Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse

Published: December 7, 2021 doi: 10.3791/62977
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Zilkha Neurogenetic Institute, Keck School of Medicine, University of Southern California, 2Department of Cell & Neurobiology, Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.

Abstract

Staaffotoreceptoren zijn sterk gepolariseerde sensorische neuronen met verschillende compartimenten. Muizenstaafjes zijn lang (~ 80 μm) en dun (~ 2 μm) en zijn zijdelings verpakt in de buitenste laag van het netvlies, de fotoreceptorlaag, wat resulteert in uitlijning van analoge subcellulaire compartimenten. Traditioneel is tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde netvlies gebruikt om de beweging en lokalisatie van eiwitten binnen verschillende staafcompartimenten te bestuderen. De hoge kromming van het staaf-dominante muizennet maakt tangentiële sectie echter een uitdaging. Gemotiveerd door de studie van eiwittransport tussen compartimenten, ontwikkelden we twee peelingmethoden die het staafbuitensegment (ROS) en andere subcellulaire compartimenten voor western blots betrouwbaar isoleren. Onze relatief snelle en eenvoudige technieken leveren verrijkte en subcellulair-specifieke fracties om de verdeling en herverdeling van belangrijke fotoreceptoreiwitten in normale staafjes kwantitatief te meten. Bovendien kunnen deze isolatietechnieken ook gemakkelijk worden aangepast om de eiwitsamenstelling van andere cellulaire lagen in zowel gezond als degenererend netvlies te isoleren en kwantitatief te onderzoeken.

Introduction

Staaffotoreceptorcellen, strak verpakt in de buitenste laag van het neurale netvlies, zijn een integraal onderdeel van het zicht op zwak licht. Om te functioneren als getrouwe fotonentellers, gebruiken staafjes een op G-eiwit gebaseerde signaalroute, fototransductie genaamd, om snelle, versterkte en reproduceerbare reacties op het vastleggen van enkele fotonen te genereren. Deze reactie op licht veroorzaakt uiteindelijk een verandering in de stroom bij het plasmamembraan en wordt vervolgens gesignaleerd aan de rest van het visuele systeem1. Zoals hun naam al aangeeft, heeft elke staafcel een verschillende staafachtige vorm en vertoont een sterk gepolariseerde cellulaire morfologie, bestaande uit een buitenste segment (OS), binnensegment (IS), cellichaam (CB) en synaptische terminal (ST). Elk subcellulair compartiment heeft specifieke eiwitmachines (membraangebonden en oplosbaar), biomoleculaire kenmerken en eiwitcomplexen die een cruciale rol spelen, zoals visuele fototransductie, algemene huishouding en eiwitsynthese, en synaptische transmissie2,3.

Meer dan 30 jaar geleden werd de lichtafhankelijke wederzijdse beweging van subcellulaire eiwitten, met name transducine (weg van het OS) en arrestine (naar het OS), voor het eerst waargenomen4,5,6,7. Al vroeg werd dit waargenomen fenomeen met scepsis ontvangen, deels vanwege de kwetsbaarheid van immunohistochemie voor epitoopmaskering8. In de vroege jaren 2000 werd stimulusafhankelijke eiwittranslocatie bevestigd met behulp van een rigoureuze en zware fysieke sectietechniek9. Seriële tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde knaagdier retinae gevolgd door immunoblotting onthulde dat transducine9,10, arrestin11,12 en recoveryin13 allemaal subcellulaire herverdeling ondergaan als reactie op licht. Er wordt aangenomen dat lichtgestuurde translocatie van deze belangrijke signaaleiwitten niet alleen de gevoeligheid van de fototransductiecascade9,14,15 reguleert, maar ook neuroprotectief kan zijn tegen lichtschade16,17,18. Omdat lichtgedreven eiwittransport in staven zeer belangrijk lijkt te zijn voor de biologie en fysiologie van staafcellen, zijn technieken die de isolatie van verschillende subcellulaire compartimenten mogelijk maken om de eiwitverdeling te bepalen waardevolle onderzoeksinstrumenten.

Momenteel zijn er een paar methoden gericht op het isoleren van de staafsubcellulaire compartimenten. Deze methoden kunnen echter lang en moeilijk te reproduceren zijn, of vereisen een aanzienlijke hoeveelheid retinaal isolaat. Staaf buitensegment (ROS) preparaten via dichtheidsgradiënt centrifugatie19 wordt bijvoorbeeld vaak gebruikt om de ROS te scheiden van retinaal homogenaat. Deze methode wordt veel gebruikt voor western blot, maar de procedure is zeer tijdrovend en vereist een minimum van 8-12 murine retinae20. Aan de andere kant is seriële tangentiële sectie van bevroren murine en rat retinae met succes geïmplementeerd bij het isoleren van het OS, IS, CB en ST9,11,13. Deze methode is echter technisch uitdagend vanwege de noodzaak om het kleine en sterk gebogen muriene netvlies volledig af te vlakken om de retinale lagen uit te lijnen voorafgaand aan tangentiële sectie. Aangezien er een overvloed aan muismodellen en transgene muizen zijn die ziekten van het visuele systeem samenvatten, is de creatie van een techniek die betrouwbaar, snel en gemakkelijk individuele staafcompartimenten scheidt veelbelovend bij het onthullen van de fysiologische processen die zich voordoen in elk gespecialiseerd compartiment en de mechanismen die ten grondslag liggen aan visuele processen in gezondheid en ziekte.

Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, beschrijven we twee peelingmethoden die staafsubcellulaire compartimenten gemakkelijker isoleren dan de huidige protocollen. De eerste peelingmethode, aangepast van een techniek om fluorescerend gelabelde bipolaire cellen bloot te leggen voor patchklemregistratie21, maakt gebruik van cellulosefilterpapier om de ROS sequentieel te verwijderen van een levend, geïsoleerd murine netvlies (figuur 1). De tweede methode, aangepast van een procedure die de drie primaire retinale cellagen isoleert van een chick22 en frog23 retina, maakt gebruik van plakband om het ROS- en staafbinnensegment (RIS) van een gelyofiliseerd netvlies te verwijderen (figuur 2). Beide procedures kunnen in 1 uur worden voltooid en zijn aanzienlijk gebruiksvriendelijk. We bieden validatie van de effectiviteit van deze twee scheidingsprotocollen voor western blot door gebruik te maken van donker-aangepast en aan licht blootgesteld netvlies van C57BL / 6J-muizen om lichtgeïnduceerde translocatie van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) aan te tonen. Bovendien leveren we met behulp van de tape peeling-methode aanvullend bewijs dat onze techniek kan worden gebruikt om inconsistenties tussen eiwitlokalisatiegegevens verkregen door immunocytochemie (ICC) en western blots te onderzoeken en aan te pakken. Concreet toonde onze techniek aan dat: 1) het eiwitkinase C-alfa (PKCα) isovorm niet alleen aanwezig is in bipolaire cellen, maar ook in murine ROS en RIS, zij het in lage concentraties24,25, en 2) rhodopsinekinase (GRK1) voornamelijk aanwezig is in het geïsoleerde OS-monster. Deze gegevens tonen de effectiviteit aan van onze twee peelingtechnieken voor het scheiden en kwantificeren van specifieke staaf- en retinale eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale institutionele richtlijnen van de commissie voor dierverzorging van de University of Southern California (USC).

1. Live cell retinal peeling methode

  1. Bereiding van Ames' buffers, schilpapier en dissectieschotel
    1. Knip met een irisschaar met stompe punt (of een gelijkwaardig schaartype) het cellulosefilterpapier (grade 413) in rechthoeken van ongeveer 5 mm x 2,5 mm. Bewaar de stekken voor toekomstig gebruik.
    2. Bereid 1 l HEPES-buffer van Ames door één fles Ames' Medium, 2,38 g HEPES en 0,877 g NaCl te combineren. Los de reagentia op in een steriele glazen fles met gedestilleerd ultrapuur water en stel de osmolariteit en pH in op respectievelijk 280 mOsm en 7,4. Filter om te steriliseren (poriegrootte 0,2 μm), sluit het deksel af met paraffinefilm en bewaar bij 4 °C.
    3. Bereid 1 l bicarbonaatbuffer van Ames door één fles Ames' Medium en 1,9 g NaHCO3 te combineren. Los de reagentia op in een steriele glazen fles met gedestilleerd ultrapuur water en stel de osmolariteit en pH in op respectievelijk 280 mOsm en 7,4. Filter om te steriliseren (poriegrootte 0,2 μm), sluit het deksel af met paraffinefilm en bewaar bij 4 °C.
      OPMERKING: De HEPES- en bicarbonaatbuffers van Ames kunnen van tevoren worden voorbereid en gedurende 1 week bij 4 °C worden bewaard.
    4. Maak aan de onderkant van een petrischaaltje van 35 x 10 mm een rooster- of dambordpatroon met een scalpel (blad nr. 11, 40 mm).
      OPMERKING: De getextureerde onderkant van de petrischaal houdt het geïsoleerde, vrij zwevende oog op zijn plaats tijdens de netvliesdissectie.
  2. Dissectie van het netvlies
    OPMERKING: Voor deze procedure moet de buffer worden aangebracht en op kamertemperatuur (RT) worden gehouden. Ververs de bicarbonaatbuffer van de Ames elke 15 minuten met de vers gecarbogen Ames'-bicarbonaatbuffer tijdens de dissectie. Dit handhaaft de noodzakelijke fysiologische pH.
    1. Geef ongeveer 15-20 minuten voor de dissectie zuurstof aan de HEPES-buffer van Ames in een laboratorium van 100 ml of mediafles uitgerust met een buisdopadapter en bubbel de bicarbonaatbuffer van Ames met 95% O2 en 5% CO2 in een weefselincubatiekamer en in een laboratorium- of mediafles van 100 ml uitgerust met een buisdopadapter.
    2. Euthanaseer een gelijk aantal van beide geslachten van C57BL / 6J-muizen (2-3 maanden oud) hetzij door isofluraaninhalatie of koolstofdioxide (CO2) gevolgd door cervicale dislocatie. Enucleer de ogen met een gebogen schaar en plaats de ogen in de getextureerde petrischaal van 35 x 10 mm gevuld met bubbelige Ames's bicarbonaatbuffer.
    3. Maak een oogschelp (figuur 1A) door met een naald van 18 G een gat op de kruising tussen hoornvlies en limbus te prikken. Knip langs de omtrek van deze kruising met behulp van microdissectie irisschaar om het hoornvlies van elk oog te verwijderen. Scheid de lens en glasvochthumor van elk oog met een pincet en gooi weg.
    4. Isoleer het netvlies van de oogschelp door het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE)-sclera-vaatvliescomplex voorzichtig weg te pellen van het neurale netvlies. Gooi het RPE-sclera-vaatvliescomplex weg. Zorg ervoor dat het netvlies niet wordt beschadigd tijdens de dissectie door alleen de randen te hanteren.
    5. Breng geïsoleerde netvliezen over met behulp van een transpet met brede boring in het deksel van een schaal van 60 x 15 mm gevuld met bubbelvormige bicarbonaatbuffer van Ames.
    6. Oriënteer het halfrondvormige netvlies concaaf omhoog (de fotoreceptoren zijn naar beneden gericht naar de onderkant van de schaal) en doorbreek elk netvlies (door de oogzenuw) met behulp van een irisschaar of een scalpel (mes nr. 10, 40 mm). Snijd de gebogen randen van elk half netvlies bij om twee rechthoeken te maken (figuur 1A).
      OPMERKING: Het minimaliseren van de kromming van elk gehalveerd netvlies zorgt ervoor dat het netvlies beter afvlakt in de volgende peelingstappen en produceert een nauwkeurige peeling van de staaf buitenste segment (ROS) laag.
    7. Bewaar het gehalveerde netvlies in de weefselincubatiekamer die continu wordt gebbeld met 95% O2 en 5% CO2.
      OPMERKING: Geïsoleerd netvlies kan gedurende ~ 24 uur in de bicarbonaatbuffer van de gecarbogen Ames worden gehouden.
  3. Rod outer segment (ROS) collectie door filterpapier peeling
    OPMERKING: Ververs de RT oxygenated Ames' HEPES-buffer elke 15-20 minuten tijdens het peelingproces om de noodzakelijke fysiologische pH te behouden.
    1. Breng een retinale rechthoek van de weefselkamer over met een transferpipet met brede boring en een stuk filtreerpapier van 5 mm x 2,5 mm in een petrischaaltje van 35 x 10 mm gevuld met Ames' HEPES-buffer, bebeld met 100% O2.
    2. Oriënteer het gewanden van het netvlies concaaf omhoog en zorg ervoor dat de fotoreceptoren naar beneden gericht zijn naar de onderkant van de schaal. Pak de zijkanten van het gehalveerde netvlies lichtjes vast met een pincet en beweeg het over het filterpapier. Zodra het netvlies op het filterpapier is gecentreerd, beweegt u het filterpapier naar boven zodat het gehalveerde netvlies het filterpapier raakt om de adhesie van ROS-naar-filterpapier te creëren (figuur 1B).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de fotoreceptorlaag direct contact maakt met het filterpapier.
    3. Til het filterpapier met het aangesloten netvlies voorzichtig uit de HEPES-buffer van de Ames. Plaats de onderkant van het filterpapier (de kant zonder het netvlies) op een papieren handdoek en dep 2-3 keer om te drogen (figuur 1B).
    4. Voeg een druppel HEPES van Ames toe aan de zijkant van het filterpapier met het netvlies. Leg het filtreerpapier weer op het keukenpapier om te drogen, zoals zojuist beschreven. Herhaal dit proces nog twee keer.
    5. Plaats het filterpapier met het netvlies terug in de petrischaal. Duw met een pincet voorzichtig alle randen van het gehalveerde netvlies aan alle kanten omhoog en weg van het filterpapier.
    6. Pel het netvlies voorzichtig af van het filterpapier. Raak alleen de extreme omtrek van het netvlies aan tijdens het peelingproces om de structurele integriteit van het netvlies te behouden.
    7. Til het filtreerpapier uit de petrischaal en verwijder overtollige vloeistof op een keukenpapier. Zorg ervoor dat de kant die in contact was met het netvlies geen contact maakt met het keukenpapier.
    8. Plaats het filtreerpapier met de gedeeltelijke ROS-laag in een gelabelde buis op ijs (figuur 1B). Houd het geschilde netvlies ondergedompeld in de HEPES-buffer van Ames.
    9. Herhaal het peelingproces voor dit gehalveerde netvlies ongeveer 7-8 keer om de hele ROS-laag te verwijderen. Plaats na elke peeling het filterpapier in dezelfde buis, die de geïsoleerde ROS van één gehalveerd netvlies zal bevatten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u het gehalveerde netvlies niet scheurt wanneer u het van het filterpapier afpelt, omdat het netvlies tijdens dit proces dunner wordt.
    10. Plaats de buis met alle filterpapierschillen van de geïsoleerde ROS op ijs voor onmiddellijk gebruik of vries deze direct in op droogijs en bewaar bij -80 °C.
    11. Gebruik een pincet om het overgebleven geschilde netvlies (zonder ROS) over te brengen in een op de juiste manier gelabelde buis. Plaats de tube op ijs voor onmiddellijk gebruik of vries in met droogijs en bewaar bij -80 °C.
    12. Herhaal het peelingproces voor elk gehalveerd netvlies en label elke buis nauwkeurig.

2. Gelyofiliseerde retina peeling methode

  1. Buffers, schilmedium, bereiding van dissectiegerechten en set-up van lyofilisator
    1. Bereid in een opslagfles van 1 liter de ringeroplossing door 500 ml gedestilleerd ultrapuur water toe te voegen. Los de reagentia op tot een eindconcentratie van 130 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES en 0,02 mM EDTA. Stel de pH in op 7,4 met NaOH, voeg ultrapuur water toe om het uiteindelijke volume op 1 l te brengen en stel de osmolariteit in op 313 mOsm.
    2. Filtreer de Ringer-oplossing voorafgaand aan het gebruik met een steriel filter (poriegrootte 0,2 μm), sluit het deksel af met paraffinefilm en bewaar bij 4 °C.
    3. Knip met een irisschaar met stompe punt (of een gelijkwaardig schaartype) het cellulosefilterpapier in rechthoeken van ongeveer 5 mm x 2,5 mm. Gebruik een potlood om op één kant van het filterpapier te schrijven om een uniek label te maken.
    4. Maak een rooster- of dambordpatroon in de bodem van een petrischaaltje van 35 x 10 mm met behulp van een scalpel (mes nr. 11, 40 mm).
    5. Schakel de lyofilisator in volgens de specificaties van de fabrikant.
    6. Verkrijg vloeibare stikstof in een Dewar-kolf of een soortgelijke isolerende vacuümkolf.
  2. Retinale dissectie
    1. Voltooi de retinale dissectie zoals beschreven in rubriek 1 van het protocol (figuur 1A). Gebruik de oplossing van Cold Ringer in plaats van de buffer van Ames.
    2. Bewaar na de dissectie het gehalveerde, rechthoekige netvlies in een petrischaaltje van 35 x 10 mm gevuld met koude Ringer-oplossing en plaats het op ijs.
  3. Retinale monstervoorbereiding voor lyofilisatie
    1. Plaats een stuk filterpapier van 5 x 2,5 mm en breng een gehalveerd netvlies over in de getextureerde petrischaal van 35 x 10 mm gevuld met koude Ringer's buffer. Gebruik een transpitpet met brede boring om elk netvlies tussen schotels te verplaatsen.
    2. Gebruik een pincet om het netvlies voorzichtig om te draaien zodat het hol omhoog is gericht (de fotoreceptoren wijzen naar boven) en beweeg het zodat het op het filterpapier rust (figuur 2A).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de fotoreceptoren geen contact maken met het filterpapier (de retinale ganglioncellaag moet in direct contact staan met het filterpapier) en het unieke label zichtbaar is. Om het retinale isolaat gemakkelijk en snel te identificeren, wordt aanbevolen dat het unieke label zich aan de onderkant van het filterpapier bevindt.
    3. Til het filtreerpapier aan de randen omhoog zodat het gehalveerde stuk netvlies het filtreerpapier raakt en blijf het filtreerpapier uit de oplossing van de Ringer tillen.
    4. Plaats de onderkant van het filterpapier (de kant zonder het netvlies erop) op een papieren handdoek en dep voorzichtig 2-3 keer om overtollige vloeistof te verwijderen (figuur 2A).
    5. Pak het filterpapier op met een pincet en voeg een druppel koude Ringer's toe aan de zijkant van het filterpapier met het netvlies. Plaats het filtreerpapier opnieuw op het keukenpapier om overtollige vloeistof te verwijderen. Herhaal het proces nog twee keer.
      OPMERKING: Deze afwisselende bevochtigings- en droogstappen zorgen ervoor dat het tissue stevig aan het filterpapier wordt bevestigd.
    6. Bewaar elk aangehecht monster van netvlies-/filterpapier in een petrischaal gevuld met koude Ringer's totdat het klaar is om alle monsters in te vriezen. Herhaal dit proces voor alle gehalveerde retinae.
    7. Verkrijg een schone en droge petrischaal van 35 x 10 mm (alleen bodem) en een stuk aluminiumfolie gesneden in een vierkant van 3,5 x 3,5 inch.
    8. Til elk monster met een pincet uit de buffer van de koude Ringer. Zorg ervoor dat het pincet alleen contact maakt met de randen van het filterpapier, zodat het gehalveerde netvlies wordt vermeden.
    9. Plaats de onderkant van elk filterpapier (de kant zonder het netvlies erop) op een papieren handdoek en verwijder overtollige vloeistof.
    10. Voeg een druppel koude 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) toe aan de zijkant van het filterpapier waar het netvlies is vastgeplakt. Dep het filtreerpapier op het keukenpapier om overtollige vloeistof te verwijderen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het vocht van het filterpapier voldoende is verwijderd voordat u het bevriest.
    11. Plaats alle stukjes filterpapier in de petrischaal van 35 x 10 mm. Gebruik een pluisvrij tissuepapier om overtollige vloeistof rond het filterpapier af te voeren.
      OPMERKING: Overvolle de petrischaal niet met monsters. Als er meer dan vier muizenogen worden gebruikt, overweeg dan om een grotere petrischaal of meerdere kleinere petrischalen te gebruiken om de monsters van het netvlies/ filterpapier vast te houden.
    12. Wikkel de hele schaal goed in met aluminiumfolie. Zorg ervoor dat de randen van de aluminiumfolie worden vastgezet en soepel in de bodem van de petrischaal worden gedrukt. Prik een handvol gaten van 0,1-0,2 mm in het deksel van aluminiumfolie (figuur 2A).
    13. Laat met behulp van een metalen tang de met aluminiumfolie bedekte petrischaal geleidelijk zakken in de vloeibare stikstof. Bewaar de monsters in de vloeibare stikstof (<10 min) totdat ze klaar zijn om te lyofieliseren.
  4. Lyofilisatie
    1. Plaats de met aluminiumfolie bedekte petrischaal in een vriesdroogkolf en bevestig deze aan de lyofilisatormachine volgens het protocol van de fabrikant. Lyofiliseer het netvlies gedurende 30 minuten.
    2. Maak de kolf los van de lyofilisator en schakel de machine uit volgens de fabrikant.
    3. Verwijder de aluminiumfolie en werk dezelfde dag nog met de gevriesdroogde monsters of bewaar ze in goed gelabelde microcentrifugebuizen van 1 ml. Plaats deze buizen in een container (zoals een conische buis van 50 ml) gevuld met een watervrij droogmiddel en bewaar de monsters bij -80 °C.
  5. Staaf buiten- en binnensegmentcollectie door plakband peeling.
    1. Knip stroken doorzichtig plakband (1-2 cm) en bewaar strips aan de rand van de tapedispenser/laboratoriumbank/etc. voor snel gebruik.
    2. Verplaats een netvliesmonster naar het deksel van een plastic petrischaaltje van 60 x 15 mm om te schillen. Zorg ervoor dat u alleen de buitenste randen van het filterpapier vastpakt en raak het netvlies niet aan.
    3. Knip met een irisschaar met stompe punt (of een gelijkwaardig schaartype) een klein rechthoekig stukje tape tot de geschatte grootte van het weefsel (1,5 x 2,5 mm).
    4. Leg voorzichtig een klein stukje tape op het gelyofiliseerde netvlies (figuur 2B) en oefen lichte druk uit met het pincet om ervoor te zorgen dat het zich bindt met de fotoreceptorlaag (de oranje / roze getinte toplaag).
    5. Trek de tape langzaam weg. Zowel het staafbuitensegment (ROS) als het staafbinnensegment (RIS) worden op de tape geplakt (figuur 2B).
    6. Zorg ervoor dat er een dunne witte film op het gebroken oppervlak zit. Dit is RIS.To de RIS te scheiden, een ander stuk tape te plaatsen en de tape op het gebroken oppervlak naar beneden te duwen (figuur 2B).
      OPMERKING: Het kan meer dan één stuk tape kosten om de hele dunne witte laag te verwijderen.
    7. Plaats het stukje tape met alleen de oranje/roze laag in een microcentrifugebuis met het label +ROS.
    8. Plaats de tape of stukjes tape met de dunne witte laag in een microcentrifugebuis met het label +RIS.
      OPMERKING: Het scheiden van het gelyofiliseerde netvlies met tape vergt oefening. De hoeveelheid druk die op de tape wordt uitgeoefend, heeft invloed op hoe het gelyofiliseerde monster zal fractioneren. Als er te veel druk op de tape over het monster wordt uitgeoefend, zal het hele gelyofiliseerde netvlies het filterpapier afbladderen en aan de tape blijven plakken. Als er te weinig druk op de tape wordt uitgeoefend, zal de oranje/roze toplaag (+ROS) niet aan de tape blijven plakken.
    9. Verzamel het overgebleven retinale weefsel (beroofd van ROS- en RIS-lagen, -OIS) op het filterpapier door de dikke, witte laag van het filterpapier af te pellen met tape. Plaats het isolaat in een buis met het label -OIS.
    10. Herhaal deze stappen voor elk gehalveerd retinaal monster.
    11. Bewaar de geïsoleerde lagen van het gelyofiliseerde netvlies bij kamertemperatuur als u diezelfde dag eiwitkwantificering, gel-elektroforese en eiwitimmunoblots uitvoert, of bewaar in een container (zoals een conische buis van 50 ml) gevuld met watervrij droogmiddel bij -80 °C voor later gebruik.

3. Western blot monstervoorbereiding voor peeling isolaties

  1. Ripa-lysisbuffer voorbereiden
    1. Voeg in een opslagfles van 100 ml reagentia toe om een eindconcentratie van 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS en 1 mM EDTA te verkrijgen. Voeg 100 ml gedeïoniseerd ultrapuur water toe en meng grondig.
      OPMERKING: RIPA lysis buffer kan worden bewaard bij 2-8 °C gedurende 2-3 weken. Voor langere bewaring, aliquot en bewaren in de -20 °C vriezer.
    2. Voeg op de dag van het experiment een proteaseremmercocktail (0,1 M PMSF, 1:1000 Aprotinine en 1:1000 Leupeptin) toe aan de RIPA-lysisbuffer en blijf op ijs.
  2. Filterpapier peeling lysaat voorbereiding voor western blot
    1. Zorg ervoor dat buisjes met de filterpapierschillen en overgebleven geschilde retinae op ijs worden gehouden (voor het experiment op dezelfde dag) of worden verwijderd uit de diepvriesopslag van -80 °C en op ijs worden geplaatst.
    2. Verwijder overtollige vloeistof van de bodem van de microcentrifugebuizen die de filterpapierschillen bevatten. Draai snel in een minicentrifuge gedurende 2-4 s en gooi alle resterende vloeistof weg.
    3. Pipetteer 45-55 μL koude RIPA-buffer in buizen die het filterpapierisolaat bevatten.
    4. Homogeniseer elk monster met een schone, geautoclaveerde stampermenger gedurende 1 minuut. Zorg ervoor dat het filtreerpapier in contact blijft met de stampermixer. Houd het filtreerpapier aan de zijkant van elke buis in plaats van aan de onderkant.
    5. Verplaats met een pincet het filterpapier naar de zijkant van elke buis en draai 2-4 s in de minicentrifuge. Hiermee wordt de RIPA-buffer uit het filterpapier verwijderd.
    6. Verwijder gedroogd filtreerpapier en herhaal dit indien nodig voor alle filterpapieren in elke buis.
    7. Breng het homogenaat over in een nieuwe buis en label het op de juiste manier.
      OPMERKING: Dit is de meest tijdrovende stap en als het niet goed wordt voltooid, wordt een groot deel van het monster uiteindelijk geabsorbeerd door het filterpapier.
    8. Pipetteer 60-80 μL koude RIPA-buffer in de afzonderlijke buisjes met het overgebleven geschilde netvlies.
    9. Homogeniseer elk monster met een schone, geautoclaveerde stampermenger gedurende 1 minuut.
  3. Tape peeling Lysate voorbereiding voor western blot
    1. Plaats de RT gelyofiliseerde monsters of de -80 °C monsters op ijs.
    2. Pipetteer 50-70 μL koude RIPA-buffer in elke buis met +ROS- en +RIS-tapeschillen.
    3. Pipetteer 60-80 μL koude lysisbuffer in de -OIS-buizen met het resterende gelyofiliseerde netvlies, waarbij de ROS en RIS worden verwijderd.
    4. Homogeniseer elk monster met een schone stampermixer gedurende 1 minuut. Zorg ervoor dat de tape in de afzonderlijke buizen in contact blijft met de stampermixer en lysisbuffer.
    5. Verplaats met een gesteriliseerd pincet de tape naar de zijkant van de buizen en draai met een minicentrifuge gedurende 2-4 s. Hierdoor wordt de vloeistof uit de tape verwijderd. Verwijder de gedroogde tape van de buisjes.
      OPMERKING: Op dit punt kunt u twee halve retinale isolaten van hetzelfde netvlies combineren voor de 'filterpapier peeling' of 'tape peeling' methode om ervoor te zorgen dat u voldoende volume heeft om een bicinchoninezuurtest (BCA) uit te voeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De huidige strategieën zijn ontwikkeld om relatief snelle en eenvoudige methoden te bieden om eiwitten te isoleren en te analyseren tussen specifieke staafsubcellulaire compartimenten voor western blot-analyse. We pasten twee sequentiële peelingtechnieken toe (figuur 1 en figuur 2), gevolgd door immunoblotting om aan te tonen dat deze methoden betrouwbaar kunnen worden gebruikt om de bekende verdeling van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) bij zowel donker- als lichtgecorrigeerde dieren te detecteren. Om de effectiviteit van onze twee protocollen te valideren in het nauwkeurig isoleren van staafsubcellulaire compartimenten zonder besmetting van andere cellulaire lagen, werden immunoblots onderzocht met antilichamen voor cytochroom C (Cyt C), actine en Gß5S / Gß5L26. Een lijst van gebruikte antilichamen en verdunningen is weergegeven in tabel 1. Cyt C en actine duidden op ROS-zuiverheid, omdat ze overvloedige eiwitten zijn in het proximale netvlies, maar afwezig zijn in de ROS. Gß5L, een component van GTPase activerend eiwit (GAP) voor GNAT127, is aanwezig in de ROS en RIS en diende als controle voor deze isolaties. Gß5S, de kortere splice-isovorm die niet aanwezig is in ROS of RIS maar wel in alle andere staafcompartimenten, diende als controle voor niet-ROS/RIS geïsoleerde subcellulaire compartimenten.

Ten eerste werd de effectiviteit van onze sequentiële retinale peelingmethode voor levende cellen beoordeeld door de verdeling van GNAT1 en ARR1 in staafjes van donker- en lichtgecorrigeerde muizen te analyseren (figuur 3). De filterpapieren met de ROS (+ROS) werden samengevoegd uit in totaal één heel netvlies en het bijbehorende restweefsel (-ROS) werd ook gecombineerd. De signalen van de geïndiceerde eiwitten werden vervolgens vergeleken tussen de +ROS-monsters en de -ROS-monsters, en een heel geïsoleerd netvlies diende als invoercontrole. De eiwitconcentratie en het homogenisatievolume voor deze monsters zijn weergegeven in tabel 2. De resultaten in figuur 3A laten zien dat bij donker-aangepaste dieren de verdeling van GNAT1 en ARR128 nauw overeenkwam met hun bekende dark-state verdelingen waar het GNAT1-signaal zichtbaar het sterkst was in de +ROS-isolatie, terwijl het ARR1-signaal robuuster was in de -ROS-isolatie. Dienovereenkomstig was het GNAT1-signaal in het aan licht blootgestelde netvlies merkbaar verminderd in de +ROS-isolatie en had het een verhoogd signaal in het -ROS-monster, terwijl lichtgeïnduceerde ARR1-translocatie kon worden gevisualiseerd in +ROS- en -ROS-monsters. Resultaten van zes verschillende experimenten werden gekwantificeerd en statistisch significante verschillen werden gevonden tussen donkere /lichte omstandigheden voor GNAT1 en ARR1 in de +ROS- en -ROS-monsters (figuur 3B). Deze bevindingen komen overeen met de eerder bekende eiwit licht/donker beweging binnen staaf subcellulaire compartimenten en geven sterk aan dat deze techniek verrijkte +ROS fracties kan isoleren.

Om onze live cell peeling methode verder te valideren, onderzochten we bekende ROS zuiverheid marker distributies in zowel +ROS als -ROS monsters. In zowel donkere als lichtgecorrigeerde monsters zijn de Gß5S-, Cyt C- en actinesignalen uitgesloten van de +ROS-monsters (figuur 3A), wat een afwezigheid van verontreiniging van andere cellulaire lagen aantoont. Bovendien was het Gß5L-signaal duidelijk zichtbaar in de +ROS-monsters (figuur 3A). Bovendien bevestigden actine- en Gß5L-signalen niet alleen de zuiverheid van de +ROS- en -ROS-fracties, maar fungeerden ze ook als controles voor normalisatie, waarbij de signalen van de +ROS-monsters werden genormaliseerd tegen Gß5L- en -ROS-monsters werden genormaliseerd tegen actine. Zoals weergegeven in figuur 3A, wordt aanbevolen dat de levende cel peeling isolaten worden geladen naast een belastingscontrole, met name een geheel retinaal homogenaat, voor optimale immunoblotting normalisatie en analyse. Samen valideren deze gegevens dat onze live cell peeling-methode een snelle en reproduceerbare aanpak kan bieden om de ROS-subcellulaire laag te isoleren van de rest van de staaf en het netvlies voor eiwitanalyse.

Vervolgens evalueerden we onze gelyofiliseerde peelingtechniek om te verifiëren of deze methode de ROS- en RIS-compartimenten reproduceerbaar kon isoleren. Voorafgaand aan immunoblotting hebben we de oppervlakken van intacte en geschilde gelyofiliseerde muis netvlies in beeld gebracht met behulp van een scanning elektronenmicroscoop (SEM) om te analyseren welke fotoreceptor subcellulaire laag de tape peeling opleverde (figuur 4). Voor het pellen met plakband sloot het oppervlak van het intacte gelyofiliseerde netvlies (oranje/roze getinte laag) nauw aan bij het profiel van de karakteristieke cilindrische ROS (figuur 4A). Na de eerste tape peeling leken de ROS en RIS volledig verwijderd te zijn, zoals blijkt uit de uniforme nucleaire laag die aanwezig is op het oppervlak van het overgebleven gepelde gelyofiliseerde netvlies (figuur 4C). Volgende tapepeelings verwijderden de RIS (dunne witte laag, figuur 4B) van het vrije oppervlak van de geschilde laag, een proces dat waarschijnlijk wordt geholpen door het smalle en fragiele verbindingscilium dat de binnenste en buitenste segmenten verbindt. Deze resultaten bevestigden dat staafsubcellulaire lagen van gelyofiliseerd netvliesweefsel specifiek kunnen worden gefractioneerd met behulp van tape.

Na de effectiviteit van deze methode visueel te hebben gevalideerd, werden donker- en lichtgezuiverde peeled retinae onderworpen aan immunoblotting met behulp van dezelfde aanpak met behulp van eiwitmarkers voor verschillende compartimenten zoals beschreven voor onze live cell peeling-methode (figuur 3). Eiwitconcentratie en homogenisatievolume voor ROS-isolatie (+ROS), RIS-isolatie (+RIS) en de resterende retinale lagen (-OIS) zijn weergegeven in tabel 2. Zoals verwacht was er een duidelijke lichtgeïnduceerde verschuiving voor GNAT1 van de ROS naar de RIS, evenals ARR1 van de RIS naar de ROS (figuur 5A). GNAT1 was het meest aanwezig in het +ROS-monster in het donker en het +RIS-monster in het licht, terwijl het ARR1-signaal werd omgekeerd (figuur 5A). Vervolgens normaliseerden en kwantificeerden we de translocerende eiwitsignalen van +ROS-, +RIS- en -OIS-isolaties (figuur 5B), met dezelfde controles en aanpak als de live peeling-methodologie. We hebben ook +RIS- en -OIS-monsters (figuur 5C) gecombineerd voor een meer directe vergelijking met onze methode voor het pellen van levend celfilterpapier (figuur 3B). Beide grafieken tonen de gevestigde en karakteristieke licht-geïnduceerde translocatie van zowel GNAT1 als ARR1. Op basis van deze waarnemingen lijkt het tapepeelingpreparaat verrijkte ROS- en RIS-fracties op te leveren, zoals blijkt uit de eiwitsamenstelling van ARR1 en GNAT1 in deze isolaties.

Vervolgens werd de zuiverheid van individuele subcellulaire isolaties geëvalueerd. Vergelijkbaar met de resultaten in figuur 3A, misten de +ROS-monsters signalen voor actine, cytochroom C en Gß5S terwijl ze een sterk Gß5L-signaal vertoonden (figuur 5). Deze bevinding toont een gebrek aan verontreiniging uit andere subcellulaire compartimenten in onze +ROS-monstervoorbereiding. Vervolgens werd het eiwitgehalte van de daaropvolgende subcellulaire laag van de staaf, de +RIS-isolatie, beoordeeld. We vonden dat het +RIS-monster positief was voor Cyt C, Gß5L en actine. Deze bevinding komt overeen met de bekende samenstelling van RIS, die rijk is aan mitochondriën en cytoskeletelementen. De laatste laag, het -OIS-isolaat, had eiwitverdelingen die consistent waren met de -ROS-monsters in figuur 3A.

Om het nut van onze tape peeling-methode bij het onderzoeken van de eiwitsamenstelling van staafsubcellulaire compartimenten verder te beoordelen, hebben we specifiek de immunoreactiviteit van rhodopsinekinase (GRK1) en eiwitkinase C-alfa (PKCα) in onze +ROS-, +RIS- en -OIS-monsters onderzocht. Verschillende experimentele methoden, zoals immunocytochemie (ICC) en western blot, leveren vaak tegenstrijdige resultaten op over de precieze lokalisatie van deze eiwitten in staafjes en het netvlies. GRK1, bijvoorbeeld, wordt verondersteld relatief overvloedig te zijn in staaf- en kegel-OS om fosforylering van lichtgeactiveerde opsins29 te bemiddelen. Immunolabeling van retinale plakjes heeft echter de lokalisatie van GRK1 onthuld, hetzij specifiek in de OS30,31 of gedurende de gehele fotoreceptorlaag32. PKCα, aan de andere kant, is een eiwit dat vaak wordt gebruikt voor ICC om bipolaire cellen te labelen. Ondanks het feit dat er geen duidelijk bewijs is van staafspecifieke PKCα-immunolabeling in retinale plakjes25, is er aanzienlijk biochemisch24,25 en functioneel33,34,35 bewijs dat de aanwezigheid en fosforylatende rol van PKCα in de ROS ondersteunt. Met behulp van onze techniek ontdekten we dat GRK1-immunoreactiviteit het meest intens was in de +ROS-monsters in aan licht blootgesteld netvlies en afwezig was in -OIS-monsters (figuur 6A). Omgekeerd laten we zien dat de +ROS- en +RIS-monsters een zwak signaal voor PKCα vertoonden. Zoals te zien is in figuur 6B, wordt PKCα gewoonlijk niet gedetecteerd in de ROS of RIS door immunofluorescentiekleuring van retinale secties. PKCα werd echter immuungedetecteerd door western blot (figuur 6A,D). Omdat de +ROS- en +RIS-isolaties een sterk Gß5L-signaal en een afwezigheid van Gß5S vertonen (figuur 6A), zijn we ervan overtuigd dat het zwakke PKCα-signaal in zowel ROS- als RIS-monsters echt is en niet te wijten is aan verontreiniging door andere lagen. Om de individuele signalen in +ROS-, +RIS- en -OIS-isolaties te visualiseren, werden GRK1- en PKCα-vlekken gecombineerd en uitgezet voor vergelijking (figuur 6C).

Ten slotte laat een voorbeeld van een suboptimale peelingsessie (figuur 6D) zien hoe verontreiniging van verschillende sublagen de resultaten kan vertekenen, wat het belang van gegevensinterpretatie en opname van de juiste controleantistoffen voor het screenen op experimentele peelingfouten verder illustreert. In dit voorbeeld van tape peeling isolatie is een zwak Gß5S-signaal zichtbaar in de RIS-isolatiestrook, wat wijst op lichte verontreiniging van het -OIS-monster. Afhankelijk van het doel van de gebruiker is deze lichte besmetting mogelijk geen probleem. In dit geval onderzochten we echter het PKCα-signaal in +ROS- en +RIS-monsters, en het PKCα-signaal is iets hoger in de RIS-rijstrook in vergelijking met de ROS-rijstrook (figuur 6A,D), misschien als gevolg van verontreiniging. Daarom moet tijdens het schilproces worden gezorgd voor een nauwkeurige isolatie en om besmetting te minimaliseren. Ondanks minimale verontreiniging als gevolg van individuele fouten, leveren deze gegevens overtuigend bewijs dat de tape peeling-methodologie nauwkeurige sequentiële isolaties van staaffotoreceptorlagen voor eiwitanalyse kan opleveren.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de stappen voor het pellen van levende cellen. (A) Diagram toont de belangrijkste stappen voor het ontleden en omhullen van het geïsoleerde oog. (B) De buitenste segmenten van de fotoreceptor worden stapsgewijs verwijderd door sequentieel pellen met behulp van filterpapier. Ten eerste zijn netvliezen zo georiënteerd dat de fotoreceptorlaag in contact staat met het filterpapier. Vervolgens wordt het filterpapier gedroogd door op een papieren handdoek te deppen en wordt het netvlies van het filterpapier afgepeld. Dit geschilde isolaat wordt verzameld in een buis die op ijs wordt bewaard. Dit proces wordt zeven tot acht keer herhaald om het staafbuitenste segment (+ROS) volledig te verwijderen. Deze figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Lyofilized retina peeling process. (A) Flow diagram van de monstervoorbereiding voor het gelyofiliseerde netvlies. Netvliezen zijn zo georiënteerd dat de retinale ganglioncellaag in contact staat met het filterpapier en de fotoreceptoren naar boven gericht zijn. (B) Na lyofilisatie wordt het gevriesdroogde netvlies op een stuk tape geplakt na het toevoegen van lichte druk aan de bovenkant van de tape. De tape wordt afgepeld, waarbij de lagen staafbuitensegment (ROS) en staafbinnensegment (RIS) worden verwijderd. De RIS-laag wordt verwijderd door meer tape-peelings totdat de ROS-laag zichtbaar is (oranje/roze laag). Deze figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Expressie van GNAT1 en ARR1 in geïsoleerde staaffotoreceptoren na sequentiële filterpapierschillen. (A) Immunoblots van +ROS- en -ROS-(ROS-uitgeputte) monsters verzameld met de filterpapierafpelmethode verkregen uit donker- en lichtgecorrigeerd netvlies. Vlekken werden onderzocht met antilichamen voor lichtgeactiveerde eiwitten (transducine (GNAT1) en arrestine (ARR1)) en kwaliteitscontrolemarkers (GTPase activerend eiwit (Gß5L / S), cytochroom C (Cyt C) en actine). Twee gehalveerde retinae werden gecombineerd voor deze representatieve vlekken. (B) Gekwantificeerde signalen van GNAT1 en ARR1 van donker- en lichtgecorrigeerd netvlies. Er is een wederzijdse licht-geactiveerde beweging van GNAT1 en ARR van +ROS en -ROS isolaten. Vioolplots tonen de genormaliseerde expressie van +ROS- en -ROS-samples. Dit cijfer is aangepast van Rose et al.36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Scanning elektronenmicroscoop beelden van gelyofiliseerd netvlies. (A) Oppervlak van gelyofiliseerd netvlies vóór het afbladderen van tape (fotoreceptorzijde naar boven). (B) De binnenste segmentlaag na het afbladderen van tape. (C) De cellichaamlaag na het afbladderen van tape vertoont een uniform nucleair uiterlijk. Deze figuur is aangepast van Rose et al.36 en is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Validatie van de tape peeling methode om ROS en RIS te isoleren van gelyofiliseerd netvlies. (A) Western blots van +ROS, +RIS en -OIS (ROS/RIS-depleted) monsters verzameld door de tape peeling methode. Immunoblots werden onderzocht met transducine (GNAT1), arrestine (ARR1), GTPase activerend eiwit (Gß5L/S), cytochroom C (Cyt C) en actine-antilichamen. Monsters werden verkregen van donker- en lichtgecorrigeerde retinale en gehalveerde retinale isolaten (+ROS, +RIS, -OIS) werden gecombineerd voor meer geconcentreerd materiaal. (B) Gekwantificeerde signalen van GNAT1 en ARR1 worden uitgezet als vioolplots voor de verschillende geïsoleerde retinale lagen, die werden verkregen uit donker- en lichtgecorrigeerd netvlies. (C) Genormaliseerde expressieniveaus van +RIS en -OIS werden gecombineerd en uitgezet om tape- en filterpapierpelmethoden te vergelijken. Donkere en licht-aangepaste monsters vertoonden de bekende beweging van belangrijke fototransductie-eiwitten. Dit cijfer is aangepast van Rose et al.36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Tape peeling van gelyofiliseerd netvlies om de subcellulaire lokalisatie van GRK1 en PKCα in fotoreceptoren te onderzoeken. (A) Een representatieve western blot van geschilde monsters van lichtgezuiverde C57BL/6J-muizen die de relatieve niveaus van rhodopsinekinase (GRK1), eiwitkinase C-alfa (PKCα), GTPase-activerend eiwit (Gß5L/S) en actine aantonen. (B) Bevroren retinale sectie bereid uit aan licht blootgestelde muizen geïncubeerd met PKCα-antilichaam (groen, 1:100). RPE, retinaal gepigmenteerd epitheel; OS, buitenste segment; IS, binnenste segment; CB, cellichaam; ST, synaptische terminal. Schaalbalk = 10 μm. (C) PKCα en GRK1 genormaliseerde expressieniveaus voor +ROS, +RIS, -OIS samples worden uitgezet als vioolplots. (D) Suboptimale tapepeeling kan mogelijk licht verontreinigde monsters opleveren. Het rode vierkant markeert het +RIS-monster dat besmet is met een aantal -OIS-monsters, waardoor zowel Gß5L/S-banden als een hoger PKCα-signaal worden geproduceerd. Twee gehalveerde retinae werden gecombineerd voor alle vlekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Doel Antistof Verdunning Fabrikant
Arrestin Konijn anti-ARR1 1:1000 Chen, et al., 2006.
Transducine Muis anti-GNAT (TF-15) 1:1000 CytoSignal.
ß Actin Konijn anti-ß Actin 1:5000 GeneTex Inc
Cytochroom C Konijn anti-cytochroom C 1:500 Santa Cruz, sc-7159.
GAP (Gß5L/S) Konijn anti-Gß5L/S (CT2-15) 1:2000 Watson, et al., 1996.
Proteïne kinase C alfa (PKC) Konijn anti-PKC (#2050) 1:1000 Cell Signaling Technologie.
Rhodopsine Kinase (GRK1) Muis anti-GRK1 (G-8) 1:200 Santa Cruz, sc-8004.

Tabel 1: Lijst van antilichamen die worden gebruikt voor western blot validatie van scheidingstechnieken.

Filterpapier retinale isolatie
+ROS* -ROS* Heel Retina
Gemiddelde eiwitconcentratie (μg/ml) 700 1,500 1,500
RIPA-buffervolume (μL) 90 150 200
Tape peeling retinale isolatie
+ROS* +RIS* -ROS* Heel Retina
Gemiddelde eiwitconcentratie (μg/ml) 520 440 1,200 1,600
RIPA-buffervolume (μL) 100 100 125 150
* Gecombineerd twee gehalveerde retinale isolaties.

Tabel 2: Eiwitconcentratie in retinale isolatiehomogenaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Veel retinale ziekten beïnvloeden staaffotoreceptorcellen, wat leidt tot staafdood en uiteindelijk volledig verlies van het gezichtsvermogen37. Een aanzienlijk deel van de genetische en mechanistische oorsprong van menselijke retinale degeneratie is in de loop der jaren met succes samengevat in tal van muismodellen. In die context zou het vermogen om gemakkelijk en selectief individuele staafsubcellulaire compartimenten van het kleine muizennet te scheiden ons begrip van de gelokaliseerde biochemische en moleculaire onderbouwing van retinale ziekten aanzienlijk verbeteren. Bovendien maakt de gelaagde aard van het neurale netvlies, gecombineerd met de unieke, sterk gepolariseerde opstelling van staaffotoreceptoren, de isolatie van staafcompartimenten mogelijk door selectieve peeling. Dit manuscript beschrijft twee protocollen die worden gebruikt om individuele subcellulaire compartimenten van staaffotoreceptorcellen te isoleren voor immunoblotting. Niet alleen zijn beide methoden aanzienlijk sneller en minder technisch uitdagend in vergelijking met de bestaande methode van tangentiële sectie9, maar ze vereisen ook een aanzienlijk kleinere steekproefomvang dan de gebruikelijke biochemische isolatie van de ROS met behulp van dichtheidsgradiënten19. Dergelijke ROS gradiëntzuiveringstechnieken vereisen 8-10 murine retinae om betrouwbaar voldoende ROS te herstellen, terwijl de hier gepresenteerde protocollen geschikt zijn voor enkele retinae.

Ondanks de algehele eenvoud van de voorgestelde technieken, is een van de belangrijkste uitdagingen die beide protocollen gemeen hebben, het afvlakken van het gebogen netvlies op het filterpapier dat nodig is voor een goede isolatie van de verschillende subcellulaire compartimenten. Het geïsoleerde netvlies heeft de neiging om op te krullen en een clam-achtige vorm aan te nemen. Als het netvlies gevouwen randen heeft wanneer het op het filterpapier wordt geplaatst (fotoreceptorzijde omhoog of omlaag), kan dit de opbrengst van de gewenste geïsoleerde staaflagen verminderen. Wat nog belangrijker is, als het netvlies niet goed is afgeplat, is laagafwijking en besmetting van andere subcellulaire compartimenten en retinale cellen een waarschijnlijke uitkomst (figuur 6D). Om de kromming van de gehalveerde retinale rechthoek te beperken en de onvolmaakte uitlijning van de staaf- en netvlieslagen te corrigeren, kan de retinale rechthoek in tweeën worden gesneden om twee retinale vierkanten te produceren. Door het neurale netvlies in kleinere stukjes te snijden, wordt de natuurlijke kromming van het netvlies verminderd en ligt het weefsel eerder plat op het filterpapier.

Herkennen wanneer de verschillende staafcompartimenten fysiek gescheiden zijn, kan lastig zijn voor iemand die onervaren is met deze technieken. We adviseren dat voordat een biologisch significant experiment wordt gestart, de gebruiker het proces met monster retinae gedurende een uur of twee moet doorlopen. De praktijk moet leiden tot een aanzienlijke verbetering van de vaardigheden van de operator en de vaardigheid in de methoden. Bij het gebruik van filterpapier om de ROS van een levend netvlies af te pellen, geven geen duidelijke visuele aanwijzingen aan wanneer de ROS-laag is geïsoleerd. Terwijl het netvlies dunner en kwetsbaarder wordt, moet de gebruiker het aantal peelings zelf controleren en valideren om de ROS nauwkeurig te isoleren. Bovendien zal het gebruik van filterpapier met verschillende vezeldiktes en grofheid de ROS-schiltijd veranderen. Filterpapier met dikkere vezels (zoals VWR Grade 413) zal retinale lagen sneller isoleren (6-8 peelings), maar is mogelijk niet zo selectief en kan leiden tot besmetting van andere lagen. Filterpapier met dunnere vezels (zoals Whatman Grade 1) zal retinale lagen langzamer isoleren (12-15 peelings) en zal een schone isolatie van de fotoreceptorlagen geven. We raden aan om zowel dikker als dunner filterpapier te gebruiken om de schiltijd te minimaliseren en de zuiverheid van de verzameling te garanderen.

Tegelijkertijd zijn visuele benadering en verwerking van tapemonsters beide de sleutel tot het succes van het isoleren van de subcellulaire compartimenten van het gelyofiliseerde netvlies. Als er te veel druk op de tape wordt toegevoegd, zal het hele gelyofiliseerde netvlies zich aan de tape hechten. Zodra dit gebeurt, wordt het scheiden van de ROS langer en moeilijker, maar niet onmogelijk: plaats een tweede stuk tape op het vrije oppervlak (aan de ganglioncelzijde) van het netvlies en trek de lagen langzaam weg met tape totdat alleen de oranje / roze laag zichtbaar is op het eerste stuk tape. Het isoleren van de RIS op dit punt is echter onmogelijk. Als er te weinig druk op de tape wordt uitgeoefend, zal een groot deel van de ROS zich niet aan de tape hechten. Om een goede hechting van ROS-tape te garanderen, adviseren wij om voorzichtig met een pincet op de gebieden te drukken die niet aan de tape kleven. Meestal resulteert de geringste druk in het verwijderen van de ROS- en RIS-lagen, maar de hoeveelheid druk moet worden bepaald op basis van ervaring. De aanwezigheid van geïsoleerde RIS kan worden vastgesteld door te controleren of een dunne, witte laag (vergelijkbaar met een lichte afstoffen van sneeuw) zichtbaar is op de initiële ROS-tapeschil, terwijl de aanwezigheid van geïsoleerde ROS eenvoudig kan worden bepaald door de kleur van de staaffotoreceptorlaag (oranje voor donker-aangepast, rozeachtig voor licht-aangepast) op de tape te controleren.

Een laatste uitdaging doet zich voor bij het homogeniseren van de filterpapierschillen (+ROS) van het levende netvlies. Filtreerpapier absorbeert gemakkelijk vloeistof en een aanzienlijk deel van de homogeniserende buffer zal tijdens deze stap van het protocol worden opgenomen. Het draaien van de vloeistof in een minicentrifuge na het plaatsen van het schilpapier aan de zijkant van elke buis helpt het verlies van monster te voorkomen. Helaas kan het draaien van meerdere stukken filterpapier een tijdrovend proces zijn en is verlies van monster onvermijdelijk. Om dit probleem op te lossen, verwijdert u enkele stukjes filterpapier en richt u zich op het homogeniseren van minder stukken tegelijk. Om het verlies van monster tijdens deze stap te voorkomen, kunt u bovendien overwegen om de totale hoeveelheid filterpapier die wordt gebruikt om de ROS te isoleren, te minimaliseren.

Hoewel beide methoden geen grote steekproefgrootte vereisen, of de precieze uitlijning van een mes om het netvlies te snijden, zijn er een paar beperkingen aan onze fotoreceptor peelingtechnieken die het vermelden waard zijn. Ten eerste is het gelyofiliseerde murine netvlies mogelijk niet vatbaar voor het afpellen van volgende fotoreceptorlagen buiten de ROS en RIS. Ten tweede zijn onze peelingmethoden meer geschikt voor het verwerken van individuele retinae en zijn ze niet vatbaar voor grote batchverwerking in één keer. Ten derde is het succes van het experiment afhankelijk van de gevoeligheidslimiet van het antilichaam dat in de western blot wordt gebruikt. Ondanks deze beperkingen tonen onze representatieve resultaten aan dat onze twee isolatie peelingtechnieken specifieke staaffotoreceptorcompartimenten efficiënt kunnen isoleren. Bovendien gebruiken deze twee methoden goedkope en alledaagse laboratoriummaterialen (filterpapier en plakband), waardoor ze zeer toegankelijk zijn. In onze studie hebben we niet direct beoordeeld of andere retinale cellen konden worden geïsoleerd voor immunoblotting; wij zijn echter van mening dat deze methoden gemakkelijk kunnen worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van een brede dwarsdoorsnede van de retinale onderzoeksgemeenschap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY12155, EY027193 en EY027387 aan JC. We zijn Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) en Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) dankbaar voor het proeflezen van het manuscript. We willen ook Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, VS) en Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, VS) bedanken voor het leveren van de benodigde apparatuur om de door de auteur verstrekte beelden te verzamelen. Materiaal van: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, published [2017], [Springer Nature].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell'Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don't). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. Neuroscience. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 178
Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two… More

Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter