Summary
Denne protokollen beskriver en forbedret metodikk for ADSC-isolasjon som resulterer i et enormt cellulært utbytte med tidsøkning sammenlignet med litteraturen. Denne studien gir også en enkel metode for å oppnå et relativt stort antall levedyktige celler etter langvarig kryopreservering.
Abstract
Humane mesenkymale stamceller avledet fra fettvev har blitt stadig mer attraktive ettersom de viser passende egenskaper og er en tilgjengelig kilde for regenerative kliniske anvendelser. Ulike protokoller har blitt brukt for å oppnå fettavledede stamceller. Denne artikkelen beskriver ulike trinn i en forbedret tidsbesparende protokoll for å oppnå en mer betydelig mengde ADSC, som viser hvordan du kryopreserverer og tiner ADSC for å oppnå levedyktige celler for kulturutvidelse. Ett hundre milliliter lipoaspirat ble samlet, ved hjelp av en 26 cm tre-hulls og 3 mm kaliber sprøyte fettsuging, fra bukområdet på ni pasienter som senere gjennomgikk elektiv bukplastikk. Stamcelleisolasjonen ble utført med en serie vasker med Dulbeccos fosfatbufrede saltoppløsning (DPBS) supplert med kalsium og bruk av kollagenase. Stromal vaskulær fraksjon (SVF) celler ble kryopreservert, og deres levedyktighet ble kontrollert ved immunfenotyping. SVF-celleutbyttet var 15,7 x 105 celler/ml, fra 6,1-26,2 celler/ml. Assosierte SVF-celler nådde sammenløp etter gjennomsnittlig 7,5 (±4,5) dager, med et gjennomsnittlig mobilutbytte på 12,3 (± 5,7) x 105 celler / ml. Levedyktigheten til tint SVF etter 8 måneder, 1 år og 2 år varierte mellom 23,06% -72,34% med et gjennomsnitt på 47,7% (±24,64) med den laveste levedyktigheten korrelert med tilfeller av toårig frysing. Bruken av DPBS-løsning supplert med kalsium- og posehviletider for fettutfelling med kortere tid med kollagenasefordøyelse resulterte i økt stamcelle endelig cellulært utbytte. Den detaljerte prosedyren for å oppnå høye utbytter av levedyktige stamceller var mer effektiv med hensyn til tid og cellulært utbytte enn teknikkene fra tidligere studier. Selv etter en lang periode med kryopreservering ble levedyktige ADSC-celler funnet i SVF.
Introduction
Humane mesenkymale stamceller er fordelaktige i både grunnleggende og anvendt forskning. Bruken av denne voksne celletypen overgår etiske problemer - sammenlignet med bruk av embryonale eller andre celler - som er et av de mest lovende studieområdene innen autolog vevregenereringsteknikk og celleterapi1, for eksempel det neoplastiske området, behandling av degenerative sykdommer og terapeutiske anvendelser i det rekonstruktive kirurgiområdet 2,3,4, 5. Det har tidligere blitt rapportert at det er en rikelig kilde til mesenkymale multipotente og pluripotente stamceller i stromal vaskulær cellefraksjon av fettvev 6,7. Disse ADSC anses som gode kandidater for bruk i celleterapi og transplantasjon / infusjon siden et betydelig antall celler med sterk kapasitet for ekspansjon ex vivo lett kan oppnås med høyt utbytte fra en minimal invasiv prosedyre 5,8.
Det ble også vist at fettvev har større kapasitet til å gi mesenkymale stamceller enn to andre kilder (benmarg og navlestrengsvev)9. Foruten å være dårlig immunogen og ha høy evne til å integrere seg i vertsvevet og samhandle med det omkringliggende vevet4,10, har ADSC en multipotent kapasitet til differensiering i cellelinjer, med rapporter om kondrogen, osteogen og myogen differensiering under passende kulturforhold11,12,13, og inn i celler, som bukspyttkjertel, hepatocytter, og nevrogene celler14,15,16.
Det vitenskapelige samfunnet er enig i at de mesenkymale stamcellenes immunmodulerende effekt er en mer relevant virkningsmekanisme for celleterapi 17,18,19 enn deres differensieringsegenskap. En av de viktigste fordelene ved ADSC-bruken er muligheten for autolog infusjon eller podning, og blir en alternativ behandling for flere sykdommer. For regenerativ medisin har ADSC allerede blitt brukt i tilfeller av leverskade, rekonstruksjon av hjertemuskel, regenerering av nervesvev, forbedring av skjelettmuskulaturfunksjon, beinregenerering, kreftbehandling og diabetesbehandling20,21.
Til dags dato er det 263 registrerte kliniske studier for evaluering av ADSCs potensial, oppført på nettstedet til USAs National Institutes of Health22. Det er etablert ulike protokoller for høsting av fettvev, men det er ingen konsensus i litteraturen om en standardisert metode for å isolere ADSC for klinisk bruk23,24. Lipoaspiratbehandlingsmetoder under og etter operasjonen kan direkte påvirke cellens levedyktighet, det endelige mobilutbyttet25 og kvaliteten på ADSC-populasjonen20. Når det gjelder kirurgisk forbehandling, er det ikke godt etablert hvilken kirurgisk forbehandlingsteknikk som gir et mer signifikant antall levedyktige celler etter isolering, eller om bedøvelsesløsningen injisert i fettvev påvirker celleutbyttet og dets funksjoner26. På samme måte kan forskjellen mellom teknikker for å oppnå fettceller føre til så mye som en 70% reduksjon i antall levedyktige ADSC20. Ifølge litteraturen bør mekaniske behandlinger for å oppnå cellepopulasjoner med høy levedyktighet - inkludert ultralyd - unngås, for de kan bryte ned fettvevet20. Den manuelle fettaspirasjonsmetoden med sprøyter er imidlertid mindre skadelig, noe som forårsaker mindre celledestruksjon, med tumescent fettsuging som gir et betydelig antall celler med best kvalitet26.
Denne teknikken bruker en saltoppløsning med lidokain og epinefrin som injiseres i fettsugingsområdet. For hvert 3 ml volum oppløsning som injiseres, aspireres 1 ml. I denne studien ble den våte fettsugingsteknikken utført, hvor for hver 1 ml adrenalin og saltoppløsning injisert, aspireres 0,2 ml fettvev. Bruken av fordøyelsesenzymer, spesielt kollagenase, er vanlig for prosessen med å isolere ADSC.
Etter det første isolasjonstrinnet i laboratoriet kalles den endelige pelleten stromal vaskulær fraksjon (SVF). Den inneholder forskjellige celletyper27, inkludert endotelformede forløperceller, endotelceller, makrofager, glatte muskelceller, lymfocytter, pericytter, pre-adipocytter og ADSC, som er i stand til adhesjon. Når den endelige isoleringen er avsluttet fra in vitro-kulturer , elimineres celler som ikke festet seg til plasten i middels utveksling. Etter åtte uker med ekspansjon, middels endringer og passasjer, representerer ADSC-er det meste av cellepopulasjonen i kolber20. En av de viktigste fordelene ved å bruke isolerte fettavledede stamceller for en mulig fremtidig terapi er muligheten for kryopreservering. Det ble vist at kryopreservert lipoaspirat er en potensiell kilde til SVF-celler selv etter 6 ukers frysing28, med biologisk aktivitet selv etter 2 år med kryopreservering29, og full evne til å vokse og differensiere i kultur30. Under tiningsprosessen går imidlertid en betydelig prosentandel av cellene vanligvis tapt31. Derfor må lipoaspiratfjerningsprosessen og følgende metoder for celleisolasjon sikre det høyeste celleutbyttet.
Denne studien beskriver en raskere metodikk for innsamling og isolering av ADSC, som demonstrerer høyt cellulært utbytte og levedyktighet for bedre effektivitet av cellulære terapier. Videre ble effekten av denne forbedrede teknikken etter langvarig SVF-kryopreservering evaluert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien er godkjent av UNIFESPs etiske komité (protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), utført etter skriftlig informert samtykke fra pasientene i henhold til Helsinkideklarasjonen (2004). Utvalget av denne studien består av ni kvinnelige pasienter i alderen 33-50 år (gjennomsnittsalder 41,5) og gjennomsnittlig initial kroppsmasseindeks (BMI) på 24,54 (mellom 22,32-26,77) (tabell 1) som gjennomgikk estetisk bukplastikk på grunn av overskudd av hud etter graviditeter, ved Divisjon for plastikkirurgi ved Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brasil. For å redusere skjevheter ble pasientene valgt ut som en homogen gruppe med tanke på kjønn, alder og BMI. Datasettene som ble brukt og / eller analysert i løpet av denne studien, er tilgjengelige fra den tilsvarende forfatteren på rimelig forespørsel.
1. Innsamling av lipoaspirat
MERK: Dette trinnet må utføres i operasjonssenteret.
- Bruk 4% klorhexidinglukonat (se materialtabell) for hudforberedelse og asepsis.
- Utfør et 2 mm subkutant hudinnsnitt (mellom subdermis og aponeurose). Sett inn en Klein-kanyle på 26 mm 3 G trehulls og 3 mm kaliber og en sprøyte for å injisere et totalt volum på 500 ml av en adrenalinoppløsning (1 mg/ml) (se materialtabell) fortynnet i saltvann (1:1 000 000) i det infrastrukturelle området.
- Koble en 60 ml sprøyte til en 26 mm 3 G trehulls og 3 mm kaliber fettsugingskanyle og sett den inn gjennom hudsnittet, og lås stempelet for å skape et vakuum.
- Gjør skyve- og trekkbevegelser slik at lipoaspiratet, med vakuumet opprettet, forblir i 60 ml sprøyten.
- Bruk en steril kontakt med en ventil, overfør 100 ml av det oppsamlede lipoaspiratet til en 150 ml polyvinylkloridoverføringspose (se materialtabell).
- Pakk overføringsposen i en isoporboks ved romtemperatur (~25 °C) og ta den umiddelbart med til laboratoriet. Ikke ta lengre tid enn 30 minutter å starte vevsbehandlingen.
2. Behandling av lipoaspirat
MERK: Dette trinnet skal utføres i laboratoriet.
- Først veier du posen, måler temperaturen med et digitalt berøringsfritt infrarødt klinisk termometer, og lar posen hvile i 5 minutter inne i det laminære strømningskammeret for utfelling av de fetere lagene (boblene) og vevsseparasjonen som inneholder cellene av interesse.
- Utfør en serie vevsvasker. Første vask: injiser 100 ml DPBS med kalsium (1x) i overføringsposen og bland den med hendene.
- La det stå i 5 minutter og fjern det meste av basalvæsken som faller ut.
- Kast basalvæsken med en 60 ml sprøyte festet til poseadapteren. Denne prosessen må gjentas to ganger.
- Tilsett 100 ml fordøyelsesløsning i posen (93 ml kalsiumfri DPBS + 60 μL kalsiumklorid (1 g / L) + 7 ml 0,075% steril kollagenase, se materialtabell) og la stå ved 37 ° C i 30 minutter under langsom omrøring.
- Overfør alt innholdet i posen til fire koniske rør på 50 ml og sentrifuger dem ved 400 x g ved 22 °C i 10 minutter.
- Fjern og kast supernatanten og tilsett 5 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) lav glukose supplert med 20% FBS (Fetal bovine serum) til cellepelleten (figur 1).
3. Telling av SVF-cellene
- Bland en frisk løsning på 10 μL trypanblå ved 0,05% i destillert vann med 10 μL cellulær suspensjon i 5 minutter.
- Tell levedyktige celler i et Neubauer-celletellingskammer32 ved hjelp av et omvendt lysmikroskop (se materialtabell) ved 20x forstørrelse.
- Resuspend cellepelleten i et kryobeskyttende medium (5 ml FBS + 10% dimetylsulfoksid - DMSO) i en konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml.
- Plasser 1 ml av denne blandingen i kryovialer. Bruk en frysebeholder (se materialtabell) med en kjølehastighet på (1 °C/min til -80 °C).
- Oppbevares ved -80 °C i 1 år.
- Etter denne tiden, oppbevar i standard kassettbokser nedsenket i flytende nitrogendampfase (-165 ° C).
4. Tining av cellens prosess
- Fjern hetteglassene fra flytende nitrogen og legg dem umiddelbart i vannbadet på 37 °C i 1 min.
- Plasser SVF-cellene i et konisk rør med 4 ml DMEM (lav glukose supplert med 20% FBS) forvarmet ved 37 ° C.
- Sentrifuge ved 400 x g ved 22 °C i 5 min.
- Fjern supernatanten og tilsett 1 ml DMEM (lav glukose) + 10% FBS. Utfør immunfenotyping ved å følge trinnene nedenfor.
5. Flowcytometriteknikk (immunfenotype multiple labeling)
- Plasser 1 ml cellepellets (konsentrasjon på 1000 celler / μL) i fem cytometrirør (200 μL hver).
- Sentrifuge ved 400 x g ved 22 °C i 5 minutter og kast supernatanten med pipette.
- Tilsett 300 μL fosfatbufret saltvann (PBS) (10x), sentrifuge ved 400 x g ved 22 °C og kast supernatanten med en pipette.
- Forbered fem rør for forskjellige markørkombinasjoner som følger: 5 μL CD11B / 5 μL CD19 / 20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL av HLA-DR/20 μL av CD45; Cell levedyktighet analyse-5 μL av fluorescerende reaktivt fargestoff. (se Tabell over materialer) og et rør med ufargede celler og PBS som negativ kontroll. Homogeniser i en virvel og inkuber ved 4 °C i 30 minutter.
- Sentrifuge ved 400 x g ved 22 °C i 5 minutter, kast supernatanten med pipette, tilsett 500 μL PBS (10x) og fortsett med cellesortering.
MERK: Fem tusen hendelser er anskaffet per antistoffsett i Flow Cytometer av fire farger og fem parametere og analysert med CellQuest-programvare.
- Sentrifuge ved 400 x g ved 22 °C i 5 minutter, kast supernatanten med pipette, tilsett 500 μL PBS (10x) og fortsett med cellesortering.
6. Såing av passasje 1 (P1)
- Frø 2 x 105 celler i en 75 cm2 kulturkolbe.
- Tilsett 12 ml DMEM lav glukose + 20% FBS + 10% antibiotika / antimykotisk (med 10.000 enheter penicillin, 10 mg streptomycin og 25 μg amfotericin B per ml, 0,1 μm).
- Når cellene når mellom 80% -90% sammenløp, utfør trypsinisering av klebende celler med 2 ml 0,25% EDTA-trypsin i 3 minutter.
- Tell celler på nytt (som nevnt i trinn 3).
- Utfør immunfenotyping igjen (som nevnt i trinn 5).
7. Statistisk analyse
- Bruk Spearmans Rho Kalkulator33 for å måle styrken av assosiasjon mellom følgende variabler med P < 0,05, som nevnt nedenfor.
- Velg SVF-mobilutbytte og antall dager SVF forblir i kultur i første passasje (P1) til 80% -90% sammenløp (dager til P1).
- Velg SVF-mobilkapasitet før og etter å ha gått til P1.
- Vurder dager til P1 og mobilutbytte før du går til P1.
- Velg SVF-mobilutbytte med gjennomsnittlig prosentandel av bekreftet ADSC.
- Beregn prosentandelen av bekreftet ADSC og mobilutbyttet før du går til P1.
- Bestem BMI og SVF mobilutbytte.
8. Analyse av differensiering
- Utfør differensieringsanalysen etter en differensieringssettprotokoll (se Tabell over materialer). Figur 4 viser resultatene for sak 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakteriseringen av de ni undersøkte individene, inkludert alder, vekt, høyde og BMI, er vist i tabell 1.
I henhold til det cellulære utbyttet som opprinnelig ble presentert, ble cellevolumet inokulert i kultur beregnet til å være så nært som mulig til kapasiteten til 75 cm2 kulturkolben. Prøvevolumet som er sådd i hvert enkelt tilfelle er beskrevet i tabell 2. Deretter, i henhold til det opprinnelige cellulære utbyttet, ble et variabelt volum av celler for hver prøve bestemt: 1 ml for prøver med høyere cellulært utbytte, 1,1 ml for prøver med mellomliggende cellulært utbytte og 2 ml for prøver med lavere cellulært utbytte for å utføre mer lik cellesåing mellom tilfeller. Når kulturen nådde ca. 80% -90% sammenløp (figur 2A) (ca. 7,5 ± 4,5 dager), ble trypsinisering av adherenteceller utført (tabell 2 og figur 2B).
Celleutbyttet før passering 1 varierte bredt selv om man observerte samme samløp før trypsinisering (tab 2). Dette kan forklares med at celler kan ha vokst i lag. Ulike parametere fra pasientenes ADSC ble også vurdert i ulike perioder, som vist i tabell 2.
Noen prøver (sak 1, sak 2, sak 7) kunne ikke evalueres med hensyn til prosentandelen av bekreftet ADSC og estimert antall ADSC i kultur på grunn av bakteriekontaminering og mangel på tilgjengelige celler for å utføre kryopreservert SVF-immunfenotyping. Ifølge Spearmans Rho-kalkulator 33 ble det ikke funnet noen statistiske forskjeller mellom SVF-mobilutbytte og dager til P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), mellom SVF-mobilutbytte før og etter å ha gått til P1 (r = -0,33333, p = 0,38071), og mellom dager til P1 og cellulær avkastning før du går til P1 (r = -0,53783, p = 0,13529). Videre ble det ikke observert signifikante forskjeller ved korrelering av SVF-cellulært utbytte med gjennomsnittlig prosentandel av bekreftet ADSC (r = -0,02857, p = 0,95716) og mellom gjennomsnittlig prosentandel av bekreftet ADSC og mobilutbyttet før man gikk til P1 (r = 0,42857, p = 0,3965). Korrelasjonen mellom BMI og SVF-mobilutbytte kunne heller ikke betraktes som statistisk signifikant (r = -0,46667, p = 0,20539). Tabell 3 viser flowcytometriske data utført på SVF-celler som er kryopreservert. De første SVF-cellene inneholdt en undergruppe av positive celler for hematopoietiske markører (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. Fra den første SVF-cellepopulasjonen uttrykte en bestemt undergruppe CD11b 34 og CD1934 stromale celleassosierte markører. Nivåene av CD73 34, CD90 34 og CD10534 var mellomliggende mellom disse verdiene. Den første SVF inneholdt en subpopulasjon av celler som var positive for stamcelleassosierte markører (figur 3). Et gjennomsnitt på 79 % av SVF-ene uttrykte den HSC-assosierte markøren CD3434.
Totalt var det nødvendig med 21 minutter for de tre vaskene, 30 minutter for kollagenasefordøyelse, 10 minutter for sentrifugering og 5 minutter for celletelling og plating.
Figur 1: Trinn fra protokollen adipose-avledet stamcelleisolasjon . (A) Pose for lipoaspirattransport i lukket system. (B) Trinnet med hvilepose gjentatt tre ganger etter vask. (C) Lipoaspirat etter tre vasker med DPBS. (D) Lipoaspirat etter kollagenase fordøyelse. (E) Lipoaspirat etter fordøyelsen fordeles i et 50 ml rør. (F) Fordøyd lipoaspirat etter sentrifugering. (G) Endelig prosessisolering med pelleten med stromal vaskulær fraksjon (SVF). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologi og levedyktighet av ADSC . (A) Plast adherent mesenkymale fettavledede stamceller ved første passasje etter isolering ved lysmikroskopi. Cellene viser vedheft til plastisk og fibroblast-lignende morfologi. (B) Trypan blå analyse som viser levedyktige celler som telles i Neubauer-kammeret ved hjelp av et lysmikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Subpopulasjon av celler positive for stamcelleassosierte markører i SVF i tilfelle 9 etter 8 måneders kryopreservering. R1: Total cellulær region analysert i FSC (Forward Scatter) x SSC (Side Scatter) (Størrelse x Kompleksitet); R2: CD45 negativ region, hvis populasjoner CD73, CD90 og CD105 er positive i denne regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Differensieringsanalyse . (A) ADSC-differensiering i kondrocytter. (B) ADSC-differensiering i osteocytter. (C) ADSC-differensiering i adipocytter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Pasient | Alder ved innsamling (år) | Vekt (kg) | Høyde (meter) | BMI* |
| Tilfelle 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Tilfelle 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Tilfelle 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Tilfelle 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Tilfelle 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Tilfelle 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Tilfelle 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Tilfelle 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Tilfelle 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tabell 1: Data fra utvalgene til individene som ble studert. *BMI: kroppsmasseindeks.
| Pasient | Samlet volum (ml) | SVF Cellulært utbytte (celle/ml) (x 105) | Volum i kultur (ml) | Gjennomsnittlig prosentandel av bekreftet ADSC (%) | Antall celler i utgangskulturen (x 105) | Estimert antall ADSC i kultur (x 105) | Dager til P1 | Mobilutbytte før du går til P1 (x 105) |
| Tilfelle 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Tilfelle 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Tilfelle 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Tilfelle 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Tilfelle 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Tilfelle 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Tilfelle 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Tilfelle 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Tilfelle 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tabell 2: Data fra ulike trinn i prosedyren fra de ni analyserte pasientene. SVF: stromal vaskulær fraksjon; ADSC: fett-avledet stamcelle; P1: passasje 1; NA: Data er ikke tilgjengelig.
| EKSEMPEL | % av ADSC BESTEMT AV MONOKLONALE ANTISTOFFER | % AV HEMATOPOIETISKE CELLER BESTEMT AV MONOKLONALE ANTISTOFFER | CELLE LEVEDYKTIGHET ANALYSE OG TIDSPUNKT FOR SVF KRYOPRESERVERING | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Bety | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | LEVENDE/DØD + | |||
| Tilfelle 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39,54% (2 år) | ||
| Tilfelle 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38,30% (2 år) | ||
| Tilfelle 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23,06% (2 år) | ||
| Tilfelle 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56,76% (2 år) | ||
| Tilfelle 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55,56% (1 år) | ||
| Tilfelle 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34% (8 måneder) | ||
Tabell 3: Flowcytometridata fra seks av pasientene. (*) Ut fra disse CD45-cellene ble % av ADSC med ulike kombinasjoner av stamcellemarkører bestemt. ADSC: fett-avledet stamcelle; SVF: stromal vaskulær fraksjon; (*) Ut fra disse CD45-cellene ble % av ADSC med ulike kombinasjoner av stamcellemarkører bestemt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolasjon gir
Det er godt etablert at kryopreserveringsprosessen, som ofte kreves i cellulær terapi, resulterer i betydelig celletap, noen ganger større enn 50% 29,30,35. Dermed er en teknisk forbedring for å oppnå høyt innledende mobilutbytte isolert sett grunnleggende. Samlemetoden for lipoaspirat og isolasjonsmetoden til cellene må fokusere på å bevare et større antall celler, opprettholde høy levedyktighet og trekke ut maksimalt antall celler fra det opprinnelige materialet mens man regner med langsiktig kultur og manipulering av cellene. Derfor er det nødvendig med rett kulturvedlikehold for å holde cellene borte fra apoptose, senescens eller genetisk ustabilitet, siden celleterapi sannsynligvis vil være effektiv og trygg for pasienter.
Så vidt vi vet, er det ingen tidligere artikkel som bruker dette settet med trinn for isolering av mesenkymale stamceller avledet fra lipoaspirat, noe som resulterer i en tidsbesparende og kostnad-nytte-teknikk. I denne studien ble hvert metodologisk trinn begrunnet i henhold til litteraturen som viste det høyeste endelige celleutbyttet i cellulær isolasjon. Nyheten av teknikken som ble utført i denne studien var bruken av manuell aspirasjon forbundet med en serie lipoaspiratvasker, med den påfølgende posen hvilende. Oppsamlingsposen som ble brukt til å transportere og behandle lipoaspirat tillot ufordøyd vevsfragmenter å ikke delta i kollagenasefordøyelsen. Det mest kritiske trinnet er å legge kalsiumklorid til den friske fordøyelsesløsningen, da det forsterker virkningen av kollagenase. Tidsøkningen er ennå ikke rapportert i litteraturen med en celletiningsmetode som tillater levedyktige celler selv etter lang kryopreserveringstid. SVF-celleutbyttet som ble funnet i denne studien varierte bredt fra 6,15 til 26,2 x 10 5 celler / ml med et gjennomsnitt på 15,7 x 105 celler / ml. Dette kan skyldes tilstedeværelsen av en mer signifikant mengde adrenalinoppløsning sugd, som kan ha vært høyere eller lavere i henhold til scenen i den kirurgiske prosedyren og til antall andre kjente celletyper som vanligvis finnes i SVF. Selv om noen studier har funnet negative korrelasjoner mellom BMI og ADSC-utbytte 36,37, fant denne studien ingen signifikant korrelasjon, som de to andre studiene38,39, og reduserte muligheten for at det var årsaken til det utrolige utvalget av SVF-mobilutbytte som ble funnet i denne studien. Disse dataene viser at det laveste SVF-cellulære utbyttet som ble oppnådd var 6,15 x 105 celler / ml. Noen studier hadde allerede målt effektiviteten av ADSC-isolasjon i henhold til kirurgisk teknikk for å oppnå lipoaspirat. En studie oppnådde 0,087 x 10 5 celler/ml i nyisolert SVF for fettsugingsteknikken ved bruk av adrenalinløsning (som brukt i denne studien) og 0,143 x 105 celler/ml uten den26. Dette arbeidet fremhevet betydningen av adrenalinoppløsningsinjeksjonen på grunn av den vasokonstriktive effekten som reduserer intraoperativ blødning og blåmerker, som flertallet av kirurger velger å utføre i klinisk praksis. En annen studie viste at levende ADSC-er isolert varierte fra 0 til 0,59 x 105 celler / g lipoaspirat høstet, med et gjennomsnitt på 0,295 (±0,25) x 105 celler / g vev31. Noen studier har testet forskjellige måter å oppnå høyere ADSC-utbytte på. En av disse studiene oppnådde omtrent 350 x 105 for metoden som presenterte forskjellige bestanddeler i kollagenasefordøyelsesbuffer og bruk av en orbital shaker40. En annen studie viste 29,7 (±0,2) x 105 celler/ml som totalt antall SVF-celler fra bukområdet41. Abdominalområdet som er valgt i denne studien er fortsatt referanseområdet for best tilgjengelighet og tilgjengelighet av lipoaspirat42. Kroppsregionen for lipoaspiratsamling, blant andre faktorer som donoralder og metode for den valgte samlingen, er en sterk determinant for kvaliteten på ADSC-utbyttet.
Muligheten for at mikroorganismers forurensning forårsaket utilgjengelighet av celler for å fortsette forsøkene var det eneste utførelsesproblemet som begrenset fullføringen av denne studien. Selv ved bruk av antibiotika og krav til god produksjonspraksis kan forurensning oppstå på grunn av mangel på et totalt aseptisk miljø for å utføre aspirasjon av fett.
SVF immunfenotyping
Ifølge The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy 34, er et av de tre minimale kriteriene for å definere humane mesenkymale stamceller at cellene må uttrykke CD105 34, CD73 34 og CD90 34 og bør ikke uttrykke CD45 34, CD34 34, CD14 34 eller CD11b 34, CD79a 34 eller CD19 34, og HLA-DR34 overflatemembranmolekyler. Mitchell43 testet ferske SVF-celler ved immunfenotyping og fant maksimalt 54% av cellene med ADSC-overflatemarkører. I denne studien viste immunfenotyping en høyere prosentandel av bekreftede ADSC (ikke-hematopoietiske celler) på opptil 78,91% i SVF etter langvarig kryopreservering (fra 37,95% -78,91% med et gjennomsnitt på 53,68%). Bevis viser at forfedrene til en stamcellepopulasjon som ennå ikke er begått, ikke uttrykker CD34-markøren34,44,45. Avhengig av differensieringsstadiet kan CD3434 negative stamceller generere ikke bare hematopoietiske forfedre, men også mer spesifikke mesenkymale forløpere, som osteoklaster, kondrocytter, myocytter, adipocytter og andre. Noen studier viste den slående plastisiteten til den primitive stamcellepopulasjonen, sammensatt av celler med stromalcellefunksjon og hematopoietiske og mesenkymale forfedre45. Ifølge litteraturen er den komplette CD3434 funksjonelle rollen i vevsdannelsen i SVF-celler fortsatt ukjent46. Mitchell43 viste et gjennomsnitt på 60% celler av SVF som uttrykker CD3434-markør, mens gjennomsnittet i denne studien var 78,81%. Det er kjent at uttrykket av CD3434 overflatemarkør avtar langs passasjer.
Tilhengerceller og differensieringsanalyse
Avhengig av antall celler oppnådd etter isolasjon, varierte antall celler som ble sådd i den første kulturen. Den første kulturtiden for å nå 80% -90% sammenløp i 75 cm2 kolber tok i gjennomsnitt 8,4 dager og et standardavvik på 7,5 (±4,5) dager fra 6,6 til 16,1 x 105 celler / ml. Det skal bemerkes at selv for tilfellene med lavere cellulært utbytte førte den første kulturtiden til høye cellulære avkastningsindekser sammenlignet med litteraturen, sannsynligvis på grunn av den beste tilgjengeligheten av levedyktige celler opprettholdt under hele innsamlings- og isolasjonsprosessen. En studie oppnådde et cellulært utbytte på 3,75 (±1,42) x 105 ADSC per ml lipoaspirat innen en kulturperiode på 4,1 (±0,7) dager47. En annen studie viste et utbytte av nukleerte SVF-celler på 3,08 (±1,40) x 105 per millimeter med et gjennomsnitt på 6,0 (±2,4) dager i den første kulturperioden43. I denne studien, ved å estimere antall ADSC sådd i kultur, som varierte som en funksjon av antall celler observert i SVF fra samlingen av samme volum på 100 ml lipoaspirat, ble det bekreftet at antall dager for å nå P1 ikke hadde noen sammenheng med cellevolum. For eksempel, for tilfelle 9, hvor 12, 2 x 105 celler ble inkubert, var det nødvendig med 6 dager for å nå 80% -90% sammenløp. For tilfelle 6, hvor 14, 6 x 105 celler ble sådd i kultur, var det nødvendig med en lengre periode (10 dager) for å nå opp til samme nivå av sammenløp. Kanskje er et minimum ADSC-tall nok for den første adhesjonsperioden. Det kan være betydelig interindividuell variasjon, som komorbiditeter, alder og generell helsetilstand. Noen studier i litteraturen stilte spørsmål ved betydningen av å vurdere pasientenes interindividuelle variabilitet for SVF-celleutbytte48,49.
Ifølge The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy34, må mesenkymal celle ha evnen til å differensiere i tre forskjellige celletyper som osteogene, adipogene og kondrogene linjer som det ble demonstrert i figur 4.
Cell levedyktighet, cryopreservering, og genetisk ustabilitet
Ulike metoder har blitt brukt for å bestemme levedyktighetstap, definert som plasmamembranintegritetsskade50. Kulturene kan imidlertid også presentere tidlige apoptotiske celler som disse tilnærmingene kan ignorere fordi de opprettholder en intakt plasmamembran, men de er ikke-levedyktige. Resultatene rapportert her viser et stort utvalg i levedyktighetsmarkør, fra 23,06% til 72,34%, med et gjennomsnitt på 47,6% etter langvarig kryopreservering. Tatt i betraktning at kryopreservering er et betydelig skritt når det gjelder celleterapi, er gjenoppretting av maksimalt antall levedyktige og funksjonelle stamceller etter tining et av de prioriterte problemene for suksessen til celleterapi. Litteraturen har vist at minst 50% av cellens levedyktighet går tapt fra 1-4 måneder etter kryopreservering43. Spesielt er de laveste indeksene som presenteres i denne studien fra Case 5, Case 4 og Case 2, som er de eldste cryopreserverte prøvene (ca. 2 år). Selv om de presenterte de laveste levedyktighetsindeksene, viste de høyt cellulært utbytte i trypan blue dye exclusion assay i fersk SVF. Selv om litteraturen støtter årsaker til tap av levedyktighet, er disse prisene lavere enn forventet. Temperatursvingninger i cellelagring på grunn av tekniske årsaker kan forårsake økning og akkumulering av stress og favorisere akkumulering av vandige deler, og generere krystaller som skader plasmamembranen under langvarig kryopreservering51. Litteraturen viser mer enn 70% levedyktighet for prøver med samme eller lengre frysetid. Levedyktighetskontrollen ble imidlertid utført med en annen teknikk enn den som ble utført i denne studien52. En annen studie viste at lengre kryopreservering påvirker cellulær levedyktighet31 negativt, noe som kan forklares av temperaturvariasjoner i fryseren på -80 °C. Derfor må celler ofte holde seg for lenge i kultur, noe som øker cellesyklusstresset, noe som medfører risiko for genetisk ustabilitet og dermed kompromitterer cellulær terapi. Det er også konsensus i litteraturen som indikerer noen stressfaktorer og hvordan de påvirker cellecytogenetisk stabilitet, noe som er viktig for å opprettholde den langvarige stamcelledyrkingen som kreves for celleterapi35,53.
Metodefordel
Til dags dato viser litteraturen ingen standardisert protokoll for å isolere ADSC-sikte på kliniske applikasjoner. De fleste studiene viser komplekse, tidkrevende protokoller24. I denne studien må effektiviteten av metoden versus tiden som kreves for å fullføre det opprinnelige mobilutbyttet vektlegges: ca. 1,5 timer. Ifølge litteraturen kan isolering av fettavledede stamceller ta ca 3 timer til 8 timer54,55. Dermed er gevinsten av tid alliert med den høye cellulære inntekten avgjørende for regenerativ medisinterapeutisk fremgang. Flere celle levedyktighetsvurderinger bør gjøres parallelt med de som utføres i dette arbeidet for å forbedre denne metoden. Ytterligere randomiserte kontrollerte studier som inneholder et mer omfattende utvalg ved hjelp av denne metoden, er nødvendig for å kontrasignere disse resultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker pasientene som meldte seg frivillig til å delta og det medisinske og pleiepersonalet på sykehuset São Paulo. Denne studien ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
