Summary
Detta protokoll beskriver en förbättrad metod för ADSC-isolering som resulterar i ett enormt cellulärt utbyte med tidsvinst jämfört med litteraturen. Denna studie ger också en enkel metod för att erhålla ett relativt stort antal livskraftiga celler efter långvarig kryokonservering.
Abstract
Mänskliga mesenkymala stamceller som härrör från fettvävnad har blivit alltmer attraktiva eftersom de uppvisar lämpliga egenskaper och är en tillgänglig källa för regenerativa kliniska tillämpningar. Olika protokoll har använts för att erhålla fett-härledda stamceller. Den här artikeln beskriver olika steg i ett förbättrat tidsbesparande protokoll för att få en mer betydande mängd ADSC, som visar hur man kryokonserverar och tinar ADSC för att erhålla livskraftiga celler för odlingsutvidgning. Ett hundra milliliter lipoaspirat samlades in med hjälp av en 26 cm trehåls- och 3 mm kalibersprutfettsugning från bukområdet hos nio patienter som därefter genomgick elektiv bukplastik. Stamcellsisoleringen utfördes med en serie tvättar med Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) kompletterad med kalcium och användning av kollagenas. Stromal vaskulär fraktion (SVF) -celler kryokonserverades och deras livskraft kontrollerades genom immunofenotypning. SVF-cellutbytet var 15,7 x 105 celler / ml, mellan 6,1-26,2 celler / ml. Adherenta SVF-celler nådde sammanflöde efter i genomsnitt 7,5 (±4,5) dagar, med ett genomsnittligt cellulärt utbyte på 12,3 (± 5,7) x 105 celler/ml. Livskraften för tinad SVF efter 8 månader, 1 år och 2 år varierade mellan 23,06% -72,34% med i genomsnitt 47,7% (±24,64) med den lägsta livskraften som korrelerade med fall av två års frysning. Användningen av DPBS-lösning kompletterad med kalcium- och påsvilotider för fettutfällning med en kortare tid av kollagenassmältning resulterade i ett ökat stamcells slutliga cellulära utbyte. Det detaljerade förfarandet för att erhålla höga utbyten av livskraftiga stamceller var effektivare när det gäller tid och cellulär avkastning än teknikerna från tidigare studier. Även efter en lång period av kryokonservering hittades livskraftiga ADSC-celler i SVF.
Introduction
Mänskliga mesenkymala stamceller är fördelaktiga i både grundforskning och tillämpad forskning. Användningen av denna vuxna celltyp överträffar etiska problem - jämfört med användningen av embryonala eller andra celler - som är ett av de mest lovande studieområdena inom autolog vävnadsregenereringsteknik och cellterapi1, såsom det neoplastiska området, behandling av degenerativa sjukdomar och terapeutiska tillämpningar inom rekonstruktiv kirurgi område 2,3,4, 5. Det har tidigare rapporterats att det finns en riklig källa till mesenkymala multipotenta och pluripotenta stamceller i den stromala vaskulära cellfraktionen i fettvävnad 6,7. Dessa ADSC anses vara bra kandidater för användning i cellterapi och transplantation/infusion eftersom ett betydande antal celler med en stark expansionskapacitet ex vivo lätt kan erhållas med ett högt utbyte från ett minimalt invasivt förfarande 5,8.
Det visades också att fettvävnad uppvisar en större kapacitet att tillhandahålla mesenkymala stamceller än två andra källor (benmärg och navelsträngsvävnad)9. Förutom att vara dåligt immunogen och ha en hög förmåga att integrera sig i värdvävnaden och att interagera med de omgivande vävnaderna4,10, har ADSC en multipotent kapacitet för differentiering i cellinjer, med rapporter om kondrogenisk, osteogen och myogen differentiering under lämpliga odlingsförhållanden11,12,13 och i celler, såsom bukspottkörtel, hepatocyter, och neurogena celler14,15,16.
Det vetenskapliga samfundet är överens om att de mesenkymala stamcellernas immunmodulerande effekt är en mer relevant verkningsmekanism för cellterapi17,18,19 än deras differentieringsegenskap. En av de viktigaste fördelarna med ADSC-användningen är möjligheten till autolog infusion eller ympning, som blir en alternativ behandling för flera sjukdomar. För regenerativ medicin har ADSC redan använts vid leverskador, rekonstruktion av hjärtmuskeln, regenerering av nervvävnad, förbättring av skelettmuskelfunktionen, benregenerering, cancerbehandling och diabetesbehandling20,21.
Hittills finns det 263 registrerade kliniska prövningar för utvärdering av ADSC: s potential, listade på webbplatsen för United States National Institutes of Health22. Olika protokoll för att skörda fettvävnad har upprättats, men det finns ingen konsensus i litteraturen om en standardiserad metod för att isolera ADSC för klinisk användning23,24. Lipoaspiratbearbetningsmetoder under och efter operationen kan direkt påverka cellviabiliteten, det slutliga cellulära utbytet25 och kvaliteten på ADSC-populationen20. När det gäller den kirurgiska förbehandlingen är det inte väl fastställt vilken kirurgisk förbehandlingsteknik som ger ett mer betydande antal livskraftiga celler efter isolering eller om bedövningslösningen som injiceras i fettvävnad påverkar cellutbytet och dess funktioner26. På samma sätt kan skillnaden mellan tekniker för att erhålla fettceller leda till så mycket som en 70% minskning av antalet livskraftiga ADSC20. Enligt litteraturen bör mekaniska behandlingar för att erhålla cellpopulationer med hög livskraft - inklusive ultraljud - undvikas, för de kan bryta ner fettvävnaden20. Den manuella fettaspirationsmetoden med sprutor är dock mindre skadlig och orsakar mindre cellförstöring, med tumescent fettsugning som ger ett betydande antal celler med bästa kvalitet26.
Denna teknik använder en saltlösning med lidokain och adrenalin som injiceras i fettsugningsområdet. För varje 3 ml volym injicerad lösning aspireras 1 ml. I denna studie utfördes den våta fettsugningstekniken, där för varje 1 ml adrenalin och saltlösning som injiceras aspireras 0,2 ml fettvävnad. Användningen av matsmältningsenzymer, särskilt kollagenas, är vanligt för processen att isolera ADSC.
Efter det första isoleringssteget i laboratoriet kallas den slutliga pelleten stromal vaskulär fraktion (SVF). Den innehåller olika celltyper27, inklusive endotelprekursorceller, endotelceller, makrofager, glattmuskelceller, lymfocyter, pericyter, pre-adipocyter och ADSC, som kan vidhäfta. När den slutliga isoleringen har avslutats från in vitro-kulturer elimineras celler som inte fäster vid plasten i medelstora utbyten. Efter åtta veckors expansion, medelstora förändringar och passager representerar ADSC större delen av cellpopulationen i kolvarna20. En av de viktigaste fördelarna med att använda isolerade fett-härledda stamceller för en eventuell framtida terapi är möjligheten till kryokonservering. Det visades att kryokonserverad lipoaspirat är en potentiell källa till SVF-celler även efter 6 veckors frysning28, med biologisk aktivitet även efter 2 års kryokonservering29, och full förmåga att växa och differentiera i odling30. Under upptiningsprocessen förloras emellertid vanligtvis en betydande andel celler31. Därför måste lipoaspiratborttagningsprocessen och följande metoder för cellisolering säkerställa högsta cellutbyte.
Denna studie beskriver en snabbare metod för att samla in och isolera ADSC, vilket visar högt cellulärt utbyte och livskraft för bättre effektivitet av cellulära terapier. Dessutom utvärderades effekten av denna förbättrade teknik efter långvarig SVF-kryokonservering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie är godkänd av UNIFESP:s etikkommitté (protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), utförd efter skriftligt informerat samtycke från patienterna enligt Helsingforsdeklarationen (2004). Urvalet i den aktuella studien består av nio kvinnliga patienter i åldern 33-50 år (medelålder 41,5) och genomsnittligt initialt kroppsmassindex (BMI) på 24,54 (mellan 22,32-26,77) (tabell 1) som genomgick estetisk bukplastik på grund av överskott av hud efter graviditeter, vid avdelningen för plastikkirurgi vid Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brasilien. För att minska bias valdes patienterna ut som en homogen grupp med tanke på kön, ålder och BMI. De dataset som används och/eller analyseras under denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.
1. Samling av lipoaspirat
OBS: Detta steg måste utföras i kirurgicentret.
- Använd 4% klorhexidinglukonat (se materialtabell) för hudberedning och asepsis.
- Utför ett 2 mm subkutant hudsnitt (mellan sub-dermis och aponeuros). Sätt i en Klein-kanyl med kaliber på 26 mm 3 G och en spruta för att injicera en total volym på 500 ml av en adrenalinlösning (1 mg/ml) (se materialtabell) utspädd i saltlösning (1:1 000 000) i det infraumbiliska området.
- Anslut en 60 ml spruta till en 26 mm 3 G trehåls och 3 mm kaliber fettsugningskanyl och sätt in den genom hudsnittet och lås kolven för att skapa ett vakuum.
- Gör tryck- och dragrörelser så att lipoaspiratet förblir kvar i 60 ml sprutan med det vakuum som skapas.
- Använd en steril kontakt med en ventil och överför 100 ml av det uppsamlade lipoaspiratet till en 150 ml polyvinylkloridöverföringspåse (se materialtabell).
- Packa överföringspåsen i en polystyrenlåda vid rumstemperatur (~ 25 ° C) och ta den omedelbart till laboratoriet. Ta inte längre tid än 30 minuter att starta vävnadsbehandlingen.
2. Bearbetning av lipoaspirat
OBS: Detta steg ska utföras i laboratoriet.
- Väg först påsen, mät temperaturen med en digital beröringsfri infraröd klinisk termometer och låt påsen vila i 5 minuter inuti den laminära flödeskammaren för utfällning av de fetare skikten (bubblor) och vävnadsseparation som innehåller cellerna av intresse.
- Utför en serie vävnadstvättar. Första tvätten: injicera 100 ml DPBS med kalcium (1x) i överföringspåsen och blanda den med händerna.
- Låt den stå i 5 min och ta bort det mesta av basalvätskan som fälls ut.
- Kassera basalvätskan med en 60 ml spruta fäst vid påsadaptern. Denna process måste upprepas två gånger.
- Tillsätt 100 ml digestionslösning i påsen (93 ml kalciumfri DPBS + 60 μl kalciumklorid (1 g/l) + 7 ml 0,075 % sterilt kollagenas, se materialtabell) och låt stå vid 37 °C i 30 minuter under långsam omrörning.
- Överför hela påsens innehåll till fyra koniska rör på 50 ml och centrifugera dem vid 400 x g vid 22 °C i 10 minuter.
- Ta bort och kassera supernatanten och tillsätt 5 ml av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) låga glukos kompletterat med 20% FBS (Fetal bovine serum) till cellpelleten (Figur 1).
3. Räkning av SVF-cellerna
- Blanda en ny lösning av 10 μL trypanblå vid 0,05% i destillerat vatten med 10 μL cellulär suspension i 5 min.
- Räkna livskraftiga celler i en Neubauer-cellräkningskammare32 med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop (se materialtabell) vid 20x förstoring.
- Återsuspendera cellpelleten i ett kryoskyddande medium (5 ml FBS + 10% dimetylsulfoxid - DMSO) i en koncentration av 1 x 106 celler / ml.
- Lägg 1 ml av denna blandning i kryovialer. Använd en frysbehållare (se materialförteckning) med en kylhastighet på (1 °C/min till -80 °C).
- Förvaras vid -80 °C i 1 år.
- Efter denna tid, förvara i standardkassettlådor nedsänkta i flytande kväveångfas (-165 ° C).
4. Upptining av cellerna
- Ta ut injektionsflaskorna från flytande kväve och placera dem omedelbart i 37 °C vattenbad i 1 min.
- Placera SVF-cellerna i ett koniskt rör med 4 ml DMEM (låg glukos kompletterad med 20% FBS) förvärmd vid 37 °C.
- Centrifugera vid 400 x g vid 22 °C i 5 minuter.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml DMEM (låg glukos) + 10% FBS. Utför immunofenotypning enligt stegen nedan.
5. Flödescytometriteknik (immunofenotyp multipel märkning)
- Placera 1 ml cellpellet (koncentration av 1 000 celler/μl) i fem cytometrirör (200 μl vardera).
- Centrifugera vid 400 x g vid 22 °C i 5 minuter och kasta supernatanten med pipett.
- Tillsätt 300 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (10x), centrifugera vid 400 x g vid 22 °C och kasta supernatanten med pipett.
- Bered fem rör för olika markörkombinationer enligt följande: 5 μl CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μl CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μl CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Cellviabilitetsanalys-5 μL fluorescerande reaktivt färgämne. (se Materialförteckning) och ett rör med ostoppade celler och PBS som negativ kontroll. Homogenisera i en virvel och inkubera vid 4 °C i 30 minuter.
- Centrifugera vid 400 x g vid 22 °C i 5 minuter, kassera supernatanten med pipett, tillsätt 500 μl PBS (10x) och fortsätt med cellsortering.
OBS: Fem tusen händelser förvärvas per antikroppsuppsättning i flödescytometern med fyra färger och fem parametrar och analyseras med CellQuest-programvaran.
- Centrifugera vid 400 x g vid 22 °C i 5 minuter, kassera supernatanten med pipett, tillsätt 500 μl PBS (10x) och fortsätt med cellsortering.
6. Sådd av passage 1 (P1)
- Frö 2 x 105 celler i en 75 cm2 odlingskolv.
- Tillsätt 12 ml DMEM låg glukos + 20% av FBS + 10% antibiotikum / antimykotika (med 10 000 enheter penicillin, 10 mg streptomycin och 25 μg amfotericin B per ml, 0,1 μm).
- När cellerna når mellan 80% -90% sammanflöde, utför trypsinisering av vidhäftande celler med 2 ml 0,25% EDTA-trypsin i 3 min.
- Räkna celler igen (som nämns i steg 3).
- Utför immunofenotypning igen (som nämnts i steg 5).
7. Statistisk analys
- Använd Spearmans Rho-kalkylator33 för att mäta styrkan i associationen mellan följande variabler med P < 0,05, som nämns nedan.
- Välj SVF-cellulär avkastning och antalet dagar SVF stannar i kulturen i den första passagen (P1) tills 80% -90% sammanflöde (dagar till P1).
- Välj SVF-mobilutbyte före och efter att du har gått till P1.
- Tänk på dagar till P1 och cellulär avkastning innan du går till P1.
- Välj SVF-mobilutbyte med den genomsnittliga procentandelen bekräftad ADSC.
- Beräkna procentandelen bekräftad ADSC och det cellulära utbytet innan du går till P1.
- Bestäm BMI- och SVF-cellutbytet.
8. Differentieringsanalys
- Utför differentieringsanalysen enligt ett differentieringssatsprotokoll (se Materialförteckning). Figur 4 visar resultaten för fall 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakteriseringen av de nio studerade individerna, inklusive deras ålder, vikt, längd och BMI, visas i tabell 1.
Enligt det cellulära utbytet som ursprungligen presenterades beräknades cellvolymen som ympades i odling för att vara så nära kapaciteten hos 75 cm 2-odlingskolven som möjligt. Den urkärna volymen i varje enskilt fall beskrivs i tabell 2. Sedan, enligt det initiala cellulära utbytet, bestämdes en variabel volym celler för varje prov: 1 ml för prover med högre cellulärt utbyte, 1,1 ml för prover med mellanliggande cellulärt utbyte och 2 ml för prover med lägre cellutbyte för att utföra mer liknande cellsådd mellan fallen. När kulturen nådde cirka 80%-90% sammanflöde (figur 2A) (cirka 7,5 ± 4,5 dagar) utfördes trypsinisering av vidhäftande celler (tabell 2 och figur 2B).
Det cellulära utbytet före passage 1 varierade i stort sett även när samma sammanflöde före trypsinisering observerades (tabell 2). Detta kan förklaras av det faktum att celler kan ha vuxit i lager. Olika parametrar från patienternas ADSC bedömdes också vid olika perioder, vilket framgår av tabell 2.
Vissa prover (fall 1, fall 2, fall 7) kunde inte utvärderas med avseende på andelen bekräftad ADSC och det uppskattade antalet ADSC i odling på grund av bakteriekontaminering och brist på tillgängliga celler för att utföra kryokonserverad SVF-immunfenotypning. Enligt Spearmans Rho-kalkylator 33 hittades inga statistiska skillnader mellan SVF-cellutbyte och dagar till P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), mellan SVF-cellulär avkastning före och efter att ha gått till P1 (r = -0,33333, p = 0,38071) och mellan dagar till P1 och cellulär avkastning innan du går till P1 (r = -0,53783, p = 0,13529). Dessutom observerades inga signifikanta skillnader när man korrelerade SVF-cellutbytet med den genomsnittliga procentandelen bekräftad ADSC (r = -0,02857, p = 0,95716) och mellan den genomsnittliga procentandelen bekräftad ADSC och det cellulära utbytet innan man gick till P1 (r = 0,42857, p = 0,3965). Korrelationen mellan BMI och SVF-cellulär avkastning kunde inte heller betraktas som statistiskt signifikant (r = -0,46667, p = 0,20539). Tabell 3 visar flödescytometriska data som utförts på SVF-celler kryokonserverade. De initiala SVF-cellerna innehöll en delmängd av positiva celler för hematopoetiska markörer (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. Från den initiala SVF-cellpopulationen uttryckte en viss undergrupp CD11b 34 och CD1934 stromacellassocierade markörer. Nivåerna av CD73 34, CD90 34 och CD10534 var mellanliggande mellan dessa värden. Den ursprungliga SVF innehöll en delpopulation av celler som var positiva för stamcellsassocierade markörer (figur 3). Ett medelvärde på 79% av SVFs uttryckte den HSC-associerade markören CD3434.
Totalt var 21 min nödvändiga för de tre tvättarna, 30 min för kollagenassmältning, 10 min för centrifugering och 5 min för cellräkning och plätering.
Figur 1: Steg från protokollet fett-härledd stamcellsisolering . (A) Väska för lipoaspirattransport i ett slutet system. (B) Steget i vilopåsen upprepas tre gånger efter tvätt. (C) Lipoaspirat efter tre tvättar med DPBS. D) Lipoaspirat efter kollagenassmältning. (E) Lipoaspirat efter uppslutningen fördelas i ett 50 ml rör. (F) Smält lipoaspirat efter centrifugering. (G) Slutlig processisolering med pelleten med den stromala vaskulära fraktionen (SVF). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Morfologi och viabilitet hos ADSC. (A) Plastvidhäftande mesenkymala fett-härledda stamceller vid den första passagen efter isolering vid ljusmikroskopi. Cellerna visar vidhäftning till den plastiska och fibroblastliknande morfologin. (B) Trypanblå analys som visar livskraftiga celler räknade i Neubauer-kammaren med hjälp av ett ljusmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Delpopulation av celler som är positiva för stamcellsassocierade markörer i SVF i fall 9 efter 8 månaders kryokonservering. R1: Total cellulär region analyserad i FSC (Forward Scatter) x SSC (Side Scatter) (Storlek x Komplexitet); R2: CD45 negativ region, vars populationer CD73, CD90 och CD105 är positiva i denna region. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Differentieringsanalys . (A) ADSC-differentiering i kondrocyter. (B) ADSC-differentiering i osteocyter. (C) ADSC-differentiering i adipocyter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tålmodig | Ålder vid insamling (år) | Vikt (kg) | Höjd (meter) | BMI* |
| Ärende 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Ärende 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Ärende 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Ärende 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Ärende 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Ärende 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Ärende 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Ärende 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Ärende 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tabell 1: Data från proverna från de studerade individerna. *BMI: kroppsmasseindex.
| Tålmodig | Insamlad volym (ml) | SVF cellulär avkastning (cell/ml) (x 105) | Volym i kultur (ml) | Genomsnittlig procentandel bekräftad ADSC (%) | Antal celler i den ursprungliga odlingen (x 105) | Uppskattat antal ADSC i odling (x 105) | Dagar till P1 | Cellulärt utbyte innan du går till P1 (x 105) |
| Ärende 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Ärende 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Ärende 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Ärende 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Ärende 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Ärende 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Ärende 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Ärende 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Ärende 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tabell 2: Data från olika steg i proceduren från de nio analyserade patienterna. SVF: stromal vaskulär fraktion; ADSC: fett-härledd stamcell; P1: passage 1; NA: Inga tillgängliga uppgifter.
| PROV | % ADSC BESTÄMD MED MONOKLONALA ANTIKROPPAR | % AV HEMATOPOETISKA CELLER BESTÄMDA AV MONOKLONALA ANTIKROPPAR | CELLVIABILITETSANALYS OCH TID FÖR SVF-KRYOKONSERVERING | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Betyda | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | LEVANDE/DÖD + | |||
| Ärende 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39,54% (2 år) | ||
| Ärende 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38,30% (2 år) | ||
| Ärende 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23,06% (2 år) | ||
| Ärende 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56,76% (2 år) | ||
| Ärende 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55.56% (1 år) | ||
| Ärende 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72,34% (8 månader) | ||
Tabell 3: Flödescytometridata från sex av patienterna. (*) Från dessa CD45-celler bestämdes % av ADSC med olika kombinationer av stamcellsmarkörer. ADSC: fett-härledd stamcell; SVF: stromal vaskulär fraktion; (*) Från dessa CD45-celler bestämdes % av ADSC med olika kombinationer av stamcellsmarkörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering utbyte
Det är väl etablerat att kryokonserveringsprocessen, som ofta krävs vid cellterapi, resulterar i signifikant cellförlust, ibland större än 50%29,30,35. Således är en teknisk förbättring för att erhålla högt initialt cellulärt utbyte isolerat grundläggande. Uppsamlingsmetoden för lipoaspirat och cellernas isoleringsmetod måste fokusera på att bevara ett större antal celler, upprätthålla hög livskraft och extrahera det maximala antalet celler från det ursprungliga materialet samtidigt som man redovisar den långsiktiga kulturen och manipulationen av cellerna. Därför krävs rak odlingsunderhåll för att hålla cellerna borta från apoptos, åldrande eller genetisk instabilitet, eftersom cellterapi sannolikt är effektiv och säker för patienter.
Så vitt vi vet finns det ingen tidigare artikel som använder denna uppsättning steg för isolering av mesenkymala stamceller härledda från lipoaspirat, vilket resulterar i en tidsbesparande och kostnads-nyttoteknik. I denna studie motiverades varje metodiskt steg enligt litteraturen som visade det högsta slutliga cellutbytet i cellulär isolering. Nyheten med tekniken som utfördes i denna studie var användningen av manuell aspiration i samband med en serie lipoaspirattvättar, med den efterföljande påsen vilande. Uppsamlingspåsen som användes för att transportera och bearbeta lipoaspirat tillät osmälta vävnadsfragment att inte delta i kollagenassmältningen. Det mest kritiska steget är att tillsätta kalciumklorid till den färska matsmältningslösningen eftersom det förstärker verkan av kollagenas. Tidsvinsten rapporteras ännu inte i litteraturen med en cellupptiningsmetod som tillåter livskraftiga celler även efter lång kryokonserveringstid. SVF-cellutbytet som hittades i denna studie varierade i stort från 6.15 till 26.2 x 10 5 celler / ml med i genomsnitt 15.7 x 105 celler / ml. Detta kan bero på närvaron av en mer betydande mängd adrenalinlösning sugen, som kan ha varit högre eller lägre beroende på scenen för det kirurgiska ingreppet och till antalet andra kända celltyper som vanligtvis finns i SVF. Även om vissa studier har funnit negativa korrelationer mellan BMI och ADSC-avkastning 36,37, fann denna studie ingen signifikant korrelation, som de andra två studierna38,39, vilket minskar möjligheten att det är orsaken till den otroliga variationen av SVF-cellulärt utbyte som finns i denna studie. Dessa data visar att det lägsta SVF-cellulära utbytet som erhölls var 6,15 x 105 celler / ml. Vissa studier hade redan mätt effektiviteten av ADSC-isolering enligt den kirurgiska tekniken för att erhålla lipoaspirat. En studie erhöll 0,087 x 10 5 celler/ml i nyisolerad SVF för fettsugningstekniken med adrenalinlösning (som används i denna studie) och 0,143 x 105 celler/ml utan den26. Detta arbete belyste betydelsen av adrenalinlösningsinjektionen på grund av den vasokonstriktiva effekten som minskar intraoperativ blödning och blåmärken, som majoriteten av kirurgerna väljer att utföra i klinisk praxis. En annan studie visade att levande ADSC isolerade varierade från 0 till 0.59 x 10 5 celler / g lipoaspirat skördade, med i genomsnitt 0.295 (± 0.25) x 105 celler / g vävnad31. Vissa studier har testat olika sätt att uppnå högre ADSC-avkastning. En av dessa studier uppnådde cirka 350 x 105 för metoden som presenterade olika beståndsdelar i kollagenasförtunningsbuffert och användningen av en orbital shaker40. En annan studie visade 29.7 (±0.2) x 105 celler / ml som det totala antalet SVF-celler från bukområdet41. Det bukområde som valts i denna studie är fortfarande referensområdet för bästa tillgänglighet och tillgänglighet av lipoaspirate42. Kroppsregionen för lipoaspiratsamling, bland annat som givarålder och metod för den valda samlingen, är en stark determinant för kvaliteten på ADSC-utbytena.
Möjligheten att mikroorganismernas kontaminering orsakar cellernas otillgänglighet för att fortsätta experimenten var det enda exekveringsproblemet som begränsade slutförandet av denna studie. Även med hjälp av antibiotika och krav på god tillverkningssed kan kontaminering uppstå på grund av bristen på en total aseptisk miljö för att utföra aspiration av fett.
SVF-immunfenotypning
Enligt The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy 34 är ett av de tre minimikriterierna för att definiera humana mesenkymala stamceller att cellerna måste uttrycka CD105 34, CD73 34 och CD90 34 och inte ska uttrycka CD45 34, CD34 34, CD14 34 eller CD11b 34, CD79a 34 eller CD19 34, och HLA-DR34 ytmembranmolekyler. Mitchell43 testade färska SVF-celler genom immunofenotypning och hittade högst 54% av cellerna med ADSC-ytmarkörer. I denna studie avslöjade immunofenotypningen en högre andel bekräftade ADSC (icke-hematopoetiska celler) på upp till 78,91% i SVF efter långvarig kryokonservering (från 37,95% -78,91% med ett medelvärde på 53,68%). Bevis visar att förfäderna till en stamcellspopulation som ännu inte begåtts inte uttrycker CD34-markören34,44,45. Beroende på differentieringsstadiet kan de CD3434-negativa stamcellerna generera inte bara hematopoetiska förfäder utan också mer specifika mesenkymala prekursorer, såsom osteoklaster, kondrocyter, myocyter, adipocyter och andra. Vissa studier visade den slående plasticiteten hos den primitiva stamcellspopulationen, bestående av celler med stromacellfunktion och hematopoetiska och mesenkymala förfäder45. Enligt litteraturen är den fullständiga CD3434-funktionella rollen i vävnadsbildningen i SVF-celler fortfarande okänd46. Mitchell43 visade ett medelvärde på 60% celler av SVF som uttrycker CD3434-markör, medan medelvärdet i denna studie var 78.81%. Det är känt att uttrycket av CD3434 ytmarkör minskar längs passager.
Adherenta celler och differentieringsanalys
Beroende på antalet celler som erhållits efter isolering varierade antalet celler som såddes i den första kulturen. Den första odlingstiden för att nå 80%-90% sammanflöde i 75 cm2 kolvar tog i genomsnitt 8,4 dagar och en standardavvikelse på 7,5 (±4,5) dagar från 6,6 till 16,1 x 105 celler/ml. Det bör noteras att även för fall med lägre cellulärt utbyte ledde den första odlingstiden till höga cellulära avkastningsindex jämfört med litteraturen, förmodligen på grund av den bästa tillgängligheten av livskraftiga celler som upprätthålls under hela insamlings- och isoleringsprocessen. En studie erhöll ett cellulärt utbyte på 3.75 (±1.42) x 105 ADSC per ml lipoaspirat inom en 4.1 (±0.7) dagodlingsperiod47. En annan studie visade ett utbyte av kärnbildade SVF-celler på 3,08 (±1,40) x 105 per millimeter med ett medelvärde på 6,0 (±2,4) dagar under den första odlingsperioden43. I denna studie, genom att uppskatta antalet ADSC sådda i odling, som varierade som en funktion av antalet celler som observerades i SVF från samlingen av samma volym på 100 ml lipoaspirat, verifierades att antalet dagar för att nå P1 inte hade något samband med cellvolymen. Till exempel, för fall 9, där 12, 2 x 105 celler inkuberades, krävdes 6 dagar för att nå 80% -90% sammanflöde. För fall 6, där 14,6 x 105 celler såddes i odling, var en mer längre period nödvändig (10 dagar) för att nå upp till samma konfluensnivå. Kanske är ett minimum ADSC-nummer tillräckligt för den första vidhäftningsperioden. Det kan finnas betydande interindividuell variation, såsom comorbiditeter, ålder och allmän hälsostatus. Vissa studier i litteraturen ifrågasatte vikten av att beakta patienternas interindividuella variabilitet för SVF-cellutbyte48,49.
Enligt The Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy34 måste mesenkymala celler ha förmågan att differentiera i tre olika celltyper som osteogena, adipogena och kondrogena linjer som det visades i figur 4.
Cellviabilitet, kryokonservering och genetisk instabilitet
Olika metoder har använts för att bestämma viabilitetsförlust, definierad som plasmamembranintegritetsskada50. Kulturerna kan emellertid också presentera tidiga apoptotiska celler som dessa tillvägagångssätt kan ignorera eftersom de upprätthåller ett intakt plasmamembran, men de är icke-livskraftiga. Resultaten som rapporteras här visar ett stort intervall i viabilitetsmarkör, från 23,06% -72,34%, med ett medelvärde på 47,6% efter långvarig kryokonservering. Med tanke på att kryokonservering är ett viktigt steg när det gäller cellterapi är återvinning av det maximala antalet livskraftiga och funktionella stamceller efter upptining en av de prioriterade frågorna för cellterapins framgång. Litteraturen har visat att minst 50% av cellviabiliteten går förlorad från 1-4 månader efter kryokonservering43. I synnerhet är de lägsta indexen som presenteras i denna studie från fall 5, fall 4 och fall 2, som är de äldsta kryokonserverade proverna (cirka 2 år). Även om de presenterade de lägsta viabilitetsindexen, visade de högt cellulärt utbyte i trypanblå färgämnesuteslutningsanalys i färsk SVF. Även om litteraturen stöder orsaker till lönsamhetsförlust, är dessa priser lägre än väntat. Temperaturfluktuationer i celllagring på grund av tekniska skäl kan orsaka ökning och ackumulering av stress och gynna ackumulering av vattenhaltiga delar, vilket genererar kristaller som skadar det plasmatiska membranet under långvarig kryokonservering51. Litteraturen visar mer än 70% livskraft för prover med samma eller längre frystid. Lönsamhetskontrollen utfördes dock med en annan teknik än den som utfördes i denna studie52. En annan studie visade att längre kryokonservering påverkar cellviabiliteten31 negativt, vilket kan förklaras av temperaturvariationer i frysen vid -80 °C. Därför behöver celler ofta stanna för länge i odling, vilket ökar cellcykelstressen, vilket medför risker för genetisk instabilitet och därmed äventyrar cellterapi. Det finns också en konsensus i litteraturen som indikerar vissa stressfaktorer och hur de påverkar cellcytogenetisk stabilitet, vilket är viktigt för att upprätthålla den långvariga stamcellsodling som krävs för cellterapi35,53.
Metodisk nytta
Hittills visar litteraturen inget standardiserat protokoll för att isolera ADSC som syftar till kliniska tillämpningar. De flesta studierna visar komplexa, tidskrävande protokoll24. I denna studie måste metodens effektivitet kontra den tid som krävs för att slutföra det initiala cellulära utbytet betonas: cirka 1,5 h. Enligt litteraturen kan isolering av fett-härledda stamceller ta cirka 3 h till 8 h54,55. Således är tidsvinsten allierad med den höga cellulära inkomsten avgörande för regenerativ medicinterapi. Fler cellviabilitetsbedömningar bör göras parallellt med de som utförs i detta arbete för att förbättra denna metod. Ytterligare randomiserade kontrollerade studier som innehåller ett mer omfattande urval med denna metod krävs för att kontrasignera dessa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar de patienter som frivilligt deltog och den medicinska och omvårdnadspersonalen på sjukhuset São Paulo. Denna studie stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
