Summary
Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methodologie voor ADSC-isolatie, wat resulteert in een enorme cellulaire opbrengst met tijdwinst in vergelijking met de literatuur. Deze studie biedt ook een eenvoudige methode voor het verkrijgen van een relatief groot aantal levensvatbare cellen na cryopreservatie op lange termijn.
Abstract
Menselijke mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel zijn steeds aantrekkelijker geworden omdat ze geschikte kenmerken vertonen en een toegankelijke bron zijn voor regeneratieve klinische toepassingen. Er zijn verschillende protocollen gebruikt om van vetweefsel afgeleide stamcellen te verkrijgen. Dit artikel beschrijft verschillende stappen van een verbeterd tijdbesparend protocol om een grotere hoeveelheid ADSC te verkrijgen, en laat zien hoe ADSC kan worden gecryopreserveerd en ontdooid om levensvatbare cellen te verkrijgen voor kweekuitbreiding. Honderd milliliter lipoaspiraat werd verzameld, met behulp van een 26 cm driegats en 3 mm kaliber spuit liposuctie, uit de buikstreek van negen patiënten die vervolgens electieve abdominoplastiek ondergingen. De stamcelisolatie werd uitgevoerd met een reeks wasbeurten met Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) oplossing aangevuld met calcium en het gebruik van collagenase. Stromale vasculaire fractie (SVF) cellen werden gecryopreserveerd en hun levensvatbaarheid werd gecontroleerd door immunofenotypering. De SVF cellulaire opbrengst was 15,7 x 105 cellen / ml, variërend tussen 6,1-26,2 cellen / ml. Adherente SVF-cellen bereikten confluence na een gemiddelde van 7,5 (±4,5) dagen, met een gemiddelde cellulaire opbrengst van 12,3 (± 5,7) x 105 cellen / ml. De levensvatbaarheid van ontdooide SVF na 8 maanden, 1 jaar en 2 jaar varieerde tussen 23,06% -72,34% met een gemiddelde van 47,7% (±24,64) met de laagste levensvatbaarheid correlerend met gevallen van twee jaar bevriezing. Het gebruik van DPBS-oplossing aangevuld met calcium- en zakrusttijden voor vetprecipitatie met een kortere tijd van collagenasevertering resulteerde in een verhoogde uiteindelijke celopbrengst. De gedetailleerde procedure voor het verkrijgen van hoge opbrengsten van levensvatbare stamcellen was efficiënter met betrekking tot tijd en cellulaire opbrengst dan de technieken uit eerdere studies. Zelfs na een lange periode van cryopreservatie werden levensvatbare ADSC-cellen gevonden in de SVF.
Introduction
Menselijke mesenchymale stamcellen zijn voordelig in zowel fundamenteel als toegepast onderzoek. Het gebruik van dit volwassen celtype overstijgt ethische kwesties - in vergelijking met het gebruik van embryonale of andere cellen - en is een van de meest veelbelovende studiegebieden in autologe weefselregeneratietechniek en celtherapie1, zoals het neoplastische gebied, de behandeling van degeneratieve ziekten en therapeutische toepassingen in het reconstructieve chirurgiegebied 2,3,4, 5. Eerder is gemeld dat er een overvloedige bron is van mesenchymale multipotente en pluripotente stamcellen in de stromale vasculaire celfractie van vetweefsel 6,7. Deze ADSC worden beschouwd als geweldige kandidaten voor gebruik bij celtherapie en transplantatie/infusie, aangezien een aanzienlijk aantal cellen met een sterk expansievermogen ex vivo gemakkelijk kan worden verkregen met een hoge opbrengst van een minimaal invasieve procedure 5,8.
Er werd ook aangetoond dat vetweefsel een groter vermogen heeft om mesenchymale stamcellen te leveren dan twee andere bronnen (beenmerg en navelstrengweefsel)9. Naast het feit dat het slecht immunogeen is en een hoog vermogen heeft om te integreren in het gastheerweefsel en om te interageren met de omliggende weefsels 4,10, heeft ADSC een multipotente capaciteit van differentiatie in cellijnen, met meldingen van chondrogene, osteogene en myogene differentiatie onder geschikte kweekomstandigheden 11,12,13, en in cellen, zoals pancreas, hepatocyten, en neurogene cellen 14,15,16.
De wetenschappelijke gemeenschap is het erover eens dat het immunomodulerende effect van de mesenchymale stamcellen een relevanter werkingsmechanisme is voor celtherapie 17,18,19 dan hun differentiatie-eigenschap. Een van de belangrijkste verdiensten van het ADSC-gebruik is de mogelijkheid van autologe infusie of enting, waardoor het een alternatieve behandeling wordt voor verschillende ziekten. Voor regeneratieve geneeskunde is ADSC al gebruikt in gevallen van leverschade, reconstructie van hartspier, regeneratie van zenuwweefsel, verbetering van de skeletspierfunctie, botregeneratie, kankertherapie en diabetesbehandeling20,21.
Tot op heden zijn er 263 geregistreerde klinische onderzoeken voor de evaluatie van het potentieel van ADSC, vermeld op de website van de National Institutes of Health22 van de Verenigde Staten. Er zijn verschillende protocollen opgesteld om vetweefsel te oogsten, maar er is geen consensus in de literatuur over een gestandaardiseerde methode om ADSC te isoleren voor klinisch gebruik 23,24. Lipoaspiraatverwerkingsmethoden tijdens en na de operatie kunnen direct van invloed zijn op de levensvatbaarheid van cellen, de uiteindelijke cellulaire opbrengst25 en de kwaliteit van de ADSC-populatie20. Wat de chirurgische voorbehandeling betreft, is het niet goed vastgesteld welke chirurgische voorbehandelingstechniek na isolatie een groter aantal levensvatbare cellen oplevert of dat de in vetweefsel geïnjecteerde anesthetische oplossing de celopbrengst en de functies ervan beïnvloedt26. Evenzo kan het verschil tussen technieken voor het verkrijgen van vetcellen leiden tot een afname van 70% van het aantal levensvatbare ADSC20. Volgens de literatuur moeten mechanische behandelingen om celpopulaties met een hoge levensvatbaarheid te verkrijgen - inclusief echografie - worden vermeden, omdat ze het vetweefsel kunnen afbreken20. De handmatige vetaspiratiemethode met spuiten is echter minder schadelijk en veroorzaakt minder celvernietiging, waarbij tumescente liposuctie een aanzienlijk aantal cellen met de beste kwaliteitoplevert 26.
Deze techniek maakt gebruik van een zoutoplossing met lidocaïne en epinefrine die in het liposuctiegebied wordt geïnjecteerd. Voor elk geïnjecteerd oplossingsvolume van 3 ml wordt 1 ml aangezogen. In deze studie werd de natte liposuctietechniek uitgevoerd, waarbij voor elke 1 ml adrenaline en zoutoplossing die wordt geïnjecteerd, 0,2 ml vetweefsel wordt geaspireerd. Het gebruik van spijsverteringsenzymen, met name collagenase, is gebruikelijk voor het proces van het isoleren van ADSC.
Na de eerste isolatiestap in het laboratorium wordt de laatste pellet stromale vasculaire fractie (SVF) genoemd. Het bevat verschillende celtypen27, waaronder endotheelvoorlopercellen, endotheelcellen, macrofagen, gladde spiercellen, lymfocyten, pericyten, pre-adipocyten en ADSC's, die in staat zijn tot adhesie. Zodra de definitieve isolatie uit in vitro culturen is afgerond, worden cellen die zich niet aan het plastic hebben gehecht, geëlimineerd in mediumuitwisselingen. Na acht weken van expansie, mediumveranderingen en passages vertegenwoordigen ADSC's het grootste deel van de celpopulatie in de kolven20. Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van geïsoleerde vetweefsel-afgeleide stamcellen voor een mogelijke toekomstige therapie is de mogelijkheid van cryopreservatie. Er werd aangetoond dat gecryopreserveerd lipoaspiraat een potentiële bron van SVF-cellen is, zelfs na 6 weken bevriezen28, met biologische activiteit zelfs na 2 jaar cryopreservatie29, en volledig vermogen om te groeien en te differentiëren in cultuur30. Tijdens het ontdooiproces gaat echter meestal een aanzienlijk percentage cellen verloren31. Daarom moeten het lipoaspiraatverwijderingsproces en de volgende methoden van celisolatie de hoogste celopbrengst garanderen.
Deze studie beschrijft een snellere methodologie voor het verzamelen en isoleren van ADSC, die een hoge cellulaire opbrengst en levensvatbaarheid aantoont voor een betere efficiëntie van cellulaire therapieën. Bovendien werd het effect van deze verbeterde techniek na langdurige SVF-cryopreservatie geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De huidige studie is goedgekeurd door de Ethische Commissie van de UNIFESP (protocolnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), uitgevoerd na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten volgens de Verklaring van Helsinki (2004). De steekproef van deze studie bestaat uit negen vrouwelijke patiënten in de leeftijd van 33-50 jaar (gemiddelde leeftijd 41,5) en gemiddelde initiële body mass index (BMI) van 24,54 (variërend tussen 22,32-26,77) (tabel 1) die esthetische abdominoplastiek ondergingen als gevolg van een teveel aan huid na zwangerschappen, bij de afdeling Plastische Chirurgie van de Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazilië. Om bias te verminderen, werden de patiënten geselecteerd als een homogene groep rekening houdend met geslacht, leeftijd en BMI. De datasets die tijdens dit onderzoek zijn gebruikt en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.
1. Verzameling van lipoaspiraat
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in het operatiecentrum.
- Gebruik 4% chloorhexidinegluconaat (zie materiaaltabel) voor huidvoorbereiding en asepsis.
- Voer een subcutane huidincisie van 2 mm uit (tussen de subdermis en aponeurose). Plaats een Klein canule van 26 mm 3 G driegats en 3 mm kaliber en een spuit om een totaal volume van 500 ml van een adrenaline-oplossing (1 mg / ml) (zie tabel van materialen) verdund in zoutoplossing (1: 1.000.000) in de infraumbilicale ruimte te injecteren.
- Sluit een spuit van 60 ml aan op een 26 mm 3 G driegats en 3 mm kaliber liposuctie canule en steek deze door de huidincisie, waarbij de zuiger wordt vergrendeld om een vacuüm te creëren.
- Maak duw- en trekbewegingen zodat, met het gecreëerde vacuüm, het lipoaspiraat in de spuit van 60 ml blijft.
- Breng met behulp van een steriele connector met een klep de 100 ml van het verzamelde lipoaspiraat over op een 150 ml polyvinylchloride-overdrachtszak (zie materiaaltabel).
- Verpak de transferzak in een polystyreendoos bij kamertemperatuur (~25 °C) en breng deze onmiddellijk naar het laboratorium. Het duurt niet langer dan 30 minuten om de weefselverwerking te starten.
2. Verwerking van lipoaspiraat
OPMERKING: Deze stap moet in het laboratorium worden uitgevoerd.
- Weeg eerst de zak, meet de temperatuur met een digitale contactloze infrarood klinische thermometer en laat de zak 5 minuten rusten in de laminaire stroomkamer voor neerslag van de vetmesterlagen (bubbels) en weefselscheiding die de cellen van belang bevat.
- Voer een reeks weefselwassingen uit. Eerste wasbeurt: injecteer 100 ml DPBS met calcium (1x) in de transferzak en meng deze met de handen.
- Laat het 5 minuten staan en verwijder het grootste deel van de basale vloeistof die neerslaat.
- Gooi de basale vloeistof weg met een spuit van 60 ml die aan de zakadapter is bevestigd. Dit proces moet twee keer worden herhaald.
- Voeg 100 ml digestieoplossing toe aan de zak (93 ml calciumvrij DPBS + 60 μl calciumchloride (1 g/l) + 7 ml steriel collagenase, zie materiaaltabel) en laat 30 minuten bij 37 °C onder langzaam roeren.
- Breng alle inhoud van de zak over in vier conische buizen van 50 ml en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 400 x g bij 22 °C.
- Verwijder en gooi het supernatant weg en voeg 5 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) lage glucose aangevuld met 20% FBS (foetaal runderserum) toe aan de celpellet (figuur 1).
3. Tellen van de SVF-cellen
- Meng een verse oplossing van 10 μL trypan blauw op 0,05% in gedestilleerd water met 10 μL cellulaire suspensie gedurende 5 min.
- Tel levensvatbare cellen in een Neubauer-celtelkamer32 met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop (zie Tabel van Materialen) bij 20x vergroting.
- Resuspendeer de celpellet in een cryoprotectief medium (5 ml FBS + 10% dimethylsulfoxide - DMSO) in een concentratie van 1 x 106 cellen / ml.
- Doe 1 ml van dit mengsel in cryovialen. Gebruik een vriescontainer (zie Materiaaltabel) met een koelsnelheid van (1 °C/min tot -80 °C).
- Bewaren bij -80 °C gedurende 1 jaar.
- Bewaar na deze tijd in standaard cassettedozen ondergedompeld in de vloeibare stikstofdampfase (-165 °C).
4. Ontdooiproces van de cellen
- Verwijder de injectieflacons met vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in het waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut.
- Plaats de SVF-cellen in een conische buis met 4 ml DMEM (lage glucose aangevuld met 20% FBS) voorverwarmd op 37 °C.
- Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en voeg 1 ml DMEM (lage glucose) + 10% FBS toe. Voer immunofenotypering uit volgens de onderstaande stappen.
5. Flow cytometrie techniek (immunofenotype multiple labeling)
- Plaats 1 ml celpellet (concentratie van 1.000 cellen/μL) in vijf cytometriebuizen (elk 200 μL).
- Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg met een pipet.
- Voeg 300 μL Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (PBS) (10x) toe, centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C en gooi het supernatant weg met een pipet.
- Bereid vijf buizen voor verschillende markercombinaties als volgt voor: 5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Cel levensvatbaarheid assay-5 μL van fluorescerende reactieve kleurstof. (zie Materiaaltabel) en een buis met niet-gekleurde cellen en PBS als negatieve controle. Homogeniseer in een vortex en incubeer bij 4 °C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg met een pipet, voeg 500 μL PBS (10x) toe en ga verder met celsortering.
OPMERKING: Vijfduizend gebeurtenissen worden verkregen per antilichaamset in de Flow Cytometer van vier kleuren en vijf parameters en geanalyseerd met CellQuest-software.
- Centrifugeer bij 400 x g bij 22 °C gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg met een pipet, voeg 500 μL PBS (10x) toe en ga verder met celsortering.
6. Zaaien van passage 1 (P1)
- Zaai 2 x 105 cellen in een kweekkolf van 75 cm2 .
- Voeg 12 ml DMEM lage glucose + 20% FBS + 10% antibioticum / antimycotisch (met 10.000 eenheden penicilline, 10 mg streptomycine en 25 μg amfotericine B per ml, 0,1 μm).
- Wanneer de cellen tussen 80% -90% confluence bereiken, voer trypsinisatie van adherente cellen uit met 2 ml 0,25% EDTA-trypsine gedurende 3 minuten.
- Tel cellen opnieuw (zoals vermeld in stap 3).
- Voer immunofenotypering opnieuw uit (zoals vermeld in stap 5).
7. Statistische analyse
- Gebruik Spearman's Rho Calculator33 om de sterkte van de associatie tussen de volgende variabelen met P < 0,05 te meten, zoals hieronder vermeld.
- Selecteer SVF-celopbrengst en het aantal dagen dat SVF in cultuur blijft in de eerste passage (P1) tot 80% -90% samenvloeiing (dagen tot P1).
- Selecteer SVF cellulaire opbrengst voor en na het gaan naar P1.
- Overweeg dagen tot P1 en cellulaire opbrengst voordat u naar P1 gaat.
- Selecteer SVF-celopbrengst met het gemiddelde percentage bevestigde ADSC.
- Bereken het percentage bevestigde ADSC en de cellulaire opbrengst voordat u naar P1 gaat.
- Bepaal de BMI en SVF cellulaire opbrengst.
8. Differentiatietest
- Voer de differentiatietest uit volgens een differentiatiekitprotocol (zie materiaaltabel). Figuur 4 toont de resultaten voor casus 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De karakterisering van de negen onderzochte personen, inclusief hun leeftijd, gewicht, lengte en BMI, wordt weergegeven in tabel 1.
Volgens de aanvankelijk gepresenteerde celopbrengst werd het celvolume dat in cultuur werd ingeënt berekend om zo dicht mogelijk bij de capaciteit van de 75 cm2 kweekkolf te liggen. Het monstervolume dat in elk geval wordt gezaaid, wordt beschreven in tabel 2. Vervolgens werd, volgens de initiële cellulaire opbrengst, een variabel volume cellen voor elk monster bepaald: 1 ml voor monsters met een hogere cellulaire opbrengst, 1,1 ml voor monsters met intermediaire cellulaire opbrengst en 2 ml voor monsters met een lagere cellulaire opbrengst om meer vergelijkbare celzaaiing tussen gevallen uit te voeren. Toen de cultuur ongeveer 80%-90% confluentie bereikte (figuur 2A) (ongeveer 7,5 ± 4,5 dagen), werd trypsinisatie van adherente cellen uitgevoerd (tabel 2 en figuur 2B).
De celopbrengst vóór passage 1 varieerde sterk, zelfs wanneer dezelfde samenvloeiing vóór trypsinisatie werd waargenomen (tabel 2). Dit kan worden verklaard door het feit dat cellen mogelijk in lagen zijn gegroeid. Verschillende parameters van de ADSC van de patiënten werden ook beoordeeld in verschillende perioden, zoals aangetoond in tabel 2.
Sommige monsters (case 1, case 2, case 7) konden niet worden geëvalueerd met betrekking tot het percentage bevestigde ADSC en het geschatte aantal ADSC in cultuur als gevolg van bacteriebesmetting en gebrek aan beschikbare cellen om gecryopreserveerde SVF-immunofenotypering uit te voeren. Volgens de Rho Calculator33 van Spearman werden geen statistische verschillen gevonden tussen SVF-cellulaire opbrengst en dagen tot P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), tussen SVF-cellulaire opbrengst voor en na het gaan naar P1 (r = -0,33333, p = 0,38071), en tussen dagen tot P1 en cellulaire opbrengst voordat naar P1 gaat (r = -0,53783, p = 0,13529). Bovendien werden geen significante verschillen waargenomen bij het correleren van de SVF-cellulaire opbrengst met het gemiddelde percentage bevestigde ADSC (r = -0,02857, p = 0,95716) en tussen het gemiddelde percentage bevestigde ADSC en de cellulaire opbrengst voordat naar P1 ging (r = 0,42857, p = 0,3965). Ook kon de correlatie tussen BMI en SVF cellulaire opbrengst niet als statistisch significant worden beschouwd (r = -0,46667, p = 0,20539). Tabel 3 toont flowcytometrische gegevens uitgevoerd op SVF-cellen gecryopreserveerd. De initiële SVF-cellen bevatten een subset van positieve cellen voor hematopoëtische markers (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. Uit de initiële SVF-celpopulatie drukte een bepaalde subgroep CD11b34 en CD1934 stromale cel-geassocieerde markers uit. De niveaus van CD7334, CD9034 en CD10534 lagen tussen deze waarden. De initiële SVF bevatte een subpopulatie van cellen die positief waren voor stamcel-geassocieerde markers (figuur 3). Een gemiddelde van 79% van de SRF's drukte de HSC-geassocieerde marker CD3434 uit.
In totaal was 21 minuten nodig voor de drie wasbeurten, 30 minuten voor collagenasevertering, 10 minuten voor centrifugatie en 5 minuten voor celtellingen en plating.
Figuur 1: Stappen uit het protocol vetweefsel-afgeleide stamcellen isolatie. (A) Zak voor lipoaspiraat transport in een gesloten systeem. (B) De stap van de rustzak wordt drie keer herhaald, na het wassen. (C) Lipoaspiraat na drie wasbeurten met DPBS. (D) Lipoaspiraat na collagenase vertering. (E) Lipoaspiraat na de spijsvertering wordt verdeeld in een buis van 50 ml. (F) Verteerd lipoaspiraat na centrifugatie. (G) Definitieve procesisolatie met de pellet met de stromale vasculaire fractie (SVF). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie en levensvatbaarheid van ADSC's. (A) Plastic adherente mesenchymale vetweefsel-afgeleide stamcellen bij de eerste passage na isolatie bij lichtmicroscopie. De cellen vertonen hechting aan de plastische en fibroblastachtige morfologie. (B) Trypan blue assay die levensvatbare cellen laat zien die met behulp van een lichtmicroscoop in de Neubauer-kamer zijn geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Subpopulatie van cellen positief voor stamcel-geassocieerde markers in SVF van geval 9 na 8 maanden cryopreservatie. R1: Totaal cellulair gebied geanalyseerd in FSC (Forward Scatter) x SSC (Side Scatter) (Grootte x Complexiteit); R2: CD45-negatieve regio, waarvan de populaties CD73, CD90 en CD105 positief zijn in deze regio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Differentiatietest. (A) ADSC-differentiatie in chondrocyten. (B) ADSC-differentiatie in osteocyten. (C) ADSC-differentiatie in adipocyten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Patiënt | Leeftijd bij verzameling (jaren) | Gewicht (kg) | Hoogte (meter) | BMI* |
| Geval 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Geval 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Geval 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Geval 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Geval 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Geval 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Geval 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Geval 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Geval 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tabel 1: Gegevens uit de steekproeven van de onderzochte personen. *BMI: body mass index.
| Patiënt | Opgehaald volume (ml) | SVF Celopbrengst (cel/ml) (x 105) | Volume in cultuur (ml) | Gemiddeld percentage bevestigde ADSC (%) | Aantal cellen in begincultuur (x 105) | Geschat aantal ADSC in cultuur (x 105) | Dagen t/m P1 | Cellulaire opbrengst voordat u naar P1 gaat (x 105) |
| Geval 1 | 96 | 9.2 | 2 | na | 18.4 | na | 10 | 18 |
| Geval 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Geval 3 | 100 | 26.2 | 1 | na | 26.2 | na | 12 | 6.6 |
| Geval 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Geval 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Geval 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Geval 7 | 98 | 6.8 | 2 | na | 13.6 | na | 8 | 10.5 |
| Geval 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Geval 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tabel 2: Gegevens uit verschillende stappen van de procedure van de negen geanalyseerde patiënten. SVF: stromale vasculaire fractie; ADSC: vetweefsel-afgeleide stamcel; P1: passage 1; na: gegevens niet beschikbaar.
| MONSTER | % ADSC BEPAALD DOOR MONOKLONALE ANTILICHAMEN | % VAN DE HEMATOPOËTISCHE CELLEN BEPAALD DOOR MONOKLONALE ANTILICHAMEN | CEL LEVENSVATBAARHEIDSTEST EN TIJDSTIP VAN SVF CRYOPRESERVATIE | |||||||||
| CD45-(*) | cd73+/cd90+ | CD73 + / CD105 + | CD105 + / CD90 + | Bedoelen | CD34 + | HLA-DR+ | CD11B + | CD19+ | LEVEND/DOOD + | |||
| Geval 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39.54% (2 jaar) | ||
| Geval 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38.30% (2 jaar) | ||
| Geval 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23.06% (2 jaar) | ||
| Geval 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56.76% (2 jaar) | ||
| Geval 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55.56% (1 Jaar) | ||
| Geval 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34% (8 maanden) | ||
Tabel 3: Flowcytometriegegevens van zes van de patiënten. (*) Uit deze CD45-cellen werd % ADSC met verschillende combinaties van stamcelmarkers bepaald. ADSC: vetweefsel-afgeleide stamcel; SVF: stromale vasculaire fractie; (*) Uit deze CD45-cellen werd % ADSC met verschillende combinaties van stamcelmarkers bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolatieopbrengst
Het is algemeen bekend dat het cryopreservatieproces, vaak vereist bij cellulaire therapie, resulteert in aanzienlijk celverlies, soms groter dan 50% 29,30,35. Een technische verbetering voor het verkrijgen van een hoge initiële cellulaire opbrengst in isolatie is dus van fundamenteel belang. De verzamelmethode van lipoaspiraat en de isolatiemethode van de cellen moeten zich richten op het behoud van een groter aantal cellen, het handhaven van een hoge levensvatbaarheid en het extraheren van het maximale aantal cellen uit het oorspronkelijke materiaal, rekening houdend met de langdurige cultuur en manipulatie van de cellen. Daarom is rechte kweekonderhoud vereist om de cellen weg te houden van apoptose, senescentie of genetische instabiliteit, omdat celtherapie waarschijnlijk effectief en veilig is voor patiënten.
Voor zover wij weten, is er geen eerder artikel dat deze reeks stappen gebruikt voor de isolatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van lipoaspiraat, wat resulteert in een tijdbesparende en kosten-batentechniek. In deze studie werd elke methodologische stap beredeneerd volgens de literatuur die de hoogste uiteindelijke celopbrengst in cellulaire isolatie liet zien. De nieuwigheid van de techniek die in deze studie werd uitgevoerd, was het gebruik van handmatige aspiratie geassocieerd met een reeks lipoaspiraatwassingen, waarbij de daaropvolgende zak rustte. De verzamelzak die werd gebruikt om lipoaspiraat te vervoeren en te verwerken, zorgde ervoor dat onverteerde weefselfragmenten niet konden deelnemen aan de collagenasevertering. De meest kritieke stap is het toevoegen van calciumchloride aan de verse spijsverteringsoplossing omdat het de werking van collagenase versterkt. De tijdwinst wordt nog niet gerapporteerd in de literatuur met een celontdooimethode die levensvatbare cellen mogelijk maakt, zelfs na lange cryopreservatietijd. De SVF-cellulaire opbrengst die in deze studie werd gevonden, varieerde grofweg van 6,15 tot 26,2 x 105 cellen / ml met een gemiddelde van 15,7 x 105 cellen / ml. Dit kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van een grotere hoeveelheid afgezogen adrenaline-oplossing, die mogelijk hoger of lager was volgens het stadium van de chirurgische procedure en het aantal andere bekende celtypen die over het algemeen in de SVF worden aangetroffen. Hoewel sommige studies negatieve correlaties hebben gevonden tussen BMI en ADSC-opbrengst36,37, vond deze studie geen significante correlatie, zoals de andere twee studies38,39, waardoor de mogelijkheid afneemt dat dat de oorzaak is van de ongelooflijke verscheidenheid aan SVF-cellulaire opbrengst die in deze studie wordt gevonden. Deze gegevens tonen aan dat de laagste SVF cellulaire opbrengst verkregen was 6,15 x 105 cellen / ml. Sommige studies hadden de efficiëntie van ADSC-isolatie al gemeten volgens de chirurgische techniek voor het verkrijgen van lipoaspiraat. Eén studie verkreeg 0,087 x 105 cellen / ml in vers geïsoleerde SVF voor de liposuctietechniek met behulp van adrenaline-oplossing (zoals gebruikt in deze studie) en 0,143 x 105 cellen / ml zonder26. Dit werk benadrukte het belang van de injectie met adrenaline-oplossing vanwege het vasoconstrictieve effect dat intraoperatieve bloedingen en blauwe plekken vermindert, omdat de meerderheid van de chirurgen ervoor kiest om in de klinische praktijk uit te voeren. Een andere studie toonde aan dat levende ADSC's geïsoleerd varieerden van 0 tot 0,59 x 105 cellen / g lipoaspiraat geoogst, met een gemiddelde van 0,295 (±0,25) x 105 cellen / g weefsel31. Sommige studies hebben verschillende manieren getest om een hogere ADSC-opbrengst te bereiken. Een van deze studies bereikte ongeveer 350 x 105 voor de methode die verschillende bestanddelen presenteerde in collagenaseverteringsbuffer en het gebruik van een orbitale shaker40. Een andere studie toonde 29,7 (±0,2) x 105 cellen / ml als het totale aantal SVF-cellen uit de buikstreek41. De in dit onderzoek gekozen buikstreek is nog steeds het referentiegebied voor de beste beschikbaarheid en toegankelijkheid van lipoaspiraat42. Het lichaamsgebied voor lipoaspiratenverzameling, naast andere factoren als donorleeftijd en methode van de gekozen collectie, is een sterke bepalende factor voor de kwaliteit van de ADSC-opbrengsten.
De mogelijkheid van besmetting van micro-organismen waardoor cellen niet beschikbaar zijn om de experimenten voort te zetten, was het enige uitvoeringsprobleem dat de voltooiing van deze studie beperkte. Zelfs met behulp van antibiotica en Good Manufacturing Practice-vereisten kan besmetting optreden als gevolg van het ontbreken van een totale aseptische omgeving om de aspiratie van vet uit te voeren.
SVF immunofenotypering
Volgens het Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee van de International Society for Cellular Therapy34 is een van de drie minimale criteria om menselijke mesenchymale stamcellen te definiëren dat de cellen CD10534, CD7334 en CD9034 moeten uitdrukken en geen CD4534, CD34 34, CD1434 of CD11b34, CD79a34 of CD1934 mogen uitdrukken, en HLA-DR34 oppervlaktemembraanmoleculen. Mitchell43 testte verse SVF-cellen door immunofenotypering en vond maximaal 54% van de cellen met ADSC-oppervlaktemarkers. In deze studie onthulde de immunofenotypering een hoger percentage bevestigde ADSC (niet-hematopoëtische cellen) van maximaal 78,91% in de SVF na langdurige cryopreservatie (variërend van 37,95% -78,91% met een gemiddelde van 53,68%). Er zijn aanwijzingen dat de voorlopers van een stamcelpopulatie die nog niet is vastgelegd, de CD34-marker 34,44,45 niet tot uitdrukking brengen. Afhankelijk van het stadium van differentiatie kunnen deCD34 34 negatieve stamcellen niet alleen hematopoëtische voorlopers genereren, maar ook meer specifieke mesenchymale precursoren, zoals osteoclasten, chondrocyten, myocyten, adipocyten en anderen. Sommige studies toonden de opvallende plasticiteit aan van de primitieve stamcelpopulatie, bestaande uit cellen met stromale celfunctie en hematopoëtische en mesenchymale voorlopers45. Volgens de literatuur is de volledige CD3434 functionele rol in de weefselvorming in SVF-cellen nog onbekend46. Mitchell43 toonde een gemiddelde van 60% cellen van SVF die CD3434-marker tot expressie brachten, terwijl in deze studie het gemiddelde 78,81% was. Het is bekend dat de expressie van CD3434-oppervlaktemarkering afneemt langs passages.
Adherente cellen en differentiatietest
Afhankelijk van het aantal cellen dat na isolatie werd verkregen, varieerde het aantal cellen dat in de eerste cultuur werd gezaaid. De eerste kweektijd voor het bereiken van 80%-90% samenvloeiing in 75 cm2 kolven duurde gemiddeld 8,4 dagen en een standaarddeviatie van 7,5 (±4,5) dagen variërend van 6,6 tot 16,1 x 105 cellen/ml. Opgemerkt moet worden dat zelfs voor de gevallen met een lagere cellulaire opbrengst, de eerste kweektijd leidde tot hoge cellulaire opbrengstindexen in vergelijking met de literatuur, waarschijnlijk vanwege de beste beschikbaarheid van levensvatbare cellen die tijdens het hele verzamel- en isolatieproces werden gehandhaafd. Eén studie verkreeg een cellulaire opbrengst van 3,75 (±1,42) x 105 ADSC per ml lipoaspiraat binnen een cultuurperiode van 4,1 (±0,7) dagen47. Een andere studie toonde een opbrengst van nucleated SVF-cellen van 3,08 (±1,40) x 105 per millimeter met een gemiddelde van 6,0 (±2,4) dagen in de eerste kweekperiode43. In deze studie werd door het schatten van het aantal ADSC gezaaid in cultuur, dat varieerde als functie van het aantal cellen waargenomen in de SVF uit de verzameling van hetzelfde volume van 100 ml lipoaspiraat, geverifieerd dat het aantal dagen om P1 te bereiken geen relatie had met het celvolume. Bijvoorbeeld, voor geval 9, waarin 12,2 x 105 cellen werden geïncubeerd, waren 6 dagen nodig om 80% -90% samenvloeiing te bereiken. Voor geval 6, waarin 14,6 x 105 cellen in cultuur werden gezaaid, was een langere periode (10 dagen) nodig om hetzelfde niveau van samenvloeiing te bereiken. Misschien is een minimaal ADSC-nummer voldoende voor de eerste hechtingsperiode. Er kan sprake zijn van significante interindividuele variatie, zoals comorbiditeiten, leeftijd en algemene gezondheidstoestand. Sommige studies in de literatuur betwijfelden het belang van het overwegen van de interindividuele variabiliteit van de patiënten voor SVF-celopbrengst48,49.
Volgens het Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee van de International Society for Cellular Therapy34 moet mesenchymale cel het vermogen hebben om te differentiëren in drie verschillende celtypen als osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen zoals aangetoond in figuur 4.
Levensvatbaarheid van cellen, cryopreservatie en genetische instabiliteit
Er zijn verschillende methoden gebruikt om levensvatbaarheidsverlies te bepalen, gedefinieerd als schade aan de integriteit van het plasmamembraan50. De culturen kunnen echter ook vroege apoptotische cellen presenteren die deze benaderingen kunnen negeren omdat ze een intact plasmamembraan behouden, maar ze zijn niet levensvatbaar. De hier gerapporteerde resultaten tonen een groot bereik in levensvatbaarheidsmarker, van 23,06% -72,34%, met een gemiddelde van 47,6% na cryopreservatie op lange termijn. Aangezien cryopreservatie een belangrijke stap is met betrekking tot celtherapie, is herstel van het maximale aantal levensvatbare en functionele stamcellen na ontdooien een van de prioritaire kwesties voor het succes van celtherapie. De literatuur heeft aangetoond dat ten minste 50% van de levensvatbaarheid van cellen verloren gaat van 1-4 maanden na cryopreservatie43. Met name de laagste indexen die in deze studie worden gepresenteerd, zijn van case 5, case 4 en case 2, de oudste gecryopreserveerde monsters (ongeveer 2 jaar). Hoewel ze de laagste levensvatbaarheidsindexen presenteerden, toonden ze een hoge cellulaire opbrengst in trypan blue dye exclusion assay in verse SVF. Hoewel de literatuur oorzaken van levensvatbaarheidsverlies ondersteunt, zijn deze percentages lager dan verwacht. Temperatuurschommelingen in celopslag als gevolg van technische redenen kunnen de toename en accumulatie van stress veroorzaken en de accumulatie van waterige delen bevorderen, waardoor kristallen worden gegenereerd die het plasmamembraan beschadigen tijdens cryopreservatie op lange termijn51. De literatuur toont meer dan 70% levensvatbaarheid voor monsters met dezelfde of langere vriestijd. De levensvatbaarheidscontrole werd echter uitgevoerd met een andere techniek dan die in dit onderzoek52. Een andere studie toonde aan dat langere cryopreservatie de cellulaire levensvatbaarheid negatief beïnvloedt31, wat kan worden verklaard door temperatuurschommelingen in de vriezer van -80 °C. Daarom moeten cellen vaak te lang in cultuur blijven, wat de stress van de celcyclus verhoogt, risico's met zich meebrengt voor genetische instabiliteit en bijgevolg cellulaire therapie in gevaar brengt. Er is ook een consensus in de literatuur die enkele stressfactoren aangeeft en hoe deze de cytogenetische stabiliteit van cellen beïnvloeden, wat essentieel is om de langdurige stamcelkweek te behouden die nodig is voor celtherapie35,53.
Voordeel van de methodologie
Tot op heden toont de literatuur geen gestandaardiseerd protocol om ADSC te isoleren met als doel klinische toepassingen. De meeste studies tonen complexe, tijdrovende protocollen24. In deze studie moet de efficiëntie van de methode versus de tijd die nodig is om de initiële cellulaire opbrengst te voltooien worden benadrukt: ongeveer 1,5 uur. Volgens de literatuur kan isolatie van van vetweefsel afgeleide stamcellen ongeveer 3 uur tot 8 uur54,55 duren. De tijdwinst in combinatie met het hoge cellulaire inkomen is dus van cruciaal belang voor de vooruitgang van regeneratieve geneeskunde. Meer beoordelingen van de levensvatbaarheid van cellen moeten parallel aan die welke in dit werk worden uitgevoerd, worden uitgevoerd om deze methode te verbeteren. Verdere gerandomiseerde gecontroleerde studies met een uitgebreidere steekproef met behulp van deze methodologie zijn nodig om deze resultaten mede te ondertekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken de patiënten die vrijwillig hebben deelgenomen en het medisch en verplegend personeel van het ziekenhuis São Paulo. Deze studie werd ondersteund door het Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) en Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brazilië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
