Summary
该协议提出了两种技术来分离小鼠杆光感受器的亚细胞区室以进行蛋白质分析。第一种方法利用活视网膜和纤维素滤纸来分离杆外段，而第二种方法采用冻干视网膜和胶带剥离杆内段和外段层。
Abstract
视杆光感受器是具有不同区室的高度极化感觉神经元。小鼠杆长（~80μm）和薄（~2μm），横向堆积在视网膜的最外层，即光感受器层，导致类似的亚细胞区室对齐。传统上，冷冻的平板视网膜的切向切片已被用于研究不同杆室内蛋白质的运动和定位。然而，杆状小鼠视网膜的高曲率使得切向切片具有挑战性。在对区室间蛋白质转运研究的推动下，我们开发了两种剥离方法，可以可靠地分离出杆外段（ROS）和其他亚细胞区室用于蛋白质印迹。我们相对快速和简单的技术提供富集和亚细胞特异性级分，以定量测量正常视杆中重要光感受器蛋白的分布和再分布。此外，这些分离技术也可以很容易地用于分离和定量研究健康和退化视网膜中其他细胞层的蛋白质组成。
Introduction
棒状光感受器细胞紧密地聚集在神经视网膜的最外层，是昏暗光视觉的一个组成部分。为了充当忠实的光子计数器，杆利用基于G蛋白的信号通路（称为光转导）来产生对单光子捕获的快速，放大和可重复的响应。这种对光的响应最终会触发质膜电流的变化，并随后向视觉系统的其余部分发出信号1。顾名思义，每个杆细胞都具有独特的杆状形状，并表现出高度极化的细胞形态，由外段（OS），内段（IS），细胞体（CB）和突触末端（ST）组成。每个亚细胞区室具有特定的蛋白质机制（膜结合和可溶性）、生物分子特征和蛋白质复合物，这些蛋白质复合物起着至关重要的作用，如视觉光转导、一般内务管理和蛋白质合成以及突触传递2，3。
30多年前，首次观察到亚细胞蛋白的光依赖性相互运动，特别是转导素（远离OS）和停滞素（朝向OS），4，5，6，7。早期，这种观察到的现象受到怀疑，部分原因是免疫组织化学对表位掩蔽的脆弱性8。在2000年代初，通过使用严格而艰苦的物理切片技术证实了刺激依赖性蛋白质易位9。对冷冻的平装啮齿动物视网膜进行连续切向切片，然后进行免疫印迹，结果显示，转导素9，10，arrestin11，12和recoverin13都响应于光的亚细胞再分布。据信，这些关键信号蛋白的光驱动易位不仅调节光转导级联的灵敏度9，14，15，而且还可能对光损伤具有神经保护作用16，17，18。由于视杆细胞中的光驱动蛋白转运似乎对视杆细胞生物学和生理学非常重要，因此允许分离不同亚细胞区室以确定蛋白质分布的技术是有价值的研究工具。
目前，有几种旨在分离杆亚细胞区室的方法。然而，这些方法可能很长且难以复制，或者需要相当数量的视网膜分离物。例如，通过密度梯度离心19制备棒外段（ROS）通常用于将ROS与视网膜匀浆分离。这种方法广泛用于蛋白质印迹，但该过程非常耗时，并且至少需要8-12个小鼠视网膜20。另一方面，冷冻小鼠和大鼠视网膜的连续切向切片已成功用于分离OS，IS，CB和ST9，11，13。然而，这种方法在技术上具有挑战性，因为在切向切片之前，必须完全压平小而高度弯曲的小鼠视网膜以对齐视网膜层。由于有大量的小鼠模型和转基因小鼠概括视觉系统的疾病，因此创建一种可靠，快速且容易地分离单个杆室的技术有望揭示每个专用隔室中发生的生理过程以及健康和疾病中视觉过程背后的机制。
为了促进这些研究，我们描述了两种剥离方法，它们比目前的方案更容易分离杆亚细胞区室。第一种剥离方法改编自一种暴露荧光标记的双极细胞以进行膜片钳记录的技术21，它采用纤维素滤纸从活的，分离的小鼠视网膜中依次去除ROS（图1）。第二种方法改编自从chick22和frog23视网膜中分离出三个主要视网膜细胞层的程序，利用胶带从冻干视网膜中去除ROS和杆内段（RIS）（图2）。这两个程序都可以在1小时内完成，并且非常人性化。我们通过利用来自C57BL / 6J小鼠的黑暗适应和光暴露的视网膜来证明光诱导的杆转导素（GNAT1）和逮捕素（ARR1）的易位，从而验证了这两种分离方案对蛋白质印迹的有效性。此外，使用胶带剥离方法，我们提供了额外的证据，证明我们的技术可用于检查和解决通过免疫细胞化学（ICC）和蛋白质印迹获得的蛋白质定位数据之间的不一致。具体而言，我们的技术表明：1）蛋白激酶C-α（PKCα）亚型不仅存在于双极细胞中，还存在于小鼠ROS和RIS中，尽管浓度低24，25和2）视紫红质激酶（GRK1）主要存在于分离的OS样品中。这些数据证明了我们的两种剥离技术在分离和定量特定视网膜蛋白和视网膜蛋白方面的有效性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验均根据南加州大学（USC）研究动物护理委员会的当地机构指南进行。
1. 活细胞视网膜剥离法
- 准备艾姆斯的缓冲液、去皮纸和解剖皿
- 使用钝尖虹膜剪刀（或等效的剪刀型），将纤维素滤纸（413级）切割成长方形，尺寸约为5 mm x 2.5 mm。储存插条以备将来使用。
- 通过混合一瓶Ames'培养基，2.38克HEPES和0.877克NaCl来制备1升Ames的HEPES缓冲液。用蒸馏超纯水将试剂溶解在无菌玻璃瓶中，并将渗透压和pH分别调节至280 mOsm和7.4。过滤灭菌（孔径0.2μm），用石蜡膜密封盖子，并储存在4°C。
- 将一瓶艾姆斯培养基和 1.9 克 NaHCO3 混合，制备 1 升 Ames 碳酸氢盐缓冲液。用蒸馏超纯水将试剂溶解在无菌玻璃瓶中，并将渗透压和pH分别调节至280 mOsm和7.4。过滤灭菌（孔径0.2μm），用石蜡膜密封盖子，并储存在4°C。
注意：Ames的HEPES和Ames的碳酸氢盐缓冲液可以提前制备并在4°C下储存1周。 - 在 35 x 10 mm 培养皿的底部，使用手术刀（刀片编号 11，40 mm）创建格子或棋盘图案。
注意：在视网膜解剖期间，培养皿的纹理底部将孤立的，自由漂浮的眼睛固定在适当的位置。
- 视网膜解剖
注意：对于此过程，应将缓冲液带到室温（RT）并保持在室温（RT）下。在解剖过程中，每15分钟用新鲜的碳化Ames碳酸氢盐缓冲液刷新Ames的碳酸氢盐缓冲液。这维持了必要的生理pH值。- 在解剖前约15-20分钟，在装有管帽适配器的100 mL实验室或培养基瓶中对Ames的HEPES缓冲液进行氧氧化，并在组织培养箱和装有管帽适配器的100 mL实验室或培养基瓶中，用95%O 2和5%CO 2对Ames的碳酸氢盐缓冲液进行泡泡。
- 通过异氟醚吸入或二氧化碳（CO2）对相同数量的C57BL / 6J小鼠（2-3个月大）的两种性别实施安乐死，然后进行宫颈脱位。用弯曲的剪刀修饰眼睛，并将眼睛放入充满气泡Ames碳酸氢盐缓冲液的纹理35 x 10毫米培养皿中。
- 通过用18 G针刺穿角膜边缘连接处的孔来创建眼罩（图1A）。使用显微解剖虹膜剪刀沿着该交界处的周边切割，以去除每只眼睛的角膜。使用镊子将晶状体和玻璃体房从每只眼睛中分离出来并丢弃。
- 通过小心地将视网膜色素上皮（RPE）-巩膜-脉络膜复合物从神经视网膜上剥离出来，将视网膜从眼罩中分离出来。丢弃 RPE-巩膜-脉络膜复合物。通过仅处理边缘，确保视网膜在解剖过程中没有受损。
- 使用宽孔转移移液器将孤立的视网膜转移到充满气泡Ames碳酸氢盐缓冲液的60 x 15 mm培养皿的盖子中。
- 将半球形视网膜向上凹面（感光器朝下朝向培养皿的底部），并使用虹膜剪刀或手术刀（刀片10号，40毫米）将每个视网膜（通过视神经）一分为二。修剪每个半视网膜的弯曲边缘以形成两个矩形（图1A）。
注意：最小化每个减半视网膜的曲率可以使视网膜在随后的剥离步骤中更好地变平，并产生杆外段（ROS）层的精确剥离。 - 将减半的视网膜储存在组织孵育室中，该室连续用95%的O 2 和5%的CO 2冒泡。
注意：分离的视网膜可以在碳化Ames的碳酸氢盐缓冲液中保存约24小时。
- 通过滤纸剥离收集棒外段（ROS）
注意：在剥离过程中，每15-20分钟刷新一次RT含氧Ames的HEPES缓冲液，以保持必要的生理pH值。- 使用宽孔转移移液器和5 mm x 2.5 mm滤纸将一个视网膜矩形从组织室转移到装有100%O2气泡的Ames'HEPES缓冲液的35 x 10 mm培养皿中。
- 将分区的视网膜向上凹陷，并确保光感受器朝下朝向培养皿的底部。用镊子轻轻抓住切成两半的视网膜的侧面，然后将其移动到滤纸的顶部。一旦视网膜在滤纸上居中，向上移动滤纸，使对半的视网膜接触到滤纸，从而产生ROS到滤纸的粘附（图1B）。
注：确保光感受器层与滤纸直接接触。 - 小心地将带有视网膜的滤纸从Ames的HEPES缓冲液中取出。将滤纸的底部（没有视网膜的一面）放在纸巾上，轻拍2-3次以干燥（图1B）。
- 将一滴Ames的HEPES添加到带有视网膜的滤纸的侧面。再次将滤纸放在纸巾上晾干，如前所述。再重复此过程两次。
- 将带有视网膜的滤纸放回培养皿中。使用镊子，轻轻地将半视网膜的所有边缘向上推，从所有侧面移开滤纸。
- 小心地将视网膜从滤纸上剥离出来。在剥离过程中仅触摸视网膜的极端周边，以保持视网膜的结构完整性。
- 从培养皿中取出滤纸，取出纸巾上多余的液体。确保与视网膜接触的一侧不接触纸巾。
- 将带有部分ROS层的滤纸放入冰上的标记管中（图1B）。将去皮的视网膜浸没在 Ames 的 HEPES 缓冲液中。
- 对这个减半的视网膜重复剥离过程约7-8次，以去除整个ROS层。每次剥离后，将滤纸放入同一管中，该管将包含来自一个半视网膜的分离ROS。
注意：当将视网膜从滤纸上剥离时，请注意不要撕裂一半的视网膜，因为在此过程中视网膜会变薄。 - 将装有所有分离的ROS滤纸剥离的管子放在冰上立即使用，或直接在干冰上冷冻并储存在-80°C。
- 使用镊子将剩余的剥离的视网膜（缺乏ROS）转移到适当标记的管中。将管子放在冰上立即使用或用干冰冷冻并储存在-80°C。
- 对每个切成两半的视网膜重复剥离过程，并准确标记每个管子。
2. 冻干视网膜剥离法
- 缓冲液、去皮培养基、解剖皿制备和冻干仪设置
- 在1L储存瓶中，通过加入500mL蒸馏超纯水来制备Ringer溶液。溶解试剂以达到130 mM NaCl，3.6 mM KCl，2.4 mM MgCl2，1.2 mM CaCl2，10 mM HEPES和0.02 mM EDTA的终浓度。用NaOH将pH值调节至7.4，加入超纯水使最终体积达到1 L，并将渗透压调节至313 mOsm。
- 使用前，用无菌过滤器（孔径0.2μm）过滤林格溶液，用石蜡膜密封盖子，并储存在4°C。
- 使用钝尖虹膜剪刀（或等效的剪刀型），将纤维素滤纸切割成长方形，尺寸约为5 mm x 2.5 mm。用铅笔在滤纸的一面上书写，以创建唯一的标签。
- 使用手术刀（刀片编号11，40 mm）在35 x 10 mm培养皿的底部创建格子或棋盘图案。
- 根据制造商的规格打开冻干机。
- 在杜瓦瓶或类似的绝缘真空瓶中获取液氮。
- 视网膜夹层
- 按照方案第1节所述完成视网膜解剖（图1A）。使用冷林格溶液代替艾姆斯的缓冲液。
- 解剖后，将对半的矩形视网膜存放在装满冷林格溶液的35 x 10毫米培养皿中，然后放在冰上。
- 用于冻干的视网膜样品制备
- 放入5 x 2.5 mm滤纸，并将减半的视网膜转移到装有冷Ringer缓冲液的纹理化35 x 10 mm培养皿中。使用宽孔转移移液器在培养皿之间移动每个视网膜。
- 使用镊子小心地翻转视网膜，使其朝上凹陷（感光器指向上方），然后将其移动到滤纸的顶部（图2A）。
注意：确保光感受器不接触滤纸（视网膜神经节细胞层应与滤纸直接接触），并且唯一标签可见。为了轻松快速地识别视网膜分离物，建议将唯一标签放置在滤纸的下侧。 - 向上抬起滤纸的边缘，使切成两半的视网膜接触到滤纸，并继续将滤纸从Ringer溶液中提起。
- 将滤纸的底部（上面没有视网膜的一面）放在纸巾上，小心地轻拍2-3次以除去多余的液体（图2A）。
- 用镊子拿起滤纸，在带有视网膜的滤纸侧面加入一滴冷铃声。再次将滤纸放在纸巾上以除去多余的液体。再重复该过程两次。
注意：这些交替的润湿和干燥步骤可确保组织牢固地附着在滤纸上。 - 将每个粘附的视网膜/滤纸样品存放在装满冷铃声的培养皿中，直到准备好冷冻所有样品。对所有减半的视网膜重复此过程。
- 获得一个干净干燥的35 x 10毫米培养皿（仅限底部）和一块铝箔切成3.5 x 3.5英寸见方。
- 用镊子将每个样品从冷的Ringer缓冲液中取出。确保镊子仅接触滤纸边缘，避免视网膜减半。
- 将每张滤纸的底部（上面没有视网膜的一面）放在纸巾上，然后取出多余的液体。
- 将一滴冷的1x PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH 7.4）滴到滤纸的侧面，粘附视网膜。将滤纸轻拍在纸巾上以除去多余的液体。
注意：确保在冷冻前充分去除滤纸中的水分。 - 将所有滤纸放入 35 x 10 mm 培养皿中。使用不含绒毛的薄纸吸走滤纸周围的任何多余液体。
注意：不要用样品过度填充培养皿。如果使用四个以上的鼠眼，请考虑使用较大的培养皿或多个较小的培养皿来容纳视网膜/滤纸样品。 - 用铝箔紧紧包裹整个盘子。确保铝箔的边缘固定并顺利地压入培养皿的底部。在铝箔盖上刺穿一些0.1-0.2毫米的孔（图2A）。
- 使用金属钳，逐渐将铝箔覆盖的培养皿放入液氮中。将样品保存在液氮中（<10分钟），直到准备好冻干。
- 冻干
- 将铝箔覆盖的培养皿放入冷冻干燥烧瓶中，并按照制造商的协议将其连接到冻干机上。冻干视网膜30分钟。
- 根据制造商的说法，将烧瓶从冻干机上拆下并关闭机器。
- 取出铝箔，并在同一天处理冻干样品，或将其储存在正确标记的1 mL微量离心管中。将这些管置于装有无水干燥剂的容器（例如50 mL锥形管）中，并将样品储存在-80°C。
- 棒材外段和内段通过胶带剥离收集。
- 切割透明胶带条（1-2厘米），并将胶带条存放在胶带分配器/实验室工作台/等的边缘，以便快速使用。
- 将一个视网膜样品移至塑料60 x 15 mm培养皿的盖子上进行剥离。确保只抓住滤纸的最外边缘，避免接触视网膜。
- 使用钝尖虹膜剪刀（或等效的剪刀型），将一小块矩形胶带切成组织的近似大小（1.5 x 2.5 mm）。
- 小心地在冻干视网膜顶部铺上一小块胶带（图2B），并用镊子施加轻微的压力，以确保它与光感受器层（橙色/粉红色的顶层）粘合。
- 慢慢剥离胶带。杆外段（ROS）和杆内段（RIS）都将粘附在胶带上（图2B）。
- 确保断裂表面有一层薄薄的白色薄膜。这是 RIS.To 分离RIS，放置另一块磁带并将磁带向下推到断裂的表面上（图2B）。
注：可能需要多块胶带才能去除整个薄薄的白色层。 - 将仅带有橙色/粉红色层的胶带放入标有+ROS的微量离心管中。
- 将带有薄白色层的胶带或胶带片放入标有+RIS的微量离心管中。
注意：用胶带分离冻干的视网膜需要练习。施加在胶带上的压力量将影响冻干样品的分馏方式。如果在样品上的胶带上施加太大的压力，整个冻干的视网膜将从滤纸上剥落并粘在胶带上。如果向胶带上添加的压力太小，橙色/粉红色顶层（+ROS）将不会粘在胶带上。 - 通过使用胶带从滤纸上剥离厚厚的白色层，收集位于滤纸上的剩余视网膜组织（没有ROS和RIS层，-OIS）。将隔离物放入标有-OIS的管中。
- 对每个减半的视网膜样本重复这些步骤。
- 如果在同一天进行蛋白质定量，凝胶电泳和蛋白质免疫印迹，则将冻干视网膜中的分离层储存在室温下，或储存在充满无水干燥剂的容器（例如50mL锥形管）中，以备后用。
3. 用于剥离分离的蛋白质印迹样品制备
- 制备 RIPA 裂解缓冲液
- 在100 mL储存瓶中，加入试剂以获得50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS和1mM EDTA的最终浓度。加入 100 mL 去离子超纯水，充分混合。
注意：RIPA裂解缓冲液可以在2-8°C下储存2-3周。对于更长时间的储存，等分并储存在-20°C冰箱中。 - 在实验当天，将蛋白酶抑制剂混合物（0.1 M PMSF，1：1000抑肽酶和1：1000 Leupeptin）加入RIPA裂解缓冲液中并保持在冰上。
- 在100 mL储存瓶中，加入试剂以获得50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS和1mM EDTA的最终浓度。加入 100 mL 去离子超纯水，充分混合。
- 用于蛋白质印迹的滤纸剥离裂解液制备
- 确保将含有滤纸剥离和剩余剥离的视网膜的管子保持在冰上（用于当天的实验）或从-80°C冰箱中取出并放置在冰上。
- 从含有滤纸剥离的微量离心管底部除去任何多余的液体。在迷你离心机中快速旋转2-4秒，并丢弃任何剩余的液体。
- 将45-55μL冷RIPA缓冲液移入含有分离滤纸的管中。
- 用干净的高压灭菌杵混合器使每个样品均质1分钟。确保滤纸与杵式搅拌机保持接触。将滤纸放在每个管子的侧面，而不是底部。
- 用镊子将滤纸移到每个管子的侧面，然后在迷你离心机中旋转2-4秒。这将从滤纸中取出 RIPA 缓冲液。
- 如有必要，取出干燥的滤纸，并对每个管内的所有滤纸重复此操作。
- 将匀浆转移到新管中并适当标记。
注意：这是最耗时的步骤，如果不能正确完成，大部分样品最终将被滤纸吸收。 - 将60-80μL冷RIPA缓冲液移入剩余的剥离视网膜的单个管中。
- 用干净的高压灭菌杵混合器使每个样品均质1分钟。
- 用于蛋白质印迹的胶带剥离裂解液制备
- 将室温冻干样品或-80°C样品放在冰上。
- 将50-70μL冷RIPA缓冲液移入含有+ROS和+RIS胶带剥离的每个管中。
- 将60-80μL冷裂解缓冲液移入含有剩余冻干视网膜的-OIS管中，除去ROS和RIS。
- 用干净的杵混合器匀浆每个样品1分钟。确保各个管中的胶带与杵混合器和裂解缓冲液保持接触。
- 使用无菌镊子，将胶带移动到管的侧面，然后用迷你离心机旋转2-4秒。这将从胶带中除去液体。从试管中取出干燥的胶带。
注意：此时，您可以将来自同一视网膜的两个半视网膜分离物组合在一起，进行“滤纸剥离”或“胶带剥离”方法，以确保您有足够的体积进行比辛可宁酸测定（BCA）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本策略的开发是为了提供相对快速和简单的方法来分离和分析特定杆亚细胞区室中的蛋白质，以进行蛋白质印迹分析。我们应用了两种顺序剥离技术（图1 和 图2），然后进行免疫印迹，以证明这些方法可以可靠地用于检测黑暗和光适应动物中杆转导素（GNAT1）和停滞素（ARR1）的已知分布。为了验证我们的两种方案在精确分离杆亚细胞区室而不污染其他细胞层方面的有效性，用细胞色素C（Cyt C），肌动蛋白和Gß5S / Gß5L26抗体探针免疫印迹。使用的抗体和稀释液列表如 表1所示。细胞C和肌动蛋白表明ROS纯度，因为它们是近端视网膜中的丰富蛋白质，但在ROS中不存在。Gß5L是GNAT127的GTP酶激活蛋白（GAP）的一种成分，存在于ROS和RIS中，并作为这些分离的对照。Gß5S是较短的剪接同种型，在ROS或RIS中不存在，但存在于所有其他杆室中，用作非ROS / RIS分离的亚细胞区室的对照。
首先，通过分析GNAT1和ARR1在深色和光适应小鼠的杆细胞中的分布来评估我们的顺序活细胞视网膜剥离方法的有效性（图3）。将含有ROS（+ROS）的滤纸从一个完整的视网膜中汇集出来，并将相应的残余组织（-ROS）组合在一起。随后在+ROS样品和-ROS样品之间比较来自指示蛋白质的信号，整个分离的视网膜作为输入对照。这些样品的蛋白质浓度和均质体积如表2所示。图3A中的结果显示，在适应黑暗的动物中，GNAT1和ARR128的分布与它们已知的暗态分布非常匹配，其中GNAT1信号在+ROS隔离中明显最强，而ARR1信号在-ROS隔离中更强。因此，在光暴露的视网膜中，GNAT1信号在+ROS分离中明显降低，在-ROS样品中信号增加，而光诱导的ARR1易位在+ROS和-ROS样品中可见。对六个不同实验的结果进行了量化，并在+ROS和-ROS样品中发现了GNAT1和ARR1的暗/光条件之间的统计学显着差异（图3B）。这些发现与先前已知的杆亚细胞区室内蛋白质的亮/暗运动一致，并强烈表明该技术可以分离富集的+ROS级分。
为了进一步验证我们的活细胞剥离方法，我们研究了+ROS和-ROS样品中已知的ROS纯度标记物分布。在暗光适应的样品中，Gß5S，Cyt C和肌动蛋白信号从+ROS样品中排除（图3A），表明没有来自其他细胞层的污染。此外，Gß5L信号在+ROS样本中清晰可见（图3A）。此外，肌动蛋白和Gß5L信号不仅证实了+ROS和-ROS级分的纯度，而且还充当了归一化的对照，来自+ROS样品的信号根据Gß5L归一化，-ROS样品被归一化为针对肌动蛋白。如图 3A所示，建议将活细胞剥离分离物与上样对照（特别是整个视网膜匀浆）一起上样，以实现最佳的免疫印迹归一化和分析。总之，这些数据证实了我们的活细胞剥离方法可以提供一种快速且可重复的方法，将ROS亚细胞层从视杆和视网膜的其余部分分离出来，用于蛋白质分析。
接下来，我们评估了我们的冻干剥离技术，以验证该方法可以再现地分离ROS和RIS区室。在免疫印迹之前，我们使用扫描电子显微镜（SEM）对完整和剥离的冻干小鼠视网膜的表面进行成像，以分析胶带剥离产生的光感受器亚细胞层（图4）。在用胶带剥离之前，完整的冻干视网膜（橙色/粉红色层）的表面与特征圆柱形ROS的轮廓紧密匹配（图4A）。在最初的胶带剥离后，ROS和RIS似乎被完全去除，正如残留剥离的冻干视网膜表面上存在的均匀核层所证明的那样（图4C）。随后的胶带剥离从剥离层的自由表面上去除RIS（薄白色层，图4B），这一过程可能由连接内段和外段的狭窄而脆弱的连接纤毛辅助。这些结果证实，来自冻干视网膜组织的杆亚细胞层可以使用胶带特异性分馏。
在视觉上验证了该方法的有效性后，使用相同的方法对深色和光适应性剥离的视网膜进行了免疫印迹，该方法利用蛋白质标记物对不同区室进行了免疫印迹，如我们的活细胞剥离方法所述（图3）。ROS分离（+ROS），RIS分离（+RIS）和剩余视网膜层（-OIS）的蛋白质浓度和均质体积见 表2。正如预期的那样，GNAT1从ROS到RIS以及ARR1从RIS到ROS的明显光诱导偏移（图5A）。GNAT1在黑暗中的+ROS样本中最丰富，在光照下+RIS样本中最丰富，而ARR1信号相反（图5A）。接下来，我们使用与活剥离方法相同的对照和方法，对来自+ROS、+RIS和-OIS分离的易位蛋白质信号进行归一化和量化（图5B）。我们还结合了+RIS和-OIS样品（图5C），以便与我们的活细胞滤纸剥离方法（图3B）进行更直接的比较。两张图都显示了GNAT1和ARR1的成熟和特征性的光诱导易位。基于这些观察结果，胶带剥离制剂似乎产生富集的ROS和RIS级分，正如这些分离物中ARR1和GNAT1的蛋白质组成所证明的那样。
接下来，评估了单个亚细胞分离的纯度。与 图3A所示的结果类似，+ROS样品缺乏肌动蛋白，细胞色素C和Gß5S的信号，同时显示强烈的Gß5L信号（图5）。这一发现表明，在我们的+ROS样品制备中，没有其他亚细胞区室的污染。然后评估杆的后续亚细胞层的蛋白质含量，即+RIS分离。我们发现+RIS样本对Cyt C，Gß5L和肌动蛋白呈阳性。这一发现与已知的RIS组成一致，RIS富含线粒体和细胞骨骼元素。最后一层，-OIS分离物，其蛋白质分布与 图3A所示的-ROS样品一致。
为了进一步评估我们的胶带剥离方法在研究杆亚细胞区室蛋白质组成中的效用，我们专门检查了我们的+ROS，+RIS和-OIS样品中视紫红质激酶（GRK1）和蛋白激酶C-α（PKCα）的免疫反应性。不同的实验方法，如免疫细胞化学（ICC）和蛋白质印迹，经常产生关于这些蛋白质在视杆细胞和视网膜中的精确定位的相互矛盾的结果。例如，GRK1被认为在杆和锥体OS中相对丰富，以介导光激活的视蛋白的磷酸化29。然而，视网膜切片的免疫标记揭示了GRK1的定位，特别是在OS30，31 或整个光感受器层32中。另一方面，PKCα是一种通常用于ICC标记双极细胞的蛋白质。尽管没有明确的证据表明视网膜切片中存在杆特异性PKCα免疫标记25，但有相当多的生化24，25 和功能性证据33，34，35 支持PKCα在ROS中存在和磷酸化作用。利用我们的技术，我们发现GRK1免疫反应性在光暴露的视网膜中的+ROS样品中最强烈，而在-OIS样品中不存在（图6A）。相反，我们表明+ROS和+RIS样本显示出PKCα的微弱信号。从 图6B中可以看出，通过视网膜切片的免疫荧光染色，通常不能在ROS或RIS中检测到PKCα。然而，PKCα通过蛋白质印迹免疫检测（图6A，D）。由于+ROS和+RIS隔离显示强烈的Gß5L信号和没有Gß5S（图6A），我们相信ROS和RIS样品中微弱的PKCα信号是真实的，而不是由于其他层的污染。为了在+ROS、+RIS和-OIS隔离中可视化单个信号，将GRK1和PKCα印迹组合并绘制以进行比较（图6C）。
最后，一个次优剥离过程的示例（图6D）展示了来自不同子层的污染如何扭曲结果，进一步说明了数据解释和包含适当对照抗体以筛选实验剥离错误的重要性。在此磁带剥离隔离示例中，RIS隔离通道中明显出现微弱的Gß5S信号，表明-OIS样品有轻微污染。根据用户的目标，这种轻微的污染可能不是问题。然而，在这种情况下，我们正在研究+ROS和+RIS样品中的PKCα信号，与ROS泳道相比，RIS泳道中的PKCα信号略高（图6A，D），可能是由于污染。因此，在剥离过程中应小心，以确保准确隔离并最大限度地减少污染。尽管由于个体误差造成的污染最小，但这些数据提供了令人信服的证据，证明磁带剥离方法可以产生用于蛋白质分析的杆状光感受器层的准确顺序分离。
图1：活细胞剥离步骤示意图 （A）图显示了解剖和偏析孤立眼的主要步骤。（B）通过使用滤纸的顺序剥离，逐渐去除光感受器外段。首先，视网膜的方向使感光层与滤纸接触。接下来，通过在纸巾上印迹来干燥滤纸，并将视网膜从滤纸上剥离出来。这种剥离的分离物被收集在冰上保存的管子中。该过程重复七到八次，以完全去除杆外段（+ROS）。这个数字是用 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：冻干视网膜剥离过程。 （A）冻干视网膜样品制备的流程图。视网膜定向，使视网膜神经节细胞层与滤纸接触，并且光感受器朝上。（B）冻干后，冻干的视网膜在向胶带顶部添加轻微压力后粘附在一块胶带上。剥离胶带，去除杆外段 （ROS） 和杆内段 （RIS） 层。RIS层通过更多的胶带剥离去除，直到ROS层可见（橙色/粉红色层）。这个数字是用 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：顺序滤纸剥离后分离的杆光感受器中GNAT1和ARR1的表达。 （A）通过滤纸剥离方法从暗光适应视网膜获得的+ROS和-ROS（ROS耗尽）样品的免疫印迹。用光触发蛋白（转导素（GNAT1）和停滞素（ARR1））和质量控制标志物（GTP酶激活蛋白（Gß5L / S）细胞色素C（Cyt C）和肌动蛋白）的抗体探针印迹。将两个减半的视网膜组合用于这些代表性印迹。（B）来自暗视网膜和光适应视网膜的GNAT1和ARR1的量化信号。GNAT1 和 ARR 从 +ROS 和 -ROS 分离物中出现相互光触发的运动。小提琴图描绘了 +ROS 和 -ROS 样本的归一化表达式。这个数字是从Rose等人36修改而来的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：冻干视网膜的扫描电子显微镜图像。 （A）胶带剥离前冻干视网膜表面（感光器面朝上）。（B）内段层胶带后剥落。（三）胶带剥离后细胞体层呈现均匀的核外观。这个数字是从Rose et al.36 修改而来的，是用 BioRender.com 创建的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：验证从冻干视网膜中分离 ROS 和 RIS 的胶带剥离方法。 （A） 通过胶带剥离方法收集的 +ROS、+RIS 和 -OIS（ROS/RIS 耗尽）样品的蛋白质印迹。用转导素（GNAT1），arrestin（ARR1），GTP酶激活蛋白（Gß5L / S），细胞色素C（Cyt C）和肌动蛋白抗体探针免疫印迹。从暗视网膜和光适应的视网膜中获得样品，并将减半的视网膜分离物（+ROS，+RIS，-OIS）组合以获得更浓缩的材料。（B）GNAT1和ARR1的量化信号被绘制为不同孤立视网膜层的小提琴图，这些视网膜层是从暗视网膜和光适应的视网膜中获得的。（C）将+RIS和-OIS的归一化表达水平组合并绘制，以比较胶带和滤纸剥离方法。适合暗和光的样品显示出关键光转导蛋白的已知运动。这个数字是从Rose等人36修改而来的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：冻干视网膜的胶带剥离，以研究光感受器中GRK1和PKCα的亚细胞定位。 （A）来自光适应的C57BL / 6J小鼠的剥离样品的代表性蛋白质印迹，显示视紫红质激酶（GRK1），蛋白激酶C-α（PKCα），GTPase激活蛋白（Gß5L / S）和肌动蛋白的相对水平。（B）用PKCα抗体孵育的光暴露小鼠制备的冷冻视网膜切片（绿色，1：100）。RPE，视网膜色素上皮;操作系统，外段;IS，内段;CB，细胞体;ST，突触末端。比例尺 = 10 μm. （C） +ROS、+RIS、-OIS 样本的 PKCα 和 GRK1 归一化表达水平绘制为小提琴图。（D） 不理想的胶带剥离可能会产生轻微污染的样品。红色方块突出显示被一些-OIS样品污染的+RIS样品，产生Gß5L / S波段和更高的PKCα信号。将两个减半的视网膜合并用于所有印迹。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 目标 | 抗体 | 稀释 | 制造者 |
| 阿瑞斯汀 | 兔子抗ARR1 | 1:1000 | 陈 等， 2006. |
| 转导素 | 小鼠抗胰腺炎药 （TF-15） | 1:1000 | 细胞信号。 |
| β 肌动蛋白 | 兔抗β肌动蛋白 | 1:5000 | 吉恩泰克斯公司 |
| 细胞色素 C | 兔抗细胞色素C | 1:500 | 圣克鲁斯，sc-7159。 |
| 间隙 （Gß5L/S） | 兔子抗 Gß5L/S （CT2-15） | 1:2000 | 沃森 等人，1996年。 |
| 蛋白激酶 C α （PKC） | 兔子反PKC （#2050） | 1:1000 | 细胞信号传导技术。 |
| 视紫红质激酶 （GRK1） | 鼠标抗GRK1 （G-8） | 1:200 | 圣克鲁斯，sc-8004。 |
表1：用于分离技术的蛋白质印迹验证的抗体列表。
| 滤纸视网膜分离 | ||||||
| +ROS* | -ROS* | 整个视网膜 | ||||
| 平均蛋白浓度（微克/毫升） | 700 | 1,500 | 1,500 | |||
| RIPA缓冲液体积（μL） | 90 | 150 | 200 | |||
| 胶带剥离视网膜分离 | ||||||
| +ROS* | +RIS* | -ROS* | 整个视网膜 | |||
| 平均蛋白浓度（微克/毫升） | 520 | 440 | 1,200 | 1,600 | ||
| RIPA缓冲液体积（μL） | 100 | 100 | 125 | 150 | ||
| *联合两种减半的视网膜分离。 | ||||||
表2：视网膜分离均质物中的蛋白质浓度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
许多视网膜疾病会影响视杆细胞，导致视杆细胞死亡，并最终导致完全视力丧失37。多年来，人类视网膜变性的遗传和机制起源的很大一部分已经在许多小鼠模型中成功概括。在这种情况下，能够轻松和选择性地将单个杆亚细胞区室与小小鼠视网膜分开，这将大大增强我们对视网膜疾病的局部生化和分子基础的理解。此外，神经视网膜的分层性质，结合杆光感受器独特的高度极化排列，允许通过选择性剥离来隔离杆室。本手稿描述了两种方案，用于分离杆细胞的单个亚细胞室的杆光感受器细胞以进行免疫印迹。与现有的切向切片方法相比，这两种方法不仅速度更快，技术挑战性更小9，而且与使用密度梯度对ROS进行常见生化分离相比，它们需要的样本量也要小得多19。这种ROS梯度纯化技术需要8-10个小鼠视网膜才能可靠地恢复充足的ROS，而这里提出的方案适用于单个视网膜。
尽管所提出的技术总体上很简单，但两种方案共同面临的主要挑战之一是将弯曲的视网膜压平到正确分离不同亚细胞区室所需的滤纸上。孤立的视网膜倾向于蜷缩并呈现出蛤蜊般的形状。如果视网膜在放置在滤纸上（感光器侧向上或向下）时边缘折叠，则可能会降低所需孤立杆层的产量。更重要的是，如果视网膜没有正确变平，那么层错位和来自其他亚细胞区室和视网膜细胞的污染是可能的结果（图6D）。为了限制对半视网膜矩形的曲率并纠正视网膜和视网膜层的不完美排列，视网膜矩形可以切成两半以产生两个视网膜正方形。通过将神经视网膜切成更小的碎片，视网膜的自然曲率减小，组织更有可能平放在滤纸上。
对于没有这些技术经验的人来说，识别不同的杆室何时在物理上分开可能会很棘手。我们建议，在开始具有生物学意义的实验之前，用户应该用视网膜样本运行一两个小时的过程。实践应大大提高操作员的技能和对方法的熟练程度。当使用滤纸从活视网膜剥离ROS时，没有明显的视觉线索表明ROS层何时被分离。当视网膜变得更薄、更脆弱时，用户将不得不自我监控和验证剥离次数，以准确分离ROS。此外，使用具有不同纤维厚度和粗糙度的滤纸会改变ROS剥离时间。纤维较厚的滤纸（如VWR Grade 413）可以更快地分离视网膜层（6-8次剥离），但可能不那么有选择性，并可能导致其他层的污染。纤维较薄的滤纸（如Whatman Grade 1）将较慢地分离视网膜层（12-15个剥离），并将提供光感受器层的干净隔离。我们建议使用更厚和更薄的滤纸，以最大限度地减少剥离时间并确保收集纯度。
同时，视觉近似和胶带样品处理都是成功从冻干视网膜中分离亚细胞区室的关键。如果向胶带上加太大的压力，整个冻干的视网膜将粘附在胶带上。一旦发生这种情况，分离ROS会变得更长，更困难，但并非不可能：在视网膜的自由表面（神经节细胞侧）放置第二块胶带，然后用胶带慢慢拉开各层，直到在最初的胶带上只看到橙色/粉红色的层。但是，此时隔离 RIS 是不可能的。如果向磁带添加的压力太小，则大部分ROS将不会粘附在磁带上。为确保ROS胶带的粘附力，我们建议用镊子轻轻按压未粘附在胶带上的区域。通常，最轻微的压力会导致ROS和RIS层的去除，但是，压力的大小必须根据经验确定。通过检查在初始ROS胶带剥离上是否可见薄的白色层（类似于雪的轻度灰尘）可以确定孤立的RIS的存在，而孤立的ROS的存在可以通过检查胶带上杆光感受器层的颜色（橙色表示深色适应，粉红色表示光适应）来轻松确定。
当将滤纸从活视网膜上均质化（+ROS）时，会出现最后一个挑战。滤纸容易吸收液体，并且在协议的这一步骤中将吸收大量的均质缓冲液。将剥离纸放在每个管的侧面后，在小型离心机中旋转液体有助于防止样品损失。不幸的是，旋转多张滤纸可能是一个耗时的过程，样品的丢失是不可避免的。要解决此问题，请移除一些滤纸，并专注于一次均匀化较少的碎片。此外，为避免在此步骤中样品丢失，请考虑尽量减少用于分离ROS的滤纸总量。
虽然我们的两种方法都不需要大样本量，也不需要刀片的精确对准来切除视网膜，但我们的感光器剥离技术有一些值得注意的局限性。首先，冻干的小鼠视网膜可能不适合剥离ROS和RIS之外的后续光感受器层。其次，我们的剥离方法更适合处理单个视网膜，并且不适合一次进行大批量处理。第三，实验的成功取决于免疫印迹中使用的抗体的灵敏度极限。尽管有这些局限性，但我们具有代表性的结果表明，我们的两种隔离剥离技术可以有效地隔离特定的杆细胞光感受器隔室。此外，这两种方法使用廉价且常见的实验室材料（滤纸和胶带），使其易于访问。在我们的研究中，我们没有直接评估是否可以分离其他视网膜细胞进行免疫印迹;然而，我们认为这些方法可以很容易地被修改，以有利于视网膜研究界广泛的横截面的需求。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH Grant EY12155，EY027193和EY027387对JC的支持。我们感谢Spyridon Michalakis博士（美国帕萨迪纳加州理工学院）和Natalie Chen博士（美国洛杉矶南加州大学）校对手稿。我们还要感谢Seth Ruffins博士（南加州大学，洛杉矶，美国）和Janos Peti-Peterdi博士（南加州大学，洛杉矶，美国）提供必要的设备来收集作者提供的镜头。材料来自：Kasey Rose等人，分离小鼠视网膜中的感光细胞区室进行蛋白质分析，分子神经变性，发表[2017]，[施普林格自然]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
References
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N.
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
