Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Два метода пилинга для выделения компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

В этом протоколе представлены два метода выделения субклеточных компартментов фоторецепторов мышечных стержней для анализа белка. Первый способ использует живую сетчатку и целлюлозную фильтровальную бумагу для разделения наружных сегментов стержня, в то время как второй использует лиофилизированные сетчатки и клейкую ленту для удаления слоев внутреннего и наружного сегментов стержня.

Abstract

Палочковые фоторецепторы представляют собой высокополяризованные сенсорные нейроны с отчетливыми отсеками. Мышиные стержни длинные (~80 мкм) и тонкие (~2 мкм) и сбоку упакованы в самый внешний слой сетчатки, слой фоторецепторов, что приводит к выравниванию аналогичных субклеточных компартментов. Традиционно тангенциальное сечение замороженной плоской сетчатки использовалось для изучения движения и локализации белков в разных стержневых отсеках. Однако высокая кривизна стержневой доминантной сетчатки мыши затрудняет тангенциальное сечение. Мотивированные изучением транспорта белка между компартментами, мы разработали два метода пилинга, которые надежно изолируют стержневой внешний сегмент (АФК) и другие субклеточные компартменты для вестерн-блотов. Наши относительно быстрые и простые методы обеспечивают обогащенные и субклеточные специфические фракции для количественного измерения распределения и перераспределения важных белков фоторецепторов в нормальных палочках. Кроме того, эти методы изоляции также могут быть легко адаптированы для выделения и количественного исследования белкового состава других клеточных слоев как в здоровых, так и в дегенеративных сетчатках.

Introduction

Палочковые фоторецепторные клетки, плотно упакованные в самый внешний слой нервной сетчатки, являются неотъемлемой частью зрения тусклого света. Чтобы функционировать как верные счетчики фотонов, палочки используют сигнальный путь на основе G-белка, называемый фототрансдукцией, для генерации быстрых, усиленных и воспроизводимых реакций на захват одного фотона. Эта реакция на свет в конечном итоге вызывает изменение тока на плазматической мембране и впоследствии сигнализируется остальной части зрительной системы1. Как следует из названия, каждая палочковая клетка имеет отличную палочковидную форму и демонстрирует высокополяризованную клеточную морфологию, состоящую из внешнего сегмента (OS), внутреннего сегмента (IS), тела клетки (CB) и синаптической терминали (ST). Каждый субклеточный компартмент имеет специфический белковый механизм (связанный с мембраной и растворимый), биомолекулярные особенности и белковые комплексы, которые играют решающую роль, такие как визуальная фототрансдукция, общее ведение хозяйства и синтез белка, а также синаптическая передача2,3.

Более 30 лет назад впервые наблюдалось светозависимое реципрокное движение субклеточных белков, в частности трансдуцина (от ОС) и арестина (к ОС), 4,5,6,7. Вначале это наблюдаемое явление было воспринято скептически, отчасти из-за уязвимости иммуногистохимии к эпитопной маскировке8. В начале 2000-х годов транслокация белка, зависящая от стимула, была подтверждена с помощью строгой и трудной техники физического сечения9. Последовательное тангенциальное сечение замороженной плоской сетчатки грызунов с последующим иммуноблоттингом показало, что трансдуцин9,10, арестин11,12 и восстановление13 подвергаются субклеточному перераспределению в ответ на свет. Считается, что световая транслокация этих ключевых сигнальных белков не только регулирует чувствительность каскада фототрансдукции9,14,15, но также может быть нейропротекторной против повреждения светом16,17,18. Поскольку легкий транспорт белка в палочках, по-видимому, очень важен для биологии и физиологии стержневых клеток, методы, которые позволяют выделять различные субклеточные компартменты для определения распределения белка, являются ценными инструментами исследования.

В настоящее время существует несколько методов, направленных на изоляцию стержневых субклеточных компартментов. Однако эти методы могут быть длительными и трудными для воспроизведения или требуют значительного количества изолята сетчатки. Например, препараты внешнего сегмента стержня (АФК) посредством центрифугирования градиента плотности19 обычно используются для отделения АФК от гомогената сетчатки. Этот метод широко используется для вестерн-блоттинга, но процедура очень трудоемкая и требует минимум 8-12 мышиных сетчаток20. С другой стороны, последовательное тангенциальное сечение замороженных мышей и сетчатки крыс было успешно реализовано в изоляции OS, IS, CB и ST9,11,13. Однако этот метод является технически сложным из-за необходимости полного сглаживания маленькой и сильно изогнутой мышиной сетчатки для выравнивания слоев сетчатки перед тангенциальным сечением. Поскольку существует множество мышиных моделей и трансгенных мышей, повторяющих заболевания зрительной системы, создание техники, которая надежно, быстро и легко разделяет отдельные стержневые отсеки, имеет перспективы в выявлении физиологических процессов, которые происходят в каждом специализированном отсеке, и механизмов, лежащих в основе зрительных процессов в здоровье и болезни.

Чтобы облегчить эти исследования, мы описываем два метода пилинга, которые изолируют стержневые субклеточные компартменты легче, чем современные протоколы. Первый метод пилинга, адаптированный из метода воздействия флуоресцентно меченых биполярных клеток для записи зажима пластыря21, использует целлюлозную фильтровальную бумагу для последовательного удаления АФК из живой, изолированной мышиной сетчатки (рисунок 1). Второй метод, адаптированный из процедуры, которая изолирует три первичных слоя клеток сетчатки от сетчатки chick22 и frog23, использует клейкую ленту для удаления внутреннего сегмента АФК и палочки (РИС) из лиофилизированной сетчатки (рисунок 2). Обе процедуры могут быть выполнены за 1 час и значительно удобны для пользователя. Мы обеспечиваем проверку эффективности этих двух протоколов разделения для вестерн-блоттинга путем использования адаптированной к темноте и подверженной воздействию света сетчатки от мышей C57BL / 6J для демонстрации светоиндуцированной транслокации стержневого трансдуцина (GNAT1) и арестина (ARR1). Кроме того, используя метод ленточного пилинга, мы предоставляем дополнительные доказательства того, что наша методика может быть использована для изучения и устранения несоответствий между данными локализации белка, полученными иммуноцитохимией (ICC), и западными пятнами. В частности, наша методика показала, что: 1) изоформа протеинкиназы С-альфа (PKCα) присутствует не только в биполярных клетках, но и в мышиных АФК и РИС, хотя и в низких концентрациях24,25, и 2) родопсинкиназа (GRK1) присутствует преимущественно в изолированном образце ОС. Эти данные демонстрируют эффективность наших двух методов пилинга для разделения и количественной оценки конкретных стержневых и сетчаточных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с местными институциональными руководящими принципами комитета по уходу за животными из Университета Южной Калифорнии (USC).

1. Метод пилинга сетчатки живыми клетками

  1. Приготовление буферов Эймса, пилинг бумаги и тарелки для вскрытия
    1. Используя ножницы с тупым наконечником радужной оболочки (или эквивалентные ножницы), разрежьте целлюлозную фильтровальную бумагу (марка 413) на прямоугольники размером примерно 5 мм х 2,5 мм. Храните черенки для будущего использования.
    2. Приготовьте 1 л буфера HEPES Эймса, соединив одну бутылку среды Эймса, 2,38 г HEPES и 0,877 г NaCl. Растворите реагенты в стерильной стеклянной бутылке с дистиллированной сверхчистой водой и отрегулируйте осмолярность и рН до 280 мОсм и 7,4 соответственно. Фильтровать для стерилизации (размер пор 0,2 мкм), запечатывать крышку парафиновой пленкой и хранить при 4 °C.
    3. Приготовьте 1 л бикарбонатного буфера Эймса, соединив одну бутылку среды Эймса и 1,9 г NaHCO3. Растворите реагенты в стерильной стеклянной бутылке с дистиллированной сверхчистой водой и отрегулируйте осмолярность и рН до 280 мОсм и 7,4 соответственно. Фильтровать для стерилизации (размер пор 0,2 мкм), запечатывать крышку парафиновой пленкой и хранить при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HePES Эймса и бикарбонатные буферы Эймса могут быть приготовлены заранее и храниться в течение 1 недели при 4 °C.
    4. На дне чашки Петри размером 35 х 10 мм создайте решетчатый или шахматный узор скальпелем (лезвие No 11, 40 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Текстурированное дно чашки Петри удерживает изолированный, свободно плавающий глаз на месте во время рассечения сетчатки.
  2. Рассечение сетчатки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры буфер следует подносить и хранить при комнатной температуре (RT). Обновляйте бикарбонатный буфер Эймса каждые 15 минут свежим карбогенированным бикарбонатным буфером Эймса во время рассечения. Это поддерживает необходимый физиологический рН.
    1. Примерно за 15-20 мин до рассечения насыщают кислородом буфер HEPES Эймса в лабораторной или медиа-бутылке объемом 100 мл, оснащенной адаптером колпачка трубки, и пузырьковый буфер бикарбоната Эймса с 95% O2 и 5% CO2 в инкубационной камере ткани и в лабораторном или медиа-баллоне объемом 100 мл, оснащенном адаптером колпачка трубки.
    2. Усыплите равное количество обоих полов мышей C57BL/6J (2-3 месяца) либо путем вдыхания изофлурана, либо углекислого газа (CO2) с последующим вывихом шейки матки. Энуклеируйте глаза изогнутыми ножницами и поместите глаза в текстурированную чашку Петри размером 35 х 10 мм, наполненную пузырьковым бикарбонатным буфером Эймса.
    3. Создайте глазную чашку (рисунок 1А), проткнув отверстие в соединении роговицы и лимбуса иглой 18 G. Разрезать по периметру этого соединения с помощью микродиссекции ножницами радужной оболочки для удаления роговицы каждого глаза. Отделите хрусталик и стекловидное тело от каждого глаза с помощью пинцета и выбросьте.
    4. Изолируйте сетчатку от глазной чашки, тщательно отшелушивая пигментированный эпителий сетчатки (RPE)-склера-сосудистой оболочки от нервной сетчатки. Откажитесь от комплекса RPE-склера-сосудистой оболочки. Убедитесь, что сетчатка не повреждена во время рассечения, обрабатывая только края.
    5. Перенесите изолированную сетчатку с помощью широкой передаточной пипетки в крышку тарелки размером 60 x 15 мм, заполненную пузырьковым бикарбонатным буфером Эймса.
    6. Ориентируйте полусферообразную сетчатку вверх (фоторецепторы обращены вниз к нижней части тарелки) и разделяйте каждую сетчатку пополам (через зрительный нерв) с помощью ножниц радужной оболочки или скальпеля (лезвие No 10, 40 мм). Обрежьте изогнутые края каждой половины сетчатки, чтобы получить два прямоугольника (рисунок 1A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация кривизны каждой половинчатой сетчатки позволяет сетчатке лучше сплющиваться на последующих этапах пилинга и производит точный отслаивание слоя наружного сегмента палочки (АФК).
    7. Храните половинчатую сетчатку в тканевой инкубационной камере, которая непрерывно пузырится с 95% O2 и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированную сетчатку можно держать в карбогенированном бикарбонатном буфере Эймса в течение ~24 ч.
  3. Сбор наружного сегмента стержня (ROS) методом очистки фильтровальной бумаги
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обновляйте насыщенный кислородом буфер HEPES Эймса каждые 15-20 минут во время процесса пилинга для поддержания необходимого физиологического рН.
    1. Переместите один прямоугольник сетчатки из камеры ткани с помощью переносной пипетки с широким отверстием и листа фильтровальной бумаги размером 5 мм x 2,5 мм в чашку Петри размером 35 x 10 мм, заполненную буфером HEPES Эймса, наполненным 100% O2.
    2. Ориентируйте разделенную сетчатку вверх и убедитесь, что фоторецепторы обращены вниз к нижней части чашки. Слегка обхватите пинцетом по бокам половинчатую сетчатку и переместите ее поверх фильтровальной бумаги. Как только сетчатка будет центрирована на фильтровальной бумаге, переместите фильтровальную бумагу вверх, чтобы половинчатая сетчатка коснулась фильтровальной бумаги, чтобы создать адгезию ROS к фильтрующей бумаге (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что слой фоторецептора вступает в непосредственный контакт с фильтровальной бумагой.
    3. Осторожно поднимите фильтровальную бумагу с прикрепленной сетчаткой из буфера HEPES Эймса. Положите нижнюю сторону фильтровальной бумаги (сторону без сетчатки) на бумажное полотенце и смажьте 2-3 раза для высыхания (рисунок 1B).
    4. Добавьте каплю HEPES Эймса на боковую сторону фильтровальной бумаги с сетчаткой. Снова положите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце, чтобы высохнуть, как только что описано. Повторите этот процесс еще два раза.
    5. Поместите фильтровальную бумагу с сетчаткой обратно в чашку Петри. С помощью пинцета осторожно отодвиньте все края половинчатой сетчатки вверх и прочь от фильтровальной бумаги со всех сторон.
    6. Деликатно отклейте сетчатку от фильтровальной бумаги. Прикасайтесь только к крайнему периметру сетчатки во время процесса шелушения, чтобы сохранить структурную целостность сетчатки.
    7. Поднимите фильтровальную бумагу с чашки Петри и удалите лишнюю жидкость на бумажном полотенце. Убедитесь, что сторона, которая соприкасалась с сетчаткой, не контактирует с бумажным полотенцем.
    8. Поместите фильтровальную бумагу с частичным слоем ROS в маркированную трубку на льду (рисунок 1B). Держите очищенную сетчатку погруженной в буфер HEPES Эймса.
    9. Повторите процесс пилинга для этой половинки сетчатки примерно 7-8 раз, чтобы удалить весь слой ROS. После каждого пилинга поместите фильтровальную бумагу в ту же трубку, которая будет содержать изолированный АФК из одной половинки сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не порвать половинку сетчатки при отслаивании ее от фильтровальной бумаги, так как сетчатка становится тоньше во время этого процесса.
    10. Поместите трубку, содержащую все отслаивания фильтровальной бумаги изолированного АФК, на лед для немедленного использования или заморозьте непосредственно на сухом льду и храните при -80 °C.
    11. Используйте пинцет для переноса остатков очищенной сетчатки (без АФК) в соответствующим образом маркированную трубку. Поместите трубку на лед для немедленного использования или заморозьте сухим льдом и храните при -80 °C.
    12. Повторите процесс пилинга для каждой половинки сетчатки и точно обозначьте каждую трубку.

2. Метод лиофилизированного пилинга сетчатки

  1. Буферы, пилинговая среда, приготовление блюд для рассечения и установка лиофилизатора
    1. В бутылке для хранения объемом 1 л приготовьте раствор Рингера, добавив 500 мл дистиллированной сверхчистой воды. Растворяют реагенты до конечной концентрации 130 мМ NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl2, 1,2 мМ CaCl2, 10 мМ HEPES и 0,02 мМ ЭДТА. Отрегулируйте pH до 7,4 с NaOH, добавьте сверхчистую воду, чтобы довести конечный объем до 1 л, и отрегулируйте осмолярность до 313 мОсм.
    2. Перед применением отфильтруйте раствор Рингера стерильным фильтром (размер пор 0,2 мкм), закройте крышку парафиновой пленкой и храните при 4 °C.
    3. Используя ножницы с тупым наконечником радужной оболочки (или эквивалентные ножницы), разрежьте целлюлозную фильтровальную бумагу на прямоугольники размером примерно 5 мм х 2,5 мм. Используйте карандаш, чтобы написать на одной стороне фильтровальной бумаги, чтобы создать уникальную этикетку.
    4. Создайте рисунок решетки или шахматной доски в нижней части чашки Петри размером 35 х 10 мм с помощью скальпеля (лезвие No 11, 40 мм).
    5. Включите лиофилизатор в соответствии со спецификациями производителя.
    6. Приобретайте жидкий азот в колбе Дьюара или аналогичной изоляционной вакуумной колбе.
  2. Рассечение сетчатки
    1. Завершите рассечение сетчатки, как описано в разделе 1 протокола (рисунок 1А). Используйте холодный раствор Рингера вместо буфера Эймса.
    2. После вскрытия храните половинчатую прямоугольную сетчатку в чашке Петри размером 35 х 10 мм, заполненной холодным раствором Рингера, и поместите на лед.
  3. Пробоподготовка сетчатки к лиофилизации
    1. Поместите лист фильтровальной бумаги размером 5 x 2,5 мм и переложите половинчатую сетчатку в текстурированную чашку Петри размером 35 x 10 мм, заполненную холодным буфером Рингера. Используйте переносную пипетку с широким отверстием, чтобы перемещать каждую сетчатку между чашками.
    2. Используйте пинцет, чтобы осторожно перевернуть сетчатку, чтобы она была ориентирована вогнутой вверх (фоторецепторы направлены вверх) и переместите ее так, чтобы она опиралась поверх фильтровальной бумаги (рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фоторецепторы не контактируют с фильтровальной бумагой (слой ганглиозных клеток сетчатки должен находиться в непосредственном контакте с фильтровальной бумагой), и уникальная метка видна. Чтобы легко и быстро идентифицировать изолят сетчатки, рекомендуется, чтобы уникальная этикетка располагалась на нижней стороне фильтровальной бумаги.
    3. Поднимите фильтровальную бумагу по краям вверх, чтобы разрезанный пополам кусок сетчатки коснулся фильтровальной бумаги, и продолжайте поднимать фильтровальную бумагу из раствора Рингера.
    4. Поместите нижнюю сторону фильтровальной бумаги (сторону без сетчатки на ней) на бумажное полотенце и осторожно смажьте 2-3 раза, чтобы удалить лишнюю жидкость (рисунок 2А).
    5. Возьмите фильтровальную бумагу пинцетом и добавьте каплю холодного Ringer's на бок фильтровальной бумаги с сетчаткой. Снова поместите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Повторите процесс еще два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти чередующиеся этапы смачивания и сушки гарантируют, что ткань прочно прикреплена к фильтровальной бумаге.
    6. Храните каждый приклеенный образец сетчатки/фильтровальной бумаги в чашке Петри, наполненной холодными образцами Рингера, пока они не будут готовы заморозить все образцы. Повторите этот процесс для всех половинок сетчатки.
    7. Получите чистую и сухую чашку Петри размером 35 x 10 мм (только снизу) и кусок алюминиевой фольги, разрезанный на квадрат размером 3,5 x 3,5 дюйма.
    8. Поднимите каждый образец из буфера холодного рингера пинцетом. Убедитесь, что пинцет контактирует только с краями фильтровальной бумаги, избегая половинки сетчатки.
    9. Поместите нижнюю сторону каждой фильтровальной бумаги (сторону без сетчатки на ней) на бумажное полотенце и удалите лишнюю жидкость.
    10. Добавьте каплю холодного 1x PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ KH2PO4, pH 7,4) на сторону фильтровальной бумаги, где прилипает сетчатка. Нанесите фильтровальную бумагу на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что влага из фильтровальной бумаги достаточно удалена перед замерзанием.
    11. Поместите все кусочки фильтровальной бумаги в чашку Петри размером 35 x 10 мм. Используйте папиросную бумагу без ворса, чтобы удалить лишнюю жидкость, окружающую фильтровальную бумагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не переполняйте чашку Петри образцами. Если используется более четырех мышиных глаз, рассмотрите возможность использования большей чашки Петри или нескольких меньших чашек Петри для хранения образцов сетчатки / фильтровальной бумаги.
    12. Плотно оберните всю посуду алюминиевой фольгой. Убедитесь, что края алюминиевой фольги закреплены и плавно вдавлены в дно чашки Петри. Проколите горсть отверстий диаметром 0,1-0,2 мм в крышке из алюминиевой фольги (рисунок 2А).
    13. Используя металлические щипцы, постепенно опустите покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри в жидкий азот. Храните образцы в жидком азоте (<10 мин) до готовности к лиофилизации.
  4. Лиофилизация
    1. Поместите покрытую алюминиевой фольгой чашку Петри в флягу для сублимационной сушки и прикрепите ее к лиофилизирующей машине в соответствии с протоколом производителя. Лиофилизируют сетчатку в течение 30 мин.
    2. Отсоедините колбу от лиофилизатора и выключите машину по словам производителя.
    3. Снимите алюминиевую фольгу и либо работайте с сублимированными образцами в тот же день, либо храните их в правильно маркированных микроцентрифужных трубках объемом 1 мл. Поместите эти трубки в контейнер (например, коническую трубку объемом 50 мл), заполненный безводным осушителем, и храните образцы при -80 °C.
  5. Сбор стержня наружного и внутреннего сегмента методом отслаивания клейкой лентой.
    1. Нарежьте полоски прозрачной клейкой ленты (1-2 см) и храните полоски на краю дозатора ленты / лабораторного стенда / и т. Д. Для быстрого использования.
    2. Переместите один образец сетчатки на крышку пластиковой чашки Петри размером 60 х 15 мм для очистки. Убедитесь, что вы захватываете только самые внешние края фильтровальной бумаги и не прикасайтесь к сетчатке.
    3. С помощью тупого наконечника ирисовых ножниц (или эквивалентного ножничного типа) отрежьте небольшой прямоугольный кусочек ленты до приблизительного размера ткани (1,5 х 2,5 мм).
    4. Аккуратно положите небольшой кусочек ленты поверх лиофилизированной сетчатки (рисунок 2B) и приложите небольшое давление пинцетом, чтобы убедиться, что он связывается со слоем фоторецепторов (верхний слой оранжевого / розового оттенка).
    5. Медленно отклейте ленту. Как внешний сегмент стержня (ROS), так и внутренний сегмент стержня (RIS) будут прикреплены к ленте (рисунок 2B).
    6. Убедитесь, что на разрушенной поверхности есть тонкая белая пленка. Это RIS.To отделить РИС, поместить еще один кусок ленты и протолкнуть ленту вниз на трещиноватую поверхность (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления всего тонкого белого слоя может потребоваться более одного куска ленты.
    7. Поместите кусок ленты только с оранжевым/розовым слоем в микроцентрифужную трубку с маркировкой +ROS.
    8. Поместите ленту или кусочки ленты тонким белым слоем в микроцентрифужную трубку с маркировкой +RIS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение лиофилизированной сетчатки лентой требует практики. Количество давления, приложенного к ленте, будет влиять на то, как лиофилизированный образец будет дробиться. Если слишком сильно надавить на ленту над образцом, вся лиофилизированная сетчатка отслоится от фильтровальной бумаги и прилипнет к ленте. Если к ленте добавить слишком мало давления, оранжевый/розовый верхний слой (+ROS) не будет прилипать к ленте.
    9. Соберите оставшуюся ткань сетчатки (без слоев ROS и RIS, -OIS), расположенную на фильтровальной бумаге, сняв толстый белый слой с фильтровальной бумаги с помощью ленты. Поместите изолят в трубку с маркировкой -OIS.
    10. Повторите эти шаги для каждого половинчатого образца сетчатки.
    11. Храните изолированные слои из лиофилизированной сетчатки либо при комнатной температуре, если выполняете количественную оценку белка, гель-электрофорез и белковые иммуноблоки в тот же день, либо храните в контейнере (например, конической трубке объемом 50 мл), заполненном безводным осушителем при -80 °C для последующего использования.

3. Вестерн блотт пробоподготовка для изоляции пилинга

  1. Подготовка буфера лизиса RIPA
    1. В бутылку для хранения 100 мл добавляют реагенты для получения конечной концентрации 50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% Тритона X-100, 1% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS и 1 мМ ЭДТА. Добавьте 100 мл деионизированной сверхчистой воды и тщательно перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер лизиса RIPA можно хранить при 2-8 °C в течение 2-3 недель. Для более длительного хранения аликвотируйте и храните в морозильной камере -20 °C.
    2. В день эксперимента добавьте коктейль ингибитора протеазы (0,1 M PMSF, 1:1000 апротинина и 1:1000 leupeptin) в буфер лизиса RIPA и держите на льду.
  2. Подготовка фильтровальной бумаги для очистки лизата для вестерн-блоттинга
    1. Убедитесь, что трубки, содержащие кожуру фильтровальной бумаги и остатки очищенной сетчатки, выдержаны на льду (для эксперимента в тот же день) или извлечены из морозильной камеры при температуре -80 °C и помещены на лед.
    2. Удалите лишнюю жидкость со дна микроцентрифужных трубок, содержащих кожуру фильтровальной бумаги. Быстро вращайте в мини-центрифуге в течение 2-4 с и выбрасывайте оставшуюся жидкость.
    3. Пипетка 45-55 мкл холодного буфера RIPA в пробирки, содержащие изолят фильтровальной бумаги.
    4. Гомогенизируйте каждый образец чистым автоклавным смесителем для пестиков в течение 1 мин. Убедитесь, что фильтровальная бумага остается в контакте с смесителем для пестиков. Держите фильтровальную бумагу сбоку каждой трубки, а не внизу.
    5. Пинцетом переместите фильтровальную бумагу в сторону каждой трубки и вращайте в мини-центрифуге в течение 2-4 с. Это удалит буфер RIPA из фильтровальной бумаги.
    6. Удалите высохшую фильтровальную бумагу и при необходимости повторите для всей фильтровальной бумаги в каждой трубке.
    7. Перенесите гомогенат на новую трубку и метьте его соответствующим образом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это самый трудоемкий шаг, и если он не будет выполнен должным образом, большая часть образца в конечном итоге будет поглощена фильтровальной бумагой.
    8. Пипетка 60-80 мкл холодного буфера RIPA в отдельные трубки с остатками очищенной сетчатки.
    9. Гомогенизируйте каждый образец чистым автоклавным смесителем для пестиков в течение 1 мин.
  3. Ленточный пилинг Лизат препарат для вестерн-блоттинга
    1. Поместите на лед лиофилизированные образцы RT или пробы с температурой -80 °C.
    2. Пипетка 50-70 мкл холодного буфера RIPA в каждую трубку, содержащую ленточные пипетки +ROS и +RIS.
    3. Пипетка 60-80 мкл буфера холодного лизиса в трубки -OIS, содержащие оставшуюся лиофилизированную сетчатку, с удалением АФК и РИС.
    4. Гомогенизируйте каждый образец чистым смесителем для пестиков в течение 1 мин. Убедитесь, что лента в отдельных трубках остается в контакте с смесителем пестиков и буфером лизиса.
    5. Стерилизованным пинцетом переместите ленту в сторону трубок и вращайте мини-центрифугой в течение 2-4 с. Это удалит жидкость из ленты. Снимите высохшую ленту с трубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе вы можете объединить два полуизолята сетчатки из одной и той же сетчатки для метода «пилинг фильтровальной бумаги» или «пилинг ленты», чтобы убедиться, что у вас достаточно объема для выполнения анализа бицинхониновой кислоты (BCA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Настоящие стратегии были разработаны для обеспечения относительно быстрых и простых методов выделения и анализа белков среди специфических стержневых субклеточных компартментов для анализа вестерн-блоттинга. Мы применили два метода последовательного пилинга (рисунок 1 и рисунок 2) с последующим иммуноблоттингом, чтобы продемонстрировать, что эти методы могут быть надежно использованы для обнаружения известного распределения стержневого трансдуцина (GNAT1) и арестина (ARR1) как у темных, так и у светоадаптированных животных. Чтобы подтвердить эффективность наших двух протоколов в точном выделении стержневых субклеточных компартментов без загрязнения из других клеточных слоев, иммуноблоты были исследованы антителами к цитохрому C (Cyt C), актину и Gß5S / Gß5L26. Список используемых антител и разведений представлен в таблице 1. Cyt C и актин указывают на чистоту АФК, так как они являются обильными белками в проксимальной сетчатке, но отсутствуют в АФК. Gß5L, компонент белка, активирующего ГТФазу (GAP) для GNAT127, присутствует в АФК и РИС и служит средством контроля для этих выделений. Gß5S, более короткая изоформа сращивания, которая не присутствует в ROS или RIS, но находится во всех других стержневых отсеках, служила в качестве контроля для изолированных субклеточных компартментов, не относящихся к ROS/RIS.

Во-первых, эффективность нашего метода последовательного пилинга сетчатки живыми клетками оценивалась путем анализа распределения GNAT1 и ARR1 в стержнях мышей, адаптированных к темноте и свету (рисунок 3). Фильтровальные бумаги, содержащие АФК (+АФК), были объединены в общей сложности из одной целой сетчатки, и соответствующая остаточная ткань (-АФК) также была объединена. Сигналы от указанных белков впоследствии сравнивали между образцами +ROS и образцами -ROS, и целая изолированная сетчатка служила входным контролем. Концентрация белка и объем гомогенизации для этих образцов представлены в таблице 2. Результаты, представленные на рисунке 3A , показывают, что у животных, адаптированных к темноте, распределение GNAT1 и ARR128 близко соответствовало их известным распределениям в темном состоянии, где сигнал GNAT1 был явно самым сильным в изоляции +ROS, тогда как сигнал ARR1 был более надежным в изоляции -ROS. Соответственно, в сетчатке, подвергшейся воздействию света, сигнал GNAT1 был заметно уменьшен при изоляции +ROS и имел повышенный сигнал в образце -ROS, в то время как светоиндуцированная транслокация ARR1 могла быть визуализирована в образцах +ROS и -ROS. Результаты шести различных экспериментов были количественно оценены, и были обнаружены статистически значимые различия между условиями темного /светлого для GNAT1 и ARR1 в выборках +ROS и -ROS (рисунок 3B). Эти результаты согласуются с ранее известным движением белка в светло-темном движении в стержневых субклеточных компартментах и убедительно указывают на то, что этот метод может изолировать обогащенные фракции + АФК.

Для дальнейшей проверки нашего метода пилинга живых клеток мы исследовали известные распределения маркеров чистоты АФК как в образцах +АФК, так и в образцах -АФК. Как в темных, так и в светоадаптированных образцах сигналы Gß5S, Cyt C и актина исключаются из образцов +ROS (рисунок 3A), демонстрируя отсутствие загрязнения из других клеточных слоев. Кроме того, сигнал Gß5L был хорошо виден в образцах +ROS (рисунок 3A). Кроме того, сигналы актина и Gß5L не только подтверждали чистоту фракций +ROS и -ROS, но и выступали в качестве средств контроля для нормализации, при этом сигналы от образцов +ROS нормализовались по образцам Gß5L и -ROS по отношению к актину. Как показано на фиг.3А, рекомендуется, чтобы изоляты пилинга живых клеток загружались вместе с контролем нагрузки, в частности целым гомогенатом сетчатки, для оптимальной нормализации и анализа иммуноблоттинга. Вместе эти данные подтверждают, что наш метод пилинга живых клеток может обеспечить быстрый и воспроизводимый подход к выделению субклеточного слоя АФК от остальной части палочки и сетчатки для анализа белка.

Затем мы оценили нашу технику лиофилизированного пилинга, чтобы убедиться, что этот метод может воспроизводимо изолировать компартменты АФК и РИС. До иммуноблоттинга мы визуализировали поверхности неповрежденных и очищенных лиофилизированных сетчаток мыши с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), чтобы проанализировать, какой субклеточный слой фоторецептора дал ленточный пилинг (рисунок 4). Перед отслаиванием клейкой лентой поверхность неповрежденной лиофилизированной сетчатки (оранжевый/розово-окрашенный слой) вплотную соответствовала профилю характерного цилиндрического АФК (рисунок 4А). После первоначального отслаивания ленты АФК и РИС, по-видимому, были полностью удалены, о чем свидетельствует однородный ядерный слой, присутствующий на поверхности оставшейся очищенной лиофилизированной сетчатки (рисунок 4C). Последующие ленточные отслаивания удаляли РИС (тонкий белый слой, рисунок 4В) со свободной поверхности очищенного слоя, процессу, вероятно, способствовал узкий и хрупкий соединительный ресничок, связывающий внутренний и внешний сегменты. Эти результаты подтвердили, что палочковые субклеточные слои из лиофилизированной ткани сетчатки могут быть специально фракционированы с помощью ленты.

Подтвердив эффективность этого метода визуально, адаптированные к темноте и свету очищенные сетчатки были подвергнуты иммуноблоттингу с использованием того же подхода с использованием белковых маркеров для разных компартментов, как описано для нашего метода пилинга живых клеток (рисунок 3). Концентрация белка и объем гомогенизации для выделения АФК (+АФК), выделения РИС (+РИС) и остальных слоев сетчатки (-ОИС) представлены в таблице 2. Как и ожидалось, для GNAT1 произошел явный световой сдвиг от ROS к RIS, а также ARR1 от RIS к ROS (рисунок 5A). GNAT1 был наиболее распространен в образце +ROS в темноте и в образце +RIS на свету, в то время как сигнал ARR1 был обратным (рисунок 5A). Затем мы нормализовали и количественно оценили транслокационные белковые сигналы из изоляций +ROS, +RIS и -OIS (рисунок 5B), используя те же элементы управления и подход, что и методология живого пилинга. Мы также объединили образцы +RIS и -OIS (рисунок 5C) для более прямого сравнения с нашим методом очистки фильтровальной бумаги с живыми ячейками (рисунок 3B). Оба графика показывают хорошо установленную и характерную светоиндуцированную транслокацию как GNAT1, так и ARR1. Основываясь на этих наблюдениях, препарат для лущивания ленты, по-видимому, дает обогащенные фракции ROS и RIS, о чем свидетельствует белковый состав ARR1 и GNAT1 в этих изоляциях.

Далее оценивали чистоту отдельных субклеточных выделений. Подобно результатам, показанным на рисунке 3A, в образцах +ROS отсутствовали сигналы для актина, цитохрома C и Gß5S при отображении сильного сигнала Gß5L (рисунок 5). Этот результат показывает отсутствие загрязнения из других субклеточных компартментов в нашей пробоподготовке +ROS. Затем оценивали содержание белка в последующем субклеточном слое стержня, изоляции +RIS. Мы обнаружили, что образец +RIS был положительным для Cyt C, Gß5L и актина. Это открытие согласуется с известным составом РИС, который богат митохондриями и цитоскелетными элементами. Последний слой, изолят -OIS, имел распределение белка, соответствующее образцам -ROS, показанным на рисунке 3A.

Чтобы дополнительно оценить полезность нашего метода пилинга клейкой ленты при исследовании белковых композиций стержневых субклеточных компартментов, мы специально изучили иммунореактивность родопсинкиназы (GRK1) и протеинкиназы C-альфа (PKCα) в наших образцах +ROS, +RIS и -OIS. Различные экспериментальные методы, такие как иммуноцитохимия (ICC) и вестерн-блоттинг, часто дают противоречивые результаты о точной локализации этих белков в палочках и сетчатке. GRK1, например, считается относительно обильным в стержневой и конусной ОС для опосредования фосфорилирования светоактивированных опсинов29. Однако иммуномаркировка срезов сетчатки выявила локализацию GRK1 либо конкретно в OS30,31, либо по всему слою фоторецепторов32. PKCα, с другой стороны, является белком, который обычно используется для ICC для маркировки биполярных клеток. Несмотря на отсутствие четких доказательств палочкоспецифической иммуномаркировки PKCα в срезах сетчатки25, существует значительное количество биохимических24,25 и функциональных33,34,35 доказательств, подтверждающих наличие и фосфорилируя роль PKCα в АФК. Используя наш метод, мы обнаружили, что иммунореактивность GRK1 была наиболее интенсивной в образцах +ROS в сетчатке, подвергающихся воздействию света, и отсутствовала в образцах -OIS (рисунок 6A). И наоборот, мы показываем, что выборки +ROS и +RIS отображали слабый сигнал для PKCα. Как видно на рисунке 6B, PKCα обычно не обнаруживается в АФК или РИС путем иммунофлуоресцентного окрашивания срезов сетчатки. Однако PKCα был иммуноопределен западным пятном (рисунок 6A,D). Поскольку изоляции +ROS и +RIS отображают сильный сигнал Gß5L и отсутствие Gß5S (рисунок 6A), мы уверены, что тусклый сигнал PKCα в образцах ROS и RIS является подлинным и не связан с загрязнением из других слоев. Для визуализации отдельных сигналов в изоляциях +ROS, +RIS и -OIS блоки GRK1 и PKCα были объединены и построены для сравнения (рисунок 6C).

Наконец, пример неоптимального сеанса пилинга (рисунок 6D) демонстрирует, как загрязнение из разных подслоев может искажать результаты, дополнительно иллюстрируя важность интерпретации данных и включения соответствующих контрольных антител для скрининга на экспериментальные ошибки пилинга. В этом примере изоляции отслаивания ленты в полосе изоляции РИС проявляется слабый сигнал Gß5S, указывающий на незначительное загрязнение от образца -OIS. В зависимости от цели пользователя, это небольшое загрязнение может не быть проблемой. Однако в данном случае мы исследовали сигнал PKCα в образцах +ROS и +RIS, и сигнал PKCα немного выше в полосе RIS по сравнению с полосой ROS (рисунок 6A, D), возможно, из-за загрязнения. Таким образом, во время процесса пилинга следует соблюдать осторожность, чтобы обеспечить точную изоляцию и свести к минимуму загрязнение. Несмотря на минимальное загрязнение из-за индивидуальной ошибки, эти данные являются убедительными доказательствами того, что методология ленточного пилинга может дать точные последовательные выделения слоев фоторецепторов стержней для анализа белка.

Figure 1
Рисунок 1: Схема этапов пилинга живых клеток. (А) Диаграмма показывает основные этапы рассечения и гемисекции изолированного глаза. (B) Наружные сегменты фоторецептора удаляются постепенно путем последовательного отслаивания с использованием фильтровальной бумаги. Во-первых, сетчатка ориентирована так, что слой фоторецептора контактирует с фильтровальной бумагой. Далее фильтровальную бумагу высушивают путем промокания на бумажном полотенце, а сетчатку отслаивают от фильтровальной бумаги. Этот очищенный изолят собирают в трубку, хранящуюся на льду. Этот процесс повторяется семь-восемь раз, чтобы полностью удалить внешний сегмент стержня (+ROS). Эта фигура была создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Процесс лиофилизированного пилинга сетчатки. (А) Технологическая схема пробоподготовки лиофилизированной сетчатки. Сетчатки ориентированы так, что слой ганглиозных клеток сетчатки контактирует с фильтровальной бумагой, а фоторецепторы обращены вверх. (B) После лиофилизации лиофилизацию лиофилизированную сетчатку приклеивают к куску ленты после добавления небольшого давления на верхнюю часть ленты. Лента отслаивается, удаляя слои наружного сегмента стержня (ROS) и внутреннего сегмента стержня (RIS). Слой RIS удаляется большим количеством ленточных пилингов до тех пор, пока не станет виден слой ROS (оранжевый/розовый слой). Эта фигура была создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Экспрессия GNAT1 и ARR1 в изолированных палочковых фоторецепторах после последовательного пилинга фильтровальной бумаги. (A) Иммуноблоты образцов +ROS и -ROS (ROS-истощенных) образцов, собранных методом пилинга фильтровальной бумаги, полученных из темных и светоадаптированных сетчаток. Кляксы были исследованы антителами к белкам, вызванным светом (трансдуцин (GNAT1) и арестин (ARR1)) и маркерами контроля качества (активирующий GTPase белок (Gß5L / S), цитохром C (Cyt C) и актин). Две половинчатые сетчатки были объединены для этих репрезентативных пятен. (B) Количественные сигналы GNAT1 и ARR1 от сетчатки, адаптированной к темноте и свету. Наблюдается обратное световое движение GNAT1 и ARR от изолятов +ROS и -ROS. Скрипичные графики изображают нормализованное выражение образцов +ROS и -ROS. Этот показатель был изменен по сравнению с Rose et al.36. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Сканирующие изображения в электронном микроскопе лиофилизированной сетчатки. (A) Поверхность лиофилизированной сетчатки перед отслаиванием ленты (фоторецепторная сторона вверх). (B) Внутренний сегмент слоя после отслаивания ленты. (C) Клеточный слой тела после отслаивания ленты показывает однородный ядерный вид. Этот рисунок был изменен из Rose et al.36 и был создан с BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Валидация метода ленточного пилинга для выделения АФК и РИС из лиофилизированной сетчатки. (А) Вестерн-пятна образцов +АФК, +РИС и -ОИС (ROS/RIS-истощенные) образцы, собранные методом ленточного пилинга. Иммуноблоты были исследованы трансдуцином (GNAT1), арестином (ARR1), активирующим ГТФазу белком (Gß5L / S), цитохромом C (Cyt C) и антителами к актину. Образцы, полученные из темных и светоадаптированных сетчаток, и половинчатые изоляты сетчатки (+ROS, +RIS, -OIS) были объединены для получения более концентрированного материала. (B) Количественные сигналы GNAT1 и ARR1 строятся в виде скрипичных графиков для различных изолированных слоев сетчатки, которые были получены из сетчатки, адаптированной к темноте и свету. (C) Нормализованные уровни экспрессии +RIS и -OIS были объединены и нанесены на график для сравнения методов очистки ленты и фильтровальной бумаги. Образцы, адаптированные к темноте и свету, показали известное движение ключевых белков фототрансдукции. Этот показатель был изменен по сравнению с Rose et al.36. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Ленточный пилинг лиофилизированной сетчатки для исследования субклеточной локализации GRK1 и PKCα в фоторецепторах. (A) Репрезентативное западное пятно очищенных образцов от адаптированных к свету мышей C57BL/6J, демонстрирующее относительные уровни родопсинкиназы (GRK1), протеинкиназы C-альфа (PKCα), белка, активирующего ГТФазу (Gß5L/S), и актина. (B) Замороженный участок сетчатки, приготовленный из мышей, подвергшихся воздействию света, инкубированных с антителом PKCα (зеленый, 1:100). РПЭ, пигментированный эпителий сетчатки; ОС, внешний сегмент; IS, внутренний сегмент; CB, тело клетки; ST, синаптический терминал. Шкала баров = 10 мкм. (C) PKCα и GRK1 нормализованные уровни экспрессии для образцов +ROS, +RIS, -OIS строятся в виде скрипичных графиков. D) Неоптимальное отслаивание ленты может потенциально привести к образованию слабо загрязненных образцов. Красный квадрат выделяет образец +RIS, загрязненный некоторым образцом -OIS, производя как диапазоны Gß5L/S, так и более высокий сигнал PKCα. Две половинчатые сетчатки были объединены для всех пятен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Цель Антитело Разбавление Изготовитель
Арестин Кролик анти-ARR1 1:1000 Чен и др., 2006.
Трансдуцин Мышь анти-GNAT (TF-15) 1:1000 Цитосигнал.
ß Актин Кролик анти-ß Actin 1:5000 ГенеТекс Инк.
Цитохром С Кролик антицитохром С 1:500 Санта-Крус, sc-7159.
ГАП (Гсс5Л/С) Кролик анти-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et al., 1996.
Протеинкиназа С альфа (PKC) Кролик анти-PKC (#2050) 1:1000 Технология сотовой сигнализации.
Родопсинкиназа (GRK1) Мышь анти-GRK1 (G-8) 1:200 Санта-Крус, sc-8004.

Таблица 1: Список антител, используемых для валидации методов сепарации вестерн-блоттинга.

Изоляция сетчатки из фильтровальной бумаги
+РОС* -РОС* Вся сетчатка
Средняя концентрация белка (мкг/мл) 700 1,500 1,500
Объем буфера RIPA (мкл) 90 150 200
Ленточный пилинг выделения сетчатки
+РОС* +РИС* -РОС* Вся сетчатка
Средняя концентрация белка (мкг/мл) 520 440 1,200 1,600
Объем буфера RIPA (мкл) 100 100 125 150
* Комбинированные две половинчатые изоляции сетчатки.

Таблица 2: Концентрация белка в гомогенатах выделения сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Многие заболевания сетчатки поражают палочковые фоторецепторные клетки, приводя к гибели палочки и, в конечном счете, полной потере зрения37. Значительная часть генетического и механистического происхождения дегенерации сетчатки человека была успешно воспроизведена в многочисленных моделях мышей на протяжении многих лет. В этом контексте способность легко и избирательно отделять отдельные палочковые субклеточные компартменты от сетчатки маленьких мышей значительно улучшила бы наше понимание локализованных биохимических и молекулярных основ заболеваний сетчатки. Кроме того, слоистая природа нервной сетчатки в сочетании с уникальным, высокополяризованным расположением палочковых фоторецепторов позволяет изолировать стержневые отсеки путем селективного пилинга. В этой рукописи описаны два протокола, используемые для выделения отдельных субклеточных компартментов палочковых фоторецепторных клеток для иммуноблоттинга. Мало того, что оба метода значительно быстрее и менее технически сложны по сравнению с существующим методом тангенциального сечения9, но они также требуют значительно меньшего размера выборки, чем обычная биохимическая изоляция АФК с использованием градиентов плотности19. Такие методы очистки градиента АФК требуют 8-10 мышиных сетчаток для надежного восстановления достаточного КОЛИЧЕСТВА АФК, тогда как протоколы, представленные здесь, подходят для одной сетчатки.

Несмотря на общую простоту предложенных методов, одна из основных проблем, общих для обоих протоколов, касается сглаживания изогнутой сетчатки на фильтровальной бумаге, необходимой для правильной изоляции различных субклеточных компартментов. Изолированная сетчатка имеет тенденцию сворачиваться и принимать форму моллюска. Если сетчатка имеет сложенные края при размещении на фильтровальной бумаге (сторона фоторецептора либо вверх, либо вниз), это может уменьшить выход желаемых изолированных слоев стержней. Что еще более важно, если сетчатка не сплющена должным образом, то смещение слоя и загрязнение от других субклеточных компартментов и клеток сетчатки является вероятным результатом (рисунок 6D). Чтобы ограничить кривизну половинчатого прямоугольника сетчатки и исправить несовершенное выравнивание стержня и слоев сетчатки, прямоугольник сетчатки можно разрезать пополам, чтобы получить два квадрата сетчатки. Разрезая нервную сетчатку на более мелкие кусочки, естественная кривизна сетчатки уменьшается, и ткань с большей вероятностью будет лежать плоско на фильтровальной бумаге.

Распознавание того, когда различные стержневые отсеки были физически разделены, может быть сложным для тех, кто неопытен в этих методах. Мы советуем, чтобы перед началом биологически значимого эксперимента пользователь должен пройти через процесс с образцом сетчатки в течение часа или двух. Практика должна привести к существенному улучшению навыков оператора и владения методами. При использовании фильтровальной бумаги для удаления АФК от живой сетчатки никакие очевидные визуальные сигналы не указывают, когда слой АФК был изолирован. В то время как сетчатка становится тоньше и хрупче, пользователю придется самостоятельно контролировать и проверять количество пилингов, чтобы точно изолировать АФК. Кроме того, использование фильтровальной бумаги с различной толщиной волокна и грубостью изменит время отслаивания ROS. Фильтровальная бумага с более толстыми волокнами (например, VWR Grade 413) быстрее изолирует слои сетчатки (6-8 пилингов), но может быть не такой селективной и может привести к загрязнению из других слоев. Фильтровальная бумага с более тонкими волокнами (например, Whatman Grade 1) будет изолировать слои сетчатки медленнее (12-15 пилингов) и даст чистую изоляцию слоев фоторецепторов. Мы рекомендуем использовать как более толстую, так и более тонкую фильтровальную бумагу, чтобы свести к минимуму время отслаивания и обеспечить чистоту сбора.

В то же время визуальное приближение и обработка образцов ленты являются ключом к успеху изоляции субклеточных компартментов от лиофилизированной сетчатки. Если к ленте добавить слишком большое давление, вся лиофилизированная сетчатка будет прилипать к ленте. Как только это происходит, разделение АФК становится более длинным и трудным, но не невозможным: поместите второй кусок ленты на свободную поверхность (на стороне ганглиозных клеток) сетчатки и медленно оттяните слои лентой, пока на начальном куске ленты не будет виден только оранжевый / розоватый слой. Однако изолировать РИС на данном этапе невозможно. Если к ленте добавить слишком мало давления, большая часть АФК не будет прилипать к ленте. Чтобы обеспечить правильную адгезию ROS-ленты, советуем аккуратно надавить пинцетом на участки, которые не прилипают к ленте. Как правило, малейшее давление приводит к удалению слоев АФК и РИС, однако величина давления должна определяться на основе опыта. Наличие изолированной РИС можно установить, проверив, виден ли тонкий белый слой (сродни легкому запылению снега) на исходном отслоении ленты ROS, в то время как наличие изолированного АФК можно легко определить, проверив цвет слоя фоторецептора стержня (оранжевый для темно-адаптированного, розоватый для светоадаптированного) на ленте.

Последняя проблема возникает при гомогенизации фильтровальной бумаги (+ROS) из живой сетчатки. Фильтровальная бумага легко впитывает жидкость, и значительное количество гомогенизирующего буфера будет впитываться на этом этапе протокола. Вращение жидкости вниз в мини-центрифуге после размещения отслаивающейся бумаги на стороне каждой трубки помогает предотвратить потерю образца. К сожалению, раскрутка нескольких кусков фильтровальной бумаги может быть трудоемким процессом, и потеря образца неизбежна. Чтобы решить эту проблему, удалите некоторые кусочки фильтровальной бумаги и сосредоточьтесь на гомогенизации меньшего количества кусочков за раз. Кроме того, чтобы избежать потери образца на этом этапе, рассмотрите возможность минимизации общего количества фильтровальной бумаги, используемой для изоляции АФК.

Хотя оба наших метода не требуют большого размера выборки или точного выравнивания лезвия для разрезания сетчатки, есть несколько ограничений для наших методов фоторецепторного пилинга, которые стоит отметить. Во-первых, лиофилизированная мышиная сетчатка может не поддаваться очистке последующих слоев фоторецепторов за пределами АФК и РИС. Во-вторых, наши методы пилинга больше подходят для обработки отдельных сетчаток и не поддаются обработке большими партиями за один присест. В-третьих, успех эксперимента зависит от предела чувствительности антитела, используемого в вестерн-блотте. Несмотря на эти ограничения, наши репрезентативные результаты показывают, что наши два метода изоляционного пилинга могут эффективно изолировать определенные стержневые фоторецепторные отсеки. Кроме того, эти два метода используют недорогие и обычные лабораторные материалы (фильтровальная бумага и клейкая лента), что делает их очень доступными. В нашем исследовании мы напрямую не оценивали, могут ли другие клетки сетчатки быть выделены для иммуноблоттинга; однако мы считаем, что эти методы могут быть легко изменены в интересах широкого круга исследовательского сообщества сетчатки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами NIH EY12155, EY027193 и EY027387 для JC. Мы благодарны доктору Спиридону Михалакису (Калтех, Пасадена, США) и Натали Чен (USC, Лос-Анджелес, США) за корректуру рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Сета Раффинса (USC, Лос-Анджелес, США) и д-ра Яноша Пети-Петерди (USC, Лос-Анджелес, США) за предоставление необходимого оборудования для сбора предоставленных автором отснятого материала. Материал из: Kasey Rose et al, Разделение компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка, Молекулярная нейродегенерация, опубликовано [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

Неврология выпуск 178
Два метода пилинга для выделения компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter