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दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन में वसा ऊतक और स्ट्रोमल संवहनी अंश लक्षण वर्णन से मेसेनकाइमल स्टेम सेल प्राप्त करने की तकनीक

Published: December 30, 2021 doi: 10.3791/63036
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2, 1, 2, 3, 1
1Genetics Division, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech, São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एडीएससी अलगाव के लिए एक बेहतर पद्धति का वर्णन करता है जिसके परिणामस्वरूप साहित्य की तुलना में समय लाभ के साथ जबरदस्त सेलुलर उपज होती है। यह अध्ययन दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक सीधा तरीका भी प्रदान करता है।

Abstract

वसा ऊतक से प्राप्त मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाएं तेजी से आकर्षक हो गई हैं क्योंकि वे उचित विशेषताएं दिखाते हैं और पुनर्योजी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए एक सुलभ स्रोत हैं। वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है। यह लेख एडीएससी की अधिक महत्वपूर्ण मात्रा प्राप्त करने के लिए एक बेहतर समय-बचत प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों का वर्णन करता है, जिसमें दिखाया गया है कि संस्कृति विस्तार के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एडीएससी को क्रायोप्रिजर्व और पिघलाना कैसे है। नौ रोगियों के पेट क्षेत्र से 26 सेमी तीन-छेद और 3 मिमी कैलिबर सिरिंज लिपोसक्शन का उपयोग करके एक सौ मिलीलीटर लिपोएस्पिरेट एकत्र किया गया था, जो बाद में वैकल्पिक एब्डोमिनोप्लास्टी से गुजरे थे। स्टेम सेल अलगाव को डलबेको के फॉस्फेट बफर्ड सलाइन (डीपीबीएस) समाधान के साथ धोने की एक श्रृंखला के साथ किया गया था, जो कैल्शियम और कोलेजनेज के उपयोग के साथ पूरक था। स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्व किया गया था, और इम्यूनोफेनोटाइपिंग द्वारा उनकी व्यवहार्यता की जांच की गई थी। एसवीएफ सेलुलर उपज 15.7 x 105 कोशिकाओं / एमएल थी, जो 6.1-26.2 कोशिकाओं / एमएल के बीच थी। अनुगामी एसवीएफ कोशिकाएं औसतन 7.5 (±4.5) दिनों के बाद संगम पर पहुंचीं, जिसमें औसत सेलुलर उपज 12.3 (± 5.7) x 105 कोशिकाएं / एमएल थीं। 8 महीने, 1 वर्ष और 2 वर्षों के बाद पिघले हुए एसवीएफ की व्यवहार्यता 47.7% (±24.64) के औसत के साथ 23.06% -72.34% के बीच थी, जिसमें सबसे कम व्यवहार्यता दो साल की ठंड के मामलों के साथ संबंधित थी। कोलेजनेज पाचन के कम समय के साथ वसा वर्षा के लिए कैल्शियम और बैग आराम के समय के साथ पूरक डीपीबीएस समाधान के उपयोग के परिणामस्वरूप स्टेम सेल अंतिम सेलुलर उपज में वृद्धि हुई। व्यवहार्य स्टेम कोशिकाओं की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए विस्तृत प्रक्रिया पिछले अध्ययनों की तकनीकों की तुलना में समय और सेलुलर उपज के बारे में अधिक कुशल थी। क्रायोप्रिजर्वेशन की लंबी अवधि के बाद भी, एसवीएफ में व्यवहार्य एडीएससी कोशिकाएं पाई गईं।

Introduction

मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल बुनियादी और लागू अनुसंधान दोनों में फायदेमंद हैं। इस वयस्क सेल प्रकार का उपयोग नैतिक मुद्दों को पार करता है - भ्रूण या अन्य कोशिकाओं के उपयोग की तुलना में- ऑटोलॉगस ऊतक पुनर्जनन इंजीनियरिंग और सेल थेरेपी1 में अध्ययन के सबसे आशाजनक क्षेत्रों में से एक है, जैसे कि नियोप्लास्टिक क्षेत्र, अपक्षयी रोगों का उपचार, और पुनर्निर्माण सर्जरी क्षेत्र 2,3,4 में चिकित्सीय अनुप्रयोग। 5. यह पहले बताया गया है कि वसा ऊतक 6,7 के स्ट्रोमल संवहनी कोशिका अंश में मेसेनकाइमल मल्टीपोटेंट और प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का एक प्रचुर स्रोत है। इन एडीएससी को सेल थेरेपी और प्रत्यारोपण / जलसेक में उपयोग के लिए महान उम्मीदवार माना जाता है क्योंकि विस्तार के लिए मजबूत क्षमता वाली कोशिकाओं की काफी संख्या को न्यूनतम इनवेसिव प्रक्रिया 5,8 से उच्च उपज के साथ आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।

यह भी प्रदर्शित किया गया था कि वसा ऊतक दो अन्य स्रोतों (अस्थि मज्जा और गर्भनाल ऊतक) की तुलना में मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को प्रदान करने की अधिक क्षमता प्रस्तुत करता है। खराब इम्युनोजेनिक होने और मेजबान ऊतक में एकीकृत करने और आसपासके ऊतकों के साथ बातचीत करने की उच्च क्षमता होने के अलावा, एडीएससी में सेल लाइनों में भेदभाव की एक बहुशक्तिशाली क्षमता है, जिसमें उचित संस्कृति स्थितियोंके तहत चोंड्रोजेनिक, ओस्टोजेनिक और मायोजेनिक भेदभाव की रिपोर्ट है, और कोशिकाओं में, जैसे अग्नाशय, हेपेटोसाइट्स, और न्यूरोजेनिक कोशिकाएं 14,15,16।

वैज्ञानिक समुदाय इस बात से सहमत है कि मेसेनकाइमल स्टेम सेल का इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव उनके भेदभाव गुण की तुलना में सेल थेरेपी 17,18,19 के लिए कार्रवाई का एक अधिक प्रासंगिक तंत्र है। एडीएससी उपयोग के सबसे महत्वपूर्ण गुणों में से एक ऑटोलॉगस इन्फ्यूजन या ग्राफ्टिंग की संभावना है, जो कई बीमारियों के लिए एक वैकल्पिक उपचार बन गया है। पुनर्योजी चिकित्सा के लिए, एडीएससी का उपयोग पहले से ही यकृत क्षति, हृदय की मांसपेशियों के पुनर्निर्माण, तंत्रिका ऊतक के उत्थान, कंकाल की मांसपेशी समारोह में सुधार, हड्डी पुनर्जनन, कैंसर चिकित्सा और मधुमेह उपचार20,21 के मामलों में किया गया है।

इस तारीख तक, एडीएससी की क्षमता के मूल्यांकन के लिए 263 पंजीकृत नैदानिक परीक्षण हैं, जो संयुक्त राज्य अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान22 की वेबसाइट पर सूचीबद्ध हैं। वसा ऊतक की कटाई के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं, लेकिन नैदानिक उपयोगके लिए एडीएससी को अलग करने के लिए एक मानकीकृत विधि के बारे में साहित्य में कोई आम सहमति नहीं है। सर्जरी के दौरान और बाद में लिपोएस्पिरेट प्रसंस्करण विधियां सीधे सेल व्यवहार्यता, अंतिम सेलुलर उपज25, और एडीएससी आबादी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकतीहैं। सर्जिकल पूर्व-उपचार के संबंध में, यह अच्छी तरह से स्थापित नहीं है कि कौन सी सर्जिकल पूर्व-उपचार तकनीक अलगाव के बाद व्यवहार्य कोशिकाओं की अधिक महत्वपूर्ण संख्या उत्पन्न करती है या क्या वसा ऊतक में इंजेक्ट किया गया एनेस्थेटिक समाधान सेल उपज और इसके कार्यों को प्रभावित करताहै। इसी तरह, वसा कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए तकनीकों के बीच अंतर व्यवहार्य एडीएससी 20 की संख्या में70% तक की कमी का कारण बन सकता है। साहित्य के अनुसार, अल्ट्रासाउंड सहित उच्च व्यवहार्यता के साथ सेल आबादी प्राप्त करने के लिए यांत्रिक उपचार से बचा जाना चाहिए, क्योंकि वे वसा ऊतक20 को तोड़ सकते हैं। हालांकि, सिरिंज के साथ मैनुअल वसा आकांक्षा विधि कम हानिकारक है, जिससे कम सेल विनाश होता है, जिसमें ट्यूमसेंट लिपोसक्शन सबसे अच्छी गुणवत्तावाले कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या उत्पन्न करता है।

यह तकनीक लिडोकेन और एपिनेफ्रीन के साथ एक खारा समाधान का उपयोग करती है जिसे लिपोसक्शन क्षेत्र में इंजेक्ट किया जाता है। इंजेक्शन के प्रत्येक 3 एमएल वॉल्यूम के लिए, 1 एमएल एस्पिरेटेड है। इस अध्ययन में, गीला लिपोसक्शन तकनीक का प्रदर्शन किया गया था, जिसमें प्रत्येक 1 एमएल एड्रेनालाईन और खारा घोल इंजेक्ट करने के लिए, 0.2 एमएल वसा ऊतक एस्पिरेटेड होता है। पाचन एंजाइमों, विशेष रूप से कोलेजनेज का उपयोग, एडीएससी को अलग करने की प्रक्रिया के लिए आम है।

प्रयोगशाला में पहले अलगाव चरण के बाद, अंतिम गोली को स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) कहा जाता है। इसमें एंडोथेलियल अग्रदूत कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, मैक्रोफेज, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, लिम्फोसाइटों, पेरिसाइट, प्री-एडिपोसाइट्स और एडीएससी सहित विभिन्न सेल प्रकार27 शामिल हैं, जो आसंजन में सक्षम हैं। एक बार इन विट्रो संस्कृतियों से अंतिम अलगाव समाप्त हो जाने के बाद, प्लास्टिक का पालन नहीं करने वाली कोशिकाओं को मध्यम आदान-प्रदान में समाप्त कर दिया जाता है। आठ सप्ताह के विस्तार, मध्यम परिवर्तन और मार्ग के बाद, एडीएससी फ्लास्क20 में अधिकांश सेल आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। संभावित भविष्य की चिकित्सा के लिए पृथक वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करने के सबसे महत्वपूर्ण लाभों में से एक क्रायोप्रिजर्वेशन की संभावना है। यह प्रदर्शित किया गया था कि क्रायोप्रिजर्व्ड लिपोएस्पिरेट ठंड28 के 6 सप्ताह के बाद भी एसवीएफ कोशिकाओं का एक संभावित स्रोत है, क्रायोप्रिजर्वेशन29 के 2 साल बाद भी जैविक गतिविधि के साथ, और संस्कृति30 में बढ़ने और अंतर करने की पूरी क्षमता है। हालांकि, पिघलने की प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं का काफी प्रतिशत आमतौर परखो जाता है 31। इसलिए, लिपोएस्पिरेट हटाने की प्रक्रिया और सेल अलगाव के निम्नलिखित तरीकों को उच्चतम सेल उपज सुनिश्चित करनी चाहिए।

यह अध्ययन एडीएससी को इकट्ठा करने और अलग करने के लिए एक तेज पद्धति का वर्णन करता है, जो सेलुलर चिकित्सीय की बेहतर दक्षता के लिए उच्च सेलुलर उपज और व्यवहार्यता का प्रदर्शन करता है। इसके अलावा, दीर्घकालिक एसवीएफ क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद इस बेहतर तकनीक के प्रभाव का मूल्यांकन किया गया था।

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Protocol

वर्तमान अध्ययन को यूएनआईएफईएसपी की आचार समिति (प्रोटोकॉल संख्या: 0029/2015 सीएएई: 40846215.0.0000.5505) द्वारा अनुमोदित किया गया है, जो हेलसिंकी की घोषणा (2004) के अनुसार रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद किया गया है। वर्तमान अध्ययन का नमूना नौ महिला रोगियों से बना है, जिनकी आयु 33-50 वर्ष (औसत आयु 41.5) और औसत प्रारंभिक बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई) 24.54 (22.32-26.77 के बीच) (तालिका 1) है, जिन्होंने गर्भधारण के बाद त्वचा की अधिकता के कारण सौंदर्य संबंधी एब्डोमिनोप्लास्टी की, यूनिवर्सिडेड फेडरल डी साओ पाउलो (यूएनआईएफईएसपी) के प्लास्टिक सर्जरी विभाग में, ब्राज़ील। पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, रोगियों को लिंग, आयु और बीएमआई पर विचार करते हुए एक सजातीय समूह के रूप में चुना गया था। इस अध्ययन के दौरान उपयोग किए गए और / या विश्लेषण किए गए डेटासेट उचित अनुरोध पर संबंधित लेखक से उपलब्ध हैं।

1. लिपोएस्पिरेट का संग्रह

नोट: यह चरण सर्जरी केंद्र में किया जाना चाहिए।

  1. त्वचा की तैयारी और एसेप्सिस के लिए 4% क्लोरहेक्सिडीन ग्लूकोनेट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    1. 2 मिमी चमड़े के नीचे त्वचा चीरा (उप-डर्मिस और एपोन्यूरोसिस के बीच) करें। इन्फ्राम्बिलिकल क्षेत्र में खारा (1: 1,000,000) में पतला एड्रेनालाईन समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के 500 एमएल की कुल मात्रा इंजेक्ट करने के लिए 26 मिमी 3 जी तीन-छेद और 3 मिमी कैलिबर और एक सिरिंज का क्लेन कैनुला डालें।
  2. एक 60 एमएल सिरिंज को 26 मिमी 3 जी तीन-छेद और 3 मिमी कैलिबर लिपोसक्शन कैनुला से कनेक्ट करें और इसे त्वचा चीरा के माध्यम से डालें, प्लंजर को वैक्यूम बनाने के लिए लॉक करें।
    1. धक्का देने और खींचने वाले आंदोलनों को बनाएं ताकि, वैक्यूम के साथ, लिपोएस्पिरेट 60 एमएल सिरिंज में बना रहे।
  3. वाल्व के साथ बाँझ कनेक्टर का उपयोग करके, एकत्र किए गए लिपोएस्पिरेट के 100 एमएल को 150 एमएल पॉलीविनाइल क्लोराइड ट्रांसफर बैग में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कमरे के तापमान (~ 25 डिग्री सेल्सियस) पर पॉलीस्टाइनिन बॉक्स में ट्रांसफर बैग पैक करें और इसे तुरंत प्रयोगशाला में ले जाएं। ऊतक प्रसंस्करण शुरू करने के लिए 30 मिनट से अधिक समय न लें।

2. लिपोएस्पिरेट का प्रसंस्करण

नोट: यह चरण प्रयोगशाला में किया जाना है।

  1. सबसे पहले, बैग का वजन करें, डिजिटल गैर-संपर्क अवरक्त नैदानिक थर्मामीटर के साथ तापमान को मापें, और बैग को लामिनर प्रवाह कक्ष के अंदर 5 मिनट के लिए आराम करने के लिए छोड़ दें ताकि ग्रेजर परतों (बुलबुले) की वर्षा और रुचि की कोशिकाओं वाले ऊतक पृथक्करण के लिए।
    1. ऊतक धोने की एक श्रृंखला करें। पहला धो लें: ट्रांसफर बैग में कैल्शियम (1x) के साथ डीपीबीएस के 100 एमएल इंजेक्ट करें और इसे हाथों से मिलाएं।
    2. इसे 5 मिनट के लिए खड़े रहने दें और अधिकांश बेसल तरल को हटा दें जो अवक्षेपित होता है।
    3. बैग एडाप्टर से जुड़े 60 एमएल सिरिंज के साथ बेसल तरल को छोड़ दें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराया जाना चाहिए।
  2. बैग में 100 एमएल पाचन समाधान जोड़ें (कैल्शियम मुक्त डीपीबीएस का 93 एमएल + कैल्शियम क्लोराइड का 60 μL (1 ग्राम / एल) + 0.075% बाँझ कोलेजनेज का 7 एमएल, सामग्री की तालिका देखें) और धीमी गति से हिलाने के तहत 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  3. बैग की सभी सामग्री को 50 एमएल के चार शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 10 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    1. सुपरनैटेंट को हटा दें और त्याग दें और सेल पेलेट में 20% एफबीएस (भ्रूण गोजातीय सीरम) के साथ पूरक डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) कम ग्लूकोज के 5 एमएल जोड़ें (चित्रा 1)।

3. एसवीएफ कोशिकाओं की गिनती

  1. 5 मिनट के लिए 10 μL सेलुलर सस्पेंशन के साथ आसुत जल में 0.05% पर ट्रिपैन ब्लू के 10 μL के एक ताजा घोल को मिलाएं।
  2. 20x आवर्धन पर उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक न्यूबॉयर सेल गिनती कक्ष32 में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
  3. सेल पेलेट को क्रायोप्रोटेक्टिव माध्यम (एफबीएस का 5 एमएल + डाइमिथाइल सल्फोक्साइड - डीएमएसओ का 10%) में 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर पुन: निलंबित किया जाता है।
  4. क्रायोवियल्स में इस मिश्रण का 1 एमएल रखें। (1 डिग्री सेल्सियस / मिनट से -80 डिग्री सेल्सियस) की शीतलन दर के साथ एक फ्रीजिंग कंटेनर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
    1. 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. इस समय के बाद, तरल नाइट्रोजन वाष्प चरण (-165 डिग्री सेल्सियस) में डूबे मानक कैसेट बक्से में स्टोर करें।

4. कोशिकाओं की पिघलने की प्रक्रिया

  1. तरल नाइट्रोजन से शीशियों को निकालें और उन्हें तुरंत 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
  2. एसवीएफ कोशिकाओं को 4 एमएल डीएमईएम (20% एफबीएस के साथ पूरक कम ग्लूकोज) के साथ शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
  3. 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  4. सतह पर तैरने वाला निकालें और 1 एमएल डीएमईएम (कम ग्लूकोज) + 10% एफबीएस जोड़ें। नीचे दिए गए चरणों के बाद इम्यूनोफेनोटाइपिंग करें।

5. फ्लो साइटोमेट्री तकनीक (इम्यूनोफेनोटाइप मल्टीपल लेबलिंग)

  1. पांच साइटोमेट्री ट्यूबों (प्रत्येक 200 μL) में सेल पेलेट के 1 एमएल (1,000 कोशिकाओं / μL की एकाग्रता) रखें।
  2. 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज और पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाला छोड़ दें।
  3. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (10x) का 300 μL जोड़ें, 22 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज जोड़ें और एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
  4. विभिन्न मार्कर संयोजनों के लिए पांच ट्यूब तैयार करें: CD11B का 5 μL/CD19/20 μL CD45 का 5 μL; CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/CD45 का 20 μL; सेल व्यवहार्यता परख -फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाशील डाई का 5 μL। ( सामग्री की तालिका देखें) और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बिना दाग वाली कोशिकाओं और पीबीएस के साथ एक ट्यूब। एक भंवर में समरूप करें और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    1. 5 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज, एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, पीबीएस (10x) के 500 μL जोड़ें, और सेल सॉर्टिंग के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: चार रंगों और पांच मापदंडों के फ्लो साइटोमीटर में प्रति एंटीबॉडी सेट पांच हजार घटनाओं का अधिग्रहण किया जाता है और सेलक्वेस्ट सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया जाता है।

6. मार्ग 1 (पी 1) की सीडिंग

  1. बीज 2 x 105 कोशिकाएं 75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क में।
  2. एंटीमाइकोटिक के 12 एमएल डीएमईएम कम ग्लूकोज + एफबीएस का 20% + 10% एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक (10,000 यूनिट पेनिसिलिन, 10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 25 μg एम्फोटेरिसिन बी प्रति एमएल, 0.1 μm के साथ) जोड़ें।
  3. जब कोशिकाएं 80% -90% संगम के बीच पहुंचती हैं, तो 3 मिनट के लिए 0.25% ईडीटीए-ट्रिप्सिन के 2 एमएल के साथ अनुयायी कोशिकाओं का ट्रिप्सिनाइजेशन करें।
  4. कोशिकाओं को फिर से गिनती करें (जैसा कि चरण 3 में उल्लेख किया गया है)।
  5. इम्यूनोफेनोटाइपिंग फिर से करें (जैसा कि चरण 5 में उल्लेख किया गया है)।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. जैसा कि नीचे उल्लेख किया गया है, पी < 0.05 के साथ निम्नलिखित चर के बीच सहयोग की ताकत को मापने के लिए स्पीयरमैन के आरएचओ कैलकुलेटर33 का उपयोग करें।
    1. एसवीएफ सेलुलर उपज का चयन करें और एसवीएफ पहले मार्ग (पी 1) में संस्कृति में रहने वाले दिनों की संख्या 80% -90% संगम (पी 1 के दिन) तक रहता है।
    2. पी 1 पर जाने से पहले और बाद में एसवीएफ सेलुलर उपज का चयन करें।
    3. पी 1 पर जाने से पहले पी 1 और सेलुलर उपज के दिनों पर विचार करें।
    4. पुष्टि किए गए एडीएससी के औसत प्रतिशत के साथ एसवीएफ सेलुलर उपज का चयन करें।
    5. पी 1 पर जाने से पहले पुष्टि किए गए एडीएससी और सेलुलर उपज के प्रतिशत की गणना करें।
    6. बीएमआई और एसवीएफ सेलुलर उपज निर्धारित करें।

8. विभेदन परख

  1. भेदभाव किट प्रोटोकॉल के बाद भेदभाव परख करें ( सामग्री की तालिका देखें)। चित्रा 4 केस 1 के परिणामों को दर्शाता है।

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Representative Results

अध्ययन किए गए नौ व्यक्तियों के लक्षण वर्णन, उनकी उम्र, वजन, ऊंचाई और बीएमआई सहित, तालिका 1 में दिखाए गए हैं।

शुरू में प्रस्तुत सेलुलर उपज के अनुसार, संस्कृति में टीका लगाए गए सेल वॉल्यूम की गणना 75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क की क्षमता के जितना संभव हो उतना करीब होने के लिए की गई थी। प्रत्येक मामले में बीजित नमूना मात्रा तालिका 2 में वर्णित है। फिर, प्रारंभिक सेलुलर उपज के अनुसार, प्रत्येक नमूने के लिए कोशिकाओं की एक चर मात्रा निर्धारित की गई थी: उच्च सेलुलर उपज वाले नमूनों के लिए 1 एमएल, मध्यवर्ती सेलुलर उपज वाले नमूनों के लिए 1.1 एमएल, और कम सेलुलर उपज वाले नमूनों के लिए 2 एमएल ताकि मामलों के बीच अधिक समान सेल सीडिंग की जा सके। जब संस्कृति लगभग 80% -90% संगम (चित्रा 2 ए) (लगभग 7.5 ± 4.5 दिनों) तक पहुंच गई, तो अनुयायी कोशिकाओं का ट्रिप्सिनाइजेशन किया गया (तालिका 2 और चित्रा 2 बी)।

मार्ग 1 से पहले सेलुलर उपज मोटे तौर पर भिन्न होती है, भले ही ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले एक ही संगम देखा गया हो (तालिका 2)। इसे इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि कोशिकाएं परतों में बढ़ी हो सकती हैं। रोगियों के एडीएससी से विभिन्न मापदंडों का भी अलग-अलग अवधियों में मूल्यांकन किया गया था, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है।

कुछ नमूने (केस 1, केस 2, केस 7) का मूल्यांकन पुष्टि किए गए एडीएससी के प्रतिशत और बैक्टीरिया संदूषण और क्रायोप्रिजर्व्ड एसवीएफ इम्यूनोफेनोटाइपिंग करने के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की कमी के कारण संस्कृति में एडीएससी की अनुमानित संख्या के बारे में नहीं किया जा सका। स्पीयरमैन के आरएचओ कैलकुलेटर33 के अनुसार, एसवीएफ सेलुलर उपज और पी 1 के दिनों (आर = 0.37816, पी = 0.31561), पी 1 पर जाने से पहले और बाद में एसवीएफ सेलुलर उपज के बीच (आर = -0.33333, पी = 0.38071), और पी 1 (आर = -0.53783, पी) जाने से पहले पी 1 के दिनों और सेलुलर उपज के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं पाया गया था। = 0.13529)। इसके अलावा, पुष्टि किए गए एडीएससी (आर = -0.02857, पी = 0.95716) के औसत प्रतिशत के साथ एसवीएफ सेलुलर उपज को सहसंबंधित करते समय और पी 1 (आर = 0.42857, पी = 0.3965) पर जाने से पहले पुष्टि किए गए एडीएससी और सेलुलर उपज के औसत प्रतिशत के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। इसके अलावा, बीएमआई और एसवीएफ सेलुलर उपज के बीच सहसंबंध को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं माना जा सकता है (आर = -0.46667, पी = 0.20539)। तालिका 3 एसवीएफ कोशिकाओं क्रायोप्रिजर्व पर किए गए प्रवाह साइटोमेट्रिक डेटा को दर्शाती है। प्रारंभिक एसवीएफ कोशिकाओं में हेमटोपोइएटिक मार्करों (सीडी 45, सीडी 11 बी, सीडी 1 9, एचएलए-डीआर) 34 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का एक उप-समूह शामिल था। प्रारंभिक एसवीएफ सेल आबादी से, एक विशेष उपसमूह ने सीडी 11 बी34 और सीडी 1 934 स्ट्रोमल सेल से जुड़े मार्करों को व्यक्त किया। CD7334, CD9034 और CD10534 के स्तर इन मानों के बीच मध्यवर्ती थे। प्रारंभिक एसवीएफ में स्टेम सेल से जुड़े मार्करों (चित्रा 3) के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या शामिल थी। एसवीएफ के 79% के औसत ने एचएससी से जुड़े मार्कर सीडी 3434 को व्यक्त किया।

कुल मिलाकर, तीन वॉश के लिए 21 मिनट, कोलेजनेज पाचन के लिए 30 मिनट, सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए 10 मिनट और सेल गिनती और चढ़ाना के लिए 5 मिनट आवश्यक थे।

Figure 1
चित्र 1: प्रोटोकॉल वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव से कदम। (ए) एक बंद प्रणाली में लिपोएस्पिरेट परिवहन के लिए बैग। (बी) बैग को आराम देने का चरण धोने के बाद तीन बार दोहराया जाता है। (सी) डीपीबीएस के साथ तीन बार धोने के बाद लिपोएस्पिरेट। (डी) कोलेजनेज पाचन के बाद लिपोएस्पिरेट। (ई) पाचन के बाद लिपोएस्पिरेट को 50 एमएल ट्यूब में वितरित किया जाता है। (एफ) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद पचने वाला लिपोएस्पिरेट। (जी) स्ट्रोमल संवहनी अंश (एसवीएफ) के साथ गोली के साथ अंतिम प्रक्रिया अलगाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एडीएससी की आकृति विज्ञान और व्यवहार्यता (ए) प्रकाश माइक्रोस्कोपी में अलगाव के बाद पहले मार्ग पर प्लास्टिक अनुयायी मेसेनकाइमल वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाएं। कोशिकाएं प्लास्टिक और फाइब्रोब्लास्ट जैसी आकृति विज्ञान के लिए आसंजन दिखाती हैं। (बी) ट्रिपैन ब्लू परख एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके न्यूबॉयर कक्ष में गिने जाने वाले व्यवहार्य कोशिकाओं को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्रायोप्रिजर्वेशन के 8 महीने बाद केस 9 के एसवीएफ में स्टेम सेल से जुड़े मार्करों के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की उप-जनसंख्या। आर 1: एफएससी (फॉरवर्ड स्कैटर) एक्स एसएससी (साइड स्कैटर) (आकार एक्स जटिलता) में विश्लेषण किए गए कुल सेलुलर क्षेत्र; R2: CD45 नकारात्मक क्षेत्र, जिनकी आबादी CD73, CD90 और CD105 इस क्षेत्र में सकारात्मक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: भेदभाव परख( ए) चोंड्रोसाइट्स में एडीएससी भेदभाव। (बी) ओस्टियोसाइट्स में एडीएससी भेदभाव। (सी) एडिपोसाइट्स में एडीएससी भेदभाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रोगी संग्रह में आयु (वर्ष) वजन (किलो) ऊंचाई (मीटर) बीएमआई*
केस 1 35 68 1.64 25.28
केस 2 33 65 1.65 23.88
केस 3 35 70 1.68 24.8
केस 4 34 72 1.64 26.77
केस 5 36 72 1.69 25.21
केस 6 36 67 1.64 24.91
केस 7 38 62 1.53 26.49
केस 8 50 63 1.68 22.32
केस 9 37 65 1.58 26.04

तालिका 1: अध्ययन किए गए व्यक्तियों के नमूनों से डेटा। * बीएमआई: बॉडी मास इंडेक्स।

रोगी एकत्रित मात्रा (mL) एसवीएफ सेलुलर उपज (सेल / एमएल) (एक्स 105) संस्कृति में मात्रा (एमएल) पुष्टि किए गए एडीएससी का औसत प्रतिशत (%) प्रारंभिक संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या (x 105) संस्कृति में एडीएससी की अनुमानित संख्या (x 105) P1 के लिए दिन P1 पर जाने से पहले सेलुलर उपज (x 105)
केस 1 96 9.2 2 ना 18.4 ना 10 18
केस 2 100 25.2 1 38 25.2 9.6 12 10.8
केस 3 100 26.2 1 ना 26.2 ना 12 6.6
केस 4 105 21.1 1 55.9 21.1 11.8 3 13.1
केस 5 110 23.7 1 61.4 23.7 14.5 4 16.1
केस 6 100 13.3 1.1 78.9 14.6 11.5 10 13.5
केस 7 98 6.8 2 ना 13.6 ना 8 10.5
केस 8 100 9.7 1.1 44.2 10.7 4.7 11 6.9
केस 9 100 6.1 2 43.8 12.2 5.3 6 15.9
एसडी 3.89 7.81 0.46 13.75 5.55 3.53 3.2 3.79

तालिका 2: विश्लेषण किए गए नौ रोगियों से प्रक्रिया के विभिन्न चरणों से डेटा। एसवीएफ: स्ट्रोमल संवहनी अंश; एडीएससी: वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल; पी 1: मार्ग 1; ना: डेटा उपलब्ध नहीं है।

नमूना मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा निर्धारित एडीएससी का % मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा निर्धारित हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं का प्रतिशत सेल व्यवहार्यता परख और एसवीएफ क्रायोप्रिजर्वेशन का समय
CD45-(*) CD73+/CD90+ CD73+/CD105+ CD105+/CD90+ औसत CD34+ एचएलए-डीआर + CD11b+ CD19+ जीवित / मृत +
केस 2 52.34% 31.97% 25.36% 56.52% 37.95% 63.16% 12.87% 2.41% 0.21% 39.54% (2 साल)
केस 4 48.02% 61.62% 40.93% 65.25% 55.93% 82.94% 26.62% 0.00% 0.16% 38.30% (2 वर्ष)
केस 5 27.74% 54.02% 49.72% 80.42% 61.38% 73.33% 51.31% 0.05% 0.00% 23.06% (2 वर्ष)
केस 6 55.52% 79.52% 67.70% 89.52% 78.91% 86.86% 8.83% 0.18% 1.06% 56.76% (2 वर्ष)
केस 8 57.28% 46.84% 30.88% 57.65% 45.12% 78.47% 26.97% 0.03% 0.00% 55.56% (1 वर्ष)
केस 9 56.14% 47.52% 36.30% 47.69% 43.83% 88.10% 26.94% 0.05% 0.24% 72.34% (8 महीने)

तालिका 3: छह रोगियों से फ्लो साइटोमेट्री डेटा। (*) इन सीडी 45- कोशिकाओं से, स्टेम सेल मार्करों के विभिन्न संयोजनों के साथ एडीएससी का % निर्धारित किया गया था। एडीएससी: वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल; एसवीएफ: स्ट्रोमल संवहनी अंश; (*) इन सीडी 45- कोशिकाओं से, स्टेम सेल मार्करों के विभिन्न संयोजनों के साथ एडीएससी का % निर्धारित किया गया था।

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Discussion

अलगाव उपज
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया, अक्सर सेलुलर थेरेपी में आवश्यक होती है, जिसके परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण सेल हानि होती है, कभी-कभी 50% 29,30,35 से अधिक होती है। इस प्रकार, अलगाव में उच्च प्रारंभिक सेलुलर उपज प्राप्त करने के लिए एक तकनीकी सुधार मौलिक है। लिपोएस्पिरेट की संग्रह विधि और कोशिकाओं की अलगाव विधि को कोशिकाओं की अधिक संख्या को संरक्षित करने, उच्च व्यवहार्यता बनाए रखने और कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति और हेरफेर के लिए लेखांकन करते हुए प्रारंभिक सामग्री से कोशिकाओं की अधिकतम संख्या निकालने पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए। इसलिए, कोशिकाओं को एपोप्टोसिस, सेनेसेंस या आनुवंशिक अस्थिरता से दूर रखने के लिए सीधे संस्कृति रखरखाव की आवश्यकता होती है, क्योंकि सेल थेरेपी रोगियों के लिए प्रभावी और सुरक्षित होने की संभावना है।

हमारे ज्ञान के अनुसार, लिपोएस्पिरेट से प्राप्त मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के लिए चरणों के इस सेट का उपयोग करने वाला कोई पिछला लेख नहीं है, जिसके परिणामस्वरूप समय की बचत और लागत-लाभ तकनीक होती है। इस अध्ययन में, प्रत्येक पद्धतिगत कदम को साहित्य के अनुसार तर्क दिया गया था जिसने सेलुलर अलगाव में उच्चतम अंतिम सेल उपज दिखाई थी। इस अध्ययन में की गई तकनीक की नवीनता लिपोएस्पिरेट वॉश की एक श्रृंखला से जुड़े मैनुअल आकांक्षा का उपयोग था, जिसमें बाद में बैग आराम कर रहा था। लिपोएस्पिरेट के परिवहन और प्रक्रिया के लिए उपयोग किए जाने वाले संग्रह बैग ने कोलेजनेज पाचन में भाग नहीं लेने के लिए बिना पचे ऊतक के टुकड़ों की अनुमति दी। सबसे महत्वपूर्ण कदम ताजा पाचन समाधान में कैल्शियम क्लोराइड जोड़ना है क्योंकि यह कोलेजनेज की कार्रवाई को शक्तिशाली बनाता है। समय लाभ अभी तक साहित्य में एक सेल पिघलने विधि के साथ रिपोर्ट नहीं किया गया है जो लंबे क्रायोप्रिजर्वेशन समय के बाद भी व्यवहार्य कोशिकाओं की अनुमति देता है। इस अध्ययन में पाया गया एसवीएफ सेलुलर उपज मोटे तौर पर 6.15 से 26.2 x 105 कोशिकाओं / एमएल के औसत के साथ 15.7 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक भिन्न होती है। यह एड्रेनालाईन समाधान की अधिक महत्वपूर्ण मात्रा की उपस्थिति के कारण हो सकता है, जो शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के चरण के अनुसार और आम तौर पर एसवीएफ में पाए जाने वाले अन्य ज्ञात सेल प्रकारों की संख्या के अनुसार अधिक या कम हो सकता है। हालांकि कुछ अध्ययनों में बीएमआई और एडीएससी उपज36,37 के बीच नकारात्मक सहसंबंध पाए गए हैं, इस अध्ययन में कोई महत्वपूर्ण सहसंबंध नहीं पाया गया, अन्य दोअध्ययनों की तरह 38,39, इस अध्ययन में पाए गए एसवीएफ सेलुलर उपज की अविश्वसनीय विविधता का कारण होने की संभावना कम हो गई। इन आंकड़ों से पता चलता है कि प्राप्त सबसे कम एसवीएफ सेलुलर उपज 6.15 x 105 कोशिकाएं / एमएल थी। कुछ अध्ययनों ने लिपोएस्पिरेट प्राप्त करने के लिए शल्य चिकित्सा तकनीक के अनुसार एडीएससी अलगाव की दक्षता को पहले ही माप लिया था। एक अध्ययन ने एड्रेनालाईन समाधान (जैसा कि इस अध्ययन में उपयोग किया गया है) का उपयोग करके लिपोसक्शन तकनीक के लिए ताजा पृथक एसवीएफ में 0.087 x 105 कोशिकाएं / एमएल प्राप्त कीं और इसके बिना 0.143 x 105 कोशिकाएं / एमएल प्राप्तकीं। इस काम ने वासोकॉन्स्ट्रिक्टिव प्रभाव के कारण एड्रेनालाईन समाधान इंजेक्शन के महत्व पर प्रकाश डाला जो इंट्राऑपरेटिव रक्तस्राव और चोट को कम करता है, क्योंकि अधिकांश सर्जन नैदानिक अभ्यास में प्रदर्शन करना चुनते हैं। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि जीवित एडीएससी 0 से 0.59 x 105 कोशिकाओं / जी लिपोएस्पिरेट तक काटा गया था, जिसमें औसत 0.295 (±0.25) x 105 कोशिकाएं / जी ऊतक31 था। कुछ अध्ययनों ने उच्च एडीएससी उपज प्राप्त करने के विभिन्न तरीकों का परीक्षण किया है। इन अध्ययनों में से एक ने उस विधि के लिए लगभग 350 x 105 हासिल किया जो कोलेजनेज पाचन बफर में विभिन्न घटकों को प्रस्तुत करता है और एक कक्षीय शेकर40 का उपयोग करता है। एक अन्य अध्ययन में 29.7 (±0.2) x 105 कोशिकाओं / एमएल को पेट के क्षेत्र से एसवीएफ कोशिकाओं की कुल संख्या41 के रूप में दिखाया गया है। इस अध्ययन में चुना गया पेट क्षेत्र अभी भी लिपोएस्पिरेट42 की सर्वोत्तम उपलब्धता और पहुंच के लिए संदर्भ क्षेत्र है। लिपोएस्पिरेट संग्रह के लिए शरीर क्षेत्र, दाता की आयु और चुने गए संग्रह की विधि के रूप में अन्य कारकों के बीच, एडीएससी पैदावार की गुणवत्ता का एक मजबूत निर्धारक है।

प्रयोगों को जारी रखने के लिए कोशिकाओं की अनुपलब्धता के कारण सूक्ष्मजीवों के संदूषण की संभावना एकमात्र निष्पादन समस्या थी जिसने इस अध्ययन के पूरा होने को सीमित कर दिया। यहां तक कि एंटीबायोटिक दवाओं और अच्छे विनिर्माण अभ्यास आवश्यकताओं का उपयोग करके, वसा की आकांक्षा को पूरा करने के लिए कुल सड़न रोकनेवाला वातावरण की कमी के कारण संदूषण हो सकता है।

एसवीएफ इम्यूनोफेनोटाइपिंग
इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेलुलर थेरेपी34 की मेसेनकाइमल और ऊतक स्टेम सेल समिति के अनुसार, मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को परिभाषित करने के लिए तीन न्यूनतम मानदंडों में से एक यह है कि कोशिकाओं को सीडी 10534, सीडी73 34 और सीडी 9 034 को व्यक्त करना चाहिए और सीडी 4534, सीडी 34, सीडी34, सीडी 1434, या सीडी 11 बी34, सीडी 79 ए34 या सीडी 1 934 को व्यक्त नहीं करना चाहिए। और एचएलए-डीआर34 सतह झिल्ली अणु। मिशेल43 ने इम्यूनोफेनोटाइपिंग द्वारा ताजा एसवीएफ कोशिकाओं का परीक्षण किया और एडीएससी सतह मार्करों के साथ अधिकतम 54% कोशिकाओं को पाया। इस अध्ययन में, इम्यूनोफेनोटाइपिंग ने दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद एसवीएफ में 78.91% तक की पुष्टि किए गए एडीएससी (गैर-हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं) का उच्च प्रतिशत दिखाया (53.68% के औसत के साथ 37.95% -78.91% तक)। साक्ष्य से पता चलता है कि स्टेम सेल आबादी के पूर्वज अभी तक प्रतिबद्ध नहीं हैं जो सीडी 34 मार्कर34,44,45 को व्यक्त नहीं करते हैं। भेदभाव के चरण के आधार पर, सीडी 3434 नकारात्मक स्टेम कोशिकाएं न केवल हेमटोपोइएटिक पूर्वजों को उत्पन्न कर सकती हैं, बल्कि अधिक विशिष्ट मेसेनकाइमल अग्रदूत, जैसे ओस्टियोक्लास्ट, चोंड्रोसाइट्स, मायोसाइट्स, एडिपोसाइट्स और अन्य। कुछ अध्ययनों ने आदिम स्टेम सेल आबादी की हड़ताली प्लास्टिसिटी का प्रदर्शन किया, जो स्ट्रोमल सेल फ़ंक्शन और हेमटोपोइएटिक और मेसेनकाइमल पूर्वजोंके साथ कोशिकाओं से बना था। साहित्य के अनुसार, एसवीएफ कोशिकाओं में ऊतक गठन में पूर्ण सीडी34 34 कार्यात्मक भूमिका अभीभी अज्ञात है। मिशेल43 ने सीडी 34 34 मार्कर को व्यक्त करने वाले एसवीएफ की 60% कोशिकाओं का औसत दिखाया, जबकि, इस अध्ययन में, औसत 78.81% था। यह ज्ञात है कि सीडी 3434 सतह मार्कर की अभिव्यक्ति मार्ग के साथ कम हो जाती है।

अनुयायी कोशिकाएं और भेदभाव परख
अलगाव के बाद प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, पहली संस्कृति में बीजित कोशिकाओं की संख्या भिन्न होती है। 75 सेमी2 फ्लास्क में 80% -90% संगम तक पहुंचने के लिए पहली संस्कृति समय में औसतन 8.4 दिन और 7.5 (±4.5) दिनों का मानक विचलन 6.6 से 16.1 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक था। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कम सेलुलर उपज वाले मामलों के लिए भी, पहली संस्कृति समय ने साहित्य की तुलना में उच्च सेलुलर उपज सूचकांक का नेतृत्व किया, शायद पूरे संग्रह और अलगाव प्रक्रिया के दौरान बनाए गए व्यवहार्य कोशिकाओं की सर्वोत्तम उपलब्धता के कारण। एक अध्ययन ने 4.1 (±0.7) दिन कीसंस्कृति अवधि 47 के भीतर लिपोएस्पिरेट के प्रति एमएल 3.75 (±1.42) x 105 एडीएससी की सेलुलर उपज प्राप्त की। एक अन्य अध्ययन ने पहली संस्कृति अवधि 43 में 6.0 (±2.4) दिनों के औसत के साथ3.08 (±1.40) x 105 मिलीमीटर की न्यूक्लियेटेड एसवीएफ कोशिकाओं की उपज का प्रदर्शन किया। इस अध्ययन में, संस्कृति में बीजित एडीएससी की संख्या का अनुमान लगाकर, जो लिपोएस्पिरेट के 100 एमएल की समान मात्रा के संग्रह से एसवीएफ में देखी गई कोशिकाओं की संख्या के कार्य के रूप में भिन्न था, यह सत्यापित किया गया था कि पी 1 तक पहुंचने वाले दिनों की संख्या का सेल वॉल्यूम से कोई संबंध नहीं था। उदाहरण के लिए, केस 9 के लिए, जिसमें 12.2 x 105 कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया गया था, 80% -90% संगम तक पहुंचने के लिए 6 दिनों की आवश्यकता थी। केस 6 के लिए, जिसमें 14.6 x 105 कोशिकाओं को संस्कृति में बीज दिया गया था, संगम के समान स्तर तक पहुंचने के लिए अधिक विस्तारित अवधि (10 दिन) आवश्यक थी। शायद, पहली आसंजन अवधि के लिए एक न्यूनतम एडीएससी संख्या पर्याप्त है। कोमोर्बिडिटी, आयु और सामान्य स्वास्थ्य की स्थिति जैसे महत्वपूर्ण अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता हो सकती है। साहित्य में कुछ अध्ययनों ने एसवीएफ सेल उपज48,49 के लिए रोगियों की अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता पर विचार करने के महत्व पर सवाल उठाया।

इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेलुलर थेरेपी34 की मेसेनकाइमल और ऊतक स्टेम सेल समिति के अनुसार, मेसेनकाइमल सेल में ओस्टोजेनिक, एडिपोजेनिक और चोंड्रोजेनिक वंश के रूप में तीन अलग-अलग सेल प्रकारों में अंतर करने की क्षमता होनी चाहिए जैसा कि चित्र 4 में प्रदर्शित किया गया था।

सेल व्यवहार्यता, क्रायोप्रिजर्वेशन, और आनुवंशिक अस्थिरता
व्यवहार्यता हानि को निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है, जिसे प्लाज्मा झिल्ली अखंडता क्षति50 के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि, संस्कृतियां प्रारंभिक एपोप्टोटिक कोशिकाओं को भी पेश कर सकती हैं जिन्हें ये दृष्टिकोण अनदेखा कर सकते हैं क्योंकि वे एक बरकरार प्लाज्मा झिल्ली बनाए रखते हैं, लेकिन वे अव्यवहार्य हैं। यहां रिपोर्ट किए गए परिणाम व्यवहार्यता मार्कर में एक बड़ी सीमा दिखाते हैं, 23.06% -72.34% तक, दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद 47.6% का औसत। यह देखते हुए कि क्रायोप्रिजर्वेशन सेल थेरेपी से संबंधित एक महत्वपूर्ण कदम है, पिघलने के बाद व्यवहार्य और कार्यात्मक स्टेम कोशिकाओं की अधिकतम संख्या की वसूली सेल थेरेपी की सफलता के लिए प्राथमिकता के मुद्दों में से एक है। साहित्य से पता चला है कि क्रायोप्रिजर्वेशन43 के बाद 1-4 महीने से सेल व्यवहार्यता का कम से कम 50% खो जाता है। विशेष रूप से, इस अध्ययन में प्रस्तुत सबसे कम सूचकांक केस 5, केस 4 और केस 2 से हैं, जो सबसे पुराने क्रायोसंरक्षित नमूने (लगभग 2 वर्ष) हैं। यद्यपि उन्होंने सबसे कम व्यवहार्यता सूचकांक प्रस्तुत किए, उन्होंने ताजा एसवीएफ में ट्रिपैन ब्लू डाई बहिष्करण परख में उच्च सेलुलर उपज का प्रदर्शन किया। यद्यपि साहित्य व्यवहार्यता हानि के कारणों का समर्थन करता है, ये दरें अपेक्षा से कम हैं। तकनीकी कारणों से सेल भंडारण में तापमान में उतार-चढ़ाव तनाव की वृद्धि और संचय का कारण बन सकता है और जलीय भागों के संचय का पक्ष ले सकता है, जिससे क्रिस्टल उत्पन्न होते हैं जो दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन51 के दौरान प्लास्मोटिक झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं। साहित्य समान या लंबे समय तक ठंड के समय वाले नमूनों के लिए 70% से अधिक व्यवहार्यता दिखाता है। हालांकि, व्यवहार्यता जांचइस अध्ययन में की गई तुलना में एक अलग तकनीक के साथ की गई थी। एक अन्य अध्ययन से पता चला है कि लंबे समय तक क्रायोप्रिजर्वेशन सेलुलर व्यवहार्यता31 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है, जिसे -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में तापमान भिन्नताओं द्वारा समझाया जा सकता है। इसलिए, कोशिकाओं को अक्सर संस्कृति में बहुत लंबे समय तक रहने की आवश्यकता होती है, जो कोशिका चक्र तनाव को बढ़ाता है, आनुवंशिक अस्थिरता के लिए जोखिम लाता है और परिणामस्वरूप सेलुलर थेरेपी से समझौता करता है। साहित्य में एक आम सहमति भी है जो कुछ तनाव कारकों को इंगित करती है और वे सेल साइटोजेनेटिक स्थिरता को कैसे प्रभावित करते हैं, जो सेल थेरेपी35,53 के लिए आवश्यक लंबे समय तक स्टेम सेल खेती को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

कार्यप्रणाली लाभ
आज तक, साहित्य नैदानिक अनुप्रयोगों के उद्देश्य से एडीएससी को अलग करने के लिए कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं दिखाता है। अधिकांश अध्ययन जटिल, समय लेने वाले प्रोटोकॉल24 का प्रदर्शन करते हैं। इस अध्ययन में, प्रारंभिक सेलुलर उपज को पूरा करने के लिए मांगे गए समय बनाम विधि की दक्षता पर जोर दिया जाना चाहिए: लगभग 1.5 घंटे। साहित्य के अनुसार, वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के अलगाव में लगभग 3 घंटे से 8 घंटे54,55 तक का समय लग सकता है। इस प्रकार, पुनर्योजी चिकित्सा चिकित्सीय प्रगति के लिए उच्च सेलुलर आय से संबद्ध समय का लाभ महत्वपूर्ण है। इस पद्धति को बेहतर बनाने के लिए इस काम में किए गए लोगों के समानांतर अधिक सेल व्यवहार्यता आकलन किया जाना चाहिए। इन परिणामों को प्रतिहस्ताक्षरित करने के लिए इस पद्धति का उपयोग करके अधिक व्यापक नमूने को शामिल करने वाले आगे यादृच्छिक नियंत्रित परीक्षणों की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम उन रोगियों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने स्वेच्छा से भाग लिया और अस्पताल साओ पाउलो के चिकित्सा और नर्सिंग कर्मचारियों को धन्यवाद दिया। इस अध्ययन को फंडाको डी एम्पारो ए पेसक्विसा डो एस्टाडो डी साओ पाउलो (एफएपीईएसपी) और कॉन्सेलो नेशनल डी डेसेनवोल्विमेंटो साइंटिफिको और टेक्नोलोगिको (सीएनपीक्यू), ब्राजील द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.8 mL cryovials Nunc Thermo Fisher Scientific 340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag JP FARMA 80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 Sigma Aldrich A5533
Adrenaline (1 mg/mL) Hipolabor NA
Alcian Blue solution Sigma Aldrich 1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis BD BioSciences NA
Calcium chloride 10% Merck 102379
Chlorhexidine gluconate 4% VIC PHARMA NA
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) Gibco 11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285601
Fetal bovine serum Gibco 10500056
Formaldehyde 4% Sigma Aldrich 1,00,496
Inverted light microscope Nikon Eclipse TS100 NA
Live and Dead Cell Assay Thermofisher 01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105 BD BioSciences 745927
Monoclonal antibody: CD11B BD BioSciences 746004
Monoclonal antibody: CD19 BD BioSciences 745907
Monoclonal antibody: CD34 BD BioSciences 747822
Monoclonal antibody: CD45 DAKO M0701
Monoclonal antibody: CD73 BD BioSciences 746000
Monoclonal antibody: CD90 BD BioSciences 553011
Monoclonal antibody: HLA-DR BD BioSciences 340827
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 Gibco  10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Gibco A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Gibco A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Gibco A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site Origen Biomedical Connector, USA NA Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4% Sigma Aldrich 93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red Gibco 25200056

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References

  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
  32. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
  33. Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).

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Pola-Silva, L., Xerfan Nahas, F., Nascimento, F., Santos, T. R., Malinverni, A. M., Alves, A., Ferreira, L. M., Melaragno, M. I. Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation. J. Vis. Exp. (178), e63036, doi:10.3791/63036 (2021).

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