Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

To peeling metoder for isolering av photoreceptor celle rom i musen netthinnen for protein analyse

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Denne protokollen presenterer to teknikker for å isolere de subcellulære rommene til murine rod fotoreseptorer for proteinanalyse. Den første metoden benytter levende netthinne og cellulosefilterpapir for å skille stang ytre segmenter, mens den andre bruker lyofilisert netthinne og tape for å skrelle bort stang indre og ytre segmentlag.

Abstract

Rod fotoreseptorer er svært polariserte sensoriske nevroner med forskjellige rom. Musestenger er lange (~ 80 μm) og tynne (~ 2 μm) og er sidelengs pakket i det ytterste laget av netthinnen, fotoreseptorlaget, noe som resulterer i justering av analoge subcellulære rom. Tradisjonelt har tangentiell seksjonering av den frosne flatmonterte netthinnen blitt brukt til å studere bevegelse og lokalisering av proteiner i forskjellige stangrom. Imidlertid gjør den høye krumningen i den stangdomenerende mus netthinnen tangentielle seksjoner utfordrende. Motivert av studiet av proteintransport mellom rom, utviklet vi to peelingmetoder som pålitelig isolerer stangens ytre segment (ROS) og andre subcellulære rom for vestlige flekker. Våre relativt raske og enkle teknikker leverer berikede og subcellulære fraksjoner for kvantitativt å måle fordelingen og omfordelingen av viktige fotoreseptorproteiner i normale stenger. Videre kan disse isolasjonsteknikkene også enkelt tilpasses for å isolere og kvantitativt undersøke proteinsammensetningen av andre cellulære lag innen både sunn og degenererende netthinne.

Introduction

Rod fotoreseptorceller, tett pakket i det ytterste laget av nevral netthinnen, er en integrert del av svakt lyssyn. For å fungere som trofaste fotontellere, bruker stenger en G-proteinbasert signalvei, kalt fototransduksjon, for å generere raske, forsterkede og reproduserbare responser på enkelt fotonfangst. Denne responsen på lys utløser til slutt en endring i strømmen ved plasmamembranen og signaliseres deretter til resten av det visuelle systemet1. Som navnet antyder, har hver stangcelle en distinkt stanglignende form og viser en svært polarisert cellulær morfologi, bestående av et ytre segment (OS), indre segment (IS), cellekropp (CB) og synaptisk terminal (ST). Hvert subcellulære rom har spesifikke proteinmaskiner (membranbundet og løselig), biomolekylære egenskaper og proteinkomplekser som spiller avgjørende roller som visuell fototransduksjon, generell rengjøring og proteinsyntese og synaptisk overføring2,3.

For over 30 år siden ble den lysavhengige gjensidige bevegelsen av subcellulære proteiner, spesielt transducin (vekk fra operativsystemet) og arrestin (mot operativsystemet), først observert4,5,6,7. Tidlig ble dette observerte fenomenet mottatt med skepsis, delvis på grunn av immunhiistokjemiens sårbarhet for epitopmaskering8. Tidlig på 2000-tallet ble stimulusavhengig proteintranslokasjon bekreftet ved hjelp av en streng og krevende fysisk seksjoneringsteknikk9. Seriell tangensiell seksjonering av den frosne flatmonterte gnager netthinnen etterfulgt av immunoblotting avslørte at transducin9,10, arrestin11,12, og recoverin13 alle gjennomgår subcellulær omfordeling som svar på lys. Det antas at lysdrevet translokasjon av disse viktige signalproteinene ikke bare regulerer følsomheten til fototransduksjonskaskaden9,14,15, men kan også være nevrobeskyttende mot lysskader16,17,18. Fordi lysdrevet proteintransport i stenger ser ut til å ha stor betydning for stangcellebiologi og fysiologi, er teknikker som tillater isolering av forskjellige subcellulære rom for å bestemme proteinfordeling verdifulle forskningsverktøy.

For tiden er det noen få metoder som tar sikte på å isolere stangens subcellulære rom. Imidlertid kan disse metodene være lange og vanskelige å reprodusere, eller krever en betydelig mengde retinal isolering. Rod ytre segment (ROS) preparater via tetthet gradient sentrifugering19, for eksempel, brukes ofte til å skille ROS fra retinal homogenat. Denne metoden er mye brukt for vestlig blot, men prosedyren er svært tidkrevende og krever minst 8-12 murine netthinne20. På den annen side har seriell tangentiell seksjonering av frossen murine og rotte netthinne blitt implementert for å isolere operativsystemet, IS, CB og ST9,11,13. Denne metoden er imidlertid teknisk utfordrende på grunn av nødvendigheten av å fullt ut flate ut den lille og svært buede murine netthinnen for å justere netthinnelagene før tangentiell seksjonering. Siden det er en mengde musemodeller og transgene mus som recapitulerer sykdommer i det visuelle systemet, holder opprettelsen av en teknikk som pålitelig, raskt og enkelt skiller individuelle stangrom løfter om å avsløre de fysiologiske prosessene som oppstår i hvert spesialiserte rom og mekanismene som ligger til grunn for visuelle prosesser i helse og sykdom.

For å lette disse undersøkelsene beskriver vi to peelingmetoder som isolerer stang subcellulære rom lettere enn dagens protokoller. Den første peelingmetoden, tilpasset fra en teknikk for å eksponere fluorescerende merkede bipolare celler for patchklemmeopptak21, bruker cellulosefilterpapir for sekvensielt å fjerne ROS fra en levende, isolert murine netthinne (figur 1). Den andre metoden, tilpasset fra en prosedyre som isolerer de tre primære netthinnecellelagene fra en kylling22 og frog23 netthinne, bruker tape for å fjerne ROS og stang indre segment (RIS) fra en lyofilisert netthinne (figur 2). Begge prosedyrene kan fullføres i 1 time og er betydelig brukervennlige. Vi gir validering av effektiviteten til disse to separasjonsprotokollene for vestlig blotte ved å bruke mørktilpasset og lys eksponert netthinne fra C57BL/6J-mus for å demonstrere lysindusert translokasjon av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1). Videre, ved hjelp av tape peeling-metoden, gir vi ytterligere bevis på at teknikken vår kan brukes til å undersøke og adressere inkonsekvenser mellom proteinlokaliseringsdata som er samlet inn av immunocytokjemi (ICC) og vestlige flekker. Spesielt viste vår teknikk at: 1) protein kinase C-alfa (PKCα) isoform er til stede ikke bare i bipolare celler, men også i murine ROS og RIS, om enn i lave konsentrasjoner24,25, og 2) rhodopsin kinase (GRK1) er for tiden hovedsakelig i den isolerte OS-prøven. Disse dataene viser effektiviteten av våre to peeling teknikker for separering og kvantifisering av spesifikke stang og retinal proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i henhold til de lokale institusjonelle retningslinjene til komiteen for dyrepleie fra University of Southern California (USC).

1. Levende celle retinal peeling metode

  1. Tilberedning av Ames' buffere, peelingpapir og disseksjonsfat
    1. Bruk stump spiss saks saks (eller tilsvarende saksetype), kutt cellulosefilterpapiret (grad 413) i rektangler som måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Oppbevar stikkene til senere bruk.
    2. Forbered 1 L av Ames' HEPES-buffer ved å kombinere en flaske Ames' Medium, 2,38 g HEPES og 0,877 g NaCl. Løs opp reagensene i en steril glassflaske med destillert ultrarent vann og juster osmolariteten og pH til henholdsvis 280 mOsm og 7,4. Filtrer for å sterilisere (porestørrelse 0,2 μm), forsegle lokket med parafinfilm og oppbevar ved 4 °C.
    3. Forbered 1 L av Ames' bikarbonatbuffer ved å kombinere en flaske Ames' Medium og 1,9 g NaHCO3. Løs opp reagensene i en steril glassflaske med destillert ultrarent vann og juster osmolariteten og pH til henholdsvis 280 mOsm og 7,4. Filtrer for å sterilisere (porestørrelse 0,2 μm), forsegle lokket med parafinfilm og oppbevar ved 4 °C.
      MERK: Ames' HEPES- og Ames' bikarbonatbuffere kan tilberedes på forhånd og lagres i 1 uke ved 4 °C.
    4. På bunnen av en 35 x 10 mm Petri-tallerken, lag et gitter- eller sjakkbrettmønster med en skalpell (blad nr. 11, 40 mm).
      MERK: Den teksturerte bunnen av Petri-parabolen holder det isolerte, frittflytende øyet på plass under netthinnen.
  2. Disseksjon av netthinnen
    MERK: For denne prosedyren skal bufferen bringes til og oppbevares ved romtemperatur (RT). Oppdater Ames' bikarbonatbuffer hvert 15. Dette opprettholder den nødvendige fysiologiske pH.
    1. Rundt 15-20 minutter før avhandlingen oksygenerer du Ames' HEPES-buffer i et 100 ml laboratorium eller en medieflaske utstyrt med en slangehetteadapter og bobler Ames' Bikarbonatbuffer med 95% O2 og 5% CO2 i et vev inkubasjonskammer og i et 100 ml laboratorium eller medieflaske utstyrt med en rørhetteadapter.
    2. Euthanize et likt antall av begge kjønn av C57BL/6J mus (2-3 måneder gammel) enten ved isofluran innånding eller karbondioksid (CO2) etterfulgt av cervical dislokasjon. Forfør øynene med buet saks og legg øynene inn i den teksturerte 35 x 10 mm Petri-parabolen fylt med boblet Ames' bikarbonatbuffer.
    3. Lag en øyekopp (figur 1A) ved å punktere et hull i cornea-limbus-krysset med en 18 G nål. Klipp langs omkretsen av dette krysset ved hjelp av mikro-disseksjon iris saks for å fjerne hornhinnen i hvert øye. Skill linsen og glasslegemet humor fra hvert øye ved hjelp av pinsett og kast.
    4. Isoler netthinnen fra øyekoppen ved å forsiktig skrelle det retinal pigmenterte epitelet (RPE)-sclera-choroid-komplekset vekk fra nevral netthinnen. Kast RPE-sclera-choroid-komplekset. Pass på at netthinnen ikke blir skadet under disseksjonen ved å håndtere bare kantene.
    5. Overfør isolert netthinne ved hjelp av en bred boreoverføringspipette inn i lokket på en 60 x 15 mm tallerken fylt med boblet Ames' bikarbonatbuffer.
    6. Orienter den halvkuleformede netthinnen konkav opp (fotoreseptorene vender ned mot bunnen av parabolen) og bisect hver netthinne (gjennom synsnerven) ved hjelp av iris saks eller en skalpell (blad nr. 10, 40 mm). Trim de buede kantene på hver halve netthinne for å lage to rektangler (figur 1A).
      MERK: Hvis du minimerer krumningen i hver halverte netthinne, kan netthinnen flate bedre ut i etterfølgende peelingtrinn og gir en nøyaktig peeling av stangens ytre segmentlag (ROS).
    7. Oppbevar den halverte netthinnen i vev inkubasjonskammeret som kontinuerlig bobles med 95% O2 og 5% CO2.
      MERK: Isolert netthinne kan oppbevares i den karbogenerte Ames' bikarbonatbuffer i ca. 24 timer.
  3. Stang ytre segment (ROS) samling ved filterpapir peeling
    MERK: Oppdater RT-oksygenerte Ames' HEPES-buffer hver 15-20 min under peelingprosessen for å opprettholde den nødvendige fysiologiske pH.
    1. Overfør ett retinalrektangel fra vevskammeret med en bred boreoverføringspipette og et filterpapir på 5 mm x 2,5 mm til en 35 x 10 mm Petri-tallerken fylt med Ames' HEPES-buffer boblet med 100 % O2.
    2. Orienter den partisjonerte netthinnen konkav opp og sørg for at fotoreseptorene vender ned mot bunnen av parabolen. Ta lett tak i sidene av den halverte netthinnen med pinsett og flytt den oppå filterpapiret. Når netthinnen er sentrert på filterpapiret, flytter du filterpapiret oppover slik at den halverte netthinnen berører filterpapiret for å lage ROS-til-filter-papiradhesjonen (figur 1B).
      MERK: Pass på at fotoreseptorlaget kommer i direkte kontakt med filterpapiret.
    3. Løft filterpapiret forsiktig med den vedlagte netthinnen ut av Ames' HEPES-buffer. Plasser undersiden av filterpapiret (siden uten netthinnen) på et papirhåndkle og tørk 2-3 ganger (figur 1B).
    4. Legg en dråpe Ames' HEPES på siden av filterpapiret med netthinnen. Legg filterpapiret på papirhåndkleet igjen for å tørke, som beskrevet. Gjenta denne prosessen to ganger til.
    5. Legg filterpapiret med netthinnen tilbake i Petri-parabolen. Bruk pinsett til å skyve alle kantene på den halverte netthinnen forsiktig opp og bort fra filterpapiret på alle sider.
    6. Skrell netthinnen forsiktig bort fra filterpapiret. Berør bare den ekstreme omkretsen av netthinnen under peeling prosessen for å bevare netthinnens strukturelle integritet.
    7. Løft filterpapiret fra Petri-fatet og fjern overflødig væske på et papirhåndkle. Pass på at siden som var i kontakt med netthinnen ikke kommer i kontakt med papirhåndkleet.
    8. Plasser filterpapiret med det delvise ROS-laget i et merket rør på is (figur 1B). Hold den skrellede netthinnen nedsenket i Ames' HEPES-buffer.
    9. Gjenta peeling prosessen for denne halverte netthinnen ca 7-8 ganger for å fjerne hele ROS-laget. Etter hver peeling plasserer du filterpapiret i samme rør, som vil inneholde den isolerte ROS fra en halvert netthinne.
      MERK: Pass på at du ikke den halverte netthinnen når du skreller den bort fra filterpapiret, da netthinnen blir tynnere under denne prosessen.
    10. Plasser røret som inneholder alle filterpapirskallene til den isolerte ROS-en, på isen for umiddelbar bruk eller frys direkte på tørris og oppbevar den ved -80 °C.
    11. Bruk pinsett til å overføre den resterende skrellede netthinnen (mangler ROS) til et passende merket rør. Plasser røret på isen for umiddelbar bruk eller frys med tørris og oppbevar det ved -80 °C.
    12. Gjenta peeling prosessen for hver halvert netthinne og nøyaktig merke hvert rør.

2. Lyofilisert netthinne peeling metode

  1. Buffere, peeling medium, disseksjon parabolen forberedelse, og lyophilizer oppsett
    1. I en 1 L oppbevaringsflaske forbereder du Ringers løsning ved å tilsette 500 ml destillert ultrarent vann. Løs opp reagensene for å nå en endelig konsentrasjon på 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES og 0,02 mM EDTA. Juster pH til 7,4 med NaOH, tilsett ultrapure vann for å bringe det endelige volumet til 1 L, og juster osmolariteten til 313 mOsm.
    2. Før bruk, filtrer Ringers oppløsning med et sterilt filter (porestørrelse 0,2 μm), forsegle lokket med parafinfilm og oppbevar ved 4 °C.
    3. Bruk stump spiss saks saks (eller tilsvarende saksetype), kutt cellulosefilterpapiret i rektangler som måler ca. 5 mm x 2,5 mm. Bruk en blyant til å skrive på den ene siden av filterpapiret for å opprette en unik etikett.
    4. Lag et gitter- eller sjakkbrettmønster i bunnen av en 35 x 10 mm Petri-tallerken ved hjelp av en skalpell (blad nr. 11, 40 mm).
    5. Slå på lyofilisatoren i henhold til produsentens spesifikasjoner.
    6. Skaff flytende nitrogen i en Dewar-kolbe eller lignende isolerende vakuumflaske.
  2. Retinal disseksjon
    1. Fullfør netthinneavhandlingen som beskrevet i punkt 1 i protokollen (figur 1A). Bruk kald Ringers løsning i stedet for Ames' buffer.
    2. Oppbevar den halverte, rektangulære netthinnen i en 35 x 10 mm Petri-tallerken fylt med kald Ringers løsning og legg den på is.
  3. Retinal prøvepreparering for lyofilisering
    1. Legg et filterpapir på 5 x 2,5 mm og overfør en halvert netthinne til den teksturerte 35 x 10 mm Petri-retten fylt med kald Ringers buffer. Bruk en bred boreoverføringspipette for å flytte hver netthinne mellom retter.
    2. Bruk pinsett til å snu netthinnen forsiktig slik at den er orientert konkav opp (fotoreseptorene peker oppover) og flytt den slik at den hviler oppå filterpapiret (figur 2A).
      MERK: Pass på at fotoreseptorene ikke kommer i kontakt med filterpapiret (det retinale ganglioncellelaget skal være i direkte kontakt med filterpapiret) og at den unike etiketten er synlig. For å enkelt og raskt identifisere retinal isolere, anbefales det at den unike etiketten skal være plassert på undersiden av filterpapiret.
    3. Løft filterpapiret etter kantene oppover slik at det halverte netthinnen berører filterpapiret og fortsetter å løfte filterpapiret ut av Ringers løsning.
    4. Plasser undersiden av filterpapiret (siden uten netthinnen på) på et papirhåndkle og forsiktig dab 2-3 ganger for å fjerne overflødig væske (figur 2A).
    5. Plukk opp filterpapiret med pinsett og legg til en dråpe kalde Ringer's på siden av filterpapiret med netthinnen. Legg filterpapiret på papirhåndkleet igjen for å fjerne overflødig væske. Gjenta prosessen to ganger til.
      MERK: Disse vekslende fukt- og tørketrinnene sikrer at vevet er godt festet til filterpapiret.
    6. Oppbevar hver retina/filterpapirprøve i en Petri-tallerken fylt med kalde Ringer's til de er klare til å fryse alle prøver. Gjenta denne prosessen for alle halverte netthinne.
    7. Få en ren og tørr 35 x 10 mm Petri tallerken (kun nederst) og et stykke aluminiumsfolie kuttet i en 3,5 x 3,5 tommers firkant.
    8. Løft hver prøve ut av den kalde Ringers buffer med pinsett. Pass på at pinsettene bare kommer i kontakt med filterpapirkantene, og unngå den halverte netthinnen.
    9. Plasser undersiden av hvert filterpapir (siden uten netthinnen på) på et papirhåndkle og fjern overflødig væske.
    10. Tilsett en dråpe kald 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) på siden av filterpapiret der netthinnen festes. Tørk filterpapiret på papirhåndkleet for å fjerne overflødig væske.
      MERK: Pass på at fuktigheten fra filterpapiret er tilstrekkelig fjernet før frysing.
    11. Legg alle filterpapirstykker i Petri-retten på 35 x 10 mm. Bruk et lofritt papir for å transportere bort overflødig væske rundt filterpapiret.
      MERK: Ikke overbefolk Petri-retten med prøver. Hvis mer enn fire murine øyne brukes, bør du vurdere å bruke en større Petri-tallerken eller flere mindre Petri-retter for å holde netthinnen / filterpapirprøvene.
    12. Pakk hele parabolen tett med aluminiumsfolie. Pass på at kantene på aluminiumsfolien er festet og jevnt presset inn i bunnen av Petri-parabolen. Punkter en håndfull hull på 0,1-0,2 mm inn i aluminiumsfolielokket (figur 2A).
    13. Bruk metall tang, gradvis senke aluminiumsfolie dekket Petri parabolen i flytende nitrogen. Oppbevar prøvene i flytende nitrogen (<10 min) til de er klare til å lyofilisere.
  4. Lyofilisering
    1. Plasser den aluminiumsfoliebelagte Petri-retten i en frysetørkende kolbe og fest den til lyofilisatormaskinen etter produsentens protokoll. Lyophilize netthinnen i 30 min.
    2. Løsne kolben fra lyofilisatoren og slå av maskinen i henhold til produsenten.
    3. Fjern aluminiumsfolien og arbeid enten med frysetørkede prøver samme dag eller oppbevar dem i riktig merkede 1 ml mikrosenterrør. Legg disse rørene i en beholder (for eksempel et konisk rør på 50 ml) fylt med en vannfri tørkemiddel og oppbevar prøvene ved -80 °C.
  5. Stang ytre og indre segment samling ved selvklebende tape peeling.
    1. Klipp strimlene med klart tape (1-2 cm) og oppbevar strimler på kanten av tapedispenseren/labbenken/etc. for rask bruk.
    2. Flytt en retinal prøve til lokket på en plast 60 x 15 mm Petri tallerken for peeling. Pass på at du bare tar tak i de ytterste kantene på filterpapiret og unngår å berøre netthinnen.
    3. Bruk stump spiss iris saks (eller tilsvarende saksetype), kutt et lite rektangulært stykke tape til den omtrentlige størrelsen på vevet (1,5 x 2,5 mm).
    4. Legg forsiktig et lite stykke tape på toppen av den lyofiliserte netthinnen (figur 2B) og påfør et lite trykk med pinsettene for å sikre at det binder seg til fotoreseptorlaget (det oransje / rosa tonede topplaget).
    5. Skrell langsomt båndet bort. Både stangens ytre segment (ROS) og stangens indre segment (RIS) festes til båndet (figur 2B).
    6. Sørg for at det er en tynn hvit film på den oppsprukne overflaten. Dette er RIS.To skille RIS, plassere et annet stykke tape og skyve båndet ned på den oppsprukne overflaten (figur 2B).
      MERK: Det kan ta mer enn ett stykke tape å fjerne hele det tynne hvite laget.
    7. Plasser tapestykket med bare det oransje/rosa laget i et mikrosenterrør merket +ROS.
    8. Plasser tapen eller tapestykkene med det tynne hvite laget i et mikrosenterrør merket +RIS.
      MERK: Å skille den lyofiliserte netthinnen med tape tar praksis. Mengden trykk som påføres båndet vil påvirke hvordan den lyofiliserte prøven vil fraksjonere. Hvis det legges for mye trykk på båndet over prøven, vil hele den lyofiliserte netthinnen skrelle av filterpapiret og holde seg til båndet. Hvis det legges for lite trykk på båndet, vil ikke det oransje/rosa topplaget (+ROS) holde seg til båndet.
    9. Samle rester av retinal vev (bereft av ROS og RIS lag, -OIS) plassert på filterpapiret ved å skrelle av det tykke, hvite laget fra filterpapiret ved hjelp av tape. Plasser isolasjonen i et rør merket -OIS.
    10. Gjenta disse trinnene for hver halverte netthinneprøve.
    11. Oppbevar de isolerte lagene fra den lyofiliserte netthinnen enten ved romtemperatur hvis du utfører proteinkvantifisering, gelelektroforese og proteinimmunobloter samme dag, eller oppbevar i en beholder (for eksempel 50 ml konisk rør) fylt med vannfri tørkemiddel ved -80 °C for senere bruk.

3. Vestlig blot prøvepreparering for peeling isolasjoner

  1. Klargjøre RIPA lysis-buffer
    1. I en 100 ml lagringsflaske legger du til reagenser for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS og 1 mM EDTA. Tilsett 100 ml deionisert ultrarent vann og bland grundig.
      MERK: RIPA lysisbuffer kan oppbevares ved 2-8 °C i 2-3 uker. For lengre lagring, aliquot og oppbevar i -20 °C fryser.
    2. På eksperimentets dag legger du til en proteasehemmercocktail (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotinin og 1:1000 Leupeptin) til RIPA lysisbufferen og holder på is.
  2. Filterpapir peeling lysate forberedelse for vestlig blot
    1. Påse at rør som inneholder filterpapirskall og rester av skrellet netthinne opprettholdes på is (for eksperimentet samme dag) eller fjernes fra -80 °C fryselager og plasseres på is.
    2. Fjern overflødig væske fra bunnen av mikrosenterrørene som inneholder filterpapirskallene. Spinn raskt i en mini sentrifuge i 2-4 s og kast eventuell gjenværende væske.
    3. Pipette 45-55 μL kald RIPA-buffer i rør som inneholder filterpapirisolering.
    4. Homogeniser hver prøve med en ren, autoklavert pestleblander i 1 min. Pass på at filterpapiret holder seg i kontakt med pestleblanderen. Oppbevar filterpapiret på siden av hvert rør i stedet for nederst.
    5. Med pinsett flytter du filterpapirene til siden av hvert rør og spinner i mini sentrifugen i 2-4 s. Dette fjerner RIPA-bufferen fra filterpapiret.
    6. Fjern tørket filterpapir og gjenta for alle filterpapir i hvert rør om nødvendig.
    7. Overfør homogenatet til et nytt rør og merk det riktig.
      MERK: Dette er det mest tidkrevende trinnet, og hvis det ikke fullføres riktig, vil mye av prøven ende opp med å bli absorbert av filterpapiret.
    8. Pipette 60-80 μL kald RIPA buffer inn i de enkelte rørene med rester skrelt netthinne.
    9. Homogeniser hver prøve med en ren, autoklavert pestleblander i 1 min.
  3. Tape peeling Lysate forberedelse for vestlig blot
    1. Plasser RT-lyofiliserte prøver eller -80 °C-prøvene på is.
    2. Pipette 50-70 μL kald RIPA buffer inn i hvert rør som inneholder +ROS og +RIS tape peeling.
    3. Pipette 60-80 μL kald lysisbuffer inn i -OIS-rørene som inneholder den gjenværende lyofiliserte netthinnen, med ROS og RIS fjernet.
    4. Homogeniser hver prøve med en ren pestleblander i 1 min. Pass på at båndet i de enkelte rørene holder seg i kontakt med pestleblanderen og lysisbufferen.
    5. Med steriliserte pinsett, flytt båndet til siden av rørene og spinn med en mini sentrifuge i 2-4 s. Dette vil fjerne væsken fra båndet. Fjern tørket tape fra rørene.
      MERK: På dette tidspunktet kan du kombinere to halve netthinneisolasjoner fra samme netthinne for enten "filterpapir peeling" eller "tape peeling" -metoden for å sikre at du har nok volum til å utføre en bicinchoninic acid assay (BCA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De nåværende strategiene ble utviklet for å gi relativt raske og enkle metoder for å isolere og analysere proteiner blant spesifikke stang subcellulære rom for vestlig blotanalyse. Vi brukte to sekvensielle peeling teknikker (figur 1 og figur 2) etterfulgt av immunoblotting for å demonstrere at disse metodene på en pålitelig måte kunne brukes til å oppdage den kjente fordelingen av stangtransducin (GNAT1) og arrestin (ARR1) hos både mørk- og lystilpassede dyr. For å validere effektiviteten av våre to protokoller i nøyaktig isolerende stang subcellulære rom uten forurensning fra andre cellulære lag, ble immunobloter undersøkt med antistoffer for cytokrom C (Cyt C), aktin og Gß5S / Gß5L26. En liste over antistoffer og fortynning som brukes er presentert i tabell 1. Cyt C og aktin indikerte ROS renhet, da de er rikelig proteiner i den proksimale netthinnen, men er fraværende i ROS. Gß5L, en komponent av GTPase aktiverende protein (GAP) for GNAT127, er til stede i ROS og RIS og fungerte som en kontroll for disse isolasjonene. Gß5S, den kortere skjøteisoformen som ikke finnes i ROS eller RIS, men som er i alle andre stangrom, fungerte som en kontroll for ikke-ROS / RIS isolerte subcellulære rom.

For det første ble effektiviteten av vår sekvensielle levende celle retinal peeling-metode vurdert ved å analysere fordelingen av GNAT1 og ARR1 i stenger av mørke og lystilpassede mus (figur 3). Filterpapirene som inneholder ROS (+ROS) ble samlet fra totalt en hel netthinne, og det tilsvarende restvevet (-ROS) ble også kombinert. Signalene fra de angitte proteinene ble deretter sammenlignet mellom +ROS-prøvene og -ROS-prøvene, og en hel isolert netthinne fungerte som inngangskontroll. Proteinkonsentrasjon og homogeniseringsvolum for disse prøvene er presentert i tabell 2. Resultatene som presenteres i figur 3A viser at i mørktilpassede dyr samsvarte fordelingen av GNAT1 og ARR128 tett med deres kjente mørke tilstandsfordelinger der GNAT1-signalet var synlig det sterkeste i +ROS-isolasjonen, mens ARR1-signalet var mer robust i -ROS-isolasjonen. Følgelig, i den lyseksponerte netthinnen, ble GNAT1-signalet merkbart redusert i +ROS-isolasjonen og hadde et økt signal i -ROS-prøven, mens lysindusert ARR1-translokasjon kunne visualiseres i +ROS- og -ROS-prøver. Resultater fra seks ulike eksperimenter ble kvantifisert, og statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom mørke/lyse forhold for GNAT1 og ARR1 i +ROS- og -ROS-prøvene (figur 3B). Disse funnene er i samsvar med den tidligere kjente proteinlys / mørke bevegelsen i stang subcellulære rom og indikerer sterkt at denne teknikken kan isolere beriket + ROS-fraksjoner.

For å validere vår live celle peeling-metode ytterligere, undersøkte vi kjente ROS-renhetsmarkørdistribusjoner i både +ROS- og -ROS-prøver. I både mørke og lystilpassede prøver er Gß5S-, Cyt C- og aktinsignalene ekskludert fra +ROS-prøvene (figur 3A), noe som viser fravær av forurensning fra andre cellulære lag. I tillegg var Gß5L-signalet tydelig synlig i +ROS-prøvene (figur 3A). Videre bekreftet aktin- og Gß5L-signaler ikke bare renheten til +ROS- og -ROS-fraksjonene, men fungerte også som kontroller for normalisering, med signalene fra +ROS-prøvene normalisert mot Gß5L- og -ROS-prøver som normaliseres mot aktin. Som presentert i figur 3A, anbefales det at levende celle peeling isolerer lastes sammen med en lastekontroll, spesielt en hel retinal homogenat, for optimal immunoblotting normalisering og analyse. Sammen validerer disse dataene at vår live celle peeling-metode kan gi en rask og reproduserbar tilnærming for å isolere ROS-subcellulærlaget fra resten av stangen og netthinnen for proteinanalyse.

Vi evaluerte deretter vår lyofiliserte peeling-teknikk for å bekrefte at denne metoden kunne reprodusere ROS- og RIS-rommene. Før immunoblotting avbildet vi overflatene av intakt og skrelt lyofilisert mus netthinne ved hjelp av et skanningselektronmikroskop (SEM) for å analysere hvilket fotoreseptor subcellulært lag tape peeling ga (figur 4). Før peeling med tape, samsvarte overflaten av den intakte lyofiliserte netthinnen (oransje / rosafarget lag) tett profilen til den karakteristiske sylindriske ROS (figur 4A). Etter den første tapeskallen så ROS og RIS ut til å være helt fjernet, noe som fremgår av det ensartede kjernefysiske laget som er tilstede på overflaten av den resterende skrellede lyofiliserte netthinnen (figur 4C). Etterfølgende tapeskall fjernet RIS (tynt hvitt lag, figur 4B) fra den frie overflaten av det skrellede laget, en prosess som sannsynligvis er hjulpet av det smale og skjøre forbindelsessiliumet som forbinder de indre og ytre segmentene. Disse resultatene bekreftet at stang subcellulære lag fra lyofilisert retinal vev kan spesielt fraksjoneres ved hjelp av tape.

Etter å ha validert effektiviteten av denne metoden visuelt, ble mørk- og lystilpasset skrelt netthinne utsatt for immunoblotting ved hjelp av samme tilnærming ved hjelp av proteinmarkører for forskjellige rom som skissert for vår live celle peeling-metode (figur 3). Proteinkonsentrasjon og homogeniseringsvolum for ROS-isolasjon (+ROS), RIS-isolasjon (+RIS) og de resterende netthinnelagene (-OIS) presenteres i tabell 2. Som forventet var det et klart lysindusert skifte for GNAT1 fra ROS til RIS, samt ARR1 fra RIS til ROS (figur 5A). GNAT1 var mest tallrik i +ROS-prøven i mørket og +RIS-prøven i lyset, mens ARR1-signalet ble reversert (figur 5A). Vi normaliserte og kvantifiserte deretter de translokerende proteinsignalene fra +ROS-, +RIS- og -OIS-isolasjoner (figur 5B), ved hjelp av de samme kontrollene og tilnærmingen som live peeling-metodikken. Vi kombinerte også +RIS- og -OIS-prøver (figur 5C) for en mer direkte sammenligning med vår livecellefilterpapirskallmetode (figur 3B). Begge grafene viser den veletablerte og karakteristiske lysinduserte translokasjonen av både GNAT1 og ARR1. Basert på disse observasjonene ser det ut til at preparatet for avskalling av bånd gir berikede ROS- og RIS-fraksjoner, som det fremgår av proteinsammensetningen av ARR1 og GNAT1 i disse isolasjonene.

Deretter ble renheten til individuelle subcellulære isolasjoner evaluert. I likhet med resultatene som er vist i figur 3A, manglet +ROS-prøvene signaler for aktin, cytokrom C og Gß5S mens de viste et sterkt Gß5L-signal (figur 5). Dette funnet viser mangel på forurensning fra andre subcellulære rom i vår +ROS prøvepreparering. Proteininnholdet i det etterfølgende subcellulære laget av stangen, +RIS-isolasjonen, ble deretter vurdert. Vi fant ut at +RIS-prøven var positiv for Cyt C, Gß5L og aktin. Dette funnet er i samsvar med den kjente sammensetningen av RIS, som er rik på mitokondrier og cytoskeletale elementer. Det siste laget, -OIS-isolasjonen, hadde proteinfordelinger i samsvar med -ROS-prøvene vist i figur 3A.

For å vurdere nytten av vår selvklebende tape peeling metode i å undersøke stang subcellulære rom protein sammensetninger, undersøkte vi spesifikt immunoreaktivitet av rhodopsin kinase (GRK1) og protein kinase C-alfa (PKCα) i våre +ROS, +RIS, og -OIS prøver. Ulike eksperimentelle metoder, som immunocytokjemi (ICC) og vestlig blot, gir ofte motstridende resultater om presis lokalisering av disse proteinene i stenger og netthinnen. GRK1, for eksempel, antas å være relativt rikelig i stang og kjegle OS for å megle fosforylering av lysaktiverte opsiner29. Imidlertid har immunolabeling av retinal skiver avslørt lokaliseringen av GRK1 enten spesielt i OS30,31 eller gjennom hele fotoreseptorlaget32. PKCα er derimot et protein som ofte brukes til ICC for å merke bipolare celler. Til tross for ingen klare bevis på stangspesifikk PKCα immunolabeling i retinal skiver25, er det betydelig biokjemisk24,25 og funksjonell33,34,35 bevis som støtter tilstedeværelse og fosforylering rolle PKCα i ROS. Ved hjelp av teknikken vår fant vi ut at GRK1 immunoreaktivitet var mest intens i +ROS-prøvene i lyseksponert netthinne og var fraværende i -OIS-prøver (figur 6A). Omvendt viser vi at +ROS- og +RIS-prøvene viste et svakt signal for PKCα. Som det fremgår av figur 6B, oppdages PKCα vanligvis ikke i ROS eller RIS ved immunfluorescensfarging av netthinnedeler. PKCα ble imidlertid immunodetert av vestlig flekk (figur 6A,D). Fordi +ROS- og +RIS-isolasjonene viser et sterkt Gß5L-signal og fravær av Gß5S (figur 6A), er vi sikre på at det svake PKCα-signalet i både ROS- og RIS-prøver er ekte og ikke på grunn av forurensning fra andre lag. For å visualisere de enkelte signalene i +ROS-, +RIS- og -OIS-isolasjoner ble GRK1- og PKCα-flekker kombinert og plottet inn for sammenligning (figur 6C).

Til slutt viser et eksempel på en sub-optimal peeling-økt (figur 6D) hvordan forurensning fra forskjellige underlag kan forskyve resultatene, noe som ytterligere illustrerer viktigheten av datatolkning og inkludering av de riktige kontrollantistoffene for å screene for eksperimentelle peelingfeil. I dette eksemplet med teglskallingsisolasjon er et svakt Gß5S-signal tydelig i RIS-isolasjonsbanen, noe som indikerer liten forurensning fra -OIS-prøven. Avhengig av brukerens mål, kan det hende at denne lille forurensningen ikke er noe problem. Men i dette tilfellet undersøkte vi PKCα-signalet i +ROS- og +RIS-prøver, og PKCα-signalet er litt høyere i RIS-banen sammenlignet med ROS-banen (figur 6A,D), kanskje på grunn av forurensning. Dermed bør det tas hensyn under peelingprosessen for å sikre en nøyaktig isolasjon og for å minimere forurensning. Til tross for minimal forurensning på grunn av individuell feil, gir disse dataene overbevisende bevis på at tape peeling-metoden kan gi nøyaktige sekvensielle isolasjoner av stang fotoreseptorlag for proteinanalyse.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for trinn for hurtigcelleskalling. (A) Diagram viser hovedtrinnene for dissekering og hemisecting av det isolerte øyet. (B) Fotoreseptor ytre segmenter fjernes trinnvis ved sekvensiell peeling ved hjelp av filterpapir. For det første er netthinner orientert slik at fotoreseptorlaget er i kontakt med filterpapiret. Deretter tørkes filterpapiret ved blotting på et papirhåndkle, og netthinnen skrelles bort fra filterpapiret. Denne skrellede isolasjonen samles i et rør som holdes på is. Denne prosessen gjentas syv til åtte ganger for å fjerne stangens ytre segment (+ROS). Denne figuren ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Lyofilisert netthinne peeling prosess. (A) Flyt diagram over prøvepreparering for lyofilisert netthinne. Netthinner er orientert slik at netthinnen ganglion cellelaget er i kontakt med filterpapiret og fotoreseptorene vender opp. (B) Etter lyofilisering festes den frysetørkede netthinnen til et stykke tape etter å ha tilført litt trykk til toppen av båndet. Båndet skrelles bort, fjerner stangens ytre segment (ROS) og stang indre segment (RIS) lag. RIS-laget fjernes med flere tapeskall til ROS-laget er synlig (oransje/rosa lag). Denne figuren ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Uttrykk for GNAT1 og ARR1 i isolerte stangfotoreseptorer etter sekvensiell filterpapirskalling. (A) Immunoblots of +ROS og -ROS (ROS-utarmede) prøver samlet inn av filterpapirskallmetoden som er anskaffet fra mørk- og lystilpasset netthinne. Blots ble undersøkt med antistoffer mot lysutløste proteiner (transducin (GNAT1) og arrestin (ARR1)) og kvalitetskontrollmarkører (GTPase aktiverende protein (Gß5L/S) cytokrom C (Cyt C) og aktin). To halverte netthinne ble kombinert for disse representative blotter. (B) Kvantifiserte signaler fra GNAT1 og ARR1 fra mørk- og lystilpasset netthinne. Det er gjensidig lysutløst bevegelse av GNAT1 og ARR fra +ROS og -ROS isolerer. Fiolinplott viser det normaliserte uttrykket for +ROS- og -ROS-prøver. Denne figuren er endret fra Rose et al.36. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Skanne elektronmikroskopbilder av lyofilisert netthinne. (A) Overflate av lyofilisert netthinne før tape peeling (fotoreseptor side opp). (B) Det indre segmentet lag etter tape peeling. (C) Cellekroppslaget etter tape peeling viser et jevnt kjernefysisk utseende. Denne figuren er endret fra Rose et al.36 og ble opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Validering av tape peeling metoden for å isolere ROS og RIS fra lyofilisert netthinne. (A) Vestlige flekker av +ROS, +RIS, og -OIS (ROS / RIS-utarmet) prøver samlet inn av tape peeling metoden. Immunobloter ble undersøkt med transducin (GNAT1), arrestin (ARR1), GTPase aktiverende protein (Gß5L/S), cytokrom C (Cyt C) og aktinantistoffer. Prøver ble hentet fra mørk- og lystilpasset netthinne og halverte retinalisolasjoner (+ROS, +RIS, -OIS) ble kombinert for mer konsentrert materiale. (B) Kvantifiserte signaler fra GNAT1 og ARR1 er plottet som fiolinplott for de forskjellige isolerte netthinnelagene, som ble hentet fra mørk- og lystilpasset netthinne. (C) Normaliserte uttrykksnivåer fra +RIS og -OIS ble kombinert og plottet inn for å sammenligne metoder for høytrykks- og filterpapirskalling. Mørke og lystilpassede prøver viste kjent bevegelse av viktige fototransduksjonsproteiner. Denne figuren er endret fra Rose et al.36. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Tape peeling av lyofilisert netthinne for å undersøke subcellulær lokalisering av GRK1 og PKCα i fotoreseptorer. (A) En representativ vestlig blott av skrellede prøver fra lystilpassede C57BL/6J-mus som demonstrerer de relative nivåene av rhodopsinkinase (GRK1), proteinkinase C-alfa (PKCα), GTPase aktiverende protein (Gß5L/S) og aktin. (B) Frossen retinal seksjon fremstilt av lys-eksponerte mus inkubert med PKCα antistoff (grønn, 1:100). RPE, retinal pigmentert epitel; OS, ytre segment; IS, indre segment; CB, cellekropp; ST, synaptisk terminal. Skalastang = 10 μm. (C) PKCα og GRK1 normaliserte uttrykksnivåer for +ROS, +RIS, -OIS-prøver plottes som fiolinplott. (D) Sub-optimal tape peeling kan potensielt gi litt forurensede prøver. Den røde firkanten fremhever +RIS-prøven kontaminert med noen -OIS-prøve, og produserer både Gß5L/S-bånd og et høyere PKCα-signal. To halverte netthinne ble kombinert for alle blotter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mål Antistoff Fortynning Fabrikant
Arrestin Kanin anti-ARR1 1:1000 Chen, et. al., 2006.
Transducin Mus anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Actin Kanin anti-ß Actin 1:5000 GeneTex Inc.
Cytokrom C Kanin anti-cytokrom C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
GAP (Gß5L/S) Kanin anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et. al., 1996.
Protein kinase C alfa (PKC) Kanin anti-PKC (#2050) 1:1000 Cellesignaleringsteknologi.
Rhodopsin Kinase (GRK1) Mus anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tabell 1: Liste over antistoffer som brukes til vestlig blot validering av separasjonsteknikker.

Isolasjon av filterpapir retinal
+ROS* -ROS* Hele Retina
Gjennomsnittlig proteinkonsentrasjon (μg/ml) 700 1,500 1,500
RIPA-buffervolum (μL) 90 150 200
Tape peeling retinal isolasjon
+ROS* +RIS* -ROS* Hele Retina
Gjennomsnittlig proteinkonsentrasjon (μg/ml) 520 440 1,200 1,600
RIPA-buffervolum (μL) 100 100 125 150
* Kombinert to halverte retinal isolasjoner.

Tabell 2: Proteinkonsentrasjon i retinal isolasjon homogenater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mange netthinnesykdommer påvirker stang fotoreseptorceller, noe som fører til stangdød og til slutt fullstendig synstap37. En betydelig del av den genetiske og mekanistiske opprinnelsen til menneskelig retinal degenerasjon har blitt vellykket rekapitulert i mange musemodeller gjennom årene. I den sammenhengen vil evnen til enkelt og selektivt å skille individuelle stang subcellulære rom fra den lille mus netthinnen i stor grad forbedre vår forståelse av lokaliserte biokjemiske og molekylære understøttelser av netthinnesykdommer. Videre tillater den lagdelte naturen til nevral netthinnen, kombinert med det unike, svært polariserte arrangementet av stang fotoreseptorer, isolasjon av stangrom ved selektiv peeling. Dette manuskriptet beskriver to protokoller som brukes til å isolere individuelle subcellulære rom av stang fotoreseptorceller for immunoblotting. Ikke bare er begge metodene betydelig raskere og mindre teknisk utfordrende sammenlignet med den eksisterende metoden for tangentiell seksjonering9, men de krever også en vesentlig mindre prøvestørrelse enn den vanlige biokjemiske isolasjonen av ROS ved hjelp av tetthetsgradienter19. Slike ROS gradient rensing teknikker krever 8-10 murine netthinne å pålitelig gjenopprette rikelig ROS, mens protokollene presentert her er egnet for enkelt netthinne.

Til tross for den generelle enkelheten i de foreslåtte teknikkene, gjelder en av hovedutfordringene som er felles for begge protokollene sammenslåingen av den buede netthinnen på filterpapiret som kreves for riktig isolasjon av de forskjellige subcellulære rommene. Den isolerte netthinnen har en tendens til å krølle seg opp og ta på seg en muslinglignende form. Hvis netthinnen har brettede kanter når den plasseres på filterpapiret (fotoreseptorsiden enten opp eller ned), kan dette redusere utbyttet av de ønskede isolerte stanglagene. Enda viktigere, hvis netthinnen ikke er riktig flatt, er lagfordeling og forurensning fra andre subcellulære rom og netthinneceller et sannsynlig utfall (figur 6D). For å begrense krumningen av det halverte retinalrektangelet og for å rette opp den ufullkomne justeringen av stangen og netthinnelagene, kan retinalrektangelet kuttes i halvparten for å produsere to retinal firkanter. Ved å kutte nevral netthinnen i mindre biter, reduseres den naturlige krumningen i netthinnen, og vevet er mer sannsynlig å ligge flatt på filterpapiret.

Å gjenkjenne når de forskjellige stangrommene har blitt fysisk separert, kan være vanskelig for noen som er uerfaren med disse teknikkene. Vi anbefaler at før du starter et biologisk signifikant eksperiment, bør brukeren løpe gjennom prosessen med prøve netthinne i en time eller to. Praksis bør gi betydelig forbedring i operatørens ferdigheter og ferdigheter i metodene. Når du bruker filterpapir til å skrelle ros fra en levende netthinne, indikerer ingen åpenbare visuelle signaler når ROS-laget er isolert. Mens netthinnen blir tynnere og mer skjøre, må brukeren selv overvåke og validere antall peeling for å isolere ROS nøyaktig. Videre vil bruk av filterpapir med forskjellige fibertykkelser og grovhet endre ROS-peelingtiden. Filterpapir med tykkere fibre (for eksempel VWR Grad 413) vil isolere retinal lag raskere (6-8 peeling), men kan ikke være så selektiv og kan føre til forurensning fra andre lag. Filterpapir med tynnere fibre (for eksempel Whatman Grad 1) isolerer netthinnelag langsommere (12-15 peeling) og vil gi en ren isolasjon av fotoreseptorlagene. Vi anbefaler at du bruker både tykkere og tynnere filterpapir for å minimere peelingtiden og sikre at samlingen er ren.

Samtidig er visuell tilnærming og båndprøvehåndtering begge nøkkelen til suksessen med å isolere subcellulære rom fra den lyofiliserte netthinnen. Hvis det legges for mye trykk på båndet, vil hele den lyofiliserte netthinnen holde seg til båndet. Når dette skjer, blir separering av ROS lengre og vanskeligere, men ikke umulig: Plasser et annet stykke tape på den frie overflaten (på ganglioncellesiden) av netthinnen og trekk sakte bort lagene med tape til bare det oransje / rosa laget er synlig på det første stykke tape. Å isolere RIS på dette tidspunktet er imidlertid umulig. Hvis det legges for lite trykk på båndet, vil en stor del av ROS ikke feste seg til båndet. For å sikre riktig ROS-tape-vedheft, anbefaler vi å trykke forsiktig med pinsett på regionene som ikke holder seg til båndet. Vanligvis resulterer det minste trykket i fjerning av ROS- og RIS-lagene, men mengden trykk må bestemmes basert på erfaring. Tilstedeværelsen av isolert RIS kan fastslås ved å sjekke om et tynt, hvitt lag (som ligner på en lett støving av snø) er synlig på den første ROS-tapeskallet, mens tilstedeværelsen av isolert ROS lett kan bestemmes ved å sjekke fargen på stangfotoreseptorlaget (oransje for mørktilpasset, rosa for lystilpasset) på båndet.

En siste utfordring oppstår når du homogeniserer filterpapirskallene (+ROS) fra den levende netthinnen. Filterpapir absorberer lett væske, og en betydelig mengde av homogeniseringsbufferen vil bli gjennomvåt i løpet av dette trinnet i protokollen. Spinning av væsken ned i en mini sentrifuge etter å ha plassert peeling papiret på siden av hvert rør bidrar til å forhindre tap av prøve. Dessverre kan spinning av flere stykker filterpapir være en tidkrevende prosess, og tap av prøve er uunngåelig. Du kan løse dette problemet ved å fjerne noen av filterpapirdelene og fokusere på å homogenisere færre deler om gangen. I tillegg, for å unngå tap av prøve i løpet av dette trinnet, bør du vurdere å minimere den totale mengden filterpapir som brukes til å isolere ROS.

Selv om begge metodene våre ikke krever en stor prøvestørrelse, eller den nøyaktige justeringen av et blad for å seksjonere netthinnen, er det noen begrensninger for våre fotoreseptor peeling teknikker som er verdt å merke seg. For det første kan den lyofiliserte murin netthinnen ikke være mottagelig for peeling påfølgende fotoreseptorlag utover ROS og RIS. For det andre er våre peelingmetoder mer egnet for behandling av individuell netthinne og er ikke mottagelige for stor batchbehandling i en sittende. For det tredje er suksessen til eksperimentet avhengig av følsomhetsgrensen til antistoffet som brukes i den vestlige blotten. Til tross for disse begrensningene viser våre representative resultater at våre to isolasjonsskallteknikker effektivt kan isolere spesifikke stang fotoreseptorrom. I tillegg bruker disse to metodene billige og vanlige laboratoriematerialer (filterpapir og tape), noe som gjør dem svært tilgjengelige. I studien vår vurderte vi ikke direkte om andre netthinneceller kunne isoleres for immunoblotting; Vi tror imidlertid at disse metodene lett kan endres for å dra nytte av behovene til et bredt tverrsnitt av netthinneforskningssamfunnet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant EY12155, EY027193 og EY027387 til JC. Vi er takknemlige til Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) og Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) for korrekturlesing av manuskriptet. Vi vil også takke Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, USA) og Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, USA) for å gi nødvendig utstyr for å samle forfatteren ga opptak. Materiale fra: Kasey Rose et al, Separasjon av fotoreseptorcellerom i mus netthinne for proteinanalyse, Molecular Neurodegeneration, publisert [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

Nevrovitenskap utgave 178
To peeling metoder for isolering av photoreceptor celle rom i musen netthinnen for protein analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter