Summary
Mevcut protokol, literatüre kıyasla zaman kazanımı ile muazzam bir hücresel verim ile sonuçlanan ADSC izolasyonu için geliştirilmiş bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra nispeten çok sayıda canlı hücre elde etmek için basit bir yöntem sunmaktadır.
Abstract
Yağ dokusundan elde edilen insan mezenkimal kök hücreleri, uygun özellikler gösterdikleri ve rejeneratif klinik uygulamalar için erişilebilir bir kaynak oldukları için giderek daha çekici hale gelmiştir. Adipoz türevi kök hücreleri elde etmek için farklı protokoller kullanılmıştır. Bu makalede, daha önemli miktarda ADSC elde etmek için geliştirilmiş bir zaman kazandıran protokolün farklı adımları anlatılmakta ve kültür genişlemesi için canlı hücreler elde etmek üzere ADSC'nin nasıl kriyoproteksiyon ve çözüleceği gösterilmektedir. Daha sonra elektif abdominoplasti uygulanan dokuz hastanın karın bölgesinden 26 cm üç delikli ve 3 mm kalibreli şırınga liposuction kullanılarak yüz mililitre lipoaspirat toplandı. Kök hücre izolasyonu, Dulbecco'nun kalsiyum ve kollajenaz kullanımı ile desteklenen Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) çözeltisi ile bir dizi yıkama ile gerçekleştirildi. Stromal Vasküler Fraksiyon (SVF) hücreleri kriyoprezerve edildi ve canlılıkları immünofenotipleme ile kontrol edildi. SVF hücresel verimi 15.7 x 105 hücre/mL idi ve 6.1-26.2 hücre/mL arasında değişiyordu. Yapışkan SVF hücreleri, ortalama 7.5 (±4.5) gün sonra birleşime ulaştı ve ortalama hücresel verim 12.3 (± 5.7) x 105 hücre / mL'dir. Çözülmüş SVF'nin 8 ay, 1 yıl ve 2 yıl sonra yaşayabilirliği %23,06-%72,34 arasında değişmekte olup, ortalama %47,7 (±24,64) arasında değişmekte olup, en düşük canlılık iki yıllık donma vakaları ile ilişkilidir. Daha kısa bir kollajenaz sindirimi süresi ile yağ çökeltmesi için kalsiyum ve torba dinlenme süreleri ile desteklenen DPBS çözeltisinin kullanılması, kök hücre nihai hücresel veriminin artmasına neden olmuştur. Yüksek canlı kök hücre verimi elde etmek için ayrıntılı prosedür, zaman ve hücresel verim açısından önceki çalışmalardan elde edilen tekniklerden daha etkiliydi. Uzun bir kriyoprezervasyon döneminden sonra bile, SVF'de canlı ADSC hücreleri bulundu.
Introduction
İnsan mezenkimal kök hücreleri hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda avantajlıdır. Bu yetişkin hücre tipinin kullanımı, embriyonik veya diğer hücrelerin kullanımına kıyasla etik sorunları aşmaktadır - otolog doku rejenerasyon mühendisliği vehücre terapisinde en umut verici çalışma alanlarından biri olan 1, neoplastik alan, dejeneratif hastalıkların tedavisi ve rekonstrüktif cerrahi alanındaki terapötik uygulamalar 2,3,4, 5. Daha önce yağ dokusunun stromal vasküler hücre fraksiyonunda mezenkimal multipotent ve pluripotent kök hücrelerin bol miktarda bulunduğu bildirilmiştir 6,7. Bu ADSC, hücre tedavisi ve transplantasyon / infüzyonda kullanım için mükemmel adaylar olarak kabul edilir, çünkü ex vivo genişleme için güçlü bir kapasiteye sahip önemli sayıda hücre, minimal invaziv bir prosedürden yüksek verimle kolayca elde edilebilir 5,8.
Ayrıca, yağ dokusunun mezenkimal kök hücre sağlama kapasitesinin diğer iki kaynaktan (kemik iliği ve göbek kordonu dokusu) daha fazla olduğu gösterilmiştir9. Kötü immünojenik olmasının yanı sıra, konakçı dokuya entegre olma ve çevre dokularla etkileşime girme yeteneğinin yüksek olmasının yanı sıra 4,10, ADSC, uygunkültür koşulları altında kondrojenik, osteojenik ve miyojenik farklılaşma raporları ile hücre hatlarına ve pankreas, hepatositler gibi hücrelere çok güçlü bir farklılaşma kapasitesine sahiptir. ve nörojenik hücreler14,15,16.
Bilimsel topluluk, mezenkimal kök hücrelerin immünomodülatör etkisinin, hücre tedavisi içinfarklılaşma özelliklerinden 17,18,19 daha uygun bir etki mekanizması olduğu konusunda hemfikirdir. ADSC kullanımının en önemli yararlarından biri, çeşitli hastalıklar için alternatif bir tedavi haline gelen otolog infüzyon veya aşılama olasılığıdır. Rejeneratif tıp için, ADSC karaciğer hasarı, kalp kasının rekonstrüksiyonu, sinir dokusunun yenilenmesi, iskelet kası fonksiyonunun iyileştirilmesi, kemik rejenerasyonu, kanser tedavisi ve diyabet tedavisi20,21 vakalarında zaten kullanılmıştır.
Bu tarihe kadar, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri 22'nin web sitesinde listelenen ADSC'nin potansiyelinin değerlendirilmesi için263 kayıtlı klinik çalışma bulunmaktadır. Yağ dokusunun toplanması için farklı protokoller oluşturulmuştur, ancak literatürde ADSK'yi klinik kullanım için izole etmek için standartlaştırılmış bir yöntem hakkında fikir birliği yoktur23,24. Ameliyat sırasında ve sonrasında lipoaspirat işleme yöntemleri, hücre canlılığını, nihai hücresel verimi25 ve ADSC popülasyonunun kalitesini20'yi doğrudan etkileyebilir. Cerrahi ön tedavi ile ilgili olarak, hangi cerrahi ön tedavi tekniğinin izolasyondan sonra daha anlamlı sayıda canlı hücre verdiği veya yağ dokusuna enjekte edilen anestezik solüsyonun hücre verimini ve fonksiyonlarını etkileyip etkilemediği iyi belirlenmemiştir26. Benzer şekilde, yağ hücreleri elde etme teknikleri arasındaki fark, canlı ADSC 20 sayısında%70'lik bir azalmaya neden olabilir. Literatüre göre, ultrason da dahil olmak üzere yüksek canlılığa sahip hücre popülasyonlarını elde etmek için mekanik tedavilerden kaçınılmalıdır, çünkü bunlar yağ dokusunu parçalayabilir20. Bununla birlikte, şırıngalarla manuel yağ aspirasyon yöntemi daha az zararlıdır, daha az hücre yıkımına neden olur, tümesan liposuction en iyi kalitede26 ile önemli sayıda hücre verir.
Bu teknik, liposuction bölgesine enjekte edilen lidokain ve epinefrin içeren bir salin çözeltisi kullanır. Enjekte edilen her 3 mL çözelti hacmi için 1 mL aspire edilir. Bu çalışmada, enjekte edilen her 1 mL adrenalin ve salin çözeltisi için 0.2 mL yağ dokusunun aspire edildiği ıslak liposuction tekniği uygulanmıştır. Sindirim enzimlerinin, özellikle kollajenazın kullanımı, ADSC'yi izole etme işlemi için yaygındır.
Laboratuvardaki ilk izolasyon adımından sonra, son pelet stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak adlandırılır. Endotel öncü hücreleri, endotel hücreleri, makrofajlar, düz kas hücreleri, lenfositler, perisitler, pre-adipositler ve adezyon yeteneğine sahip ADSC'ler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri27 içerir. Son izolasyon in vitro kültürlerden tamamlandıktan sonra, plastiğe yapışmayan hücreler orta değişimlerde elimine edilir. Sekiz haftalık genişleme, orta değişiklikler ve pasajlardan sonra, ADSC'ler şişe20'deki hücre popülasyonunun çoğunu temsil eder. Gelecekteki olası bir tedavi için izole adipoz türevi kök hücrelerin kullanılmasının en önemli avantajlarından biri kriyoprezervasyon olasılığıdır. Kriyokorunmuş lipoaspiratın, 6 haftalık donma28'den sonra bile SVF hücrelerinin potansiyel bir kaynağı olduğu, 2 yıllık kriyoprezervasyon29'dan sonra bile biyolojik aktiviteye sahip olduğu ve kültür30'da büyüme ve farklılaşma kabiliyetinin tam olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, çözülme işlemi sırasında, hücrelerin önemli bir yüzdesi genellikle31 oranında kaybolur. Bu nedenle, lipoaspirat çıkarma işlemi ve aşağıdaki hücre izolasyon yöntemleri en yüksek hücre verimini sağlamalıdır.
Bu çalışma, ADSC'yi toplamak ve izole etmek için daha hızlı bir metodolojiyi açıklamakta, hücresel terapötiklerin daha iyi verimliliği için yüksek hücresel verim ve canlılık göstermektedir. Ayrıca, bu gelişmiş tekniğin uzun süreli SVF kriyoprezervasyonundan sonraki etkisi değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Helsinki Deklarasyonu'na (2004) göre hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra gerçekleştirilen UNIFESP Etik Kurulu (protokol numarası: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmanın örneklemi, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Plastik Cerrahi Bölümü'nde, gebelik sonrası deri fazlalığı nedeniyle estetik abdominoplasti uygulanan 33-50 yaş (ortalama yaş 41.5) ve ortalama başlangıç vücut kitle indeksi (VKİ) 24.54 (22.32-26.77 arasında değişen) dokuz kadın hastadan oluşmaktadır. Brezilya. Önyargıyı azaltmak için, hastalar cinsiyet, yaş ve VKİ dikkate alınarak homojen bir grup olarak seçildi. Bu çalışma sırasında kullanılan ve/veya analiz edilen veri kümeleri, makul talep üzerine sorumlu yazardan temin edilebilir.
1. Lipoaspirat toplanması
NOT: Bu adımın ameliyat merkezinde yapılması gerekmektedir.
- Cilt hazırlığı ve asepsis için% 4 klorheksidin glukonat kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 2 mm'lik bir deri altı cilt insizyonu yapın (sub-dermis ve aponevroz arasında). 26 mm 3 G üç delikli ve 3 mm kalibreli bir Klein kanülü ve toplam 500 mL hacimli bir adrenalin çözeltisini (1 mg / mL) enjekte etmek için bir şırınga yerleştirin (bkz.
- 60 mL'lik bir şırıngayı 26 mm 3 G üç delikli ve 3 mm kalibreli liposuction kanülüne bağlayın ve vakum oluşturmak için pistonu kilitleyerek cilt kesisinden geçirin.
- İtme ve çekme hareketleri yapın, böylece oluşturulan vakum ile lipoaspirat 60 mL şırıngada kalır.
- Valfli steril bir konektör kullanarak, toplanan lipoaspiratın 100 mL'sini 150 mL'lik bir polivinil klorür transfer torbasına aktarın (bkz.
- Transfer torbasını oda sıcaklığında (~25 °C) bir polistiren kutuya koyun ve hemen laboratuvara götürün. Doku işlemeye başlamak için 30 dakikadan fazla sürmeyin.
2. Lipoaspiratın işlenmesi
NOT: Bu adım laboratuvarda gerçekleştirilmelidir.
- İlk olarak, torbayı tartın, sıcaklığı dijital temassız kızılötesi klinik termometre ile ölçün ve yağlı tabakaların (kabarcıkların) çökelmesi ve ilgili hücreleri içeren doku ayrımı için torbayı laminer akış odasının içinde 5 dakika dinlendirin.
- Bir dizi doku yıkama işlemi gerçekleştirin. İlk yıkama: Transfer torbasına kalsiyum (1x) içeren 100 mL DPBS enjekte edin ve ellerinizle karıştırın.
- 5 dakika bekletin ve çökelen bazal sıvının çoğunu çıkarın.
- Bazal sıvıyı, torba adaptörüne bağlı 60 mL'lik bir şırınga ile atın. Bu işlem iki kez tekrarlanmalıdır.
- Torbaya 100 mL sindirim çözeltisi ekleyin (93 mL kalsiyum içermeyen DPBS + 60 μL kalsiyum klorür (1 g / L) + 7 mL% 0.075 steril kollajenaz, Malzeme Tablosuna bakınız) ve yavaş karıştırma altında 30 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
- Torbanın tüm içeriğini 50 mL'lik dört konik tüpe aktarın ve 10 dakika boyunca 22 ° C'de 400 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve atın ve hücre peletine% 20 FBS (Fetal sığır serumu) ile desteklenmiş 5 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) düşük glikozunu ekleyin (Şekil 1).
3. SVF hücrelerinin sayımı
- Damıtılmış suda% 0.05'te 10 μL tripan mavisi taze bir çözeltiyi, 5 dakika boyunca 10 μL hücresel süspansiyonla karıştırın.
- Neubauer hücre sayma odası32'deki canlı hücreleri, ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak ( bkz.
- Hücre peletini kriyoprotektif bir ortamda (5 mL FBS + Dimetil Sülfoksit - DMSO'nun% 10'u) 1 x 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın.
- Bu karışımın 1 mL'sini kriyovyallere yerleştirin. Soğutma hızı (1 °C/dk ila -80 °C) olan bir dondurma kabı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- 1 yıl boyunca -80 ° C'de saklayın.
- Bu süreden sonra, sıvı azot buharı fazına (-165 ° C) batırılmış standart kaset kutularında saklayın.
4. Hücrelerin çözülme süreci
- Şişeleri sıvı azottan çıkarın ve hemen 37 °C su banyosuna 1 dakika boyunca yerleştirin.
- SVF hücrelerini, 37 ° C'de önceden ısıtılmış 4 mL DMEM (% 20 FBS ile desteklenmiş düşük glikoz) içeren konik bir tüpe yerleştirin.
- 5 dakika boyunca 22 ° C'de 400 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı çıkarın ve 1 mL DMEM (düşük glikoz) +% 10 FBS ekleyin. Aşağıdaki adımları izleyerek immünofenotipleme yapın.
5. Akım sitometri tekniği (immünofenotipli çoklu etiketleme)
- Beş sitometri tüpüne (her biri 200 μL) 1 mL hücre peleti (1.000 hücre / μL konsantrasyonu) yerleştirin.
- 5 dakika boyunca 22 °C'de 400 x g'da santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle atın.
- 300 μL Fosfat Tamponlu Tuzlu Sin (PBS) (10x) ekleyin, 22 ° C'de 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipetle atın.
- Farklı işaretleyici kombinasyonları için aşağıdaki gibi beş tüp hazırlayın: CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/CD45 μL; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/CD45 20 μL; Hücre canlılığı testi-5 μL floresan reaktif boya. (bakınız Malzeme Tablosu) ve negatif kontrol olarak lekesiz hücrelere ve PBS'ye sahip bir tüp. Bir girdapta homojenize edin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 22 °C'de 400 x g'de santrifüj yapın, süpernatantı bir pipetle atın, 500 μL PBS (10x) ekleyin ve hücre sıralamaya devam edin.
NOT: Dört renk ve beş parametreden oluşan Flow Cytometer'de ayarlanan antikor başına beş bin olay elde edilir ve CellQuest yazılımı ile analiz edilir.
- 5 dakika boyunca 22 °C'de 400 x g'de santrifüj yapın, süpernatantı bir pipetle atın, 500 μL PBS (10x) ekleyin ve hücre sıralamaya devam edin.
6. Pasajın tohumlanması 1 (P1)
- 75 cm2 kültür şişesindetohum 2 x 10 5 hücre.
- 12 mL DMEM düşük glikoz + FBS'nin% 20'si +% 10 antibiyotik / antimikotik (10.000 ünite penisilin, 10 mg streptomisin ve mL başına 25 μg amfoterisin B ile, 0.1 μm) ekleyin.
- Hücreler% 80-90 arasında birleştiğinde, 3 dakika boyunca 2 mL% 0.25 EDTA-tripsin ile yapışkan hücrelerin tripsinizasyonunu gerçekleştirin.
- Hücreleri tekrar sayın (adım 3'te belirtildiği gibi).
- İmmünofenotiplemeyi tekrar yapın (adım 5'te belirtildiği gibi).
7. İstatistiksel analiz
- Aşağıda belirtildiği gibi, aşağıdaki değişkenler ile P < 0.05 arasındaki ilişkinin gücünü ölçmek için Spearman'ın Rho Hesap Makinesi 33'ünü kullanın.
- SVF hücresel verimini ve SVF'nin ilk pasajda (P1) kültürde kaldığı gün sayısını %80-%90 birleşime kadar (P1'e kadar olan günler) seçin.
- P1'e gitmeden önce ve sonra SVF hücresel verimini seçin.
- P1'e gitmeden önce P1'e kadar olan günleri ve hücresel verimi göz önünde bulundurun.
- Doğrulanmış ADSC'nin ortalama yüzdesi ile SVF hücresel verimini seçin.
- P1'e gitmeden önce doğrulanmış ADSC yüzdesini ve hücresel verimi hesaplayın.
- BMI ve SVF hücresel verimini belirleyin.
8. Farklılaşma testi
- Bir farklılaştırma kiti protokolünü izleyerek farklılaştırma testini gerçekleştirin (bkz. Şekil 4 , Durum 1'in sonuçlarını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İncelenen dokuz bireyin yaşları, kiloları, boyları ve VKİ'leri dahil olmak üzere karakterizasyonu Tablo 1'de gösterilmiştir.
Başlangıçta sunulan hücresel verime göre, kültürde aşılanan hücre hacminin 75cm2 kültür şişesinin kapasitesine mümkün olduğunca yakın olduğu hesaplanmıştır. Her durumda tohumlanan numune hacmi Tablo 2'de açıklanmıştır. Daha sonra, ilk hücresel verime göre, her numune için değişken bir hücre hacmi belirlendi: daha yüksek hücresel verime sahip numuneler için 1 mL, orta hücresel verime sahip numuneler için 1.1 mL ve vakalar arasında daha benzer hücre tohumlaması gerçekleştirmek için daha düşük hücresel verime sahip numuneler için 2 mL. Kültür yaklaşık %80-%90 birleşime ulaştığında (Şekil 2A) (yaklaşık 7.5 ± 4.5 gün), ader hücrelerin tripsinizasyonu gerçekleştirildi (Tablo 2 ve Şekil 2B).
Pasaj 1'den önceki hücresel verim, tripsinizasyondan önceki aynı birleşme gözlendiğinde bile geniş ölçüde değişmiştir (Tablo 2). Bu, hücrelerin katmanlar halinde büyümüş olabileceği gerçeğiyle açıklanabilir. Hastaların ADSC'sinden farklı parametreler, Tablo 2'de gösterildiği gibi, farklı dönemlerde de değerlendirildi.
Bazı örnekler (Vaka 1, Vaka 2, Olgu 7), bakteri kontaminasyonu ve kriyokorunmuş SVF immünofenotipleme yapmak için mevcut hücrelerin bulunmaması nedeniyle doğrulanmış ADSC yüzdesi ve kültürdeki tahmini ADSC sayısı açısından değerlendirilememiştir. Spearman'ın Rho Hesap Makinesi 33'e göre, SVF hücresel verimi ile P1'e giden günler (r = 0.37816, p = 0.31561), P1'e gitmeden önceki ve sonraki SVF hücresel verimi arasında (r = -0.33333, p = 0.38071) ve P1'e gitmeden önceki günler ile hücresel verim arasında istatistiksel bir fark bulunmamıştır (r = -0.53783, p = 0,13529). Ayrıca, SVF hücresel verimini doğrulanmış ADSC'nin ortalama yüzdesi (r = -0.02857, p = 0.95716) ile ilişkilendirirken ve doğrulanmış ADSC'nin ortalama yüzdesi ile P1'e gitmeden önceki hücresel verim arasında anlamlı bir fark gözlenmedi (r = 0.42857, p = 0.3965). Ayrıca, VKİ ile SVF hücresel verimi arasındaki korelasyon istatistiksel olarak anlamlı kabul edilememiştir (r = -0.46667, p = 0.20539). Tablo 3'te kriyoprezerve SVF hücreleri üzerinde gerçekleştirilen akım sitometrik verileri gösterilmektedir. İlk SVF hücreleri, hematopoetik belirteçler için pozitif hücrelerin bir alt kümesini içeriyordu (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. İlk SVF hücre popülasyonundan, belirli bir alt grup CD11b 34 ve CD1934 stromal hücre ile ilişkili belirteçleri eksprese etti. CD7334, CD90 34 ve CD10534 düzeyleri bu değerler arasında orta düzeydeydi. İlk SVF, kök hücre ile ilişkili belirteçler için pozitif olan hücrelerin bir alt popülasyonunu içeriyordu (Şekil 3). SVF'lerin ortalama %79'u HSC ile ilişkili belirteç CD3434'ü ifade etmiştir.
Toplamda, üç yıkama için 21 dakika, kollajenaz sindirimi için 30 dakika, santrifüjleme için 10 dakika ve hücre sayımı ve kaplama için 5 dakika gerekliydi.
Şekil 1: Adipoz kaynaklı kök hücre izolasyonu protokolünden alınan adımlar . (A) Kapalı bir sistemde lipoaspirat taşınması için torba. (B) Yıkama torbasının basamağı, yıkandıktan sonra üç kez tekrarlanır. (C) DPBS ile üç yıkamadan sonra lipoaspirat. (D) Kollajenaz sindiriminden sonra lipoaspirat. (E) Sindirimden sonra lipoaspirat 50 mL'lik bir tüp içinde dağıtılır. (F) Santrifüjleme sonrası sindirilmiş lipoaspirat. (G) Stromal vasküler fraksiyon (SVF) ile pelet ile son proses izolasyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ADSC'lerin morfolojisi ve yaşayabilirliği . (A) Işık mikroskobunda izolasyondan sonraki ilk geçişte plastik yapışkan mezenkimal adipoz türevi kök hücreler. Hücreler plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye yapışma gösterir. (B) Neubauer odasında ışık mikroskobu kullanılarak sayılan canlı hücreleri gösteren tripan mavisi tahlil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 8 aylık kriyoprezervasyondan sonra Vaka 9'un SVF'sinde kök hücre ile ilişkili belirteçler için pozitif olan hücrelerin alt popülasyonu. S1: FSC (İleri Saçılma) x SSC (Yan Saçılma) (Boyut x Karmaşıklık) olarak analiz edilen toplam hücresel bölge; R2: CD45 negatif bölgesi, popülasyonları CD73, CD90 ve CD105 bu bölgede pozitiftir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Diferansiyasyon testi . (A) Kondrositlerde ADSC farklılaşması. (B) Osteositlerde ADSC farklılaşması. (C) Adipositlerde ADSC farklılaşması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Sabırlı | Koleksiyon yaşı (yıl) | Ağırlık (kg) | Yükseklik (metre) | BMI* |
| Vaka 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Vaka 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Vaka 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Vaka 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Vaka 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Vaka 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Vaka 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Vaka 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Vaka 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tablo 1: İncelenen bireylerin örneklerinden elde edilen veriler. * VKİ: vücut kitle indeksi.
| Sabırlı | Toplanan hacim (mL) | SVF Hücresel verim (hücre/mL) (x 105) | Kültürdeki hacim (mL) | Doğrulanmış ADSC'nin ortalama yüzdesi (%) | Başlangıç kültüründeki hücre sayısı (x 105) | Kültürde tahmini ADSC sayısı (x 105) | P1'e Kadar Geçen Gün | P1'e gitmeden önce hücresel verim (x 105) |
| Vaka 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Vaka 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Vaka 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Vaka 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Vaka 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Vaka 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Vaka 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Vaka 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Vaka 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tablo 2: Analiz edilen dokuz hastadan prosedürün farklı adımlarından elde edilen veriler. SVF: stromal vasküler fraksiyon; ADSC: adipoz türevi kök hücre; P1: pasaj 1; na: veri mevcut değil.
| ÖRNEK | ADSC'NİN %'si MONOKLONAL MİKANTIKORLAR TARAFINDAN BELİRLENİYOR | MONOKLONAL ANTIKORLAR TARAFINDAN BELIRLENEN HEMATOPOETIK HÜCRELERIN % 'SI | HÜCRE CANLILIĞI TESTI VE SVF KRIYOPREZERVASYONUNUN SÜRESI | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Demek | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | CANLI/ÖLÜ + | |||
| Vaka 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | %39.54 (2 yıl) | ||
| Vaka 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | %38.30 (2 yıl) | ||
| Vaka 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | %23.06 (2 yıl) | ||
| Vaka 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | %56.76 (2 yıl) | ||
| Vaka 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | %55.56 (1 yıl) | ||
| Vaka 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | %72.34 (8 ay) | ||
Tablo 3: Hastaların altısından alınan akış sitometri verileri. (*) Bu CD45 hücrelerinden farklı kök hücre belirteçleri kombinasyonlarına sahip ADSC'nin % 'si belirlendi. ADSC: adipoz türevi kök hücre; SVF: stromal vasküler fraksiyon; (*) Bu CD45 hücrelerinden farklı kök hücre belirteçleri kombinasyonlarına sahip ADSC'nin % 'si belirlendi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzolasyon verimi
Hücresel tedavide sıklıkla gerekli olan kriyoprezervasyon işleminin, bazen %50'den fazla olan önemli hücre kaybına neden olduğu iyi bilinmektedir29,30,35. Bu nedenle, izolasyonda yüksek başlangıç hücresel verimi elde etmek için teknik bir gelişme esastır. Lipoaspiratın toplama yöntemi ve hücrelerin izolasyon yöntemi, hücrelerin uzun vadeli kültürünü ve manipülasyonunu hesaba katarken, daha fazla sayıda hücreyi korumaya, yüksek canlılığı korumaya ve ilk materyalden maksimum sayıda hücreyi çıkarmaya odaklanmalıdır. Bu nedenle, hücreleri apoptoz, yaşlanma veya genetik instabiliteden uzak tutmak için düz kültür bakımı gereklidir, çünkü hücre tedavisinin hastalar için etkili ve güvenli olması muhtemeldir.
Bildiğimiz kadarıyla, lipoaspirattan elde edilen mezenkimal kök hücrelerin izolasyonu için bu adımları kullanan daha önce bir makale yoktur, bu da zaman kazandıran ve maliyet-fayda tekniği ile sonuçlanır. Bu çalışmada, her metodolojik adım, hücresel izolasyonda en yüksek nihai hücre verimini gösteren literatüre göre gerekçelendirilmiştir. Bu çalışmada uygulanan tekniğin yeniliği, bir dizi lipoaspirat yıkama ile ilişkili manuel aspirasyonun kullanılması ve ardından torbanın dinlenmesiydi. Lipoaspiratı taşımak ve işlemek için kullanılan toplama torbası, sindirilmemiş doku parçalarının kollajenaz sindirimine katılmamasına izin verdi. En kritik adım, kollajenazın etkisini güçlendirdiği için taze sindirim çözeltisine kalsiyum klorür eklenmesidir. Uzun kriyoprezervasyon süresinden sonra bile canlı hücrelere izin veren bir hücre çözme yöntemi ile literatürde zaman kazanımı henüz bildirilmemiştir. Bu çalışmada bulunan SVF hücresel verimi, ortalama 15.7 x 10 5 hücre / mL ile 6.15 ila 26.2 x 105 hücre / mL arasında geniş ölçüde değişmiştir. Bunun nedeni, cerrahi prosedürün aşamasına ve SVF'de genellikle bulunan diğer bilinen hücre tiplerinin sayısına göre daha yüksek veya daha düşük olabilen, emilen daha önemli miktarda adrenalin çözeltisinin varlığından kaynaklanabilir. Bazı çalışmalar VKİ ve ADSC verimi 36,37 arasında negatif korelasyonlar bulmuş olsa da, bu çalışma diğer iki çalışma38,39 gibi anlamlı bir korelasyon bulamamıştır ve bu çalışmada bulunan inanılmaz çeşitlilikteki SVF hücresel veriminin nedeni olma olasılığını azaltmıştır. Bu veriler, elde edilen en düşük SVF hücresel veriminin 6.15 x 105 hücre / mL olduğunu göstermektedir. Bazı çalışmalar, lipoaspirat elde etmek için cerrahi tekniğe göre ADSC izolasyonunun etkinliğini zaten ölçmüştür. Bir çalışmada, adrenalin çözeltisi (bu çalışmada kullanıldığı gibi) kullanılarak liposuction tekniği için taze izole edilmiş SVF'de 0.087 x 105 hücre / mL veonsuz 0.143 x 105 hücre / mL elde edilmiştir. Bu çalışma, cerrahların çoğunluğu klinik pratikte yapmayı seçtiğinden, intraoperatif kanamayı ve morarmaları azaltan vazokonstrüktif etki nedeniyle adrenalin çözeltisi enjeksiyonunun önemini vurgulamıştır. Başka bir çalışma, izole edilen canlı ADSC'lerin 0 ila 0.59 x 10 5 hücre / g lipoaspirat arasında değiştiğini, ortalama 0.295 (±0.25) x 105 hücre / g doku31 olduğunu göstermiştir. Bazı çalışmalar daha yüksek ADSC verimi elde etmenin farklı yollarını test etmiştir. Bu çalışmalardan biri, kollajenaz sindirim tamponunda çeşitli bileşenler sunan yöntem ve bir orbital çalkalayıcı 40 kullanımı için yaklaşık350 x10 5 elde etti. Başka bir çalışmada karın bölgesinden SVF hücrelerinin toplam sayısı41 olarak 29.7 (±0.2) x 105 hücre / mL gösterilmiştir. Bu çalışmada seçilen karın bölgesi, lipoaspirat42'nin en iyi kullanılabilirliği ve erişilebilirliği için hala referans alandır. Lipoaspirat toplanması için vücut bölgesi, donör yaşı ve seçilen toplama yöntemi gibi diğer faktörlerin yanı sıra, ADSC verimlerinin kalitesinin güçlü bir belirleyicisidir.
Mikroorganizmaların kontaminasyonunun hücrelerin deneylere devam edememesine neden olma olasılığı, bu çalışmanın tamamlanmasını sınırlayan tek uygulama problemiydi. Antibiyotik ve İyi Üretim Uygulamaları gereklilikleri kullanılsa bile, yağ aspirasyonunu gerçekleştirmek için toplam aseptik ortamın bulunmaması nedeniyle kontaminasyon oluşabilir.
SVF immünofenotipleme
Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği 34'ün Mezenkimal ve Doku Kök Hücre Komitesi'ne göre, insan mezenkimal kök hücrelerini tanımlamak için üç minimum kriterden biri, hücrelerin CD105 34, CD73 34 ve CD90 34'ü eksprese etmesi veCD45 34, CD34 34, CD14 34 veya CD11b 34, CD79a34 veya CD19 34'ü ifade etmemesidir. ve HLA-DR34 yüzey membran molekülleri. Mitchell43, taze SVF hücrelerini immünofenotipleme ile test etti ve ADSC yüzey belirteçlerine sahip hücrelerin maksimum% 54'ünü buldu. Bu çalışmada, immünofenotipleme, uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra SVF'de% 78.91'e kadar (ortalama% 37.95-% 78.91 arasında% 53.68 arasında) doğrulanmış ADSC'nin (hematopoetik olmayan hücreler) daha yüksek bir yüzdesini ortaya koymuştur. Kanıtlar, henüz taahhüt edilmemiş bir kök hücre popülasyonunun progenitörlerinin CD34 belirteci 34,44,45'i ifade etmediğini göstermektedir. Farklılaşma aşamasına bağlı olarak, CD3434 negatif kök hücreler sadece hematopoetik progenitörleri değil, aynı zamanda osteoklastlar, kondrositler, miyositler, adipositler ve diğerleri gibi daha spesifik mezenkimal öncülleri de üretebilir. Bazı çalışmalar, stromal hücre fonksiyonuna sahip hücreler ile hematopoetik ve mezenkimal progenitörlerden oluşan ilkel kök hücre popülasyonunun çarpıcı plastisitesini göstermiştir45. Literatüre göre SVF hücrelerinde doku oluşumundaCD34 34 fonksiyonunun tamamı hala bilinmemektedir46. Mitchell43, CD34 34 belirtecini eksprese eden SVF hücrelerinin ortalamasını% 60 gösterirken, bu çalışmada ortalama% 78.81 idi. CD3434 yüzey belirtecinin ekspresyonunun pasajlar boyunca azaldığı bilinmektedir.
Yapışkan hücreler ve farklılaşma testi
İzolasyondan sonra elde edilen hücre sayısına bağlı olarak, ilk kültürde tohumlanan hücrelerin sayısı değişmiştir. 75cm2 şişelerde %80-%90 kavuşuma ulaşmak için ilk kültür süresi ortalama 8.4 gün ve standart sapma 7.5 (±4.5) gün sürmüştür ve 6.6 ila 16.1 x 105 hücre/mL arasında değişmiştir. Daha düşük hücresel verime sahip vakalar için bile, ilk kültür zamanının, muhtemelen tüm toplama ve izolasyon işlemi boyunca tutulan canlı hücrelerin en iyi mevcudiyeti nedeniyle, literatüre kıyasla yüksek hücresel verim indekslerine yol açtığı belirtilmelidir. Bir çalışmada, 4.1 (±0.7) günlük kültür periyodu 47 içinde mL lipoaspirat başına 3.75 (±1.42) x 105 ADSC hücresel verimi elde edildi. Başka bir çalışmada, ilk kültür periyodu43'te ortalama 6.0 (±2.4) gün olan milimetre başına 3.08 (±1.40) x 105 çekirdekli SVF hücrelerinin verimi gösterilmiştir. Bu çalışmada, SVF'de gözlenen hücre sayısının bir fonksiyonu olarak aynı hacimdeki 100 mL lipoaspiratın toplanmasından değişen kültürde tohumlanan ADSC sayısı tahmin edilerek, P1'e ulaşmak için gün sayısının hücre hacmiyle hiçbir ilişkisi olmadığı doğrulanmıştır. Örneğin, 12.2 x 105 hücrenin inkübe edildiği Vaka 9 için,% 80 -% 90 birleşmeye ulaşmak için 6 gün gerekiyordu. Kültürde 14.6 x 105 hücrenin tohumlandığı Vaka 6 için, aynı birleşme seviyesine ulaşmak için daha uzun bir süre (10 gün) gerekliydi. Belki de, ilk yapışma dönemi için minimum bir ADSC sayısı yeterlidir. Komorbiditeler, yaş ve genel sağlık durumu gibi bireyler arası önemli farklılıklar olabilir. Literatürdeki bazı çalışmalar, SVF hücre verimi48,49 için hastaların bireyler arası değişkenliğinin dikkate alınmasının önemini sorgulamıştır.
Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği34 Mezenkimal ve Doku Kök Hücre Komitesi'ne göre, mezenkimal hücre, Şekil 4'te gösterildiği gibi osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar olarak üç farklı hücre tipine farklılaşma yeteneğine sahip olmalıdır.
Hücre canlılığı, kriyoprezervasyon ve genetik instabilite
Plazma membran bütünlüğü hasarı50 olarak tanımlanan canlılık kaybını belirlemek için farklı yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, kültürler, bu yaklaşımların göz ardı edebileceği erken apoptotik hücreler de sunabilir, çünkü sağlam bir plazma zarını korurlar, ancak yaşayamazlar. Burada bildirilen sonuçlar, uzun süreli kriyoprezervasyondan sonra ortalama% 23.06 -% 72.34 arasında, canlılık belirteçlerinde büyük bir aralık göstermektedir. Kriyoprezervasyonun hücre tedavisi ile ilgili önemli bir adım olduğu düşünüldüğünde, çözülme sonrası maksimum canlı ve fonksiyonel kök hücre sayısının geri kazanılması, hücre tedavisinin başarısı için öncelikli konulardan biridir. Literatür, kriyoprezervasyondan 1-4 ay sonra hücre canlılığının en az% 50'sinin kaybolduğunu göstermiştir43. Özellikle, bu çalışmada sunulan en düşük indeksler, en eski kriyokorunmuş örnekler olan (yaklaşık 2 yıl) Vaka 5, Vaka 4 ve Vaka 2'dendir. En düşük canlılık indekslerini sunmalarına rağmen, taze SVF'de tripan mavi boya dışlama testinde yüksek hücresel verim gösterdiler. Literatür canlılık kaybının nedenlerini desteklese de, bu oranlar beklenenden daha düşüktür. Teknik nedenlerden dolayı hücre depolamasındaki sıcaklık dalgalanmaları, stresin artmasına ve birikmesine neden olabilir ve sulu kısımların birikmesini destekleyerek uzun süreli kriyoprezervasyon sırasında plazmatik membrana zarar veren kristaller üretebilir51. Literatür, aynı veya daha uzun donma süresine sahip numuneler için% 70'ten fazla canlılık göstermektedir. Bununla birlikte, canlılık kontrolü bu çalışmada gerçekleştirilenden farklı bir teknikle gerçekleştirilmiştir52. Başka bir çalışma, daha uzun kriyoprezervasyonun, -80 ° C dondurucudaki sıcaklık değişimleri ile açıklanabilen hücresel canlılığı31 olumsuz etkilediğini göstermiştir. Bu nedenle, hücrelerin genellikle kültürde çok uzun süre kalmaları gerekir, bu da hücre döngüsü stresini arttırır, genetik dengesizlik için riskler getirir ve sonuç olarak hücresel tedaviyi tehlikeye atar. Literatürde ayrıca bazı stres faktörlerini ve bunların hücre sitogenetik stabilitesini nasıl etkilediğini gösteren bir fikir birliği vardır, bu da hücre tedavisi için gerekli olan uzun süreli kök hücre yetiştiriciliğini sürdürmek için gereklidir35,53.
Metodoloji avantajı
Bugüne kadar, literatür klinik uygulamaları hedefleyen ADSC'yi izole etmek için standartlaştırılmış bir protokol göstermemektedir. Çalışmaların çoğu karmaşık, zaman alıcı protokolleri göstermektedir24. Bu çalışmada, yöntemin ilk hücresel verimi tamamlamak için gereken süreye karşı etkinliği vurgulanmalıdır: yaklaşık 1.5 saat. Literatüre göre, adipoz kaynaklı kök hücrelerin izolasyonu yaklaşık 3 saat ila 8 saat54,55 arasında sürebilir. Bu nedenle, yüksek hücresel gelirle bağlantılı zaman kazanımı, rejeneratif tıp terapötiklerinin ilerlemesi için kritik öneme sahiptir. Bu yöntemi geliştirmek için bu çalışmada yapılanlara paralel olarak daha fazla hücre canlılığı değerlendirmesi yapılmalıdır. Bu metodolojiyi kullanarak daha kapsamlı bir örneklem içeren daha fazla randomize kontrollü çalışma, bu sonuçlara karşı imza atmak için gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Katılmak için gönüllü olan hastalara ve São Paulo Hastanesi'nin tıbbi ve hemşirelik personeline teşekkür ederiz. Bu çalışma Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brezilya tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
