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Neuroscience

Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Este protocolo presenta dos técnicas para aislar los compartimentos subcelulares de los fotorreceptores de bastón murino para el análisis de proteínas. El primer método utiliza retina viva y papel de filtro de celulosa para separar los segmentos externos de la varilla, mientras que el segundo emplea retinas liofilizadas y cinta adhesiva para pelar las capas internas y externas de la varilla.

Abstract

Los fotorreceptores de varilla son neuronas sensoriales altamente polarizadas con compartimentos distintos. Los bastones de ratón son largos (~80 μm) y delgados (~2 μm) y están empaquetados lateralmente en la capa más externa de la retina, la capa fotorreceptora, lo que resulta en la alineación de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, la sección tangencial de la retina plana congelada se ha utilizado para estudiar el movimiento y la localización de las proteínas dentro de diferentes compartimentos de bastones. Sin embargo, la alta curvatura de la retina del ratón dominante en bastón hace que la sección tangencial sea un desafío. Motivados por el estudio del transporte de proteínas entre compartimentos, desarrollamos dos métodos de peeling que aíslan de manera confiable el segmento externo de varilla (ROS) y otros compartimentos subcelulares para western blots. Nuestras técnicas relativamente rápidas y simples entregan fracciones enriquecidas y subcelulares específicas para medir cuantitativamente la distribución y redistribución de importantes proteínas fotorreceptoras en bastones normales. Además, estas técnicas de aislamiento también se pueden adaptar fácilmente para aislar e investigar cuantitativamente la composición proteica de otras capas celulares dentro de retinas sanas y degeneradas.

Introduction

Las células fotorreceptoras de varilla, estrechamente empaquetadas en la capa más externa de la retina neural, son una parte integral de la visión con luz tenue. Para funcionar como contadores de fotones fieles, las varillas utilizan una vía de señalización basada en proteína G, denominada fototransducción, para generar respuestas rápidas, amplificadas y reproducibles a la captura de un solo fotón. Esta respuesta a la luz finalmente desencadena un cambio en la corriente en la membrana plasmática y posteriormente se señala al resto del sistema visual1. Como su nombre lo indica, cada célula de varilla tiene una forma distinta en forma de varilla y exhibe una morfología celular altamente polarizada, que consiste en un segmento externo (OS), segmento interno (IS), cuerpo celular (CB) y terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular tiene una maquinaria proteica específica (unida a la membrana y soluble), características biomoleculares y complejos de proteínas que desempeñan funciones cruciales como la fototransducción visual, la limpieza general y la síntesis de proteínas, y la transmisión sináptica2,3.

Hace más de 30 años, se observó por primera vez el movimiento recíproco dependiente de la luz de las proteínas subcelulares, específicamente la transducina (lejos del SO) y la arrestina (hacia la SG)4,5,6,7. Al principio, este fenómeno observado fue recibido con escepticismo, debido en parte a la vulnerabilidad de la inmunohistoquímica al enmascaramiento del epítopo8. A principios de la década de 2000, se confirmó la translocación de proteínas dependientes de estímulos mediante el uso de una rigurosa y ardua técnica de seccionamiento físico9. La seccionamiento tangencial serial de las retinas de roedores de montaje plano congelado seguido de inmunoblotting reveló que la transducina9,10, la arrestina11,12 y la recuperación13 experimentan redistribución subcelular en respuesta a la luz. Se cree que la translocación impulsada por la luz de estas proteínas clave de señalización no solo regula la sensibilidad de la cascada de fototransducción9,14,15, sino que también puede ser neuroprotectora contra el daño de la luz16,17,18. Debido a que el transporte de proteínas impulsado por la luz en bastones parece ser muy significativo para la biología y fisiología celular de los bastones, las técnicas que permiten el aislamiento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar la distribución de proteínas son herramientas de investigación valiosas.

Actualmente, hay algunos métodos destinados a aislar los compartimentos subcelulares de los bastones. Sin embargo, estos métodos pueden ser largos y difíciles de reproducir, o requieren una cantidad considerable de aislamiento de retina. Las preparaciones de segmentos externos de varilla (ROS) a través de la centrifugación por gradiente de densidad19, por ejemplo, se usan comúnmente para separar las ROS del homogeneizado retiniano. Este método es ampliamente utilizado para western blot, pero el procedimiento lleva mucho tiempo y requiere un mínimo de 8-12 retinas murinas20. Por otro lado, la seccionamiento tangencial serial de retinas murinas y de rata congeladas se ha implementado con éxito en el aislamiento de la SG, IS, CB y ST9,11,13. Sin embargo, este método es técnicamente desafiante debido a la necesidad de aplanar completamente la retina murina pequeña y altamente curvada para alinear las capas retinianas antes de la sección tangencial. Dado que hay una gran cantidad de modelos de ratones y ratones transgénicos que recapitulan enfermedades del sistema visual, la creación de una técnica que separe de manera confiable, rápida y fácil los compartimentos de varillas individuales es prometedora para revelar los procesos fisiológicos que ocurren en cada compartimento especializado y los mecanismos que subyacen a los procesos visuales en la salud y la enfermedad.

Para facilitar estas investigaciones, describimos dos métodos de peeling que aíslan los compartimentos subcelulares de los bastones más fácilmente que los protocolos actuales. El primer método de peeling, adaptado de una técnica para exponer células bipolares marcadas fluorescentemente para el registro de pinzas de parche21, emplea papel de filtro de celulosa para eliminar secuencialmente las ROS de una retina murina viva y aislada (Figura 1). El segundo método, adaptado de un procedimiento que aísla las tres capas primarias de células retinianas de una retina de pollito22 y rana23, utiliza cinta adhesiva para eliminar el ROS y el segmento interno del bastón (RIS) de una retina liofilizada (Figura 2). Ambos procedimientos se pueden completar en 1 h y son considerablemente fáciles de usar. Proporcionamos validación de la efectividad de estos dos protocolos de separación para western blot mediante la utilización de retinas adaptadas a la oscuridad y expuestas a la luz de ratones C57BL / 6J para demostrar la translocación inducida por la luz de la transducina de bastón (GNAT1) y la arrestina (ARR1). Además, utilizando el método de pelado en cinta, proporcionamos evidencia adicional de que nuestra técnica se puede utilizar para examinar y abordar las inconsistencias entre los datos de localización de proteínas adquiridos por inmunocitoquímica (ICC) y western blots. Específicamente, nuestra técnica mostró que: 1) la isoforma de la proteína quinasa C-alfa (PKCα) está presente no solo en células bipolares, sino también en ROS murinas y RIS, aunque en bajas concentraciones24,25, y 2) rodopsina quinasa (GRK1) está presente predominantemente en la muestra aislada de SG. Estos datos demuestran la efectividad de nuestras dos técnicas de peeling para separar y cuantificar proteínas específicas de bastones y retinales.

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Protocol

Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales locales del comité de cuidado de animales de investigación de la Universidad del Sur de California (USC).

1. Método de peeling de retina de células vivas

  1. Preparación de tampones de Ames, papeles de pelar y plato de disección
    1. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte el papel de filtro de celulosa (Grado 413) en rectángulos que midan aproximadamente 5 mm x 2.5 mm. Guarde los esquejes para su uso futuro.
    2. Prepare 1 L de tampón HEPES de Ames combinando una botella de Ames' Medium, 2,38 g de HEPES y 0,877 g de NaCl. Disuelva los reactivos en una botella de vidrio estéril con agua ultrapura destilada y ajuste la osmolaridad y el pH a 280 mOsm y 7.4, respectivamente. Filtro para esterilizar (tamaño de poro 0,2 μm), selle la tapa con película de parafina y guárdela a 4 °C.
    3. Prepare 1 L de tampón de bicarbonato de Ames combinando una botella de Ames' Medium y 1,9 g de NaHCO3. Disuelva los reactivos en una botella de vidrio estéril con agua ultrapura destilada y ajuste la osmolaridad y el pH a 280 mOsm y 7.4, respectivamente. Filtro para esterilizar (tamaño de poro 0,2 μm), selle la tapa con película de parafina y guárdela a 4 °C.
      NOTA: Los tampones hepes y bicarbonato de Ames se pueden preparar con anticipación y almacenar durante 1 semana a 4 °C.
    4. En la parte inferior de una placa de Petri de 35 x 10 mm, cree un patrón de celosía o tablero de ajedrez con un bisturí (hoja No. 11, 40 mm).
      NOTA: El fondo texturizado de la placa de Petri mantiene el ojo aislado y flotante en su lugar durante la disección de la retina.
  2. Disección de la retina
    NOTA: Para este procedimiento, el tampón debe llevarse y mantenerse a temperatura ambiente (RT). Refresque el tampón de bicarbonato de Ames cada 15 minutos con el tampón de bicarbonato de Ames fresco carbogenado durante la disección. Esto mantiene el pH fisiológico necesario.
    1. Alrededor de 15-20 minutos antes de la disección, oxigene el tampón HEPES de Ames en un laboratorio de 100 ml o una botella de medios equipada con un adaptador de tapa de tubo y burbujee el tampón de bicarbonato de Ames con 95% de O2 y 5% de CO2 en una cámara de incubación de tejidos y en un laboratorio de 100 ml o una botella de medios equipada con un adaptador de tapa de tubo.
    2. Sacrificar un número igual de ambos sexos de ratones C57BL / 6J (2-3 meses de edad) ya sea por inhalación de isoflurano o dióxido de carbono (CO2) seguido de dislocación cervical. Enucle los ojos con tijeras curvas y coloque los ojos en la placa de Petri texturizada de 35 x 10 mm llena de tampón de bicarbonato de Ames burbujeado.
    3. Cree una copa del ojo (Figura 1A) perforando un orificio en la unión córnea-limbo con una aguja de 18 G. Corte a lo largo del perímetro de esta unión usando tijeras de iris de microdisección para eliminar la córnea de cada ojo. Separe la lente y el humor vítreo de cada ojo con pinzas y deseche.
    4. Aísle la retina de la copa del ojo pelando cuidadosamente el complejo epitelio pigmentado de la retina (EPR)-esclerótica-coroides lejos de la retina neural. Deseche el complejo RPE-esclerótica-coroides. Asegúrese de que la retina no se dañe durante la disección manejando solo los bordes.
    5. Transfiera retinas aisladas utilizando una pipeta de transferencia de orificio ancho en la tapa de un plato de 60 x 15 mm lleno de tampón de bicarbonato de Ames burbujeado.
    6. Oriente la retina en forma de hemisferio cóncava hacia arriba (los fotorreceptores están mirando hacia abajo hacia la parte inferior del plato) y divida cada retina (a través del nervio óptico) usando tijeras de iris o un bisturí (hoja No. 10, 40 mm). Recorte los bordes curvos de cada media retina para formar dos rectángulos (Figura 1A).
      NOTA: Minimizar la curvatura de cada retina cortada a la mitad permite que la retina se aplane mejor en los pasos posteriores de peeling y produce una exfoliación precisa de la capa del segmento externo del bastón (ROS).
    7. Almacene la retina cortada a la mitad en la cámara de incubación de tejido que está continuamente burbujeada con 95% de O2 y 5% de CO2.
      NOTA: Las retinas aisladas se pueden mantener en el tampón de bicarbonato carbogenado de Ames durante ~ 24 h.
  3. Recogida de segmentos exteriores de varilla (ROS) mediante pelado de papel de filtro
    NOTA: Actualice el tampón HEPES oxigenado RT de Ames cada 15-20 minutos durante el proceso de peeling para mantener el pH fisiológico necesario.
    1. Transfiera un rectángulo retiniano de la cámara de tejido con una pipeta de transferencia de orificio ancho y un trozo de papel de filtro de 5 mm x 2,5 mm a una placa de Petri de 35 x 10 mm llena de tampón HEPES de Ames burbujeado con 100% de O2.
    2. Oriente la retina dividida cóncava hacia arriba y asegúrese de que los fotorreceptores estén mirando hacia abajo hacia la parte inferior del plato. Agarre ligeramente los lados de la retina cortada a la mitad con pinzas y muévala sobre el papel de filtro. Una vez que la retina esté centrada en el papel de filtro, mueva el papel de filtro hacia arriba para que la retina cortada a la mitad toque el papel de filtro para crear la adhesión de papel ROS a filtro (Figura 1B).
      NOTA: Asegúrese de que la capa fotorreceptora haga contacto directo con el papel de filtro.
    3. Levante con cuidado el papel de filtro con la retina adjunta fuera del tampón HEPES de Ames. Coloque la parte inferior del papel de filtro (el lado sin retina) sobre una toalla de papel y aplique 2-3 veces para que se seque (Figura 1B).
    4. Agregue una gota de HEPES de Ames en el costado del papel de filtro con la retina. Coloque el papel de filtro sobre la toalla de papel nuevamente para que se seque, como se acaba de describir. Repita este proceso dos veces más.
    5. Coloque el papel de filtro con la retina de nuevo en la placa de Petri. Con pinzas, empuje suavemente todos los bordes de la retina cortada a la mitad hacia arriba y lejos del papel de filtro en todos los lados.
    6. Pelar delicadamente la retina lejos del papel de filtro. Toque solo el perímetro extremo de la retina durante el proceso de peeling para preservar la integridad estructural de la retina.
    7. Levante el papel de filtro de la placa de Petri y retire el exceso de líquido en una toalla de papel. Asegúrese de que el lado que estuvo en contacto con la retina no entre en contacto con la toalla de papel.
    8. Coloque el papel de filtro con la capa parcial de ROS en un tubo etiquetado sobre hielo (Figura 1B). Mantenga la retina pelada sumergida en el tampón HEPES de Ames.
    9. Repita el proceso de peeling para esta retina cortada a la mitad aproximadamente 7-8 veces para eliminar toda la capa de ROS. Después de cada peeling, coloque el papel de filtro en el mismo tubo, que contendrá las ROS aisladas de una retina cortada a la mitad.
      NOTA: Tenga cuidado de no rasgar la retina cortada a la mitad al despegarla del papel de filtro, ya que la retina se vuelve más delgada durante este proceso.
    10. Coloque el tubo que contiene todas las cáscaras de papel de filtro de la ROS aislada en hielo para su uso inmediato o congele directamente sobre hielo seco y guárdelo a -80 °C.
    11. Use pinzas para transferir la retina pelada sobrante (que carece de ROS) a un tubo debidamente marcado. Coloque el tubo sobre hielo para su uso inmediato o congele con hielo seco y guárdelo a -80 °C.
    12. Repita el proceso de peeling para cada retina cortada a la mitad y etiquete con precisión cada tubo.

2. Método de peeling de retina liofilizado

  1. Tampones, medio de pelado, preparación de platos de disección y configuración del liofilizador
    1. En una botella de almacenamiento de 1 L, prepare la solución de Ringer agregando 500 ml de agua ultrapura destilada. Disolver los reactivos para alcanzar una concentración final de 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES y 0,02 mM EDTA. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH, agregue agua ultrapura para llevar el volumen final a 1 L y ajuste la osmolaridad a 313 mOsm.
    2. Antes del uso, filtre la solución de Ringer con un filtro estéril (tamaño de poro 0,2 μm), selle la tapa con una película de parafina y guárdela a 4 °C.
    3. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte el papel de filtro de celulosa en rectángulos que midan aproximadamente 5 mm x 2,5 mm. Use un lápiz para escribir en un lado del papel de filtro para crear una etiqueta única.
    4. Cree un patrón de celosía o tablero de ajedrez en la parte inferior de una placa de Petri de 35 x 10 mm con un bisturí (hoja No. 11, 40 mm).
    5. Encienda el liofilizador de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
    6. Adquirir nitrógeno líquido en un matraz Dewar o matraz de vacío aislante similar.
  2. Disección retiniana
    1. Completar la disección retiniana como se describe en la sección 1 del protocolo (Figura 1A). Use la solución fría de Ringer en lugar del búfer de Ames.
    2. Después de la disección, guarde las retinas rectangulares cortadas a la mitad en una placa de Petri de 35 x 10 mm llena de solución fría de Ringer y colóquelas en hielo.
  3. Preparación de muestras de retina para la liofilización
    1. Coloque un trozo de papel de filtro de 5 x 2,5 mm y transfiera una retina cortada a la mitad a la placa de Petri texturizada de 35 x 10 mm llena de tampón frío de Ringer. Use una pipeta de transferencia de orificio ancho para mover cada retina entre platos.
    2. Use pinzas para voltear cuidadosamente la retina para que esté orientada cóncava hacia arriba (los fotorreceptores apuntan hacia arriba) y muévala para que descanse sobre el papel de filtro (Figura 2A).
      NOTA: Asegúrese de que los fotorreceptores no entren en contacto con el papel de filtro (la capa de células ganglionares de la retina debe estar en contacto directo con el papel de filtro) y que la etiqueta única sea visible. Para identificar fácil y rápidamente el aislado de retina, se recomienda que la etiqueta única se ubique en la parte inferior del papel de filtro.
    3. Levante el papel de filtro por los bordes hacia arriba para que el trozo de retina cortado a la mitad toque el papel de filtro y continúe levantando el papel de filtro de la solución de Ringer.
    4. Coloque la parte inferior del papel de filtro (el lado sin la retina) sobre una toalla de papel y aplique cuidadosamente 2-3 veces para eliminar el exceso de líquido (Figura 2A).
    5. Tome el papel de filtro con pinzas y agregue una gota de Ringer frío en el costado del papel de filtro con la retina. Coloque el papel de filtro sobre la toalla de papel nuevamente para eliminar el exceso de líquido. Repita el proceso dos veces más.
      NOTA: Estos pasos alternos de humectación y secado aseguran que el pañuelo esté firmemente unido al papel de filtro.
    6. Guarde cada muestra de retina/papel de filtro adherida en una placa de Petri llena de Ringer frío hasta que esté lista para congelar todas las muestras. Repita este proceso para todas las retinas cortadas a la mitad.
    7. Obtenga una placa de Petri limpia y seca de 35 x 10 mm (solo en la parte inferior) y un trozo de papel de aluminio cortado en un cuadrado de 3,5 x 3,5 pulgadas.
    8. Levante cada muestra del amortiguador del Ringer frío con pinzas. Asegúrese de que las pinzas entren en contacto solo con los bordes del papel de filtro, evitando la retina cortada a la mitad.
    9. Coloque la parte inferior de cada papel de filtro (el lado sin la retina) sobre una toalla de papel y retire el exceso de líquido.
    10. Agregue una gota de 1x PBS frío (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) en el lado del papel de filtro donde se adhiere la retina. Frote el papel de filtro en la toalla de papel para eliminar el exceso de líquido.
      NOTA: Asegúrese de que la humedad del papel de filtro se elimine lo suficiente antes de congelarse.
    11. Coloque todas las piezas de papel de filtro en la placa de Petri de 35 x 10 mm. Use un papel de seda sin pelusa para eliminar cualquier exceso de líquido que rodee el papel de filtro.
      NOTA: No llene la placa de Petri con muestras. Si se usan más de cuatro ojos murinos, considere usar una placa de Petri más grande o varias placas de Petri más pequeñas para contener las muestras de retina / papel de filtro.
    12. Envuelva firmemente todo el plato con papel de aluminio. Asegúrese de que los bordes del papel de aluminio estén asegurados y presionados suavemente en la parte inferior de la placa de Petri. Perfore un puñado de agujeros de 0.1-0.2 mm en la tapa de papel de aluminio (Figura 2A).
    13. Usando pinzas de metal, baje gradualmente la placa de Petri cubierta de papel de aluminio en el nitrógeno líquido. Mantenga las muestras en el nitrógeno líquido (<10 min) hasta que estén listas para liofilizar.
  4. Liofilización
    1. Coloque la placa de Petri cubierta de papel de aluminio en un matraz de liofilización y conéctela a la máquina liofilizadora siguiendo el protocolo del fabricante. Liofilizar la retina durante 30 min.
    2. Separe el matraz del liofilizador y apague la máquina según el fabricante.
    3. Retire el papel de aluminio y trabaje con las muestras liofilizadas el mismo día o guárdelas en tubos de microcentrífuga de 1 ml debidamente etiquetados. Coloque estos tubos en un recipiente (como un tubo cónico de 50 ml) lleno de un desecante anhidro y almacene las muestras a -80 °C.
  5. Recogida de segmentos exteriores e interiores de varillas mediante pelado de cinta adhesiva.
    1. Corte tiras de cinta adhesiva transparente (1-2 cm) y guarde las tiras en el borde del dispensador de cinta / banco de laboratorio / etc. para un uso rápido.
    2. Mueva una muestra de retina a la tapa de una placa de Petri de plástico de 60 x 15 mm para pelarla. Asegúrese de agarrar solo los bordes más externos del papel de filtro y evite tocar la retina.
    3. Usando tijeras de iris de punta roma (o tipo de tijera equivalente), corte un pequeño trozo rectangular de cinta al tamaño aproximado del tejido (1,5 x 2,5 mm).
    4. Coloque cuidadosamente un pequeño trozo de cinta adhesiva sobre la retina liofilizada (Figura 2B) y aplique una ligera presión con las pinzas para asegurarse de que se adhiera a la capa fotorreceptora (la capa superior teñida de naranja / rosa).
    5. Pelar lentamente la cinta. Tanto el segmento exterior de la varilla (ROS) como el segmento interior de la varilla (RIS) se adherirán a la cinta (Figura 2B).
    6. Asegúrese de que haya una película blanca delgada en la superficie fracturada. Esto es RIS.To separar el RIS, colocar otro trozo de cinta y empujar la cinta hacia abajo sobre la superficie fracturada (Figura 2B).
      NOTA: Puede tomar más de un trozo de cinta para eliminar toda la capa blanca delgada.
    7. Coloque el trozo de cinta con solo la capa naranja / rosa en un tubo de microcentrífuga etiquetado con +ROS.
    8. Coloque la cinta o trozos de cinta con la fina capa blanca en un tubo de microcentrífuga etiquetado con +RIS.
      NOTA: Separar la retina liofilizada con cinta adhesiva requiere práctica. La cantidad de presión aplicada a la cinta afectará la forma en que la muestra liofilizada se fraccionará. Si se ejerce demasiada presión sobre la cinta sobre la muestra, toda la retina liofilizada se despegará del papel de filtro y se pegará a la cinta. Si se agrega muy poca presión a la cinta, la capa superior naranja / rosa (+ ROS) no se pegará a la cinta.
    9. Recoja el tejido retiniano sobrante (desprovisto de capas ROS y RIS, -OIS) ubicado en el papel de filtro despegando la capa gruesa y blanca del papel de filtro con cinta adhesiva. Coloque el aislado en un tubo con la etiqueta -OIS.
    10. Repita estos pasos para cada muestra de retina cortada a la mitad.
    11. Guarde las capas aisladas de la retina liofilizada a temperatura ambiente si realiza cuantificación de proteínas, electroforesis en gel e inmunoblots de proteínas ese mismo día, o guárdelas en un recipiente (como un tubo cónico de 50 ml) lleno de desecante anhidro a -80 °C para su uso posterior.

3. Preparación de muestras de Western blot para aislamientos de pelado

  1. Preparar el búfer de lisis RIPA
    1. En una botella de almacenamiento de 100 ml, agregue reactivos para obtener una concentración final de 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS y 1 mM EDTA. Agregue 100 ml de agua ultrapura desionizada y mezcle bien.
      NOTA: El tampón de lisis RIPA se puede almacenar a 2-8 °C durante 2-3 semanas. Para un almacenamiento más prolongado, alícuota y guárdelo en el congelador de -20 °C.
    2. El día del experimento, agregue un cóctel inhibidor de la proteasa (0.1 M PMSF, 1: 1000 Aprotinin y 1: 1000 Leupeptin) al tampón de lisis RIPA y manténgalo en hielo.
  2. Preparación de lisado pelado de papel de filtro para western blot
    1. Asegúrese de que los tubos que contienen las cáscaras de papel de filtro y las retinas peladas sobrantes se mantengan en hielo (para el experimento el mismo día) o se retiren del almacenamiento del congelador a -80 ° C y se coloquen sobre hielo.
    2. Retire el exceso de líquido de la parte inferior de los tubos de la microcentrífuga que contienen las cáscaras de papel de filtro. Gire rápidamente en una mini centrífuga durante 2-4 s y deseche cualquier líquido restante.
    3. Pipetear 45-55 μL de tampón RIPA frío en tubos que contengan el aislado de papel de filtro.
    4. Homogeneice cada muestra con un mezclador de mortero limpio y en autoclave durante 1 min. Asegúrese de que el papel de filtro permanezca en contacto con el mezclador de morteros. Mantenga el papel de filtro en el lado de cada tubo en lugar de en la parte inferior.
    5. Con pinzas, mueva los papeles de filtro al costado de cada tubo y gire en la mini centrífuga durante 2-4 s. Esto eliminará el búfer RIPA del papel de filtro.
    6. Retire el papel de filtro seco y repita para todos los papeles de filtro dentro de cada tubo si es necesario.
    7. Transfiera el homogeneizado a un nuevo tubo y etiquételo adecuadamente.
      NOTA: Este es el paso que más tiempo consume, y si no se completa correctamente, gran parte de la muestra terminará siendo absorbida por el papel de filtro.
    8. Pipete 60-80 μL de tampón RIPA frío en los tubos individuales con las retinas peladas sobrantes.
    9. Homogeneice cada muestra con un mezclador de mortero limpio y en autoclave durante 1 min.
  3. Pelado de cinta Preparación de lisado para western blot
    1. Coloque las muestras liofilizadas RT o las muestras de -80 °C sobre hielo.
    2. Pipete 50-70 μL de tampón RIPA frío en cada tubo que contenga cáscaras de cinta +ROS y +RIS.
    3. Pipete 60-80 μL de tampón de lisis en frío en los tubos -OIS que contienen la retina liofilizada restante, con la ROS y la RIS eliminadas.
    4. Homogeneizar cada muestra con un mezclador de mortero limpio durante 1 min. Asegúrese de que la cinta en los tubos individuales permanezca en contacto con el mezclador de morteros y el tampón de lisis.
    5. Con pinzas esterilizadas, mueva la cinta hacia un lado de los tubos y gire con una mini centrífuga durante 2-4 s. Esto eliminará el líquido de la cinta. Retire la cinta seca de los tubos.
      NOTA: En este punto, puede combinar dos aislados de media retina de la misma retina para el método de "peeling de papel de filtro" o "peeling de cinta" para asegurarse de que tiene suficiente volumen para realizar un ensayo de ácido bicinconinico (BCA).

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Representative Results

Las estrategias actuales se desarrollaron para proporcionar métodos relativamente rápidos y simples para aislar y analizar proteínas entre compartimentos subcelulares de bastones específicos para el análisis de western blot. Aplicamos dos técnicas de peeling secuencial (Figura 1 y Figura 2) seguidas de inmunoblotting para demostrar que estos métodos podrían usarse de manera confiable para detectar la distribución conocida de transducina de bastón (GNAT1) y arrestina (ARR1) en animales adaptados a la oscuridad y a la luz. Para validar la efectividad de nuestros dos protocolos en el aislamiento preciso de compartimentos subcelulares de bastones sin contaminación de otras capas celulares, se sondearon inmunoblots con anticuerpos para el citocromo C (Cyt C), actina y Gß5S / Gß5L26. En la Tabla 1 se presenta una lista de anticuerpos y diluciones utilizadas. Cyt C y actina indicaron pureza ROS, ya que son proteínas abundantes en la retina proximal pero están ausentes en la ROS. Gß5L, un componente de la proteína activadora de GTPasa (GAP) para GNAT127, está presente en las ROS y RIS y sirvió como control para estos aislamientos. Gß5S, la isoforma de empalme más corta que no está presente en ROS o RIS, pero sí en todos los demás compartimentos de varillas, sirvió como control para compartimentos subcelulares aislados no ROS / RIS.

En primer lugar, se evaluó la efectividad de nuestro método secuencial de peeling retiniano de células vivas mediante el análisis de la distribución de GNAT1 y ARR1 en bastones de ratones adaptados a la oscuridad y la luz (Figura 3). Los papeles de filtro que contenían las ROS (+ROS) se agruparon a partir de un total de una retina entera, y también se combinó el tejido residual correspondiente (-ROS). Las señales de las proteínas indicadas se compararon posteriormente entre las muestras +ROS y las muestras -ROS, y toda una retina aislada sirvió como control de entrada. La concentración de proteínas y el volumen de homogeneización de estas muestras se presentan en la Tabla 2. Los resultados presentados en la Figura 3A muestran que, en animales adaptados a la oscuridad, la distribución de GNAT1 y ARR128 coincidió estrechamente con sus distribuciones de estado oscuro conocidas, donde la señal de GNAT1 fue visiblemente la más fuerte en el aislamiento +ROS, mientras que la señal ARR1 fue más robusta en el aislamiento -ROS. En consecuencia, en las retinas expuestas a la luz, la señal GNAT1 se redujo notablemente en el aislamiento +ROS y tuvo una señal aumentada en la muestra -ROS, mientras que la translocación ARR1 inducida por la luz se pudo visualizar en muestras +ROS y -ROS. Se cuantificaron los resultados de seis experimentos diferentes, y se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las condiciones de oscuridad / luz para GNAT1 y ARR1 en las muestras +ROS y -ROS (Figura 3B). Estos hallazgos son consistentes con el movimiento de luz/oscuridad de la proteína previamente conocido dentro de los compartimentos subcelulares de los bastones e indican fuertemente que esta técnica puede aislar fracciones enriquecidas + ROS.

Para validar aún más nuestro método de peeling de células vivas, investigamos las distribuciones conocidas de marcadores de pureza de ROS en muestras de +ROS y -ROS. Tanto en muestras adaptadas a la oscuridad como a la luz, las señales Gß5S, Cyt C y actina se excluyen de las muestras +ROS (Figura 3A), lo que demuestra una ausencia de contaminación de otras capas celulares. Además, la señal Gß5L fue claramente visible en las muestras +ROS (Figura 3A). Además, las señales de actina y Gß5L no solo confirmaron la pureza de las fracciones +ROS y -ROS, sino que también actuaron como controles para la normalización, normalizando las señales de las muestras +ROS contra las muestras Gß5L y -ROS contra la actina. Como se presenta en la Figura 3A, se recomienda que los aislados de peeling de células vivas se carguen junto con un control de carga, específicamente un homogeneizado retiniano completo, para una normalización y análisis óptimos de inmunoblotting. Juntos, estos datos validan que nuestro método de peeling de células vivas puede proporcionar un enfoque rápido y reproducible para aislar la capa subcelular ROS del resto del bastón y la retina para el análisis de proteínas.

A continuación, evaluamos nuestra técnica de peeling liofilizado para verificar que este método pudiera aislar de manera reproducible los compartimentos ROS y RIS. Antes de la inmunoblotting, obtuvimos imágenes de las superficies de las retinas de ratón liofilizadas intactas y peladas utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM) para analizar qué capa subcelular fotorreceptora produjo el peeling de cinta (Figura 4). Antes de pelarse con cinta adhesiva, la superficie de la retina liofilizada intacta (capa teñida de naranja / rosa) coincidía estrechamente con el perfil de la ROS cilíndrica característica (Figura 4A). Después de la exfoliación inicial de la cinta, el ROS y el RIS parecieron eliminarse por completo, como lo demuestra la capa nuclear uniforme presente en la superficie de la retina liofilizada pelada sobrante (Figura 4C). Las exfoliaciones posteriores de la cinta eliminaron el RIS (capa blanca delgada, Figura 4B) de la superficie libre de la capa pelada, un proceso probablemente ayudado por el cilio de conexión estrecho y frágil que une los segmentos interno y externo. Estos resultados confirmaron que las capas subcelulares de bastoncillos del tejido retiniano liofilizado se pueden fraccionar específicamente con cinta adhesiva.

Habiendo validado visualmente la efectividad de este método, las retinas peladas adaptadas a la oscuridad y la luz se sometieron a inmunoblotting utilizando el mismo enfoque utilizando marcadores de proteínas para diferentes compartimentos como se describe para nuestro método de peeling de células vivas (Figura 3). La concentración de proteínas y el volumen de homogeneización para el aislamiento de ROS (+ROS), el aislamiento de RIS (+RIS) y las capas retinianas restantes (-OIS) se presentan en la Tabla 2. Como se esperaba, hubo un claro cambio inducido por la luz para GNAT1 de la ROS a la RIS, así como ARR1 de la RIS a la ROS (Figura 5A). GNAT1 fue más abundante en la muestra +ROS en la oscuridad y la muestra +RIS en la luz, mientras que la señal ARR1 se invirtió (Figura 5A). A continuación, normalizamos y cuantificamos las señales de proteínas de translocación de los aislamientos +ROS, +RIS y -OIS (Figura 5B), utilizando los mismos controles y enfoque que la metodología de peeling en vivo. También combinamos muestras +RIS y -OIS (Figura 5C) para una comparación más directa con nuestro método de pelado de papel de filtro de células vivas (Figura 3B). Ambos gráficos muestran la translocación inducida por la luz bien establecida y característica de GNAT1 y ARR1. Sobre la base de estas observaciones, la preparación de pelado en cinta parece producir fracciones ROS y RIS enriquecidas, como lo demuestra la composición proteica de ARR1 y GNAT1 en estos aislamientos.

A continuación, se evaluó la pureza de los aislamientos subcelulares individuales. De manera similar a los resultados mostrados en la Figura 3A, las muestras +ROS carecían de señales para actina, citocromo C y Gß5S mientras mostraban una fuerte señal Gß5L (Figura 5). Este hallazgo muestra una falta de contaminación de otros compartimentos subcelulares en nuestra preparación de muestras +ROS. Luego se evaluó el contenido de proteína de la capa subcelular posterior de la varilla, el aislamiento +RIS. Encontramos que la muestra +RIS fue positiva para Cyt C, Gß5L y actina. Este hallazgo es consistente con la composición conocida de RIS, que es rica en mitocondrias y elementos citoesqueléticos. La capa final, el aislado -OIS, tenía distribuciones de proteínas consistentes con las muestras de -ROS que se muestran en la Figura 3A.

Para evaluar aún más la utilidad de nuestro método de peeling de cinta adhesiva en la investigación de las composiciones de proteínas de los compartimentos subcelulares de varillas, examinamos específicamente la inmunorreactividad de la rodopsina quinasa (GRK1) y la proteína quinasa C-alfa (PKCα) en nuestras muestras +ROS, +RIS y -OIS. Diferentes métodos experimentales, como la inmunocitoquímica (ICC) y el western blot, a menudo producen resultados contradictorios sobre la localización precisa de estas proteínas en bastones y la retina. Se cree que GRK1, por ejemplo, es relativamente abundante en el sistema operativo de bastones y conos para mediar la fosforilación de las opsinas activadas por la luz29. Sin embargo, el inmunomarcado de lonchas retinianas ha revelado la localización de GRK1 ya sea específicamente en la SG30,31 o en toda la capa de fotorreceptores32. PKCα, por otro lado, es una proteína que se usa comúnmente para ICC para etiquetar las células bipolares. A pesar de que no hay evidencia clara de inmunoetiquetado PKCα específico del bastón en rodajas retinianas25, existe evidencia bioquímica considerable24,25 y funcional33,34,35 que apoya la presencia y el papel fosforilante de PKCα en las ROS. Utilizando nuestra técnica, encontramos que la inmunorreactividad GRK1 fue más intensa en las muestras +ROS en retinas expuestas a la luz y estuvo ausente en muestras -OIS (Figura 6A). Por el contrario, mostramos que las muestras +ROS y +RIS mostraron una señal débil para PKCα. Como se puede ver en la Figura 6B, PKCα comúnmente no se detecta en las ROS o RIS por tinción de inmunofluorescencia de las secciones de la retina. Sin embargo, PKCα fue inmunodetectado por western blot (Figura 6A,D). Debido a que los aislamientos +ROS y +RIS muestran una fuerte señal Gß5L y una ausencia de Gß5S (Figura 6A), estamos seguros de que la señal PKCα tenue en las muestras ROS y RIS es genuina y no se debe a la contaminación de otras capas. Para visualizar las señales individuales en los aislamientos +ROS, +RIS y -OIS, se combinaron las manchas GRK1 y PKCα y se trazaron para su comparación (Figura 6C).

Por último, un ejemplo de una sesión de peeling subóptima (Figura 6D) demuestra cómo la contaminación de diferentes subcapas puede sesgar los resultados, ilustrando aún más la importancia de la interpretación de los datos y la inclusión de los anticuerpos de control apropiados para detectar errores experimentales de peeling. En este ejemplo de aislamiento de pelado de cinta, una débil señal Gß5S es evidente en el carril de aislamiento RIS, lo que indica una ligera contaminación de la muestra -OIS. Dependiendo del objetivo del usuario, esta ligera contaminación puede no ser un problema. Sin embargo, en este caso, estábamos investigando la señal PKCα en muestras +ROS y +RIS, y la señal PKCα es ligeramente mayor en el carril RIS en comparación con el carril ROS (Figura 6A, D), tal vez debido a la contaminación. Por lo tanto, se debe tener cuidado durante el proceso de pelado para garantizar un aislamiento preciso y minimizar la contaminación. A pesar de la contaminación mínima debido a un error individual, estos datos proporcionan evidencia convincente de que la metodología de pelado de cinta puede producir aislamientos secuenciales precisos de capas de fotorreceptores de varilla para el análisis de proteínas.

Figure 1
Figura 1: Esquema de los pasos de peeling de células vivas. (A) El diagrama muestra los pasos principales para diseccionar y hemisectar el ojo aislado. (B) Los segmentos externos del fotorreceptor se eliminan incrementalmente mediante pelado secuencial con papel de filtro. En primer lugar, las retinas están orientadas para que la capa fotorreceptora esté en contacto con el papel de filtro. A continuación, el papel de filtro se seca secando en una toalla de papel, y la retina se despega del papel de filtro. Este aislado pelado se recoge en un tubo mantenido en hielo. Este proceso se repite de siete a ocho veces para eliminar completamente el segmento exterior de la varilla (+ROS). Esta figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Proceso de peeling de retina liofilizada. (A) Diagrama de flujo de la preparación de la muestra para la retina liofilizada. Las retinas están orientadas de modo que la capa de células ganglionares de la retina esté en contacto con el papel de filtro y los fotorreceptores estén hacia arriba. (B) Después de la liofilización, la retina liofilizada se adhiere a un trozo de cinta después de agregar una ligera presión a la parte superior de la cinta. La cinta se despega, eliminando las capas del segmento exterior de la varilla (ROS) y del segmento interno de la varilla (RIS). La capa RIS se elimina mediante más peladuras de cinta hasta que la capa ROS es visible (capa naranja / rosa). Esta figura fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Expresión de GNAT1 y ARR1 en fotorreceptores de varilla aislados después del peeling secuencial de papel de filtro. (A) Inmunoblots de muestras +ROS y -ROS (ROS-agotadas) recogidas por el método de peeling de papel de filtro adquiridos de retinas adaptadas a la oscuridad y a la luz. Los blots fueron sondeados con anticuerpos para proteínas activadas por la luz (transducina (GNAT1) y arrestina (ARR1)) y marcadores de control de calidad (proteína activadora de GTPasa (Gß5L / S), citocromo C (Cyt C) y actina). Se combinaron dos retinas reducidas a la mitad para estas manchas representativas. (B) Señales cuantificadas de GNAT1 y ARR1 de retinas adaptadas a la oscuridad y a la luz. Hay un movimiento recíproco activado por la luz de GNAT1 y ARR a partir de aislados +ROS y -ROS. Las gráficas de violín representan la expresión normalizada de las muestras +ROS y -ROS. Esta cifra ha sido modificada a partir de Rose et al.36. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes de microscopio electrónico de barrido de retina liofilizada. (A) Superficie de la retina liofilizada antes de la descamación con cinta (lado fotorreceptor hacia arriba). (B) La capa del segmento interno poste pelado de la cinta. (C) La capa del cuerpo celular después de la peladura de la cinta muestra una apariencia nuclear uniforme. Esta figura ha sido modificada a partir de Rose et al.36 y fue creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Validación del método de peeling en cinta para aislar ROS y RIS de retina liofilizada. (A) Western blots de muestras +ROS, +RIS y -OIS (ROS/RIS-depleted) recogidas por el método de peeling en cinta. Los inmunoblots fueron sondeados con transducina (GNAT1), arrestina (ARR1), proteína activadora de GTPasa (Gß5L/S), citocromo C (Cyt C) y anticuerpos de actina. Se obtuvieron muestras de retinas adaptadas a la oscuridad y la luz y se combinaron aislados de retina reducidos a la mitad (+ROS, +RIS, -OIS) para obtener material más concentrado. (B) Las señales cuantificadas de GNAT1 y ARR1 se trazan como gráficas de violín para las diferentes capas retinianas aisladas, que se obtuvieron de retinas adaptadas a la oscuridad y la luz. (C) Los niveles de expresión normalizados de +RIS y -OIS se combinaron y trazaron para comparar los métodos de pelado de cinta y papel de filtro. Las muestras adaptadas a la oscuridad y a la luz mostraron el movimiento conocido de proteínas clave de fototransducción. Esta cifra ha sido modificada a partir de Rose et al.36. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Peeling en cinta de retina liofilizada para investigar la localización subcelular de GRK1 y PKCα en fotorreceptores. (A) Un western blot representativo de muestras peladas de ratones C57BL/6J adaptados a la luz que demuestran los niveles relativos de rodopsina quinasa (GRK1), proteína quinasa C-alfa (PKCα), proteína activadora de GTPasa (Gß5L/S) y actina. (B) Sección retiniana congelada preparada a partir de ratones expuestos a la luz incubados con anticuerpos PKCα (verde, 1:100). EPR: epitelio pigmentado de la retina; SO: segmento exterior; IS: segmento interno; CB: cuerpo celular; ST, terminal sináptico. Barra de escala = 10 μm. (C) Los niveles de expresión normalizados de PKCα y GRK1 para muestras +ROS, +RIS, -OIS se trazan como gráficas de violín. (D) El pelado de cinta subóptimo podría producir muestras ligeramente contaminadas. El cuadrado rojo resalta la muestra +RIS contaminada con alguna muestra -OIS, produciendo tanto bandas Gß5L/S como una señal PKCα más alta. Se combinaron dos retinas reducidas a la mitad para todas las manchas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Blanco Anticuerpo Dilución Fabricante
Arrestina Conejo anti-ARR1 1:1000 Chen, et. al., 2006.
Transducina Ratón anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Actina Conejo anti-ß Actina 1:5000 GeneTex Inc.
Citocromo C Conejo anti-citocromo C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
GAP (Gß5L/S) Conejo anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et. al., 1996.
Proteína quinasa C alfa (PKC) Conejo anti-PKC (#2050) 1:1000 Tecnología de señalización celular.
Rodopsina quinasa (GRK1) Ratón anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tabla 1: Lista de anticuerpos utilizados para la validación de western blot de las técnicas de separación.

Aislamiento retiniano de papel de filtro
+ROS* -ROS* Retina entera
Concentración media de proteínas (μg/ml) 700 1,500 1,500
Volumen de búfer RIPA (μL) 90 150 200
Aislamiento retiniano de peeling con cinta adhesiva
+ROS* +RIS* -ROS* Retina entera
Concentración media de proteínas (μg/ml) 520 440 1,200 1,600
Volumen de búfer RIPA (μL) 100 100 125 150
* Se combinaron dos aislamientos de retina reducidos a la mitad.

Tabla 2: Concentración de proteínas en homogeneizados de aislamiento retiniano.

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Discussion

Muchas enfermedades de la retina afectan a las células fotorreceptoras de bastoncillos, lo que lleva a la muerte de los bastones y, en última instancia, a la pérdida completa de la visión37. Una parte significativa de los orígenes genéticos y mecanicistas de la degeneración retiniana humana se han recapitulado con éxito en numerosos modelos de ratones a lo largo de los años. En ese contexto, la capacidad de separar fácil y selectivamente los compartimentos subcelulares de bastoncillos individuales de la retina de ratón pequeño mejoraría en gran medida nuestra comprensión de los fundamentos bioquímicos y moleculares localizados de las enfermedades de la retina. Además, la naturaleza estratificada de la retina neural, combinada con la disposición única y altamente polarizada de los fotorreceptores de bastón, permite el aislamiento de los compartimentos de los bastones mediante peeling selectivo. Este manuscrito describe dos protocolos utilizados para aislar compartimentos subcelulares individuales de células fotorreceptoras de bastones para la inmunoblotting. Ambos métodos no solo son considerablemente más rápidos y menos desafiantes técnicamente en comparación con el método existente de seccionamiento tangencial9, sino que también requieren un tamaño de muestra sustancialmente menor que el aislamiento bioquímico común de las ROS utilizando gradientes de densidad19. Tales técnicas de purificación de gradiente ros requieren 8-10 retinas murinas para recuperar de manera confiable una ROS amplia, mientras que los protocolos presentados aquí son adecuados para retinas individuales.

A pesar de la simplicidad general de las técnicas propuestas, uno de los principales desafíos comunes a ambos protocolos se refiere al aplanamiento de la retina curvada en el papel de filtro requerido para el aislamiento adecuado de los diferentes compartimentos subcelulares. La retina aislada tiende a acurrucarse y tomar una forma de almeja. Si la retina tiene bordes doblados cuando se coloca sobre el papel de filtro (lado del fotorreceptor hacia arriba o hacia abajo), esto puede disminuir el rendimiento de las capas de varilla aisladas deseadas. Más importante aún, si la retina no está correctamente aplanada, entonces la desalineación de capas y la contaminación de otros compartimentos subcelulares y células de la retina es un resultado probable (Figura 6D). Para limitar la curvatura del rectángulo retiniano cortado a la mitad y rectificar la alineación imperfecta del bastón y las capas retinianas, el rectángulo retiniano se puede cortar por la mitad para producir dos cuadrados retinianos. Al cortar la retina neural en trozos más pequeños, se reduce la curvatura natural de la retina y es más probable que el tejido quede plano sobre el papel de filtro.

Reconocer cuándo los diferentes compartimentos de varillas se han separado físicamente puede ser complicado para alguien sin experiencia con estas técnicas. Aconsejamos que antes de comenzar un experimento biológicamente significativo, el usuario debe ejecutar el proceso con muestras de retina durante una o dos horas. La práctica debe resultar en una mejora sustancial en las habilidades del operador y la competencia en los métodos. Cuando se usa papel de filtro para pelar las ROS de una retina viva, no hay señales visuales obvias que indiquen cuándo se ha aislado la capa de ROS. Mientras que la retina se vuelve más delgada y frágil, el usuario tendrá que autocontrolarse y validar el número de peelings para aislar las ROS con precisión. Además, el uso de papel de filtro con diferentes espesores de fibra y grosor alterará el tiempo de pelado de ROS. El papel de filtro con fibras más gruesas (como VWR Grado 413) aislará las capas de retina más rápido (6-8 peelings), pero puede no ser tan selectivo y puede conducir a la contaminación de otras capas. El papel de filtro con fibras más delgadas (como Whatman Grado 1) aislará las capas retinianas más lentamente (12-15 peelings) y dará un aislamiento limpio de las capas fotorreceptoras. Recomendamos usar papel de filtro más grueso y delgado para minimizar el tiempo de pelado y garantizar la pureza de la recolección.

Al mismo tiempo, la aproximación visual y el manejo de muestras en cinta son clave para el éxito del aislamiento de los compartimentos subcelulares de la retina liofilizada. Si se agrega demasiada presión a la cinta, toda la retina liofilizada se adherirá a la cinta. Una vez que esto ocurre, la separación de la ROS se vuelve más larga y más difícil, pero no imposible: coloque un segundo trozo de cinta en la superficie libre (en el lado de la célula ganglionar) de la retina y retire lentamente las capas con cinta adhesiva hasta que solo la capa naranja / rosada sea visible en la pieza inicial de cinta. Aislar el RIS en este punto, sin embargo, es imposible. Si se agrega muy poca presión a la cinta, una gran parte de la ROS no se adherirá a la cinta. Para garantizar una correcta adhesión ros-tape, aconsejamos presionar suavemente con pinzas en las regiones que no se adhieren a la cinta. Por lo general, la presión más mínima resulta en la eliminación de las capas ROS y RIS, sin embargo, la cantidad de presión debe determinarse en función de la experiencia. La presencia de RIS aislado se puede determinar verificando si una capa delgada y blanca (similar a un ligero polvo de nieve) es visible en la cáscara inicial de la cinta ROS, mientras que la presencia de ROS aislada se puede determinar fácilmente verificando el color de la capa fotorreceptora de varilla (naranja para adaptado a la oscuridad, rosado para adaptado a la luz) en la cinta.

Un último reto surge al homogeneizar los peelings de papel de filtro (+ROS) de la retina viva. El papel de filtro absorbe fácilmente el líquido, y una cantidad considerable del tampón de homogeneización se absorberá durante este paso del protocolo. Girar el líquido hacia abajo en una mini centrífuga después de colocar el papel pelado en el lado de cada tubo ayuda a prevenir la pérdida de muestra. Desafortunadamente, girar varias piezas de papel de filtro puede ser un proceso que consume mucho tiempo, y la pérdida de muestra es inevitable. Para abordar este problema, elimine algunas de las piezas de papel de filtro y concéntrese en homogeneizar menos piezas a la vez. Además, para evitar la pérdida de muestra durante este paso, considere minimizar la cantidad total de papel de filtro utilizado para aislar el ROS.

Si bien ambos métodos no requieren un gran tamaño de muestra, o la alineación precisa de una cuchilla para seccionar la retina, hay algunas limitaciones en nuestras técnicas de peeling de fotorreceptores que vale la pena señalar. En primer lugar, la retina murina liofilizada puede no ser susceptible de pelar las capas fotorreceptoras posteriores más allá de las ROS y RIS. En segundo lugar, nuestros métodos de peeling son más adecuados para procesar retinas individuales y no son susceptibles de procesamiento por lotes grandes en una sola sesión. En tercer lugar, el éxito del experimento depende del límite de sensibilidad del anticuerpo utilizado en el western blot. A pesar de estas limitaciones, nuestros resultados representativos demuestran que nuestras dos técnicas de peeling de aislamiento pueden aislar eficientemente compartimentos fotorreceptores específicos de varillas. Además, estos dos métodos utilizan materiales de laboratorio baratos y comunes (papel de filtro y cinta adhesiva), lo que los hace altamente accesibles. En nuestro estudio, no evaluamos directamente si otras células de la retina podían aislarse para la inmunoblotting; sin embargo, creemos que estos métodos pueden modificarse fácilmente para beneficiar las necesidades de una amplia sección transversal de la comunidad de investigación de la retina.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NIH Grant EY12155, EY027193 y EY027387 a JC. Estamos agradecidos al Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, EE.UU.) y Natalie Chen (USC, Los Ángeles, EE.UU.) por la revisión del manuscrito. También nos gustaría agradecer al Dr. Seth Ruffins (USC, Los Ángeles, EE.UU.) y al Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Ángeles, EE.UU.) por proporcionar el equipo necesario para recoger las imágenes proporcionadas por el autor. Material de: Kasey Rose et al, Separación de compartimentos de células fotorreceptoras en retina de ratón para análisis de proteínas, Molecular Neurodegeneration, publicado [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurociencia Número 178
Dos métodos de peeling para el aislamiento de compartimentos de células fotorreceptoras en la retina del ratón para el análisis de proteínas
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Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

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