Summary

To peeling metoder for isolering av photoreceptor celle rom i musen netthinnen for protein analyse

Published: December 07, 2021
doi:

Summary

Denne protokollen presenterer to teknikker for å isolere de subcellulære rommene til murine rod fotoreseptorer for proteinanalyse. Den første metoden benytter levende netthinne og cellulosefilterpapir for å skille stang ytre segmenter, mens den andre bruker lyofilisert netthinne og tape for å skrelle bort stang indre og ytre segmentlag.

Abstract

Rod fotoreseptorer er svært polariserte sensoriske nevroner med forskjellige rom. Musestenger er lange (~ 80 μm) og tynne (~ 2 μm) og er sidelengs pakket i det ytterste laget av netthinnen, fotoreseptorlaget, noe som resulterer i justering av analoge subcellulære rom. Tradisjonelt har tangentiell seksjonering av den frosne flatmonterte netthinnen blitt brukt til å studere bevegelse og lokalisering av proteiner i forskjellige stangrom. Imidlertid gjør den høye krumningen i den stangdomenerende mus netthinnen tangentielle seksjoner utfordrende. Motivert av studiet av proteintransport mellom rom, utviklet vi to peelingmetoder som pålitelig isolerer stangens ytre segment (ROS) og andre subcellulære rom for vestlige flekker. Våre relativt raske og enkle teknikker leverer berikede og subcellulære fraksjoner for kvantitativt å måle fordelingen og omfordelingen av viktige fotoreseptorproteiner i normale stenger. Videre kan disse isolasjonsteknikkene også enkelt tilpasses for å isolere og kvantitativt undersøke proteinsammensetningen av andre cellulære lag innen både sunn og degenererende netthinne.

Introduction

Rod fotoreseptorceller, tett pakket i det ytterste laget av nevral netthinnen, er en integrert del av svakt lyssyn. For å fungere som trofaste fotontellere, bruker stenger en G-proteinbasert signalvei, kalt fototransduksjon, for å generere raske, forsterkede og reproduserbare responser på enkelt fotonfangst. Denne responsen på lys utløser til slutt en endring i strømmen ved plasmamembranen og signaliseres deretter til resten av det visuelle systemet1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en distinkt stanglignende form og viser en svært polarisert cellulær morfologi, bestående av et ytre segment (OS), indre segment (IS), cellekropp (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulære rom har spesifikke proteinmaskiner (membranbundet og løselig), biomolekylære egenskaper og proteinkomplekser som spiller avgjørende roller som visuell fototransduksjon, generell rengjøring og proteinsyntese og synaptisk overføring2,3.

For over 30 år siden ble den lysavhengige gjensidige bevegelsen av subcellulære proteiner, spesielt transducin (vekk fra operativsystemet) og arrestin (mot operativsystemet), først observert4,5,6,7. Tidlig ble dette observerte fenomenet mottatt med skepsis, delvis på grunn av immunhiistokjemiens sårbarhet for epitopmaskering8. Tidlig på 2000-tallet ble stimulusavhengig proteintranslokasjon bekreftet ved hjelp av en streng og krevende fysisk seksjoneringsteknikk9. Seriell tangensiell seksjonering av den frosne flatmonterte gnager netthinnen etterfulgt av immunoblotting avslørte at transducin9,10, arrestin11,12, og recoverin13 alle gjennomgår subcellulær omfordeling som svar på lys. Det antas at lysdrevet translokasjon av disse viktige signalproteinene ikke bare regulerer følsomheten til fototransduksjonskaskaden9,14,15, men kan også være nevrobeskyttende mot lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stenger ser ut til å ha stor betydning for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker som tillater isolering av forskjellige subcellulære rom for å bestemme proteinfordeling verdifulle forskningsverktøy.

For tiden er det noen få metoder som tar sikte på å isolere stangens subcellulære rom. Imidlertid kan disse metodene være lange og vanskelige å reprodusere, eller krever en betydelig mengde retinal isolering. Rod ytre segment (ROS) preparater via tetthet gradient sentrifugering19, for eksempel, brukes ofte til å skille ROS fra retinal homogenat. Denne metoden er mye brukt for vestlig blot, men prosedyren er svært tidkrevende og krever minst 8-12 murine netthinne20. På den annen side har seriell tangentiell seksjonering av frossen murine og rotte netthinne blitt implementert for å isolere operativsystemet, IS, CB og ST9,11,13. Denne metoden er imidlertid teknisk utfordrende på grunn av nødvendigheten av å fullt ut flate ut den lille og svært buede murine netthinnen for å justere netthinnelagene før tangentiell seksjonering. Siden det er en mengde musemodeller og transgene mus som recapitulerer sykdommer i det visuelle systemet, holder opprettelsen av en teknikk som pålitelig, raskt og enkelt skiller individuelle stangrom løfter om å avsløre de fysiologiske prosessene som oppstår i hvert spesialiserte rom og mekanismene som ligger til grunn for visuelle prosesser i helse og sykdom.

For å lette disse undersøkelsene beskriver vi to peelingmetoder som isolerer stang subcellulære rom lettere enn dagens protokoller. Den første peelingmetoden, tilpasset fra en teknikk for å eksponere fluorescerende merkede bipolare celler for patchklemmeopptak21, bruker cellulosefilterpapir for sekvensielt å fjerne ROS fra en levende, isolert murine netthinne (figur 1). Den andre metoden, tilpasset fra en prosedyre som isolerer de tre primære netthinnecellelagene fra en kylling22 og frog23 netthinne, bruker tape for å fjerne ROS og stang indre segment (RIS) fra en lyofilisert netthinne (figur 2). Begge prosedyrene kan fullføres i 1 time og er betydelig brukervennlige. Vi gir validering av effektiviteten til disse to separasjonsprotokollene for vestlig blotte ved å bruke mørktilpasset og lys eksponert netthinne fra C57BL/6J-mus for å demonstrere lysindusert translokasjon av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Videre, ved hjelp av tape peeling-metoden, gir vi ytterligere bevis på at teknikken vår kan brukes til å undersøke og adressere inkonsekvenser mellom proteinlokaliseringsdata som er samlet inn av immunocytokjemi (ICC) og vestlige flekker. Spesielt viste vår teknikk at: 1) protein kinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke bare i bipolare celler, men også i murine ROS og RIS, om enn i lave konsentrasjoner24,25, og 2) rhodopsin kinase (GRK1) er for tiden hovedsakelig i den isolerte OS-prøven. Disse dataene viser effektiviteten av våre to peeling teknikker for separering og kvantifisering av spesifikke stang og retinal proteiner.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i henhold til de lokale institusjonelle retningslinjene til komiteen for dyrepleie fra University of Southern California (USC). 1. Levende celle retinal peeling metode Tilberedning av Ames’ buffere, peelingpapir og disseksjonsfat Bruk stump spiss saks saks (eller tilsvarende saksetype), kutt cellulosefilterpapiret (grad 413) i rektangler som måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Oppbevar stikkene til senere bruk. Forbered 1 L av …

Representative Results

De nåværende strategiene ble utviklet for å gi relativt raske og enkle metoder for å isolere og analysere proteiner blant spesifikke stang subcellulære rom for vestlig blotanalyse. Vi brukte to sekvensielle peeling teknikker (figur 1 og figur 2) etterfulgt av immunoblotting for å demonstrere at disse metodene på en pålitelig måte kunne brukes til å oppdage den kjente fordelingen av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1) hos både mørk- og lystilpa…

Discussion

Mange netthinnesykdommer påvirker stang fotoreseptorceller, noe som fører til stangdød og til slutt fullstendig synstap37. En betydelig del av den genetiske og mekanistiske opprinnelsen til menneskelig retinal degenerasjon har blitt vellykket rekapitulert i mange musemodeller gjennom årene. I den sammenhengen vil evnen til enkelt og selektivt å skille individuelle stang subcellulære rom fra den lille mus netthinnen i stor grad forbedre vår forståelse av lokaliserte biokjemiske og molekylæ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant EY12155, EY027193 og EY027387 til JC. Vi er takknemlige til Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) og Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) for korrekturlesing av manuskriptet. Vi vil også takke Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) og Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) for å gi nødvendig utstyr for å samle forfatteren ga opptak. Materiale fra: Kasey Rose et al, Separasjon av fotoreseptorcellerom i mus netthinne for proteinanalyse, Molecular Neurodegeneration, publisert [2017], [Springer Nature].

Materials

100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Play Video

Cite This Article
Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

View Video