Summary
Настоящий протокол описывает улучшенную методологию изоляции ADSC, приводящую к огромному клеточному выходу с увеличением времени по сравнению с литературой. Это исследование также предоставляет простой метод получения относительно большого количества жизнеспособных клеток после длительной криоконсервации.
Abstract
Мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, становятся все более привлекательными, поскольку они демонстрируют соответствующие особенности и являются доступным источником для регенеративных клинических применений. Различные протоколы были использованы для получения стволовых клеток, полученных из жировой ткани. В этой статье описываются различные этапы улучшенного протокола экономии времени для получения более значительного количества ADSC, показывая, как криоконсервировать и размораживать ADSC для получения жизнеспособных клеток для расширения культуры. Сто миллилитров липоаспирата были собраны с помощью липосакции шприца калибра 26 см и калибра 3 мм из области живота девяти пациентов, которые впоследствии прошли плановую абдоминопластику. Выделение стволовых клеток проводилось серией промывок раствором фосфатного буферного физиологического раствора (DPBS) Dulbecco, дополненным кальцием, и использованием коллагеназы. Клетки стромальной сосудистой фракции (SVF) были криоконсервированы, и их жизнеспособность была проверена иммунофенотипированием. Клеточный выход SVF составлял 15,7 x 105 клеток/мл, в диапазоне от 6,1 до 26,2 клеток/мл. Адгезивные клетки SVF достигали слияния в среднем через 7,5 (±4,5) дней, со средним клеточным выходом 12,3 (± 5,7) х 105 клеток / мл. Жизнеспособность размороженного SVF через 8 месяцев, 1 год и 2 года колебалась между 23,06%-72,34% в среднем 47,7% (±24,64) с самой низкой жизнеспособностью, коррелирующей со случаями двухлетней заморозки. Использование раствора DPBS, дополненного кальцием и временем отдыха мешков для осаждения жира с более коротким временем переваривания коллагеназы, привело к увеличению конечного клеточного выхода стволовых клеток. Детальная процедура получения высоких урожаев жизнеспособных стволовых клеток была более эффективной с точки зрения времени и клеточного выхода, чем методы из предыдущих исследований. Даже после длительного периода криоконсервации в SVF были обнаружены жизнеспособные клетки ADSC.
Introduction
Мезенхимальные стволовые клетки человека выгодны как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Использование этого типа взрослых клеток преодолевает этические вопросы по сравнению с использованием эмбриональных или других клеток, являясь одним из наиболее перспективных направлений исследований в области инженерии регенерации аутологичных тканей и клеточной терапии1, таких как опухолевая область, лечение дегенеративных заболеваний и терапевтические применения в области реконструктивной хирургии 2,3,4, 5. Ранее сообщалось, что существует обильный источник мезенхимальных мультипотентных и плюрипотентных стволовых клеток в стромальной сосудистой клеточной фракции жировой ткани 6,7. Эти ADSC считаются отличными кандидатами для использования в клеточной терапии и трансплантации / инфузии, поскольку значительное количество клеток с сильной способностью к расширению ex vivo может быть легко получено с высоким выходом из минимально инвазивной процедуры 5,8.
Было также продемонстрировано, что жировая ткань обладает большей способностью обеспечивать мезенхимальные стволовые клетки, чем два других источника (ткань костного мозга и пуповины)9. Помимо того, что ADSC плохо иммуногенен и обладает высокой способностью интегрироваться в ткань хозяина и взаимодействовать с окружающими тканями 4,10, ОН обладает мультипотентной способностью дифференцировки в клеточные линии, с сообщениями о хондрогенной, остеогенной и миогенной дифференцировке в соответствующих условиях культивирования 11,12,13, и в клетки, такие как поджелудочная железа, гепатоциты, и нейрогенные клетки 14,15,16.
Научное сообщество сходится во мнении, что иммуномодулирующее действие мезенхимальных стволовых клеток является более актуальным механизмом действия клеточной терапии 17,18,19, чем их свойство дифференцировки. Одним из наиболее значимых достоинств применения ADSC является возможность аутологичной инфузии или пересадки, становящейся альтернативным лечением нескольких заболеваний. Для регенеративной медицины ADSC уже применялись в случаях повреждения печени, реконструкции сердечной мышцы, регенерации нервной ткани, улучшения функции скелетных мышц, регенерации костей, терапии рака и лечения диабета20,21.
На сегодняшний день зарегистрировано 263 клинических испытания для оценки потенциала ADSC, перечисленных на веб-сайте Национальных институтов здоровья22 США. Были установлены различные протоколы сбора жировой ткани, но в литературе нет единого мнения о стандартизированном методе выделения ADSC для клинического использования23,24. Методы обработки липоаспирата во время и после операции могут непосредственно влиять на жизнеспособность клеток, конечный клеточный выход25 и качество популяции ADSC20. Что касается хирургического предварительного лечения, то не установлено, какой хирургический метод предварительного лечения дает более значительное количество жизнеспособных клеток после выделения или влияет ли раствор анестетика, введенный в жировую ткань, на выход клеток и их функции26. Аналогичным образом, разница между методами получения жировых клеток может привести к 70% уменьшению количества жизнеспособных ADSC20. Согласно литературе, следует избегать механических методов лечения для получения клеточных популяций с высокой жизнеспособностью, включая ультразвук, поскольку они могут разрушить жировуюткань 20. Тем не менее, ручной метод аспирации жира со шприцами менее вреден, вызывая меньшее разрушение клеток, при этом тумесцентная липосакция дает значительное количество клеток с лучшим качеством26.
В этой методике используется солевой раствор с лидокаином и адреналином, который вводится в область липосакции. На каждые 3 мл объема вводимого раствора аспирируется 1 мл. В этом исследовании была выполнена методика влажной липосакции, при которой на каждый 1 мл введенного адреналина и физиологического раствора аспирируется 0,2 мл жировой ткани. Использование пищеварительных ферментов, особенно коллагеназы, является общим для процесса выделения ADSC.
После первого этапа выделения в лаборатории конечная гранула называется стромальной сосудистой фракцией (SVF). Он содержит различные типы клеток27, включая эндотелиальные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки, макрофаги, гладкомышечные клетки, лимфоциты, перициты, преадипоциты и ADSC, которые способны к адгезии. Как только окончательное выделение заключено из культур in vitro , клетки, которые не прилипли к пластику, удаляются в средах обмена. После восьми недель расширения, средних изменений и проходов, ADSC представляют большую часть клеточной популяции в колбах20. Одним из наиболее значительных преимуществ использования изолированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для возможной будущей терапии является возможность криоконсервации. Было продемонстрировано, что криоконсервированный липоаспират является потенциальным источником SVF-клеток даже после 6 недель замораживания28, с биологической активностью даже после 2 лет криоконсервации29 и полной способностью расти и дифференцироваться в культуре30. Однако в процессе оттаивания значительного процента клеток обычно теряется31. Поэтому процесс удаления липоаспирата и следующие методы изоляции клеток должны обеспечивать самый высокий выход клеток.
Это исследование описывает более быструю методологию сбора и изоляции ADSC, демонстрирующую высокий клеточный выход и жизнеспособность для повышения эффективности клеточной терапии. Кроме того, был оценен эффект этого улучшенного метода после длительной криоконсервации SVF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Настоящее исследование одобрено Комитетом по этике UNIFESP (протокольный номер: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), выполнено после получения письменного информированного согласия от пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией (2004). Выборка настоящего исследования состоит из девяти пациенток в возрасте 33-50 лет (средний возраст 41,5) и среднего начального индекса массы тела (ИМТ) 24,54 (в диапазоне от 22,32 до 26,77) (таблица 1), которые прошли эстетическую абдоминопластику из-за избытка кожи после беременности, в отделении пластической хирургии Федерального университета Сан-Паулу (UNIFESP), Бразилия. Чтобы уменьшить предвзятость, пациенты были выбраны как однородная группа с учетом пола, возраста и ИМТ. Наборы данных, использованные и/или проанализированные в ходе данного исследования, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.
1. Сбор липоаспирата
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в хирургическом центре.
- Используйте 4% хлоргексидина глюконат (см. Таблицу материалов) для подготовки кожи и асептики.
- Выполняют подкожный разрез 2 мм (между поддермой и апоневрозом). Вставьте канюлю Klein калибра 26 мм 3 G и калибра 3 мм и шприц для введения общего объема 500 мл адреналинового раствора (1 мг/мл) (см. Таблицу материалов), разбавленного в физиологическом растворе (1:1 000 000) в подрамниковой области.
- Подключите шприц объемом 60 мл к канюле для липосакции калибра 26 мм 3 G и калибра 3 мм и вставьте ее через разрез кожи, зафиксировав поршень для создания вакуума.
- Делайте толкающие и тянущие движения так, чтобы при создании вакуума липоаспират оставался в шприце объемом 60 мл.
- Используя стерильный соединитель с клапаном, переведите 100 мл собранного липоаспирата в мешок для переноса поливинилхлорида объемом 150 мл (см. Таблицу материалов).
- Упакуйте мешок для переноски в полистирольную коробку при комнатной температуре (~25 °C) и немедленно отнесите его в лабораторию. Не потратьте больше 30 минут, чтобы начать обработку тканей.
2. Переработка липоаспирата
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в лаборатории.
- Сначала взвесьте мешок, измерьте температуру с помощью цифрового бесконтактного инфракрасного клинического термометра и оставьте мешок лежать в течение 5 минут внутри ламинарной проточной камеры для осаждения более жирных слоев (пузырьков) и разделения тканей, содержащих интересующие клетки.
- Выполните серию промывок тканей. Первая стирка: введите 100 мл DPBS с кальцием (1x) в переносной мешок и перемешайте его руками.
- Дайте ему постоять 5 минут и удалите большую часть базальной жидкости, которая выпадает в осадок.
- Выбросьте базальную жидкость с помощью шприца объемом 60 мл, прикрепленного к адаптеру для мешка. Этот процесс необходимо повторить дважды.
- Добавить в пакет 100 мл раствора для пищеварения (93 мл безкальциевого DPBS + 60 мкл хлористого кальция (1 г/л) + 7 мл 0,075% стерильной коллагеназы, см. Таблицу материалов) и оставить при 37 °C в течение 30 мин при медленном перемешивании.
- Переложите все содержимое мешка в четыре конические трубки по 50 мл и центрифугируйте их при 400 х г при 22 °C в течение 10 мин.
- Удалите и выбросьте супернатант и добавьте 5 мл модифицированной среды Dulbecco Eagle's medium (DMEM) с низким содержанием глюкозы, дополненной 20% FBS (фетальной бычьей сывороткой) в клеточную гранулу (рисунок 1).
3. Подсчет SVF ячеек
- Смешайте свежий раствор 10 мкл трипан-синего под 0,05% в дистиллированной воде с 10 мкл клеточной суспензии в течение 5 мин.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки в камере32 подсчета клеток Нойбауэра с помощью инвертированного светового микроскопа (см. Таблицу материалов) при 20-кратном увеличении.
- Повторно суспендируют клеточную гранулу в криопротекторной среде (5 мл FBS + 10% диметилсульфоксида - DMSO) в концентрации 1 х 106 клеток/мл.
- Поместите 1 мл этой смеси в криовиалы. Используйте морозильный контейнер (см. Таблицу материалов) со скоростью охлаждения (от 1 °C/мин до -80 °C).
- Хранить при -80 °C в течение 1 года.
- По истечении этого времени хранить в стандартных кассетных коробках, погруженных в фазу паров жидкого азота (-165 °C).
4. Процесс оттаивания клеток
- Извлеките флаконы из жидкого азота и поместите их сразу на водяную баню при температуре 37 °C на 1 мин.
- Поместите клетки SVF в коническую трубку с 4 мл DMEM (низкий уровень глюкозы, дополненный 20% FBS), предварительно нагретый при 37 °C.
- Центрифуга при 400 х г при 22 °C в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и добавьте 1 мл DMEM (низкий уровень глюкозы) + 10% FBS. Выполните иммунофенотипирование, выполнив следующие действия.
5. Метод проточной цитометрии (множественная маркировка иммунофенотипов)
- Поместите 1 мл клеточной гранулы (концентрация 1000 клеток/мкл) в пять пробирок для цитометрии (по 200 мкл каждая).
- Центрифугу при 400 х г при 22 °С в течение 5 мин и выбросьте супернатант с пипеткой.
- Добавьте 300 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (10x), центрифугу при 400 x g при 22 °C и выбросьте супернатант с пипеткой.
- Подготовьте пять пробирок для различных комбинаций маркеров следующим образом: 5 мкл CD11B/5 мкл CD19/20 мкл CD45; 5 мкл CD73/20 мкл CD90/5 мкл CD105/20 мкл CD45; 20 мкл CD34/5 мкл HLA-DR/20 мкл CD45; Анализ жизнеспособности клеток - 5 мкл флуоресцентного реакционноспособного красителя. (см. Таблицу материалов) и трубку с неиспорченными клетками и PBS в качестве отрицательного контроля. Гомогенизируют в вихре и инкубируют при 4 °C в течение 30 мин.
- Центрифугу при 400 х г при 22 °C в течение 5 мин, выбросьте супернатант с пипеткой, добавьте 500 мкл PBS (10x) и приступайте к сортировке ячеек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пять тысяч событий приобретаются на каждое антитело, установленное в проточном цитометре четырех цветов и пяти параметров, и анализируются с помощью программного обеспечения CellQuest.
- Центрифугу при 400 х г при 22 °C в течение 5 мин, выбросьте супернатант с пипеткой, добавьте 500 мкл PBS (10x) и приступайте к сортировке ячеек.
6. Посев прохода 1 (Р1)
- Семена 2 х 105 клеток в культуральной колбе 75см2 .
- Добавьте 12 мл DMEM с низким содержанием глюкозы + 20% FBS + 10% антибиотика / антимикотика (с 10 000 единиц пенициллина, 10 мг стрептомицина и 25 мкг амфотерицина B на мл, 0,1 мкм).
- Когда клетки достигнут 80%-90% слияния, выполняют трипсинизацию адгезивных клеток 2 мл 0,25% ЭДТА-трипсина в течение 3 мин.
- Снова подсчитайте ячейки (как упоминалось в шаге 3).
- Снова выполните иммунофенотипирование (как упоминалось в шаге 5).
7. Статистический анализ
- Используйте Rho Calculator33 Спирмена для измерения силы связи между следующими переменными с P < 0,05, как указано ниже.
- Выберите выход клеток SVF и количество дней, в течение которых SVF остается в культуре в первом прохождении (P1) до 80%-90% слияния (дней до P1).
- Выберите выход сотовой связи SVF до и после перехода на P1.
- Рассмотрите дни до P1 и клеточный выход, прежде чем перейти к P1.
- Выберите выход сотовой связи SVF со средним процентом подтвержденного ADSC.
- Рассчитайте процент подтвержденного ADSC и клеточный выход перед переходом к P1.
- Определите имт и SVF клеточный выход.
8. Дифференциация
- Выполните анализ дифференцировки в соответствии с протоколом дифференциационного набора (см. Таблицу материалов). На рисунке 4 показаны результаты для случая 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика девяти изученных лиц, включая их возраст, вес, рост и ИМТ, приведена в таблице 1.
В соответствии с первоначально представленным клеточным выходом, объем клеток, привитых в культуре, был рассчитан как максимально приближенный к емкости колбы культуры 75см2 . Объем посеянного образца в каждом случае описан в таблице 2. Затем, в соответствии с начальным клеточным выходом, был определен переменный объем клеток для каждого образца: 1 мл для образцов с более высоким клеточным выходом, 1,1 мл для образцов с промежуточным клеточным выходом и 2 мл для образцов с более низким клеточным выходом, чтобы выполнить более похожий посев клеток между случаями. Когда культура достигала около 80%-90% слияния (фиг.2А) (около 7,5 ± 4,5 дней), проводили трипсинизацию адгезивных клеток (таблица 2 и фиг.2В).
Клеточный выход перед пассажем 1 широко варьировался даже тогда, когда наблюдалось такое же слияние до трипсинизации (таблица 2). Это можно объяснить тем, что клетки, возможно, выросли слоями. Различные параметры ИЗ ADSC пациентов также оценивались в разные периоды, как показано в таблице 2.
Некоторые образцы (случай 1, случай 2, случай 7) не могли быть оценены относительно процента подтвержденного ADSC и предполагаемого количества ADSC в культуре из-за загрязнения бактериями и отсутствия доступных клеток для выполнения криоконсервированного иммунофенотипирования SVF. Согласно калькулятору RhoСпирмена 33, не было обнаружено статистических различий между выходом клеток SVF и днями до P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), между выходом клеток SVF до и после перехода к P1 (r = -0,33333, p = 0,38071) и между днями до P1 и клеточным выходом до P1 (r = -0,53783, p = 0,13529). Кроме того, не наблюдалось существенных различий при корреляции клеточного выхода SVF со средним процентом подтвержденного ADSC (r = -0,02857, p = 0,95716) и между средним процентом подтвержденного ADSC и клеточным выходом до перехода к P1 (r = 0,42857, p = 0,3965). Также корреляцию между ИМТ и svF клеточным выходом нельзя считать статистически значимой (r = -0,46667, p = 0,20539). В таблице 3 показаны проточные цитометрические данные, выполненные на криоконсервированных клетках SVF. Исходные клетки SVF содержали подмножество положительных клеток для гемопоэтических маркеров (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. Из исходной популяции клеток SVF определенная подгруппа экспрессировала CD11b34 и CD1934 стромальные клеточно-ассоциированные маркеры. Уровни CD7334, CD9034 и CD10534 были промежуточными между этими значениями. Первоначальный SVF содержал субпопуляцию клеток, положительных для маркеров, связанных со стволовыми клетками (рисунок 3). В среднем 79% SVF экспрессировали HSC-ассоциированный маркер CD3434.
В общей сложности 21 минута была необходима для трех промывок, 30 минут для переваривания коллагеназы, 10 минут для центрифугирования и 5 минут для подсчета и покрытия клеток.
Рисунок 1: Этапы из протокола выделения стволовых клеток, полученных из жировой ткани. (А) Мешок для транспортировки липоаспирата в закрытой системе. (B) Этап покоя мешка повторяется три раза после стирки. (C) Липоаспират после трех промывок с DPBS. (D) Липоаспират после переваривания коллагеназы. (E) Липоаспират после переваривания распределяется в пробирке объемом 50 мл. (F) Переваренный липоаспират после центрифугирования. (G) Окончательная изоляция процесса гранулой со стромальной сосудистой фракцией (SVF). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфология и жизнеспособность ADSC. (A) Пластические адгезивные мезенхимальные жировые стволовые клетки при первом прохождении после выделения при световой микроскопии. Клетки проявляют адгезию к пластической и фибробластоподобной морфологии. (B) Синий анализ Трипана, показывающий жизнеспособные клетки, подсчитанные в камере Нойбауэра с использованием светового микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Субпопуляция клеток, положительных на маркеры, связанные со стволовыми клетками, в SVF случая 9 после 8 месяцев криоконсервации. R1: Общая клеточная область, проанализированная в FSC (прямое рассеяние) x SSC (боковое рассеяние) (размер x сложность); R2: CD45 отрицательная область, популяции которой CD73, CD90 и CD105 положительны в этом регионе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ дифференцировки. (А) Дифференцировка ADSC в хондроцитах. (B) Дифференцировка ADSC в остеоцитах. (C) Дифференцировка ADSC в адипоцитах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Терпеливый | Возраст при сборе (лет) | Вес (кг) | Высота (метр) | ИМТ* |
| Случай 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Случай 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Случай 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Случай 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Дело 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Дело 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Дело 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Случай 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Случай 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Таблица 1: Данные из выборок исследуемых лиц. *ИМТ: индекс массы тела.
| Терпеливый | Собранный объем (мл) | SvF Клеточный выход (ячейка/мл) (x 105) | Объем в культуре (мл) | Средний процент подтвержденных ADSC (%) | Количество клеток в исходной культуре (x 105) | Предполагаемое количество ADSC в культуре (x 105) | Дни до P1 | Клеточный выход перед переходом на P1 (x 105) |
| Случай 1 | 96 | 9.2 | 2 | на | 18.4 | на | 10 | 18 |
| Случай 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Случай 3 | 100 | 26.2 | 1 | на | 26.2 | на | 12 | 6.6 |
| Случай 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Дело 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Дело 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Дело 7 | 98 | 6.8 | 2 | на | 13.6 | на | 8 | 10.5 |
| Случай 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Случай 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| СД | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Таблица 2: Данные с разных этапов процедуры от девяти проанализированных пациентов. SVF: стромальная сосудистая фракция; ADSC: стволовые клетки, полученные из жировой ткани; P1: отрывок 1; na: данные отсутствуют.
| ОБРАЗЕЦ | % ADSC, ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ | % КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК, ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ | АНАЛИЗ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК И ВРЕМЯ КРИОКОНСЕРВАЦИИ SVF | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Значить | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | ЖИВЫЕ/МЕРТВЫЕ + | |||
| Случай 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39.54% (2 года) | ||
| Случай 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38.30% (2 года) | ||
| Дело 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23.06% (2 года) | ||
| Дело 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56.76% (2 года) | ||
| Случай 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55.56% (1 год) | ||
| Случай 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34% (8 месяцев) | ||
Таблица 3: Данные проточной цитометрии от шести пациентов. (*) Из этих CD45-клеток определяли % ADSC с различными комбинациями маркеров стволовых клеток. ADSC: стволовые клетки, полученные из жировой ткани; SVF: стромальная сосудистая фракция; (*) Из этих CD45-клеток определяли % ADSC с различными комбинациями маркеров стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выход изоляции
Хорошо известно, что процесс криоконсервации, часто необходимый в клеточной терапии, приводит к значительной потере клеток, иногда превышающей 50%29,30,35. Таким образом, техническое усовершенствование для получения высокого начального клеточного выхода в изоляции является фундаментальным. Метод сбора липоаспирата и метод выделения клеток должны быть сосредоточены на сохранении большего количества клеток, поддержании высокой жизнеспособности и извлечении максимального количества клеток из исходного материала с учетом долгосрочной культуры и манипуляций с клетками. Поэтому требуется прямая поддержка культуры, чтобы держать клетки подальше от апоптоза, старения или генетической нестабильности, поскольку клеточная терапия, вероятно, будет эффективной и безопасной для пациентов.
Насколько нам известно, нет предыдущей статьи, использующей этот набор шагов для выделения мезенхимальных стволовых клеток, полученных из липоаспирата, что приводит к экономии времени и экономии средств. В этом исследовании каждый методологический шаг был аргументирован в соответствии с литературой, которая показала самый высокий конечный выход клеток в клеточной изоляции. Новизна методики, выполненной в данном исследовании, заключалась в использовании мануальной аспирации, связанной с серией липоаспиратных промываний, с последующим отдыхом мешка. Мешок для сбора, используемый для транспортировки и переработки липоаспирата, позволял непереваренным фрагментам тканей не участвовать в переваривании коллагеназы. Наиболее важным шагом является добавление хлорида кальция в свежий раствор для пищеварения, поскольку он потенцирует действие коллагеназы. О выигрыше во времени еще не сообщается в литературе с помощью метода оттаивания клеток, который позволяет жизнеспособным клеткам даже после длительного времени криоконсервации. Клеточный выход SVF, обнаруженный в этом исследовании, варьировался в широких пределах от 6,15 до 26,2 х 105 клеток / мл со средним значением 15,7 х 105 клеток / мл. Это может быть связано с наличием более значительного количества всасываемого адреналинового раствора, который может быть выше или ниже в зависимости от стадии хирургической процедуры и количества других известных типов клеток, обычно встречающихся в SVF. Хотя некоторые исследования обнаружили отрицательные корреляции между ИМТ и ADSC 36,37, это исследование не обнаружило значимой корреляции, как и в двух других исследованиях38,39, уменьшая вероятность того, что это является причиной невероятного разнообразия клеточного выхода SVF, обнаруженного в этом исследовании. Эти данные показывают, что самый низкий полученный клеточный выход SVF составил 6,15 х 105 клеток/мл. В некоторых исследованиях уже измерялась эффективность выделения ADSC в соответствии с хирургическим методом получения липоаспирата. Одно исследование получило 0,087 х 105 клеток / мл в свежеизолированном SVF для техники липосакции с использованием раствора адреналина (как использовалось в этом исследовании) и 0,143 х 105 клеток / мл без него26. Эта работа подчеркнула важность инъекции адреналинового раствора из-за сосудосуживающего эффекта, который уменьшает интраоперационное кровотечение и синяки, как большинство хирургов предпочитают выполнять в клинической практике. Другое исследование показало, что живые выделенные ADSC варьировались от 0 до 0,59 х 105 клеток / г липоаспирата собранного, в среднем 0,295 (±0,25) х 105 клеток / г ткани31. В некоторых исследованиях были протестированы различные способы достижения более высокого выхода ADSC. В одном из этих исследований было достигнуто около 350 х 105 для метода, который представлял различные компоненты в буфере переваривания коллагеназы и использование орбитального шейкера40. Другое исследование показало 29,7 (±0,2) х 105 клеток / мл в качестве общего количества клеток SVF из брюшной области41. Область живота, выбранная в этом исследовании, по-прежнему является эталонной областью для наилучшего наличия и доступности липоаспирата42. Область тела для сбора липоаспиратов, среди прочих факторов, таких как возраст донора и выбранный метод сбора, является сильным фактором, определяющим качество выходов ADSC.
Возможность загрязнения микроорганизмами, вызывающего недоступность клеток для продолжения экспериментов, была единственной проблемой выполнения, которая ограничивала завершение этого исследования. Даже при использовании антибиотиков и требований надлежащей производственной практики загрязнение может произойти из-за отсутствия общей асептической среды для выполнения аспирации жира.
SvF иммунофенотипирование
Согласно Комитету по мезенхимальным и тканевым стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии34, одним из трех минимальных критериев для определения мезенхимальных стволовых клеток человека являетсято, что клетки должны экспрессировать CD10534, CD73 34 и CD9034 и не должны экспрессироватьCD45 34,CD34 34, CD1434 или CD11b34, CD79a34 или CD1934, и молекулы поверхностной мембраны HLA-DR34. Mitchell43 протестировал свежие клетки SVF путем иммунофенотипирования и обнаружил максимум 54% клеток с поверхностными маркерами ADSC. В этом исследовании иммунофенотипирование выявило более высокий процент подтвержденных ADSC (негематопоэтических клеток) до 78,91% в SVF после длительной криоконсервации (в диапазоне от 37,95% до 78,91% при среднем значении 53,68%). Фактические данные показывают, что прародители популяции стволовых клеток, еще не зарегистрированные, не экспрессируют маркер CD34 34,44,45. В зависимости от стадии дифференцировки, CD3434 отрицательные стволовые клетки могут генерировать не только кроветворные предшественники, но и более специфические мезенхимальные предшественники, такие как остеокласты, хондроциты, миоциты, адипоциты и другие. Некоторые исследования продемонстрировали поразительную пластичность примитивной популяции стволовых клеток, состоящей из клеток со стромальной функцией клеток и гемопоэтических и мезенхимальных предшественников45. Согласно литературе, полная функциональная рольCD34 34 в образовании тканей в клетках SVF до сих пор неизвестна46. Mitchell43 показал среднее значение 60% клеток SVF, экспрессирующих маркерCD34 34, тогда как в этом исследовании среднее значение составляло 78,81%. Известно, что экспрессия CD3434 поверхностного маркера уменьшается вдоль проходов.
Адгезивные клетки и дифференцировка
В зависимости от количества клеток, полученных после выделения, количество клеток, посеянных в первой культуре, варьировалось. Первое время культивирования для достижения 80%-90% слияния в колбахразмером 75 см2 занимало в среднем 8,4 дня и стандартное отклонение 7,5 (±4,5) дней в диапазоне от 6,6 до 16,1 х 105 клеток/мл. Следует отметить, что даже в случаях с более низким клеточным выходом первое время культивирования привело к высоким показателям клеточного выхода по сравнению с литературой, вероятно, из-за наилучшей доступности жизнеспособных клеток, поддерживаемых в течение всего процесса сбора и выделения. Одно исследование получило клеточный выход 3,75 (±1,42) х 105 ADSC на мл липоаспирата в течение 4,1 (±0,7) дневного периода культивирования47. Другое исследование продемонстрировало выход ядерных SVF-клеток 3,08 (±1,40) х 105 на миллиметр со средним значением 6,0 (±2,4) дней в первом культуральном периоде43. В этом исследовании, оценивая количество ADSC, посеянных в культуре, которое варьировалось в зависимости от количества клеток, наблюдаемых в SVF из коллекции того же объема 100 мл липоаспирата, было подтверждено, что количество дней для достижения P1 не имеет никакого отношения к объему клеток. Например, для случая 9, в котором инкубировали 12,2 х 105 клеток, требовалось 6 дней, чтобы достичь 80%-90% слияния. Для случая 6, в котором 14,6 х 105 клеток были посеяны в культуре, требовался более длительный период (10 дней), чтобы достичь того же уровня слияния. Возможно, минимального числа ADSC хватит на первый период адгезии. Могут быть значительные межиндивидуальные вариации, такие как сопутствующие заболевания, возраст и общее состояние здоровья. Некоторые исследования в литературе ставили под сомнение важность учета межиндивидуальной изменчивости пациентов для SVF-клеток, дающих48,49.
По данным Комитета по мезенхимальным и тканевым стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии34, мезенхимальные клетки должны обладать способностью дифференцироваться на три различных типа клеток в качестве остеогенных, адипогенных и хондрогенных линий, как это было продемонстрировано на рисунке 4.
Жизнеспособность клеток, криоконсервация и генетическая нестабильность
Для определения потери жизнеспособности были использованы различные методы, определяемые как повреждение целостности плазматической мембраны50. Тем не менее, культуры могут также представлять ранние апоптотические клетки, которые эти подходы могут игнорировать, потому что они поддерживают неповрежденную плазматическую мембрану, но они нежизнеспособны. Результаты, представленные здесь, показывают большой диапазон маркера жизнеспособности, от 23,06% до 72,34%, со средним значением 47,6% после длительной криоконсервации. Учитывая, что криоконсервация является важным шагом в клеточной терапии, восстановление максимального количества жизнеспособных и функциональных стволовых клеток после оттаивания является одним из приоритетных вопросов для успеха клеточной терапии. Литература показала, что не менее 50% жизнеспособности клеток теряется через 1-4 месяца после криоконсервации43. Примечательно, что самые низкие индексы, представленные в этом исследовании, относятся к случаям 5, 4 и 2, которые являются самыми старыми криоконсервированными образцами (около 2 лет). Хотя они представили самые низкие индексы жизнеспособности, они продемонстрировали высокий клеточный выход в анализе исключения красителя трипан-синего в свежем SVF. Хотя литература поддерживает причины потери жизнеспособности, эти показатели ниже, чем ожидалось. Температурные колебания при хранении клеток по техническим причинам могут вызывать увеличение и накопление напряжения и благоприятствовать накоплению водных участков, образуя кристаллы, повреждающие плазматическую мембрану при длительной криоконсервации51. Литература показывает более 70% жизнеспособности для образцов с таким же или более длительным временем замораживания. Однако проверка жизнеспособности проводилась с использованием другой техники, чем та, которая проводилась в этом исследовании52. Другое исследование показало, что более длительная криоконсервация негативно влияет на жизнеспособность клеток31, что можно объяснить колебаниями температуры в морозильной камере -80 °C. Следовательно, клетки часто должны оставаться слишком долго в культуре, что увеличивает стресс клеточного цикла, создавая риски генетической нестабильности и, следовательно, ставя под угрозу клеточную терапию. Существует также консенсус в литературе, указывающий на некоторые факторы стресса и то, как они влияют на цитогенетическую стабильность клеток, что необходимо для поддержания длительного культивирования стволовых клеток, необходимого для клеточной терапии35,53.
Преимущества методологии
На сегодняшний день в литературе нет стандартизированного протокола для изоляции ADSC, предназначенного для клинического применения. Большинство исследований демонстрируют сложные, трудоемкие протоколы24. В данном исследовании необходимо подчеркнуть эффективность метода по сравнению со временем, затраченным на завершение начального клеточного выхода: около 1,5 ч. Согласно литературе, выделение стволовых клеток жирового происхождения может занять от 3 ч до 8 ч54,55. Таким образом, выигрыш времени, связанный с высоким клеточным доходом, имеет решающее значение для развития терапии регенеративной медицины. Для улучшения этого метода следует проводить больше оценок жизнеспособности клеток параллельно с теми, которые проводятся в этой работе. Дальнейшие рандомизированные контролируемые испытания, включающие более обширную выборку с использованием этой методологии, необходимы для контрподписания этих результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим пациентов, которые вызвались принять участие, а также медицинский и сестринский персонал больницы Сан-Паулу. Это исследование было поддержано Фондом организации ампаро в Пескизе Сан-Паулу (ФАПЕСП) и Национальным советом по вопросам образования и развития (CNPq), Бразилия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
