Summary
与文献相比，本协议描述了一种改进的ADSC分离方法，从而在时间增益下产生巨大的细胞产量。本研究还为长期冷冻保存后获得相对大量的活细胞提供了一种直接的方法。
Abstract
来源于脂肪组织的人间充质干细胞变得越来越有吸引力，因为它们显示出适当的特征，并且是再生临床应用的可及来源。不同的方案已被用于获得脂肪来源的干细胞。本文介绍了改进的节省时间方案的不同步骤，以获得更大量的ADSC，展示了如何冷冻保存和解冻ADSC以获得用于培养扩增的活细胞。使用26厘米三孔和3毫米口径的注射器吸脂术，从随后接受择期腹部成形术的9名患者的腹部收集100毫升脂吸物。干细胞分离是通过补充钙的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）溶液和使用胶原酶进行一系列洗涤进行的。基质血管部分（SVF）细胞被冷冻保存，并通过免疫表型检查其活力。SVF 细胞产量为 15.7 x 105 个细胞/mL，范围在 6.1-26.2 个细胞/mL 之间。贴壁SVF细胞在平均7.5（±4.5）天后达到汇合，平均细胞产量为12.3（±5.7）x 105 个细胞/mL。解冻的SVF在8个月、1年和2年后的存活率在23.06%-72.34%之间，平均为47.7%（±24.64），最低的存活率与两年冻结病例相关。使用补充钙和袋休息时间的DPBS溶液进行脂肪沉淀，胶原酶消化时间更短，从而提高干细胞最终细胞产量。获得高产量活干细胞的详细程序在时间和细胞产量方面比以前研究的技术更有效。即使经过长时间的冷冻保存，在SVF中也发现了活的ADSC细胞。
Introduction
人间充质干细胞在基础和应用研究中都是有利的。与使用胚胎或其他细胞相比，这种成体细胞类型的使用超越了伦理问题，是自体组织再生工程和细胞治疗1中最有前途的研究领域之一，例如肿瘤区域，退行性疾病的治疗以及重建手术领域的治疗应用2，3，4，5.先前已有报道，脂肪组织6，7的基质血管细胞部分中存在丰富的间充质多能和多能干细胞来源。这些ADSC被认为是用于细胞治疗和移植/输注的绝佳候选者，因为可以通过微创手术轻松获得大量具有强大体外扩增能力的细胞5，8。
还表明，脂肪组织比其他两种来源（骨髓和脐带组织）具有更大的间充质干细胞提供能力9。除了免疫原性差且具有整合到宿主组织中并与周围组织相互作用的高能力4，10外，ADSC还具有多能分化为细胞系的能力，据报道在适当的培养条件下进行软骨，成骨和成骨分化，并进入细胞，例如胰腺，肝细胞， 和神经源性细胞14，15，16。
科学界一致认为，间充质干细胞的免疫调节作用是细胞治疗17，18，19比其分化特性更相关的作用机制。ADSC使用的最显着优点之一是自体输注或移植的可能性，成为几种疾病的替代疗法。对于再生医学，ADSC已被用于肝损伤，心肌重建，神经组织再生，骨骼肌功能改善，骨再生，癌症治疗和糖尿病治疗20，21。
迄今为止，已有263项注册临床试验用于评估ADSC的潜力，列在美国国立卫生研究院的网站上22。已经建立了不同的收获脂肪组织的方案，但文献中尚未就分离ADSC用于临床的标准化方法达成共识23，24。手术期间和手术后的脂抽吸处理方法可直接影响细胞活力、最终细胞产量25和ADSC群体的质量20。关于手术预处理，尚不明确哪种手术预处理技术在分离后产生更显着数量的活细胞，或者注射到脂肪组织中的麻醉液是否影响细胞产量及其功能26。同样，获得脂肪细胞的技术之间的差异可能导致活ADSC 20的数量减少多达70%。根据文献，应避免机械处理以获得具有高活力的细胞群 - 包括超声波 - 因为它们可以分解脂肪组织20。然而，使用注射器的手动脂肪抽吸方法危害较小，导致细胞破坏较少，肿胀吸脂产生大量质量最好的细胞26。
该技术使用含有利多卡因和肾上腺素的盐水溶液，将其注射到吸脂区域。每注射 3 mL 体积的溶液，吸入 1 mL。在这项研究中，进行了湿式吸脂技术，其中每注射1mL肾上腺素和盐水溶液，吸入0.2mL脂肪组织。消化酶的使用，特别是胶原酶，在分离ADSC的过程中很常见。
在实验室的第一个分离步骤之后，最终的沉淀称为基质血管部分（SVF）。它包含不同的细胞类型27，包括内皮前体细胞，内皮细胞，巨噬细胞，平滑肌细胞，淋巴细胞，周细胞，前脂肪细胞和ADSC，它们能够粘附。一旦从 体外 培养物中完成最终分离，在培养基交换中消除未粘附在塑料上的细胞。经过八周的扩增、培养基变化和传代，ADSCs代表了烧瓶20中的大部分细胞群。使用分离的脂肪来源的干细胞进行可能的未来治疗的最显着优势之一是冷冻保存的可能性。结果表明，即使在冷冻6周后，冷冻保存的脂质抽吸物也是SVF细胞的潜在来源28，即使在冷冻保存2年后仍具有生物活性29，并且在培养物中完全具有生长和分化的能力30。然而，在解冻过程中，通常损失相当大比例的细胞31。因此，脂吸物去除过程和以下细胞分离方法必须确保最高的细胞产量。
这项研究描述了一种收集和分离ADSC的更快方法，证明了高细胞产量和活力，以提高细胞治疗的效率。此外，还评估了这种改进技术在长期SVF冷冻保存后的效果。
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Protocol
本研究由UNIFESP伦理委员会批准（协议号：0029/2015 CAAE：40846215.0.0000.5505），根据赫尔辛基宣言（2004）获得患者的书面知情同意后进行。本研究的样本由9名女性患者组成，年龄在33-50岁（平均年龄41.5岁），平均初始体重指数（BMI）为24.54（范围在22.32-26.77之间）（表1），她们在圣保罗联邦大学整形外科部（UNIFESP）因怀孕后皮肤过多而接受了美容腹部整形术， 巴西。为了减少偏倚，考虑性别、年龄和BMI将患者选为同质组。本研究期间使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。
1.脂抽吸物的收集
注意：此步骤需要在手术中心进行。
- 使用4%葡萄糖酸氯己定（见 材料表）进行皮肤准备和无菌。
- 进行2毫米皮下皮肤切口（真皮下和蚜膜之间）。插入 26 mm 3 G 三孔和 3 mm 口径的 Klein 插管和注射器，以在脐下区域注入总体积为 500 mL 的肾上腺素溶液 （1 mg/mL）（参见 材料表）用盐水 （1：1，000，000） 稀释。
- 将 60 mL 注射器连接到 26 mm 3 G 三孔和 3 mm 口径吸脂插管，并将其插入皮肤切口，锁定柱塞以产生真空。
- 进行推拉运动，以便在产生真空的情况下，脂抽吸物保留在 60 mL 注射器中。
- 使用带阀门的无菌连接器，将收集的100 mL脂抽吸物转移到150 mL聚氯乙烯转移袋中（参见 材料表）。
- 在室温（~25°C）下将转移袋包装在聚苯乙烯盒中，并立即将其带到实验室。开始组织处理的时间不要超过30分钟。
2. 脂抽吸物的加工
注意：此步骤将在实验室中执行。
- 首先，称量袋子，用数字非接触式红外临床温度计测量温度，然后将袋子在层流室内静置5分钟，以沉淀油腻层（气泡）和组织分离含有感兴趣的细胞。
- 进行一系列纸巾清洗。第一次洗涤：将 100 mL 含钙 （1x） 的 DPBS 注入转移袋中，并用手混合。
- 静置5分钟，除去沉淀的大部分基础液体。
- 用连接到袋适配器的 60 mL 注射器丢弃基础液体。此过程必须重复两次。
- 向袋中加入100mL消化溶液（93mL无钙DPBS + 60μL氯化钙（1g / L）+ 7mL0.075%无菌胶原酶，参见 材料表），并在37°C下缓慢搅拌30分钟。
- 将所有袋子的内容物转移到四个50mL的锥形管中，并在22°C下以400× g 离心10分钟。
- 取出并弃去上清液，向细胞沉淀中加入 5 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 低血糖，并补充有 20% FBS（胎牛血清）（图 1）。
3. SVF 细胞计数
- 将 10 μL 台盼蓝的新鲜溶液在蒸馏水中以 0.05% 与 10 μL 细胞悬浮液混合 5 分钟。
- 使用倒置光学显微镜（参见材料表）在Neubauer细胞计数室32中以20倍放大倍率计数活细胞。
- 将细胞沉淀重悬于冷冻保护培养基（5 mL FBS + 10% 二甲基亚砜 - DMSO）中，浓度为 1 x 106 个细胞/mL。
- 将 1 mL 的这种混合物放入冷冻管中。使用冷却速率为（1°C / min至-80°C）的冷冻容器（见 材料表）。
- 在-80°C下储存1年。
- 在此之后，储存在浸入液氮气相（-165°C）中的标准盒中。
4. 细胞的解冻过程
- 从液氮中取出小瓶，并立即将其置于37°C水浴中1分钟。
- 将SVF细胞置于锥形管中，其中4mL DMEM（补充有20%FBS的低葡萄糖）在37°C下预热。
- 在22°C下以400× g 离心5分钟。
- 取出上清液并加入 1 mL DMEM（低葡萄糖）+ 10% FBS。按照以下步骤进行免疫表型分析。
5. 流式细胞术技术（免疫表型多重标记）
- 将 1 mL 细胞沉淀（浓度为 1，000 个细胞/μL）放入五个细胞术管（每个 200 μL）中。
- 在22°C下以400× g 离心5分钟，并用移液管弃去上清液。
- 加入 300 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （10x），在 22 °C 下以 400 x g 离心，并用移液管弃去上清液。
- 为不同的标记物组合准备五个试管，如下所示：5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45;5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45;20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45;细胞活力测定-5μL荧光活性染料。（见 材料表）和具有未染色细胞和PBS的管作为阴性对照。在涡旋中匀浆并在4°C下孵育30分钟。
- 在22°C下以400× g 离心5分钟，用移液管弃去上清液，加入500μLPBS（10x），然后进行细胞分选。
注意：流式细胞仪中每个抗体组采集五千个事件，有四种颜色和五个参数，并使用CellQuest软件进行分析。
- 在22°C下以400× g 离心5分钟，用移液管弃去上清液，加入500μLPBS（10x），然后进行细胞分选。
6. 第1通道的播种（P1）
- 在75cm 2培养瓶中接种2 x 105个细胞。
- 加入 12 mL DMEM 低葡萄糖 + 20% FBS + 10% 抗生素/抗真菌药（每毫升 0.1 μm 含 10，000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 μg 两性霉素 B）。
- 当细胞达到80%-90%汇合时，用2mL的0.25%EDTA-胰蛋白酶对贴壁细胞进行胰蛋白酶消化3分钟。
- 再次计数单元格（如步骤 3 中所述）。
- 再次进行免疫分型分析（如步骤5中所述）。
7. 统计分析
- 使用 Spearman 的 Rho 计算器33 测量以下变量与 P < 0.05 之间的关联强度，如下所述。
- 选择 SVF 细胞产量和 SVF 在第一次传代 （P1） 中保持培养的天数，直到 80%-90% 汇合（至 P1 的天数）。
- 在进入P1之前和之后选择SVF细胞产量。
- 在进入 P1 之前，请考虑几天到 P1 和细胞产量。
- 选择具有已确认ADSC平均百分比的SVF细胞产量。
- 在进入P1之前计算已确认的ADSC的百分比和细胞产量。
- 确定 BMI 和 SVF 细胞产量。
8. 分化试验
- 按照分化试剂盒方案进行分化测定（见 材料表）。 图 4 演示了案例 1 的结果。
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Representative Results
所研究的九个人的特征，包括他们的年龄、体重、身高和BMI，如 表1所示。
根据最初提出的细胞产量，计算在培养物中接种的细胞体积尽可能接近75cm2 培养瓶的容量。 表2描述了每种情况下接种的样品体积。然后，根据初始细胞产量，确定每个样品的细胞体积可变：细胞产量较高的样品为1 mL，细胞产量中等的样品为1.1 mL，细胞产量较低的样品为2 mL，以便在病例之间进行更相似的细胞接种。当培养物达到约80%-90%汇合（图2A）（约7.5±4.5天）时，进行贴壁细胞的胰蛋白酶消化（表2 和 图2B）。
即使观察到胰蛋白酶消化前的相同汇合，传代1代前的细胞产量也有很大差异（表2）。这可以通过细胞可能分层生长的事实来解释。在不同时期还评估了患者ADSC的不同参数，如 表2所示。
由于细菌污染和缺乏可用细胞进行冷冻保存的SVF免疫表型，无法评估一些样本（病例1，病例2，病例7）的确诊ADSC百分比和培养物中ADSC的估计数量。根据 Spearman's Rho 计算器 33，SVF 细胞产量与 P1 天数 （r = 0.37816， p = 0.31561）、进入 P1 之前和之后的 SVF 细胞产量之间没有统计学差异 （r = -0.33333， p = 0.38071），以及到 P1 的天数与进入 P1 之前的细胞产量之间没有统计学差异 （r = -0.53783， p = 0.13529）。此外，当将SVF细胞产量与确认ADSC的平均百分比（r = -0.02857，p = 0.95716）以及确认ADSC的平均百分比与P1之前的细胞产量（r = 0.42857，p = 0.3965）相关联时，未观察到显着差异 。此外，BMI和SVF细胞产量之间的相关性不能被认为具有统计学意义（r = -0.46667，p = 0.20539）。表3显示了对冷冻保存的SVF细胞进行的流式细胞术数据。最初的SVF细胞含有造血标志物（CD45，CD11b，CD19，HLA-DR）的阳性细胞亚群34。从最初的SVF细胞群中，一个特定的亚组表达CD11b 34和CD1934基质细胞相关标志物。CD73 34、CD90 34和CD10534的水平介于这些值之间。初始SVF包含干细胞相关标志物阳性的细胞亚群（图3）。平均79%的SVF表达HSC相关标志物CD3434。
总共需要21分钟进行三次洗涤，30分钟用于胶原酶消化，10分钟用于离心，5分钟用于细胞计数和铺板。
图1：方案脂肪来源干细胞分离的步骤 。 （A） 在封闭系统中运输吸脂物的袋子。（B）将休息袋的步骤重复三次，洗涤后。（C）用DPBS洗涤三次后吸脂。（D）胶原酶消化后的脂吸物。（E）消化后的脂吸物分布在50mL管中。（F）离心后消化的脂质抽吸物。（G）与基质血管部分（SVF）的沉淀进行最终过程隔离。 请点击此处查看此图的大图。
图2：ADSC的形态和活力 。 （A）在光学显微镜下分离后第一次传代的塑料贴壁间充质脂肪来源干细胞。细胞显示出对塑料和成纤维细胞样形态的粘附。（B）台盼蓝测定显示使用光学显微镜在Neubauer室中计数的活细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：冷冻保存 8 个月后，病例 9 中 SVF 中干细胞相关标志物呈阳性的细胞亚群。 R1：在FSC（前向散射）x SSC（侧向散射）中分析的总细胞区域（大小x复杂性）;R2：CD45阴性区域，其群体CD73，CD90和CD105在该区域中呈阳性。 请点击此处查看此图的大图。
图4：分化测定 。 （A）软骨细胞中的ADSC分化。（B）骨细胞中的ADSC分化。（C）脂肪细胞中的ADSC分化。 请点击此处查看此图的大图。
| 病人 | 领取年龄（岁） | 重量（公斤） | 高度（米） | 体重指数* |
| 案例1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| 案例2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| 案例3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| 案例4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| 案例5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| 案例6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| 案例7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| 案例8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| 案例9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
表1：来自所研究个体样本的数据。 *BMI：体重指数。
| 病人 | 收集体积（毫升） | 储值支付工具细胞检出率（细胞/毫升） （x 105） | 培养体积（毫升） | 确诊ADSC的平均百分比（%） | 初始培养中的细胞数（x 105） | 培养物中ADSC的估计数量（x 105） | 到 P1 的天数 | 进入P1之前的细胞产量（x 105） |
| 案例1 | 96 | 9.2 | 2 | 那 | 18.4 | 那 | 10 | 18 |
| 案例2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| 案例3 | 100 | 26.2 | 1 | 那 | 26.2 | 那 | 12 | 6.6 |
| 案例4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| 案例5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| 案例6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| 案例7 | 98 | 6.8 | 2 | 那 | 13.6 | 那 | 8 | 10.5 |
| 案例8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| 案例9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| 标清 | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
表2：来自分析的九名患者的不同手术步骤的数据。 SVF：基质血管部分;ADSC：脂肪来源的干细胞;P1：通道1;NA：数据不可用。
| 样本 | 由单克隆抗体测定的ADSC百分比 | 由单克隆抗体测定的造血细胞百分比 | 细胞活力测定和SVF冷冻保存时间 | |||||||||
| CD45-（*） | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | 意味 着 | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | 生/死 + | |||
| 案例2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39.54% （2年） | ||
| 案例4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38.30% （2年） | ||
| 案例5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23.06% （2年） | ||
| 案例6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56.76% （2年） | ||
| 案例8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55.56% （1年） | ||
| 案例9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34% （8个月） | ||
表3：来自六名患者的流式细胞术数据。 (*)从这些CD45-细胞中，测定具有不同干细胞标志物组合的ADSC的百分比。ADSC：脂肪来源的干细胞;SVF：基质血管部分;(*)从这些CD45-细胞中，测定具有不同干细胞标志物组合的ADSC的百分比。
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Discussion
分离产量
众所周知，细胞治疗中经常需要的冷冻保存过程会导致显着的细胞损失，有时大于50%29，30，35。因此，在分离中获得高初始细胞产量的技术改进至关重要。脂抽吸物的收集方法和细胞的分离方法必须侧重于保存更多数量的细胞，保持高活力，并从初始材料中提取最大数量的细胞，同时考虑细胞的长期培养和操作。因此，需要直接维持培养，以使细胞远离细胞凋亡、衰老或遗传不稳定，因为细胞疗法可能对患者有效且安全。
据我们所知，之前没有文章使用这组步骤来分离来自脂质抽吸物的间充质干细胞，这是一种节省时间和成本效益的技术。在这项研究中，每个方法步骤都根据文献进行推理，这些文献显示细胞分离的最终细胞产量最高。本研究中执行的技术的新颖之处在于使用与一系列脂吸物洗涤相关的手动抽吸，随后的袋子休息。用于运输和处理脂抽吸物的收集袋允许未消化的组织碎片不参与胶原酶消化。最关键的一步是将氯化钙添加到新鲜消化溶液中，因为它可以增强胶原酶的作用。文献中尚未报道细胞解冻方法的时间增益，该方法即使在较长的冷冻保存时间后也能允许活细胞。本研究中发现的 SVF 细胞产量从 6.15 到 26.2 x 10 5 细胞/mL 不等，平均为 15.7 x 105 个细胞/mL。这可能是由于存在更大量的肾上腺素溶液，根据外科手术的阶段和SVF中通常发现的其他已知细胞类型的数量，该溶液可能更高或更低。尽管一些研究发现BMI和ADSC产量36，37之间存在负相关关系，但这项研究发现没有显着的相关性，就像其他两项研究38，39一样，降低了这是本研究中发现的SVF细胞产量令人难以置信的多样性的原因的可能性。这些数据表明，获得的最低SVF细胞产率为6.15 x 105个细胞/mL。一些研究已经根据获得脂抽吸物的手术技术测量了ADSC分离的效率。一项研究使用肾上腺素溶液（如本研究所用）在新鲜分离的SVF中获得了0.087 x 105个细胞/mL的吸脂技术，在没有肾上腺素溶液的情况下获得了0.143 x 105个细胞/mL26。这项工作强调了肾上腺素溶液注射的重要性，因为大多数外科医生选择在临床实践中进行的血管收缩作用可减少术中出血和瘀伤。另一项研究表明，分离的活ADSCs的范围为0至0.59 x 105个细胞/ g脂抽吸物，平均为0.295（±0.25）x 105个细胞/ g组织31。一些研究已经测试了实现更高ADSC产量的不同方法。其中一项研究实现了约350 x 105的方法，该方法在胶原酶消化缓冲液中呈现各种成分并使用轨道振荡器40。另一项研究显示，腹部 SVF 细胞总数为 29.7 （±0.2） x 105 个细胞/mL41。本研究中选择的腹部区域仍然是脂吸物42的最佳可用性和可及性的参考区域。脂质抽吸物收集的身体区域，除供体年龄和所选收集方法等因素外，是ADSC产量质量的重要决定因素。
微生物污染导致细胞无法继续实验的可能性是限制本研究完成的唯一执行问题。即使使用抗生素和良好生产规范要求，由于缺乏完全无菌环境来抽吸脂肪，也可能发生污染。
储值支付工具免疫分型
根据国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会34，定义人类间充质干细胞的三个最低标准之一是细胞必须表达CD105 34，CD73 34和CD90 34，并且不应表达CD45 34，CD34 34，CD14 34或CD11b 34，CD79a 34或CD19 34， 和 HLA-DR34 表面膜分子。Mitchell43通过免疫表型测试了新鲜的SVF细胞，发现最多54%的细胞具有ADSC表面标志物。在这项研究中，免疫表型显示长期冷冻保存后SVF中确诊的ADSC（非造血细胞）比例更高，高达78.91%（范围为37.95%-78.91%，平均值为53.68%）。有证据表明，尚未承诺的干细胞群的祖细胞不表达CD34标记34，44，45。根据分化阶段，CD3434阴性干细胞不仅可以产生造血祖细胞，还可以产生更特异性的间充质前体，例如破骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等。一些研究表明，原始干细胞群具有惊人的可塑性，该细胞群由具有基质细胞功能的细胞以及造血和间充质祖细胞组成45。根据文献，CD3434在SVF细胞组织形成中的完整功能作用仍然未知46。Mitchell43显示平均60%的SVF细胞表达CD34 34标志物，而在本研究中，平均值为78.81%。已知CD3434表面标志物的表达沿传代降低。
贴壁细胞和分化测定
根据分离后获得的细胞数量，接种在第一次培养物中的细胞数量各不相同。在75 cm2 烧瓶中达到80%-90%汇合的首次培养时间平均需要8.4天，标准差为7.5（±4.5）天，范围为6.6至16.1 x 105 个细胞/ mL。需要注意的是，即使对于细胞产量较低的病例，与文献相比，第一次培养时间也导致了高细胞产量指数，这可能是由于在整个收集和分离过程中保持了最佳活性细胞的可用性。一项研究在 4.1 （±±0.7） 天培养期内获得每毫升脂抽吸物 3.75 （1.42） x 105 ADSC 的细胞产量47.另一项研究表明，有核SVF细胞的产量为每毫米3.08（±1.40）x 105 ，在第一个培养期平均为6.0（±2.4）天43。在这项研究中，通过估计培养物中接种的ADSC数量，其随SVF中观察到的细胞数量而变化，来自收集相同体积的100mL脂抽吸物，验证达到P1的天数与细胞体积无关。例如，对于病例9，其中孵育了12.2 x 105 个细胞，需要6天才能达到80%-90%的汇合率。对于病例6，其中14.6 x 105 个细胞接种在培养物中，需要更长的时间（10天）才能达到相同的汇合水平。也许，对于第一个粘附期，最低ADSC数就足够了。可能存在显著的个体间差异，例如合并症、年龄和一般健康状况。文献中的一些研究质疑考虑患者个体间变异性对SVF细胞产量48，49的重要性。
根据国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞委员会34，间充质细胞必须能够分化成三种不同的细胞类型，如成骨细胞、成脂细胞和成软骨细胞谱系，如图 4所示。
细胞活力、冷冻保存和遗传不稳定性
已经使用了不同的方法来确定活力损失，定义为质膜完整性损伤50。然而，培养物也可以呈现这些方法可以忽略的早期凋亡细胞，因为它们保持完整的质膜，但它们是不可存活的。这里报告的结果显示，活力标志物的范围很大，从23.06%-72.34%，长期冷冻保存后的平均比例为47.6%。考虑到冷冻保存是细胞治疗的重要一步，解冻后回收最大数量的活细胞和功能性干细胞是细胞治疗成功的优先问题之一。文献表明，冷冻保存后1-4个月至少有50%的细胞活力丧失43。值得注意的是，本研究中提出的最低指数来自案例5，案例4和案例2，它们是最古老的冷冻保存样本（约2年）。尽管它们的活力指数最低，但它们在新鲜SVF的台盼蓝染料排阻测定中显示出高细胞产量。尽管文献支持生存能力丧失的原因，但这些发生率低于预期。由于技术原因，细胞储存的温度波动会导致应力的增加和积累，并有利于水部分的积累，产生在长期冷冻保存过程中损坏等离子膜的晶体51。文献显示，具有相同或更长冷冻时间的样品的活性超过70%。然而，使用与本研究中不同的技术进行可行性检查52。另一项研究表明，较长时间的冷冻保存会对细胞活力产生负面影响31，这可以通过-80°C冰箱的温度变化来解释。因此，细胞通常需要在培养物中停留太久，这会增加细胞周期应激，带来遗传不稳定的风险，从而影响细胞治疗。文献中也有一个共识，指出一些应激因素以及它们如何影响细胞遗传学稳定性，这对于维持细胞治疗所需的长期干细胞培养至关重要35，53。
方法优势
迄今为止，文献显示没有标准化的方案来分离ADSC用于临床应用。大多数研究表明，方案复杂、耗时24。在这项研究中，必须强调该方法的效率与完成初始细胞产量所需的时间：约1.5小时。根据文献，分离脂肪来源的干细胞可能需要大约3小时至8小时54，55。因此，与高细胞收入相关的时间增益对于再生医学治疗的进步至关重要。应与这项工作中同时进行更多的细胞活力评估，以改进该方法。需要进一步的随机对照试验，并使用这种方法纳入更广泛的样本来对这些结果进行会签。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
我们感谢自愿参加的患者以及圣保罗医院的医疗和护理人员。这项研究得到了巴西圣保罗国家保护宪法权利保护基金会（FAPESP）和巴西国家发展科学和技术委员会（CNPq）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
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