Summary
Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.
Abstract
Çubuk fotoreseptörleri, farklı bölmelere sahip oldukça polarize duyusal nöronlardır. Fare çubukları uzun (~80 μm) ve incedir (~2 μm) ve retinanın en dış tabakasında, fotoreseptör tabakasında lateral olarak paketlenir ve bu da benzer hücre altı bölmelerin hizalanmasına neden olur. Geleneksel olarak, donmuş düz monte edilmiş retinanın teğetsel kesiti, farklı çubuk bölmeleri içindeki proteinlerin hareketini ve lokalizasyonunu incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, çubuk baskın fare retinasının yüksek eğriliği, teğetsel kesiti zorlaştırır. Kompartmanlar arasındaki protein taşınması çalışmasıyla motive olarak, çubuk dış segmentini (ROS) ve batı lekeleri için diğer hücre altı bölmeleri güvenilir bir şekilde izole eden iki soyma yöntemi geliştirdik. Nispeten hızlı ve basit tekniklerimiz, normal çubuklardaki önemli fotoreseptör proteinlerinin dağılımını ve yeniden dağılımını nicel olarak ölçmek için zenginleştirilmiş ve hücre altı spesifik fraksiyonlar sunar. Dahası, bu izolasyon teknikleri, hem sağlıklı hem de dejenere retina içindeki diğer hücresel tabakaların protein bileşimini izole etmek ve kantitatif olarak araştırmak için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Nöral retinanın en dış tabakasında sıkıca paketlenmiş çubuk fotoreseptör hücreleri, loş ışık görüşünün ayrılmaz bir parçasıdır. Sadık foton sayaçları olarak işlev görmek için, çubuklar, tek foton yakalamaya hızlı, güçlendirilmiş ve tekrarlanabilir tepkiler üretmek için fototransdüksiyon adı verilen G-proteini tabanlı bir sinyal yolu kullanır. Işığa verilen bu tepki nihayetinde plazma zarındaki akımda bir değişikliği tetikler ve daha sonra görsel sistemin geri kalanına sinyal verir1. Adından da anlaşılacağı gibi, her çubuk hücresi farklı bir çubuk benzeri şekle sahiptir ve bir dış segment (OS), iç segment (IS), hücre gövdesi (CB) ve sinaptik terminalden (ST) oluşan oldukça polarize bir hücresel morfoloji sergiler. Her hücre altı bölmenin kendine özgü protein makineleri (membrana bağlı ve çözünür), biyomoleküler özellikleri ve görsel fototransdüksiyon, genel temizlik ve protein sentezi ve sinaptik iletim gibi önemli roller oynayan protein kompleksleri vardır2,3.
30 yıldan fazla bir süre önce, hücre altı proteinlerin, özellikle transdüsin (işletim sisteminden uzak) ve arrestinin (işletim sistemine doğru) ışığa bağımlı karşılıklı hareketi ilk olarak gözlendi4,5,6,7. İlk başlarda, gözlemlenen bu fenomen, kısmen immünohistokimyanın epitop maskelemeye karşı savunmasızlığı nedeniyle şüphecilikle karşılandı8. 2000'li yılların başında, uyarana bağımlı protein translokasyonu, titiz ve zorlu bir fiziksel kesitleme tekniği kullanılarak doğrulandı9. Dondurulmuş düz monte kemirgen retinanın seri teğetsel kesitlenmesi ve ardından immünoblotlama, transdüsin9,10, arrestin11,12 ve recoverin13'ün hepsinin ışığa yanıt olarak hücre altı yeniden dağılıma uğradığını ortaya koymuştur. Bu anahtar sinyal proteinlerinin ışığa bağlı translokasyonunun sadece fototransdüksiyon kaskadının duyarlılığını düzenlemekle kalmayıp9,14,15, aynı zamanda ışık hasarına karşı nöroprotektif olabileceğine inanılmaktadır16,17,18. Çubuklardaki ışığa bağlı protein taşınması, çubuk hücresi biyolojisi ve fizyolojisi için çok önemli göründüğünden, protein dağılımını belirlemek için farklı hücre altı bölmelerin izolasyonuna izin veren teknikler değerli araştırma araçlarıdır.
Şu anda, çubuk hücre altı bölmelerini izole etmeyi amaçlayan birkaç yöntem vardır. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğaltılması uzun ve zor olabilir veya büyük miktarda retinal izolat gerektirebilir. Örneğin, yoğunluk gradyanı santrifüjleme yoluyla çubuk dış segment (ROS) preparatları19, ROS'u retinal homojenattan ayırmak için yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem batı lekesi için yaygın olarak kullanılır, ancak prosedür çok zaman alır ve en az 8-12 murin retina20 gerektirir. Öte yandan, donmuş murin ve sıçan retinasının seri teğetsel kesiti, OS, IS, CB ve ST9,11,13'ün izole edilmesinde başarıyla uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, teğetsel kesitten önce retina tabakalarını hizalamak için küçük ve oldukça kavisli murin retinanın tamamen düzleştirilmesi gerekliliği nedeniyle teknik olarak zordur. Görsel sistemin hastalıklarını özetleyen çok sayıda fare modeli ve transgenik fare bulunduğundan, bireysel çubuk bölmelerini güvenilir, hızlı ve kolay bir şekilde ayıran bir tekniğin yaratılması, her bir özel bölmede meydana gelen fizyolojik süreçleri ve sağlık ve hastalıkta görsel süreçlerin altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmada umut vaat etmektedir.
Bu araştırmaları kolaylaştırmak için, çubuk hücre altı bölmelerini mevcut protokollerden daha kolay izole eden iki soyma yöntemi tanımladık. Yama kelepçesi kaydı21 için floresan olarak etiketlenmiş bipolar hücreleri açığa çıkarma tekniğinden uyarlanan ilk soyma yöntemi, ROS'u canlı, izole edilmiş bir murin retinadan sırayla çıkarmak için selüloz filtre kağıdı kullanır (Şekil 1). Üç primer retinal hücre tabakasını bir chick22 ve frog23 retinadan izole eden bir prosedürden uyarlanan ikinci yöntem, liyofilize bir retinadan ROS ve çubuk iç segmentini (RIS) çıkarmak için yapışkan bant kullanır (Şekil 2). Her iki prosedür de 1 saatte tamamlanabilir ve oldukça kullanıcı dostudur. Batı lekesi için bu iki ayırma protokolünün etkinliğinin, çubuk transdüsin (GNAT1) ve arrestinin (ARR1) ışığa bağlı translokasyonunu göstermek için C57BL / 6J farelerden karanlığa adapte olmuş ve ışığa maruz kalan retinayı kullanarak doğrulanmasını sağlıyoruz. Ayrıca, bant soyma yöntemini kullanarak, tekniğimizin immünositokimya (ICC) ve batı lekeleri tarafından elde edilen protein lokalizasyon verileri arasındaki tutarsızlıkları incelemek ve ele almak için kullanılabileceğine dair ek kanıtlar sunuyoruz. Spesifik olarak, tekniğimiz şunları göstermiştir: 1) protein kinaz C-alfa (PKCa) izoformu sadece bipolar hücrelerde değil, aynı zamanda düşük konsantrasyonlarda da olsa murin ROS ve RIS'de de bulunur24,25 ve 2) rodopsin kinaz (GRK1) ağırlıklı olarak izole edilmiş OS örneğinde bulunur. Bu veriler, spesifik çubuk ve retinal proteinleri ayırmak ve ölçmek için iki soyma tekniğimizin etkinliğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Güney Kaliforniya Üniversitesi'nden (USC) araştırma hayvanı bakımı komitesinin yerel kurumsal kurallarına göre gerçekleştirildi.
1. Canlı hücre retinal peeling yöntemi
- Ames tamponlarının, soyma kağıtlarının ve diseksiyon kabının hazırlanması
- Künt uçlu iris makası (veya eşdeğer makas tipi) kullanarak, selüloz filtre kağıdını (Grade 413) yaklaşık 5 mm x 2,5 mm boyutlarında dikdörtgenler halinde kesin. Kesimleri ileride kullanmak üzere saklayın.
- Bir şişe Ames 'Medium, 2.38 g HEPES ve 0.877 g NaCl'yi birleştirerek 1 L Ames HEPES tamponu hazırlayın. Reaktifleri damıtılmış ultra saf su ile steril bir cam şişede çözün ve ozmolarite ve pH'ı sırasıyla 280 mOsm ve 7.4'e ayarlayın. Sterilize etmek için filtre uygulayın (gözenek boyutu 0,2 μm), kapağı parafin film ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
- Bir şişe Ames Medium ve 1.9 g NaHCO3'ü birleştirerek 1 L Ames bikarbonat tamponu hazırlayın. Reaktifleri damıtılmış ultra saf su ile steril bir cam şişede çözün ve ozmolarite ve pH'ı sırasıyla 280 mOsm ve 7.4'e ayarlayın. Sterilize etmek için filtre uygulayın (gözenek boyutu 0,2 μm), kapağı parafin film ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: Ames'in HEPES ve Ames'in bikarbonat tamponları önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de 1 hafta saklanabilir. - 35 x 10 mm'lik bir Petri kabının altında, neşterli bir kafes veya dama tahtası deseni oluşturun (bıçak No. 11, 40 mm).
NOT: Petri kabının dokulu alt kısmı, retina diseksiyonu sırasında izole edilmiş, serbest yüzen gözü yerinde tutar.
- Retina diseksiyonu
NOT: Bu prosedür için, tampon odaya getirilmeli ve oda sıcaklığında (RT) tutulmalıdır. Ames'in bikarbonat tamponunu, diseksiyon sırasında taze karbojenlenmiş Ames'in bikarbonat tamponu ile her 15 dakikada bir yenileyin. Bu, gerekli fizyolojik pH'ı korur.- Diseksiyondan yaklaşık 15-20 dakika önce, Ames'in HEPES tamponunu bir boru kapağı adaptörü ile donatılmış 100 mL'lik bir laboratuvarda veya ortam şişesinde oksijenlendirin ve Ames'in Bikarbonat tamponunu bir doku inkübasyon odasında ve bir boru kapağı adaptörü ile donatılmış 100 mL'lik bir laboratuvar veya medya şişesinde% 95 O2 ve% 5 CO2 ile kabarcıklayın.
- C57BL / 6J farelerinin (2-3 aylık) her iki cinsiyetinin eşit sayıda ötenazisini izofluran inhalasyonu veya karbondioksit (CO2) ve ardından servikal çıkık ile ötenazileştirin. Gözleri kavisli makasla enüklee edin ve gözleri kabarcıklı Ames'in bikarbonat tamponuyla doldurulmuş dokulu 35 x 10 mm Petri kabına yerleştirin.
- 18 G'lik bir iğne ile kornea-limbus kavşağındaki bir deliği delerek bir vizör kapağı oluşturun (Şekil 1A). Her gözün korneasını çıkarmak için mikro diseksiyon iris makası kullanarak bu kavşağın çevresi boyunca kesin. Lensi ve vitreus mizahını cımbız kullanarak her gözden ayırın ve atın.
- Retinal pigmentli epitel (RPE)-sklera-koroid kompleksini nöral retinadan dikkatlice soyarak retinayı göz kapağından izole edin. RPE-sklera-koroid kompleksini atın. Sadece kenarları tutarak diseksiyon sırasında retinanın hasar görmediğinden emin olun.
- Geniş delikli bir transfer pipeti kullanarak izole edilmiş retinayı, kabarcıklı Ames'in bikarbonat tamponuyla doldurulmuş 60 x 15 mm'lik bir kabın kapağına aktarın.
- Yarımküre şeklindeki retinayı içbükey yukarı doğru yönlendirin (fotoreseptörler çanağın dibine doğru bakmaktadır) ve iris makası veya neşter (bıçak No. 10, 40 mm) kullanarak her retinayı (optik sinir yoluyla) ikiye bölün. İki dikdörtgen yapmak için her yarım retinanın kavisli kenarlarını kesin (Şekil 1A).
NOT: Her yarıya indirilmiş retinanın eğriliğini en aza indirmek, retinanın sonraki soyma adımlarında daha iyi düzleşmesini sağlar ve çubuk dış segmenti (ROS) tabakasının doğru bir şekilde soyulmasını sağlar. - Yarıya indirilmiş retinayı, %95 O2 ve %5 CO2 ile sürekli kabarcıklanan doku kuluçka odasında saklayın.
NOT: İzole retina, karbojenlenmiş Ames'in bikarbonat tamponunda ~ 24 saat boyunca tutulabilir.
- Filtre kağıdı soyma ile çubuk dış segment (ROS) toplama
NOT: Gerekli fizyolojik pH'ı korumak için soyma işlemi sırasında RT oksijenli Ames'in HEPES tamponunu her 15-20 dakikada bir yenileyin.- Geniş delikli transfer pipeti ve 5 mm x 2,5 mm filtre kağıdı ile doku odasından bir retinal dikdörtgeni, Ames'in %100 O2 ile kabarcıklanmış HEPES tamponuyla doldurulmuş 35 x 10 mm'lik Petri kabına aktarın.
- Bölümlenmiş retinayı içbükey yukarı doğru yönlendirin ve fotoreseptörlerin çanağın dibine doğru aşağı baktığından emin olun. Yarıya indirilmiş retinanın kenarlarını cımbızla hafifçe kavrayın ve filtre kağıdının üzerine getirin. Retina filtre kağıdı üzerinde ortalandıktan sonra, filtre kağıdını yukarı doğru hareket ettirin, böylece yarıya indirilmiş retina filtre kağıdına dokunarak ROS'tan filtreye kağıt yapışmasını oluşturur (Şekil 1B).
NOT: Fotoreseptör tabakasının filtre kağıdı ile doğrudan temas ettiğinden emin olun. - Filtre kağıdını, bağlı retina ile Ames'in HEPES tamponundan dikkatlice kaldırın. Filtre kağıdının alt tarafını (retinasız taraf) bir kağıt havluya yerleştirin ve kuruması için 2-3 kez sürün(Şekil 1B).
- Retina ile filtre kağıdının yan tarafına bir damla Ames HEPES ekleyin. Filtre kağıdını, az önce açıklandığı gibi kuruması için tekrar kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
- Filtre kağıdını retina ile tekrar Petri kabına yerleştirin. Cımbız kullanarak, yarıya indirilmiş retinanın tüm kenarlarını yavaşça yukarı doğru itin ve her taraftaki filtre kağıdından uzağa itin.
- Retinayı filtre kağıdından nazikçe soyun. Retinanın yapısal bütünlüğünü korumak için soyma işlemi sırasında retinanın sadece aşırı çevresine dokunun.
- Filtre kağıdını Petri kabından kaldırın ve kağıt havlu üzerindeki fazla sıvıyı çıkarın. Retina ile temas eden tarafın kağıt havluya temas etmediğinden emin olun.
- Kısmi ROS tabakasına sahip filtre kağıdını buz üzerinde etiketli bir tüpe yerleştirin (Şekil 1B). Soyulmuş retinayı Ames'in HEPES tamponuna batırılmış halde tutun.
- Tüm ROS tabakasını çıkarmak için bu yarıya inmiş retina için soyma işlemini yaklaşık 7-8 kez tekrarlayın. Her soyulduktan sonra, filtre kağıdını, yarıya indirilmiş bir retinadan izole edilmiş ROS'u içerecek olan aynı tüpe yerleştirin.
NOT: Bu işlem sırasında retina inceldiği için yarıya incelmiş retinayı filtre kağıdından soyarken yırtmamaya dikkat edin. - İzole edilmiş ROS'un tüm filtre kağıdı kabuklarını içeren tüpü hemen kullanılmak üzere buzun üzerine yerleştirin veya doğrudan kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
- Artık soyulmuş retinayı (ROS'tan yoksun) uygun şekilde etiketlenmiş bir tüpe aktarmak için cımbız kullanın. Tüpü hemen kullanmak için buzun üzerine yerleştirin veya kuru buzla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
- Her yarıya indirilmiş retina için soyma işlemini tekrarlayın ve her tüpü doğru bir şekilde etiketleyin.
2. Liyofilize retina peeling yöntemi
- Tamponlar, soyma ortamı, diseksiyon kabı hazırlama ve liyofilizatör kurulumu
- 1 L'lik bir saklama şişesinde, 500 mL damıtılmış ultra saf su ekleyerek Ringer çözeltisini hazırlayın. 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 0,02 mM EDTA'nın nihai konsantrasyonuna ulaşmak için reaktifleri çözün. NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın, son hacmi 1 L'ye getirmek için ultra saf su ekleyin ve ozmolariteyi 313 mOsm'a ayarlayın.
- Kullanmadan önce, Ringer'ın çözeltisini steril bir filtreyle (gözenek boyutu 0,2 μm) filtreleyin, kapağı parafin filmle kapatın ve 4 ° C'de saklayın.
- Künt uçlu iris makası (veya eşdeğer makas tipi) kullanarak, selüloz filtre kağıdını yaklaşık 5 mm x 2,5 mm boyutlarında dikdörtgenler halinde kesin. Benzersiz bir etiket oluşturmak üzere filtre kağıdının bir tarafına yazmak için kalem kullanın.
- Bir neşter kullanarak 35 x 10 mm'lik bir Petri kabının altında bir kafes veya dama tahtası deseni oluşturun (bıçak No. 11, 40 mm).
- Liyofilizatörü üreticinin spesifikasyonlarına göre açın.
- Bir Dewar şişesinde veya benzeri bir yalıtım vakum şişesinde sıvı azot elde edin.
- Retina diseksiyonu
- Retina diseksiyonunu protokolün 1. bölümünde açıklandığı gibi tamamlayın (Şekil 1A). Ames tamponu yerine soğuk Ringer çözeltisini kullanın.
- Diseksiyon sonrasında, yarıya indirilmiş, dikdörtgen retinayı soğuk Ringer çözeltisi ile doldurulmuş 35 x 10 mm'lik bir Petri kabında saklayın ve buzun üzerine yerleştirin.
- Liyofilizasyon için retinal numune hazırlama
- 5 x 2,5 mm'lik bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve yarıya indirilmiş bir retinayı, soğuk Ringer tamponuyla doldurulmuş tekstüre edilmiş 35 x 10 mm Petri kabına aktarın. Her retinayı bulaşıklar arasında hareket ettirmek için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın.
- Retinayı dikkatlice çevirmek için cımbız kullanın, böylece içbükey olarak yönlendirilir (fotoreseptörler yukarı doğru işaret eder) ve filtre kağıdının üstünde duracak şekilde hareket ettirin (Şekil 2A).
NOT: Fotoreseptörlerin filtre kağıdına temas etmediğinden (retinal ganglion hücre tabakası filtre kağıdıyla doğrudan temas halinde olmalıdır) ve benzersiz etiketin görünür olduğundan emin olun. Retinal izolatı kolay ve hızlı bir şekilde tanımlamak için, benzersiz etiketin filtre kağıdının alt tarafına yerleştirilmesi önerilir. - Yarıya indirilmiş retina parçasının filtre kağıdına dokunması için filtre kağıdını kenarlarından yukarı doğru kaldırın ve filtre kağıdını Ringer çözeltisinden çıkarmaya devam edin.
- Filtre kağıdının alt tarafını (üzerinde retina olmayan taraf) bir kağıt havluya yerleştirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için 2-3 kez dikkatlice süzün (Şekil 2A).
- Cımbızlı filtre kağıdını alın ve retinalı filtre kağıdının yan tarafına bir damla soğuk Ringer ekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdını tekrar kağıt havluya yerleştirin. İşlemi iki kez daha tekrarlayın.
NOT: Bu alternatif ıslatma ve kurutma adımları, mendilin filtre kağıdına sıkıca tutturulmasını sağlar. - Yapıştırılan her retina/filtre kağıdı numunesini, tüm numuneleri dondurmaya hazır olana kadar soğuk Ringer'larla dolu bir Petri kabında saklayın. Bu işlemi yarıya indirilmiş tüm retinalar için tekrarlayın.
- Temiz ve kuru bir 35 x 10 mm Petri kabı (yalnızca altta) ve 3,5 x 3,5 inç kareye kesilmiş bir parça alüminyum folyo elde edin.
- Her numuneyi cımbızla soğuk Ringer'ın tamponundan kaldırın. Cımbızların yalnızca filtre kağıdı kenarlarına temas ettiğinden ve yarıya inmiş retinadan kaçındığından emin olun.
- Her filtre kağıdının alt tarafını (üzerinde retina olmayan taraf) bir kağıt havluya yerleştirin ve fazla sıvıyı çıkarın.
- Filtre kağıdının retinanın yapıştığı yan tarafına bir damla soğuk 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) ekleyin. Fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdını kağıt havlunun üzerine sokun.
NOT: Donmadan önce filtre kağıdındaki nemin yeterince çıkarıldığından emin olun. - Tüm filtre kağıdı parçalarını 35 x 10 mm Petri kabına yerleştirin. Filtre kağıdını çevreleyen fazla sıvıyı uzaklaştırmak için tüy bırakmayan bir mendil kağıdı kullanın.
NOT: Petri kabını örneklerle aşırı doldurmayın. Dörtten fazla murin gözü kullanılıyorsa, retina / filtre kağıdı örneklerini tutmak için daha büyük bir Petri kabı veya birden fazla küçük Petri kabı kullanmayı düşünün. - Tüm tabağı alüminyum folyo ile sıkıca sarın. Alüminyum folyonun kenarlarının sabitlendiğinden ve Petri kabının dibine düzgün bir şekilde bastırıldığından emin olun. Alüminyum folyo kapağına bir avuç dolusu 0,1-0,2 mm delik açın (Şekil 2A).
- Metal maşaları kullanarak, alüminyum folyo kaplı Petri kabını yavaş yavaş sıvı azota indirin. Liyofilize hazır olana kadar numuneleri sıvı azotta (<10 dk) tutun.
- Liyofilizasyon
- Alüminyum folyo kaplı Petri kabını dondurarak kuruyan bir şişeye yerleştirin ve üreticinin protokolünü izleyerek liyofilizatör makinesine takın. Retinayı 30 dakika boyunca liyofilize edin.
- Şişeyi liyofilizatörden çıkarın ve üreticiye göre makineyi kapatın.
- Alüminyum folyoyu çıkarın ve dondurularak kurutulmuş numunelerle aynı gün çalışın veya uygun şekilde etiketlenmiş 1 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Bu tüpleri susuz bir kurutucu ile doldurulmuş bir kaba (50 mL konik tüp gibi) yerleştirin ve numuneleri -80 ° C'de saklayın.
- Yapışkan bant soyma ile çubuk dış ve iç segment toplama.
- Şeffaf yapışkan bant şeritlerini (1-2 cm) kesin ve hızlı kullanım için şeritleri bant dağıtıcısının / laboratuvar tezgahının / vb. kenarında saklayın.
- Bir retina örneğini soymak için plastik 60 x 15 mm Petri kabın kapağına taşıyın. Filtre kağıdının yalnızca en dış kenarlarını tuttuğunuzdan ve retinaya dokunmaktan kaçındığınızdan emin olun.
- Künt uçlu iris makası (veya eşdeğer makas tipi) kullanarak, küçük bir dikdörtgen bant parçasını dokunun yaklaşık boyutuna (1,5 x 2,5 mm) kesin.
- Liyofilize retinanın üzerine dikkatlice küçük bir bant parçası yerleştirin (Şekil 2B) ve fotoreseptör tabakasıyla (turuncu / pembe renkli üst tabaka) yapıştığından emin olmak için cımbızla hafif bir basınç uygulayın.
- Bandı yavaşça soyun. Hem çubuk dış segmenti (ROS) hem de çubuk iç segmenti (RIS) banda yapıştırılacaktır (Şekil 2B).
- Kırık yüzeyde ince beyaz bir film olduğundan emin olun. Bu, RIS'yi ayırmak, başka bir bant parçası yerleştirmek ve bandı kırık yüzeye aşağı itmek RIS.To (Şekil 2B).
NOT: İnce beyaz tabakanın tamamını çıkarmak için birden fazla bant parçası gerekebilir. - Bant parçasını sadece turuncu / pembe tabaka ile +ROS etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
- Bandı veya bant parçalarını ince beyaz tabaka ile +RIS etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
NOT: Liyofilize retinanın bantla ayrılması pratik gerektirir. Banda uygulanan basınç miktarı, liyofilize numunenin nasıl parçalanacağını etkileyecektir. Numune üzerindeki bant üzerine çok fazla basınç uygulanırsa, tüm liyofilize retina filtre kağıdını soyacak ve banda yapışacaktır. Banda çok az basınç eklenirse, turuncu/pembe üst katman (+ROS) banda yapışmaz. - Filtre kağıdı üzerinde bulunan artık retina dokusunu (ROS ve RIS tabakalarından yoksun, -OIS) filtre kağıdındaki kalın, beyaz tabakayı bant kullanarak soyarak toplayın. İzolatı -OIS etiketli bir tüpe yerleştirin.
- Her yarıya indirilmiş retina örneği için bu adımları tekrarlayın.
- Liyofilize retinadan izole edilen katmanları, aynı gün protein miktarı, jel elektroforezi ve protein immünobolitleri yapılırsa oda sıcaklığında saklayın veya daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de susuz kurutucu ile doldurulmuş bir kapta (50 mL konik tüp gibi) saklayın.
3. Soyma izolasyonları için Western blot numunesi hazırlama
- RIPA lizis tamponunu hazırlama
- 100 mL'lik bir saklama şişesinde, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl,% 1 Triton X-100,% 1 Sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS ve 1 mM EDTA'lık nihai konsantrasyon elde etmek için reaktifler ekleyin. 100 mL deiyonize ultra saf su ekleyin ve iyice karıştırın.
NOT: RIPA lizis tamponu 2-8 °C'de 2-3 hafta saklanabilir. Daha uzun süre saklamak için, aliquot yapın ve -20 °C dondurucuda saklayın. - Deney gününde, RIPA lizis tamponuna bir proteaz inhibitörü kokteyli (0.1 M PMSF, 1: 1000 Aprotinin ve 1: 1000 Leupeptin) ekleyin ve buz üzerinde tutun.
- 100 mL'lik bir saklama şişesinde, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl,% 1 Triton X-100,% 1 Sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS ve 1 mM EDTA'lık nihai konsantrasyon elde etmek için reaktifler ekleyin. 100 mL deiyonize ultra saf su ekleyin ve iyice karıştırın.
- Batı lekesi için filtre kağıdı soyma lizat hazırlama
- Filtre kağıdı kabuklarını ve artık soyulmuş retinayı içeren tüplerin buz üzerinde tutulduğundan (aynı günkü deney için) veya -80 °C dondurucu deposundan çıkarıldığından ve buz üzerine yerleştirildiğinden emin olun.
- Filtre kağıdı kabuklarını içeren mikrosantrifüj tüplerinin tabanındaki fazla sıvıyı çıkarın. Mini bir santrifüjde 2-4 sn hızla döndürün ve kalan sıvıyı atın.
- Pipet, 45-55 μL soğuk RIPA tamponunu içeren tüplere filtre kağıdı izolatı içerir.
- Her numuneyi temiz, otoklavlanmış bir havane karıştırıcı ile 1 dakika boyunca homojenize edin. Filtre kağıdının havaneli karıştırıcı ile temas halinde kaldığından emin olun. Filtre kağıdını her tüpün alt kısmında değil, yan tarafında tutun.
- Cımbızla, filtre kağıtlarını her borunun yanına hareket ettirin ve mini santrifüjde 2-4 sn boyunca döndürün. Bu, RIPA arabelleğini filtre kağıdından kaldırır.
- Kurutulmuş filtre kağıdını çıkarın ve gerekirse her tüp içindeki tüm filtre kağıtları için tekrarlayın.
- Homojenatı yeni bir tüpe aktarın ve uygun şekilde etiketleyin.
NOT: Bu en çok zaman alan adımdır ve düzgün bir şekilde tamamlanmazsa, numunenin çoğu filtre kağıdı tarafından emilecektir. - Pipet, 60-80 μL soğuk RIPA tamponunu, artık soyulmuş retina ile tek tek tüplere yerleştirin.
- Her numuneyi temiz, otoklavlanmış bir havane karıştırıcı ile 1 dakika boyunca homojenize edin.
- Bant soyma Batı lekesi için lizat hazırlama
- RT liyofilize numuneleri veya -80 °C numuneleri buz üzerine yerleştirin.
- Pipet, +ROS ve +RIS bant kabukları içeren her tüpün içine 50-70 μL soğuk RIPA tamponu yerleştirin.
- Pipet, 60-80 μL soğuk lizis tamponunu, kalan liyofilize retinayı içeren -OIS tüplerine, ROS ve RIS çıkarılarak alınır.
- Her numuneyi temiz bir havaneli mikser ile 1 dakika homojenize edin. Tek tek tüplerdeki bandın havane karıştırıcısı ve lizis tamponu ile temas halinde kaldığından emin olun.
- Sterilize cımbızla, bandı tüplerin yanına hareket ettirin ve 2-4 s için mini bir santrifüjle döndürün. Bu, sıvıyı banttan çıkaracaktır. Kurutulmuş bandı tüplerden çıkarın.
NOT: Bu noktada, bibinkoninik asit testi (BCA) yapmak için yeterli hacme sahip olduğunuzdan emin olmak için 'filtre kağıdı soyma' veya 'bant soyma' yöntemi için aynı retinadan iki yarım retinal izolatı birleştirebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mevcut stratejiler, batı leke analizi için spesifik çubuk hücre altı bölmeleri arasındaki proteinleri izole etmek ve analiz etmek için nispeten hızlı ve basit yöntemler sağlamak üzere geliştirilmiştir. İki ardışık soyma tekniği (Şekil 1 ve Şekil 2) uyguladık ve ardından bu yöntemlerin hem karanlık hem de ışığa adapte olmuş hayvanlarda çubuk transdüsin (GNAT1) ve arrestinin (ARR1) bilinen dağılımını tespit etmek için güvenilir bir şekilde kullanılabileceğini göstermek için immünoblotlama uyguladık. İki protokolümüzün diğer hücresel tabakalardan kontaminasyon olmadan çubuk hücre altı bölmelerini hassas bir şekilde izole etmedeki etkinliğini doğrulamak için, immünoblotlar sitokrom C (Cyt C), aktin ve Gß5S / Gß5L26 antikorları ile araştırıldı. Kullanılan antikorların ve seyreltmelerin bir listesi Tablo 1'de sunulmuştur. Cyt C ve aktin, proksimal retinada bol miktarda protein oldukları ancak ROS'ta bulunmadıkları için ROS saflığını gösterdi. GNAT127 için GTPaz aktive edici proteinin (GAP) bir bileşeni olan Gß5L, ROS ve RIS'de bulunur ve bu izolasyonlar için bir kontrol görevi görür. Gß5S, ROS veya RIS'de bulunmayan ancak diğer tüm çubuk bölmelerinde bulunan daha kısa ek izoform, ROS / RIS izole edilmemiş hücre altı bölmeler için bir kontrol görevi gördü.
İlk olarak, sıralı canlı hücreli retinal peeling yöntemimizin etkinliği, karanlık ve ışığa adapte olmuş farelerin çubuklarındaki GNAT1 ve ARR1'in dağılımı analiz edilerek değerlendirildi (Şekil 3). ROS (+ROS) içeren filtre kağıtları toplam bir bütün retinadan toplandı ve karşılık gelen artık doku (-ROS) da birleştirildi. Belirtilen proteinlerden gelen sinyaller daha sonra +ROS örnekleri ve -ROS örnekleri arasında karşılaştırıldı ve bütün bir izole retina giriş kontrolü olarak görev yaptı. Bu numuneler için protein konsantrasyonu ve homojenizasyon hacmi Tablo 2'de sunulmuştur. Şekil 3A'da sunulan sonuçlar, karanlığa adapte olmuş hayvanlarda, GNAT1 ve ARR128'in dağılımının, GNAT1 sinyalinin +ROS izolasyonunda gözle görülür şekilde en güçlü olduğu, ARR1 sinyalinin ise -ROS izolasyonunda daha sağlam olduğu bilinen karanlık hal dağılımlarıyla yakından eşleştiğini göstermektedir. Buna göre, ışığa maruz kalan retinada, GNAT1 sinyali +ROS izolasyonunda gözle görülür şekilde azaldı ve -ROS örneğinde artan bir sinyale sahipken, ışığa bağlı ARR1 translokasyonu +ROS ve -ROS örneklerinde görselleştirilebilir. Altı farklı deneyden elde edilen sonuçlar ölçüldü ve +ROS ve -ROS örneklerinde GNAT1 ve ARR1 için karanlık / ışık koşulları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar bulundu (Şekil 3B). Bu bulgular, çubuk hücre altı bölmeleri içindeki daha önce bilinen protein açık / karanlık hareketi ile tutarlıdır ve bu tekniğin zenginleştirilmiş + ROS fraksiyonlarını izole edebileceğini kuvvetle göstermektedir.
Canlı hücre soyma yöntemimizi daha da doğrulamak için, hem +ROS hem de -ROS örneklerinde bilinen ROS saflık belirteci dağılımlarını araştırdık. Hem karanlık hem de ışığa adapte olmuş numunelerde, Gß5S, Cyt C ve aktin sinyalleri +ROS numunelerinden hariç tutulur (Şekil 3A), diğer hücresel katmanlardan kontaminasyon olmadığını gösterir. Ek olarak, Gß5L sinyali +ROS örneklerinde açıkça görülebiliyordu (Şekil 3A). Ayrıca, aktin ve Gß5L sinyalleri sadece +ROS ve -ROS fraksiyonlarının saflığını doğrulamakla kalmadı, aynı zamanda +ROS numunelerinden gelen sinyallerin Gß5L'ye karşı normalleştirildiği ve -ROS numunelerinin aktin'e karşı normalleştirildiği normalizasyon kontrolleri olarak da işlev gördü. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, optimal immünoblotlama normalizasyonu ve analizi için canlı hücre soyma izolatlarının bir yükleme kontrolü, özellikle de bütün bir retinal homojenat ile birlikte yüklenmesi önerilir. Birlikte, bu veriler canlı hücre soyma yöntemimizin, ROS hücre altı tabakasını protein analizi için çubuğun ve retinanın geri kalanından izole etmek için hızlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlayabileceğini doğrulamaktadır.
Daha sonra, bu yöntemin ROS ve RIS bölmelerini tekrar tekrar izole edebileceğini doğrulamak için liyofilize soyma tekniğimizi değerlendirdik. İmmünoblotlamadan önce, bant soyulmasının hangi fotoreseptör hücre altı tabakasını verdiğini analiz etmek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak sağlam ve soyulmuş liyofilize fare retinasının yüzeylerini görüntüledik (Şekil 4). Yapışkan bantla soyulmadan önce, bozulmamış liyofilize retinanın yüzeyi (turuncu / pembe renkli tabaka) karakteristik silindirik ROS'un profiliyle yakından eşleşti (Şekil 4A). İlk bant soyulmasından sonra, ROS ve RIS, artık soyulmuş liyofilize retinanın yüzeyinde bulunan üniform nükleer tabaka ile kanıtlandığı gibi, tamamen çıkarılmış gibi görünüyordu (Şekil 4C). Sonraki bant soyulmaları, RIS'yi (ince beyaz tabaka, Şekil 4B) soyulmuş tabakanın serbest yüzeyinden çıkardı, bu işlem muhtemelen iç ve dış segmentleri birbirine bağlayan dar ve kırılgan bağlantı siliyumu tarafından desteklendi. Bu sonuçlar, liyofilize retina dokusundan çubuk hücre altı tabakalarının bant kullanılarak spesifik olarak fraksiyone edilebileceğini doğruladı.
Bu yöntemin etkinliğini görsel olarak doğruladıktan sonra, koyu ve ışığa adapte soyulmuş retina, canlı hücre soyma yöntemimiz için özetlendiği gibi farklı bölmeler için protein belirteçleri kullanılarak aynı yaklaşım kullanılarak immünoblotlamaya tabi tutuldu (Şekil 3). ROS izolasyonu (+ROS), RIS izolasyonu (+RIS) ve kalan retinal tabakalar (-OIS) için protein konsantrasyonu ve homojenizasyon hacmi Tablo 2'de sunulmuştur. Beklendiği gibi, GNAT1 için ROS'tan RIS'ye ve ARR1 için RIS'den ROS'a ışık kaynaklı net bir kayma vardı (Şekil 5A). GNAT1, karanlıkta +ROS örneğinde ve ışıkta +RIS örneğinde en bol bulunurken, ARR1 sinyali tersine çevrildi (Şekil 5A). Daha sonra, canlı soyma metodolojisi ile aynı kontrolleri ve yaklaşımı kullanarak, +ROS, +RIS ve -OIS izolasyonlarından (Şekil 5B) gelen protein sinyallerini normalleştirdik ve ölçtük. Ayrıca +RIS ve -OIS örneklerini (Şekil 5C) canlı hücre filtresi kağıt soyma yöntemimizle daha doğrudan bir karşılaştırma için birleştirdik (Şekil 3B). Her iki grafik de hem GNAT1 hem de ARR1'in iyi kurulmuş ve karakteristik ışık kaynaklı translokasyonunu göstermektedir. Bu gözlemlere dayanarak, bant soyma preparatının, bu izolasyonlarda ARR1 ve GNAT1'in protein bileşimi ile kanıtlandığı gibi, zenginleştirilmiş ROS ve RIS fraksiyonları verdiği görülmektedir.
Daha sonra, bireysel hücre altı izolasyonların saflığı değerlendirildi. Şekil 3A'da gösterilen sonuçlara benzer şekilde, +ROS numunelerinde güçlü bir Gß5L sinyali görüntülerken aktin, sitokrom C ve Gß5S sinyalleri eksikti (Şekil 5). Bu bulgu, +ROS numune hazırlamamızda diğer hücre altı bölmelerden kontaminasyon eksikliğini göstermektedir. Çubuğun sonraki hücre altı tabakasının, +RIS izolasyonunun protein içeriği daha sonra değerlendirildi. +RIS örneğinin Cyt C, Gß5L ve aktin için pozitif olduğunu bulduk. Bu bulgu, mitokondri ve sitoiskelet elementleri bakımından zengin olan RIS'nin bilinen bileşimi ile tutarlıdır. Son katman olan -OIS izolatı, Şekil 3A'da gösterilen -ROS örnekleriyle tutarlı protein dağılımlarına sahipti.
Çubuk hücre altı bölmelerinin protein bileşimlerini araştırmada yapışkan bant soyma yöntemimizin yararlılığını daha iyi değerlendirmek için, +ROS, +RIS ve -OIS örneklerimizde rodopsin kinaz (GRK1) ve protein kinaz C-alfa'nın (PKCα) immünoreaktivitesini özel olarak inceledik. İmmünositokimya (ICC) ve western blot gibi farklı deneysel yöntemler, genellikle bu proteinlerin çubuklarda ve retinada kesin lokalizasyonu hakkında çelişkili sonuçlar verir. Örneğin, GRK1'in, ışıkla aktive olan opsinlerin29 fosforilasyonuna aracılık etmek için çubuk ve koni OS'sinde nispeten bol olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, retinal dilimlerin immüno-etiketlenmesi, GRK1'in özellikle OS30,31'de veya tüm fotoreseptör tabakasında32 lokalizasyonunu ortaya çıkarmıştır. Öte yandan PKCa, ICC'nin bipolar hücreleri etiketlemesi için yaygın olarak kullanılan bir proteindir. Retina dilimlerinde25 çubuğa özgü PKCα immünoetiketlemesine dair net bir kanıt olmamasına rağmen, PKCa'nın ROS'taki varlığını ve fosforilleyici rolünü destekleyen önemli biyokimyasal24,25 ve işlevsel33,34,35 kanıtlar vardır. Tekniğimizi kullanarak, GRK1 immünoreaktivitesinin ışığa maruz kalan retinadaki +ROS örneklerinde en yoğun olduğunu ve -OIS örneklerinde bulunmadığını bulduk. Tersine, +ROS ve +RIS örneklerinin PKCα için soluk bir sinyal gösterdiğini gösteriyoruz. Şekil 6B'de görülebileceği gibi, PKCα genellikle retinal kesitlerin immünofloresan boyanması ile ROS veya RIS'de tespit edilmez. Bununla birlikte, PKCα batı lekesi ile immün olarak saptandı (Şekil 6A,D). +ROS ve +RIS izolasyonları güçlü bir Gß5L sinyali ve Gß5S yokluğu gösterdiğinden (Şekil 6A), hem ROS hem de RIS numunelerindeki loş PKCα sinyalinin gerçek olduğundan ve diğer katmanlardan kaynaklanan kontaminasyondan kaynaklanmadığından eminiz. Tek tek sinyalleri +ROS, +RIS ve -OIS izolasyonlarında görselleştirmek için, GRK1 ve PKCα lekeleri birleştirildi ve karşılaştırma için çizildi (Şekil 6C).
Son olarak, optimal olmayan bir peeling seansı örneği (Şekil 6D), farklı alt katmanlardan gelen kontaminasyonun sonuçları nasıl çarpıtabileceğini göstererek, veri yorumlamanın ve deneysel soyma hatalarını taramak için uygun kontrol antikorlarının dahil edilmesinin önemini daha da göstermektedir. Bu bant soyma izolasyonu örneğinde, RIS izolasyon şeridinde -OIS numunesinden hafif bir kontaminasyon olduğunu gösteren soluk bir Gß5S sinyali belirgindir. Kullanıcının hedefine bağlı olarak, bu hafif kirlenme bir sorun olmayabilir. Bununla birlikte, bu durumda, +ROS ve +RIS numunelerinde PKCα sinyalini araştırıyorduk ve PKCα sinyali, belki de kontaminasyon nedeniyle, RIS şeridinde ROS şeridine kıyasla biraz daha yüksektir (Şekil 6A, D). Bu nedenle, soyma işlemi sırasında doğru bir izolasyon sağlamak ve kontaminasyonu en aza indirmek için özen gösterilmelidir. Bireysel hatadan kaynaklanan minimum kontaminasyona rağmen, bu veriler bant soyma metodolojisinin protein analizi için çubuk fotoreseptör katmanlarının doğru sıralı izolasyonlarını sağlayabileceğine dair ikna edici kanıtlar sunmaktadır.
Şekil 1: Canlı hücre soyma adımlarının şeması . (A) Diyagram, izole edilmiş gözün diseksiyonu ve hemiseksiyonu için ana adımları göstermektedir. (B) Fotoreseptör dış segmentleri, filtre kağıdı kullanılarak sıralı soyma ile kademeli olarak çıkarılır. İlk olarak, retinalar fotoreseptör tabakası filtre kağıdı ile temas edecek şekilde yönlendirilir. Daha sonra, filtre kağıdı bir kağıt havlu üzerinde lekelenerek kurutulur ve retina filtre kağıdından soyulur. Bu soyulmuş izolat, buz üzerinde tutulan bir tüpte toplanır. Bu işlem, çubuk dış segmentini (+ROS) tamamen çıkarmak için yedi ila sekiz kez tekrarlanır. Bu figür BioRender.com ile yaratılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Liyofilize retina soyulması işlemi. (A) Liyofilize retina için numune hazırlığının akış diyagramı. Retinalar, retinal ganglion hücre tabakası filtre kağıdı ile temas halinde olacak ve fotoreseptörler yukarı bakacak şekilde yönlendirilir. (B) Liyofilizasyon sonrasında, dondurularak kurutulmuş retina, bandın üstüne hafif bir basınç eklendikten sonra bir bant parçasına yapıştırılır. Bant, çubuk dış segmenti (ROS) ve çubuk iç segmenti (RIS) katmanları çıkarılarak soyulur. RIS tabakası, ROS tabakası görünene kadar (turuncu / pembe tabaka) daha fazla bant kabuğu ile çıkarılır. Bu figür BioRender.com ile yaratılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıralı filtre kağıdı soyulmasından sonra izole çubuk fotoreseptörlerinde GNAT1 ve ARR1 ekspresyonu . (A) Koyu ve ışığa adapte olmuş retinadan elde edilen filtre kağıdı soyma yöntemi ile toplanan +ROS ve -ROS (ROS-tükenmiş) örneklerinin immünoblotları. Pıhtılar, ışıkla tetiklenen proteinler (transdusin (GNAT1) ve arrestin (ARR1)) ve kalite kontrol belirteçleri (GTPaz aktive edici protein (Gß5L / S) sitokrom C (Cyt C) ve aktin için antikorlarla araştırıldı. Bu temsili lekeler için iki yarıya indirilmiş retina birleştirildi. (B) Karanlık ve ışığa uyarlanmış retinadan GNAT1 ve ARR1'in niceliklendirilmiş sinyalleri. GNAT1 ve ARR'nin +ROS ve -ROS izolatlarından karşılıklı ışık tetiklemeli hareketi vardır. Keman grafikleri, +ROS ve -ROS örneklerinin normalleştirilmiş ifadesini gösterir. Bu rakam Rose ve ark.36'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Liyofilize retinanın taramalı elektron mikroskobu görüntüleri. (A) Bant soyulmadan önce liyofilize retinanın yüzeyi (fotoreseptör tarafı yukarı). (B) İç segment katmanı bant soyma sonrası. (C) Bant soyulması sonrası hücre gövdesi tabakası düzgün bir nükleer görünüm gösterir. Bu rakam Rose ve ark.36'dan değiştirilmiş ve BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Liyofilize retinadan ROS ve RIS'i izole etmek için bant soyma yönteminin doğrulanması. (A) Bant soyma yöntemiyle toplanan +ROS, +RIS ve -OIS (ROS/RIS-tükenmiş) örneklerin Batı lekeleri. İmmünoblotlar transdusin (GNAT1), arrestin (ARR1), GTPaz aktive edici protein (Gß5L / S), sitokrom C (Cyt C) ve aktin antikorları ile incelendi. Karanlık ve ışığa adapte olmuş retinadan örnekler alındı ve yarıya indirilmiş retinal izolatlar (+ROS, +RIS, -OIS) daha konsantre materyal için birleştirildi. (B) GNAT1 ve ARR1'in niceliklendirilmiş sinyalleri, karanlık ve ışığa adapte olmuş retinadan elde edilen farklı izole retina katmanları için keman grafikleri olarak çizilir. (C) +RIS ve -OIS'den normalleştirilmiş ekspresyon seviyeleri birleştirildi ve bant ve filtre kağıdı soyma yöntemlerini karşılaştırmak için çizildi. Karanlık ve ışığa uyarlanmış örnekler, anahtar fototransdüksiyon proteinlerinin bilinen hareketini gösterdi. Bu rakam Rose ve ark.36'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Fotoreseptörlerde GRK1 ve PKCa'nın hücre altı lokalizasyonunu araştırmak için liyofilize retinanın bant peelingi . (A) Rodopsin kinaz (GRK1), protein kinaz C-alfa (PKCα), GTPaz aktive edici protein (Gß5L / S) ve aktinin göreceli seviyelerini gösteren ışığa adapte olmuş C57BL / 6J farelerinden soyulmuş örneklerin temsili bir batı lekesi. (B) PKCα antikoru ile inkübe edilmiş ışığa maruz kalan farelerden hazırlanan donmuş retinal kesit (yeşil, 1:100). RPE, retina pigmentli epitel; İşletim sistemi, dış segment; IS, iç segment; CB, hücre gövdesi; ST, sinaptik terminal. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) +ROS, +RIS, -OIS örnekleri için PKCα ve GRK1 normalleştirilmiş ifade seviyeleri keman grafikleri olarak çizilir. (D) Optimal olmayan bant soyma, potansiyel olarak hafif kontamine numuneler verebilir. Kırmızı kare, bazı -OIS numuneleriyle kontamine olmuş +RIS örneğini vurgulayarak hem Gß5L/S bantları hem de daha yüksek bir PKCα sinyali üretir. İki yarıya indirilmiş retina tüm lekeler için birleştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedef | Antikor | Seyreltme | Üretici |
| Tutuklama | Tavşan anti-ARR1 | 1:1000 | Chen, vd., 2006. |
| Transdüsin | Fare anti-GNAT (TF-15) | 1:1000 | CytoSignal. |
| ß Aktin | Tavşan anti-ß Aktin | 1:5000 | GeneTex A.Ş. |
| Sitokrom C | Tavşan anti-sitokrom C | 1:500 | Santa Cruz, sc-7159. |
| GAP (Gß5L/S) | Tavşan anti-Gß5L/S (CT2-15) | 1:2000 | Watson, vd., 1996. |
| Protein kinaz C alfa (PKC) | Tavşan anti-PKC (#2050) | 1:1000 | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi. |
| Rodopsin Kinaz (GRK1) | Fare anti-GRK1 (G-8) | 1:200 | Santa Cruz, sc-8004. |
Tablo 1: Ayırma tekniklerinin western blot validasyonu için kullanılan antikorların listesi.
| Filtre kağıdı retinal izolasyon | ||||||
| +ROS* | -ROS* | Tüm Retina | ||||
| Ortalama protein konsantrasyonu (μg/mL) | 700 | 1,500 | 1,500 | |||
| RIPA arabellek birimi (μL) | 90 | 150 | 200 | |||
| Bant peeling retina izolasyonu | ||||||
| +ROS* | +RIS* | -ROS* | Tüm Retina | |||
| Ortalama protein konsantrasyonu (μg/mL) | 520 | 440 | 1,200 | 1,600 | ||
| RIPA arabellek birimi (μL) | 100 | 100 | 125 | 150 | ||
| * İki yarıya indirilmiş retina izolasyonu birleştirildi. | ||||||
Tablo 2: Retina izolasyon homojenatlarındaki protein konsantrasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Birçok retina hastalığı çubuk fotoreseptör hücrelerini etkileyerek çubuk ölümüne ve nihayetinde tam görme kaybına yol açar37. İnsan retinal dejenerasyonunun genetik ve mekanik kökenlerinin önemli bir kısmı, yıllar boyunca çok sayıda fare modelinde başarıyla özetlenmiştir. Bu bağlamda, bireysel çubuk hücre altı bölmelerini küçük fare retinasından kolayca ve seçici olarak ayırma yeteneği, retina hastalıklarının lokalize biyokimyasal ve moleküler temelleri hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde artıracaktır. Ayrıca, nöral retinanın katmanlı doğası, çubuk fotoreseptörlerinin benzersiz, oldukça polarize düzenlemesi ile birleştiğinde, seçici soyma ile çubuk bölmelerinin izolasyonuna izin verir. Bu yazıda, immünoblotlama için çubuk fotoreseptör hücrelerinin bireysel hücre altı bölmelerini izole etmek için kullanılan iki protokol açıklanmaktadır. Her iki yöntem de mevcut teğetsel kesitleme yöntemine kıyasla önemli ölçüde daha hızlı ve teknik olarak daha az zordur9, aynı zamanda yoğunluk gradyanları kullanılarak ROS'un ortak biyokimyasal izolasyonundan önemli ölçüde daha küçük bir numune boyutu gerektirir19. Bu tür ROS gradyan saflaştırma teknikleri, bol miktarda ROS'u güvenilir bir şekilde geri kazanmak için 8-10 murin retina gerektirirken, burada sunulan protokoller tek retina için uygundur.
Önerilen tekniklerin genel basitliğine rağmen, her iki protokolde de ortak olan ana zorluklardan biri, kavisli retinanın, farklı hücre altı bölmelerin uygun şekilde izole edilmesi için gerekli olan filtre kağıdına düzleştirilmesiyle ilgilidir. İzole retina kıvrılma ve istiridye benzeri bir şekil alma eğilimindedir. Retinanın filtre kağıdına yerleştirildiğinde kenarları katlanmışsa (fotoreseptör tarafı yukarı veya aşağı), bu istenen izole çubuk katmanlarının verimini azaltabilir. Daha da önemlisi, retina düzgün bir şekilde düzleştirilmemişse, diğer hücre altı bölmelerden ve retina hücrelerinden tabaka yanlış hizalanması ve kontaminasyonu olası bir sonuçtur (Şekil 6D). Yarıya indirilmiş retinal dikdörtgenin eğriliğini sınırlamak ve çubuk ve retina katmanlarının kusurlu hizalamasını düzeltmek için, retinal dikdörtgen iki retinal kare üretmek üzere ikiye bölünebilir. Nöral retinayı daha küçük parçalara bölerek, retinanın doğal eğriliği azalır ve dokunun filtre kağıdı üzerinde düz durması daha olasıdır.
Farklı çubuk bölmelerinin fiziksel olarak ne zaman ayrıldığını tanımak, bu tekniklerle deneyimsiz biri için zor olabilir. Biyolojik olarak önemli bir deneye başlamadan önce, kullanıcının bir veya iki saat boyunca örnek retina ile işlem yapmasını tavsiye ederiz. Uygulama, operatörün becerilerinde ve yöntemlerdeki yeterliliğinde önemli bir iyileşme sağlamalıdır. ROS'u canlı bir retinadan soymak için filtre kağıdı kullanırken, ROS tabakasının ne zaman izole edildiğini gösteren belirgin bir görsel ipucu yoktur. Retina daha ince ve daha kırılgan hale gelirken, kullanıcının ROS'u doğru bir şekilde izole etmek için kabuk sayısını kendi kendine izlemesi ve doğrulaması gerekecektir. Ayrıca, farklı lif kalınlıklarına ve kabalığına sahip filtre kağıdı kullanmak, ROS soyulma süresini değiştirecektir. Daha kalın lifli filtre kağıdı (VWR Grade 413 gibi) retina tabakalarını daha hızlı izole eder (6-8 peeling), ancak seçici olmayabilir ve diğer katmanlardan kontaminasyona neden olabilir. Daha ince lifli filtre kağıdı (Whatman Grade 1 gibi) retina tabakalarını daha yavaş (12-15 peeling) izole edecek ve fotoreseptör tabakalarının temiz bir izolasyonunu sağlayacaktır. Soyulma süresini en aza indirmek ve toplama saflığını sağlamak için hem daha kalın hem de daha ince filtre kağıdı kullanmanızı öneririz.
Aynı zamanda, görsel yaklaşım ve bant numunesi işleme, hücre altı bölmeleri liyofilize retinadan izole etmenin başarısının anahtarıdır. Banda çok fazla basınç eklenirse, tüm liyofilize retina banda yapışacaktır. Bu gerçekleştiğinde, ROS'u ayırmak daha uzun ve daha zor hale gelir, ancak imkansız değildir: retinanın serbest yüzeyine (ganglion hücre tarafına) ikinci bir bant parçası yerleştirin ve ilk bant parçasında yalnızca turuncu / pembemsi tabaka görünene kadar katmanları bantla yavaşça çekin. Bununla birlikte, bu noktada RIS'yi izole etmek imkansızdır. Banda çok az basınç eklenirse, ROS'un büyük bir kısmı banda yapışmaz. ROS-bandın düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için, banda yapışmayan bölgelere cımbızla hafifçe bastırmanızı öneririz. Tipik olarak, en ufak bir basınç ROS ve RIS katmanlarının çıkarılmasıyla sonuçlanır, ancak basınç miktarı deneyime dayanarak belirlenmelidir. İzole RIS'in varlığı, ilk ROS bant kabuğunda ince, beyaz bir tabakanın (hafif bir kar tozuna benzer) görünür olup olmadığı kontrol edilerek tespit edilebilirken, izole ROS'un varlığı, bant üzerindeki çubuk fotoreseptör tabakasının (koyu adaptasyonlu için turuncu, ışığa adapte olmuş için pembemsi) rengini kontrol ederek kolayca belirlenebilir.
Son bir zorluk, filtre kağıdı kabuklarının (+ROS) canlı retinadan homojenleştirilmesiyle ortaya çıkar. Filtre kağıdı sıvıyı kolayca emer ve protokolün bu adımı sırasında homojenleştirici tamponun önemli bir kısmı ıslatılır. Soyma kağıdını her tüpün yan tarafına yerleştirdikten sonra sıvının mini bir santrifüjde döndürülmesi, numune kaybını önlemeye yardımcı olur. Ne yazık ki, birden fazla filtre kağıdı parçasını döndürmek zaman alıcı bir süreç olabilir ve numune kaybı kaçınılmazdır. Bu sorunu gidermek için, filtre kağıdı parçalarından bazılarını çıkarın ve bir seferde daha az parçayı homojenleştirmeye odaklanın. Ayrıca, bu adım sırasında numune kaybını önlemek için, ROS'u izole etmek için kullanılan toplam filtre kağıdı miktarını en aza indirmeyi düşünün.
Her iki yöntemimiz de büyük bir örneklem büyüklüğü veya retinayı kesitmek için bir bıçağın hassas bir şekilde hizalanmasını gerektirmese de, fotoreseptör soyma tekniklerimizde dikkat edilmesi gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, liyofilize murin retina, ROS ve RIS'nin ötesinde sonraki fotoreseptör tabakalarını soymak için uygun olmayabilir. İkincisi, soyma yöntemlerimiz bireysel retinayı işlemek için daha uygundur ve tek bir oturuşta büyük parti bazlı işlemeye uygun değildir. Üçüncüsü, deneyin başarısı batı lekesinde kullanılan antikorun duyarlılık sınırına bağlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, temsili sonuçlarımız iki izolasyon soyma tekniğimizin spesifik çubuk fotoreseptör bölmelerini etkili bir şekilde izole edebileceğini göstermektedir. Ek olarak, bu iki yöntem ucuz ve yaygın laboratuvar malzemeleri (filtre kağıdı ve yapışkan bant) kullanır ve bu da onları oldukça erişilebilir kılar. Çalışmamızda, diğer retinal hücrelerin immünoblotlama için izole edilip edilemeyeceğini doğrudan değerlendirmedik; Bununla birlikte, bu yöntemlerin retinal araştırma topluluğunun geniş bir kesitinin ihtiyaçlarına fayda sağlamak için kolayca değiştirilebileceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rakip çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma JC'ye NIH Grant EY12155, EY027193 ve EY027387 tarafından desteklenmiştir. Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, ABD) ve Natalie Chen'e (USC, Los Angeles, ABD) makaleyi düzelttikleri için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, ABD) ve Dr. Janos Peti-Peterdi'ye (USC, Los Angeles, ABD) yazarın sağladığı görüntüleri toplamak için gerekli ekipmanı sağladıkları için teşekkür ederiz. Materyal: Kasey Rose ve ark., Protein analizi için fare retinasında fotoreseptör hücre bölmelerinin ayrılması, Moleküler Nörodejenerasyon, yayınlanan [2017], [Springer Nature].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS Sample Buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 and 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydrate) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet pestle | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze Flasks | Labconco | N/A | |
| LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ionized water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (powder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (crystal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, Free Acid | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap Aluminum Foil | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Tissue incubation chamber (purchased or custom made) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Wide bore transfer pipet, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
References
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N.
- Molday, R. S., Moritz, O. L.
- Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
- Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
- Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
- Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
- Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
- Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
- Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
- Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
- Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
- Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
- Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
- Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
- Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
- Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
- Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
- Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
- McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
- Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
- Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
- Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
- Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
- Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
- Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
- Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
- Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
- Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
- Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
- Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
- Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
- Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
- Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
- Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
- Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
- Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
- Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
