Men i det här fallet undersökte vi PKCα-signalen i +ROS- och +RIS-prover, och PKCα-signalen är något högre i RIS-körfältet jämfört med ROS-banan (figur 6A,D), kanske på grund av förorening. Således bör försiktighet iakttas under peelingprocessen för att säkerställa en korrekt isolering och för att minimera förorening. Trots minimal förorening på grund av individuella fel, dessa data ger övertygande bevis för att tejp peeling metodik kan ge exakta sekventiella isoleringar av stång fotoreceptor lager för protein analys.

Figure 1
Bild 1: Schemat för de levande cellskalningsstegen. (A) Diagrammet visar huvudstegen för dissekering och hemisecting av det isolerade ögat. (B) Yttre fotoreceptorsegment avlägsnas stegvis genom sekventiell peeling med filterpapper. För det första är näthinnan orienterad så att fotoreceptorskiktet är i kontakt med filterpapperet. Därefter torkas filterpapperet genom att blotta på en pappershandduk och näthinnan skalas bort från filterpapperet. Detta skalade isolat samlas i ett rör som hålls på is. Denna process upprepas sju till åtta gånger för att helt ta bort stavens yttre segment (+ROS). Denna siffra skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Frystorkad näthinneskalningsprocess. (A) Flödesschema för provberedningen för den frystorkade näthinnan. Näthinnorna är orienterade så att näthinnans ganglioncelllager är i kontakt med filterpapperet och fotoreceptorerna är vända uppåt. (B) Efter frystorkad näthinna fästs den frystorkade näthinnan på en tejpbit efter att ha lagt till lätt tryck på tejpens överkant. Tejpen skalas bort, vilket tar bort stångens yttre segment (ROS) och stångens inre segment (RIS) lager. RIS-skiktet avlägsnas med fler tejpskal tills ROS-skiktet är synligt (orange/rosa lager). Denna siffra skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Uttryck av GNAT1 och ARR1 i isolerade stångfotoreceptorer efter sekventiell filterpappersskalning. (A) Immunoblots av +ROS och -ROS (ROS-utarmade) prover som samlats in med filterpappersskalande metod som förvärvats från mörk- och ljusanpassad näthinna. Blots undersöktes med antikroppar för ljusutlösta proteiner (transdukin (GNAT1) och arrestin (ARR1)) och kvalitetskontrollmarkörer (GTPase aktiverande protein (Gß5L/S) cytokrom C (Cyt C) och aktin). Två halverade näthinnan kombinerades för dessa representativa fläckar. B) Kvantifierade signaler från GNAT1 och ARR1 från mörk- och ljusanpassad näthinna. Det finns ömsesidiga ljusutlösta rörelser av GNAT1 och ARR från +ROS och -ROS isolat. Violindiagram visar det normaliserade uttrycket av +ROS- och -ROS-prover. Denna siffra har ändrats från Rose et al.36. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Bild 4: Scanning elektronmikroskop bilder av frystorkad näthinna. (A) Yta av frystorkad näthinna före tejpskalning (fotoreceptorsidan uppåt). (B) Det inre segmentets skikt efter tejpskalning. (C) Cellkroppsskiktets postpläcktejpning visar ett enhetligt nukleärt utseende. Denna siffra har ändrats från Rose et al.36 och skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Validering av tejpskalningsmetoden för att isolera ROS och RIS från frystorkad näthinna. Immunoblots undersöktes med transducin (GNAT1), arrestin (ARR1), GTPase aktiverande protein (Gß5L/S), cytokrom C (Cyt C) och aktin antikroppar. Prover erhölls från mörk- och ljusanpassad näthinnan och halverade retinal isolat (+ROS, +RIS, -OIS) kombinerades för mer koncentrerat material. (B) Kvantifierade signaler från GNAT1 och ARR1 plottas som violiner för de olika isolerade näthinneskikten, som erhölls från mörk- och ljusanpassad näthinna. (C) Normaliserade uttrycksnivåer från +RIS och -OIS kombinerades och ritades för att jämföra tejp- och filterpappersskalningsmetoder. Mörk- och ljusanpassade prover visade kända rörelser av viktiga fototransduktionsproteiner. Denna siffra har ändrats från Rose et al.36. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Tejpskalning av frystorkad näthinna för att undersöka subcellulär lokalisering av GRK1 och PKCα i fotoreceptorer. (A) En representativ västerländsk fläck av skalade prover från ljusanpassade C57BL/6J-möss som visar de relativa nivåerna av rhodopsinkinas (GRK1), proteinkinas C-alfa (PKCα), GTPase-aktiverande protein (Gß5L/S) och aktin. (B) Fryst näthinnesektion framställd av ljusexponerade möss inkuberade med PKCα-antikroppar (grön, 1:100). RPE, retinal pigmenterat epitel; OS, yttre segment; IS, inre segment; CB, cellkropp; ST, synaptisk terminal. Skalstreck = 10 μm. (C) PKCα och GRK1 normaliserade uttrycksnivåer för +ROS, +RIS, -OIS-prover ritas som violindiagram. (D) Suboptimal tejpskalning kan potentiellt ge något förorenade prover. Den röda rutan belyser +RIS-provet som är förorenat med något -OIS-prov, vilket ger både Gß5L/S-band och en högre PKCα-signal. Två halverade näthinnan kombinerades för alla fläckar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Mål Antikropp Utspädning Tillverkare
Arrestin Kanin anti-ARR1 1:1000 Chen, et. al., 2006.
Transdukt Mus anti-GNAT (TF-15) 1:1000 Cytosignal.
ß Aktin Kanin anti-ß Actin 1:5000 GeneTex Inc.
Cytokrom C Kanin anti-cytokrom C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
GAP (Gß5L/S) Kanin anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et. al., 1996.
Proteinkinas C alfa (PKC) Kanin anti-PKC (#2050) 1:1000 Cellsignalteknik.
Rhodopsinkinas (GRK1) Mus anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tabell 1: Förteckning över antikroppar som används för western blot validering av separationstekniker.

Filtrera pappers näthinneisolering
+ROS* -ROS* Hela näthinnan
Genomsnittlig proteinkoncentration (μg/ml) 700 1,500 1,500
RIPA-buffertvolym (μL) 90 150 200
Tejpskalning av näthinneisolering
+ROS* +RIS* -ROS* Hela näthinnan
Genomsnittlig proteinkoncentration (μg/ml) 520 440 1,200 1,600
RIPA-buffertvolym (μL) 100 100 125 150
* Kombinerade två halverade retinal isolering.

Tabell 2: Proteinkoncentration i näthinneisolering homogenat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Många retinala sjukdomar påverkar stångfotoreceptorceller, vilket leder till stavdöd och i slutändan fullständig synförlust37. En betydande del av de genetiska och mekanistiska ursprungen mänskliga retinal degeneration har framgångsrikt rekapitulerats i många musmodeller under åren. I det sammanhanget skulle förmågan att enkelt och selektivt separera enskilda stav subcellulära fack från den lilla mus näthinnan kraftigt öka vår förståelse av de lokaliserade biokemiska och molekylära underbyggnaderna av retinala sjukdomar. Dessutom tillåter den skiktade naturen hos neural näthinnan, i kombination med det unika, mycket polariserade arrangemanget av stångfotoreceptorer, isolering av stavfack genom selektiv peeling. Detta manuskript beskriver två protokoll som används för att isolera enskilda subcellulära fack av stång fotoreceptor celler för immunoblotting. Båda metoderna är inte bara betydligt snabbare och mindre tekniskt utmanande jämfört med den befintliga metoden för tangentiell sektionssektion9, utan de kräver också en betydligt mindre urvalsstorlek än den gemensamma biokemiska isoleringen av ros med hjälp av densitetsgradienter19. Sådana ROS gradient rening tekniker kräver 8-10 murin näthinnan för att tillförlitligt återställa gott om ROS, medan protokollen som presenteras här är lämpliga för en enda näthinnan.

Trots den övergripande enkelheten i de föreslagna teknikerna, en av de viktigaste utmaningarna gemensamma för båda protokollen gäller plattning av den böjda näthinnan på filterpapper som krävs för korrekt isolering av de olika subcellulära facken. Den isolerade näthinnan tenderar att krypa upp och få en musselliknande form. Om näthinnan har vikta kanter när den placeras på filterpapperet (fotoreceptorsidan antingen uppåt eller nedåt) kan detta minska utbytet av önskade isolerade stavlager. Ännu viktigare, om näthinnan inte är ordentligt utplattad, är lagerfel och förorening från andra subcellulära fack och näthinneceller ett troligt resultat (figur 6D). För att begränsa krökningen av den halverade näthinnerektangeln och för att korrigera den ofullkomliga inriktningen av staven och näthinnans lager kan näthinnerektangeln skäras i hälften för att producera två näthinnerutor. Genom att skära neural näthinnan i mindre bitar reduceras näthinnans naturliga krökning, och vävnaden är mer benägna att ligga platt på filterpapperet.

Att känna igen när de olika stavfacken har separerats fysiskt kan vara svårt för någon som är oerfaren med dessa tekniker. Vi rekommenderar att innan du påbörjar ett biologiskt signifikant experiment bör användaren gå igenom processen med prov näthinnan i en timme eller två. Praktiken bör leda till en betydande förbättring av verksamhetsutövarens färdigheter och färdigheter i metoderna. När filterpapper används för att skala bort ROS från en näthinna, indikerar inga uppenbara visuella ledtrådar när ROS-skiktet har isolerats. Medan näthinnan blir tunnare och bräckligare, måste användaren självövervaka och validera antalet skal för att isolera ROS noggrant. Dessutom kommer användning av filterpapper med olika fibertjocklekar och grovhet att förändra ROS-peelingtiden. Filterpapper med tjockare fibrer (som VWR Grade 413) isolerar näthinneskikt snabbare (6-8 skal), men kanske inte är lika selektivt och kan leda till förorening från andra lager. Filterpapper med tunnare fibrer (som Whatman Grade 1) isolerar näthinneskikt långsammare (12-15 skal) och ger en ren isolering av fotoreceptorskikten. Vi rekommenderar att du använder både tjockare och tunnare filterpapper för att minimera peelingtiden och säkerställa uppsamlingsrenhet.

Samtidigt är visuell approximation och tejp provhantering båda nyckeln till framgången med att isolera de subcellulära facken från den frystorkade näthinnan. Om för mycket tryck läggs till tejpen kommer hela fryshinnan att hålla fast vid bandet. När detta inträffar blir det längre och svårare att separera ROS, men inte omöjligt: placera en andra tejpbit på den fria ytan (på ganglioncellsidan) i näthinnan och dra långsamt bort lagren med tejp tills endast det orange / rosa lagret är synligt på den ursprungliga tejpen. Det är dock omöjligt att isolera RIS i det här läget. Om för lite tryck läggs till tejpen kommer en stor del av ROS inte att fästas på bandet. För att säkerställa korrekt ROS-tejp vidhäftning rekommenderar vi att du försiktigt trycker med pincett på de regioner som inte håller fast vid bandet. Vanligtvis resulterar det minsta trycket i avlägsnandet av ROS- och RIS-lagren, men mängden tryck måste bestämmas baserat på erfarenhet. Förekomsten av isolerad RIS kan fastställas genom att kontrollera om ett tunt, vitt skikt (som liknar en lätt dammning av snö) är synligt på det ursprungliga ROS-tejpskalet, medan närvaron av isolerad ROS lätt kan bestämmas genom att kontrollera färgen på stångfotoreceptorskiktet (orange för mörkanpassad, rosa för ljusanpassad) på tejpen.

En sista utmaning uppstår vid homogenisering av filterpappersskal (+ROS) från den levande näthinnan. Filterpapper absorberar lätt vätska, och en betydande mängd av homogeniseringsbufferten kommer att sugas upp under detta steg i protokollet. Att snurra vätskan i en minicentrifuger efter att ha placerat skalningspapperet på sidan av varje rör hjälper till att förhindra förlust av prov. Tyvärr kan det vara en tidskrävande process att snurra ner flera bitar filterpapper, och förlust av prov är oundviklig. För att lösa problemet tar du bort några av filterpappersbitarna och fokuserar på att homogenisera färre bitar åt gången. För att undvika förlust av prov under det här steget bör du dessutom överväga att minimera den totala mängden filterpapper som används för att isolera AVKASTNINGEN.

Även om båda våra metoder inte kräver en stor provstorlek, eller den exakta justeringen av ett blad för att dela upp näthinnan, finns det några begränsningar för vår fotoreceptor peeling tekniker som är värda att notera. För det första kan den frystorkade murin näthinnan inte vara mottaglig för peeling efterföljande fotoreceptor lager utöver ROS och RIS. För det andra är våra peelingmetoder mer lämpade för bearbetning av enskilda näthinnor och är inte mottagliga för stor batchbearbetning i ett sammanträde. För det tredje är experimentets framgång beroende av känslighetsgränsen för den antikropp som används i den västra fläcken. Trots dessa begränsningar visar våra representativa resultat att våra två isoleringsskalningstekniker effektivt kan isolera specifika stångfotoreceptorfack. Dessutom använder dessa två metoder billiga och vanliga labbmaterial (filterpapper och tejp), vilket gör dem mycket tillgängliga. I vår studie bedömde vi inte direkt om andra retinala celler kunde isoleras för immunblåsning; Vi tror dock att dessa metoder lätt kan modifieras för att gynna behoven hos ett brett tvärsnitt av näthinnans forskarsamhälle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH Grant EY12155, EY027193 och EY027387 till JC. Vi är tacksamma mot Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) och Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) för korrekturläsning av manuskriptet. Vi vill också tacka Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) och Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) för att ha tillhandahållit nödvändig utrustning för att samla in författaren som tillhandahölls bilder. Material från: Kasey Rose et al, Separation av fotoreceptor cellfack i mus näthinnan för proteinanalys, Molecular Neurodegeneration, publicerad [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

Neurovetenskap nummer 178
Två peelingmetoder för isolering av fotoreceptorcellfack i mus näthinnan för proteinanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter