Summary

Technique d’obtention de cellules souches mésenchymateuses à partir de tissu adipeux et caractérisation de la fraction vasculaire stromale dans la cryoconservation à long terme

Published: December 30, 2021
doi:

Summary

Le présent protocole décrit une méthodologie améliorée pour l’isolement ADSC résultant en un rendement cellulaire énorme avec gain de temps par rapport à la littérature. Cette étude fournit également une méthode simple pour obtenir un nombre relativement important de cellules viables après cryoconservation à long terme.

Abstract

Les cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux sont devenues de plus en plus attrayantes car elles présentent des caractéristiques appropriées et constituent une source accessible pour des applications cliniques régénératives. Différents protocoles ont été utilisés pour obtenir des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Cet article décrit les différentes étapes d’un protocole amélioré permettant de gagner du temps pour obtenir une quantité plus importante d’ADSC, en montrant comment cryopréserver et décongeler l’ADSC pour obtenir des cellules viables pour l’expansion de la culture. Cent millilitres de lipoaspiration ont été prélevés, à l’aide d’une liposuccion à seringue de calibre trois trous de 26 cm et de calibre 3 mm, dans la région abdominale de neuf patients qui ont ensuite subi une abdominoplastie élective. L’isolement des cellules souches a été réalisé avec une série de lavages avec la solution de solution de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco supplémentée en calcium et en utilisant de la collagénase. Les cellules de la fraction vasculaire stromale (SVF) ont été cryopréservées et leur viabilité a été vérifiée par immunophénotypage. Le rendement cellulaire SVF était de 15,7 x 105 cellules/mL, variant entre 6,1 et 26,2 cellules/mL. Les cellules SVF adhérentes ont atteint la confluence après une moyenne de 7,5 (±4,5) jours, avec un rendement cellulaire moyen de 12,3 (± 5,7) x 105 cellules / mL. La viabilité de la SVF décongelée après 8 mois, 1 an et 2 ans variait entre 23,06 % et 72,34 %, avec une moyenne de 47,7 % (±24,64), la viabilité la plus faible étant corrélée aux cas de gel de deux ans. L’utilisation de la solution DPBS complétée par du calcium et des temps de repos en sac pour la précipitation des graisses avec un temps de digestion de collagénase plus court a entraîné une augmentation du rendement cellulaire final des cellules souches. La procédure détaillée pour obtenir des rendements élevés de cellules souches viables était plus efficace en termes de temps et de rendement cellulaire que les techniques des études précédentes. Même après une longue période de cryoconservation, des cellules ADSC viables ont été trouvées dans le SVF.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont avantageuses en recherche fondamentale et appliquée. L’utilisation de ce type de cellules adultes dépasse les questions éthiques – par rapport à l’utilisation de cellules embryonnaires ou autres – étant l’un des domaines d’étude les plus prometteurs en ingénierie de la régénération tissulaire autologue et en thérapie cellulaire1, tels que le domaine néoplasique, le traitement des maladies dégénératives et les applications thérapeutiques dans le domaine de la chirurgie reconstructive 2,3,4, 5. Il a été précédemment rapporté qu’il existe une source abondante de cellules souches mésenchymateuses multipotentes et pluripotentes dans la fraction cellulaire vasculaire stromale du tissu adipeux 6,7. Ces ADSC sont considérés comme d’excellents candidats pour une utilisation en thérapie cellulaire et en transplantation/perfusion car un nombre considérable de cellules ayant une forte capacité d’expansion ex vivo peuvent être facilement obtenues avec un rendement élevé à partir d’une procédure invasive minimale 5,8.

Il a également été démontré que le tissu adipeux présente une plus grande capacité à fournir des cellules souches mésenchymateuses que deux autres sources (moelle osseuse et tissu du cordon ombilical)9. En plus d’être peu immunogène et d’avoir une grande capacité à s’intégrer dans le tissu hôte et à interagir avec les tissus environnants4,10, l’ADSC a une capacité multipotente de différenciation en lignées cellulaires, avec des rapports de différenciation chondromogène, ostéogénique et myogénique dans des conditions de culture appropriées11,12,13, et dans les cellules, telles que le pancréas, les hépatocytes, et cellules neurogènes14,15,16.

La communauté scientifique s’accorde à dire que l’effet immunomodulateur des cellules souches mésenchymateuses est un mécanisme d’action plus pertinent pour la thérapie cellulaire17,18,19 que leur propriété de différenciation. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de l’ADSC est la possibilité de perfusion ou de greffe autologue, devenant un traitement alternatif pour plusieurs maladies. Pour la médecine régénérative, les ADSC ont déjà été utilisés dans les cas de lésions hépatiques, de reconstruction du muscle cardiaque, de régénération du tissu nerveux, d’amélioration de la fonction musculaire squelettique, de régénération osseuse, de traitement du cancer et de traitement du diabète20,21.

À ce jour, il existe 263 essais cliniques enregistrés pour l’évaluation du potentiel de l’ADSC, répertoriés sur le site Web des National Institutes of Health des États-Unis22. Différents protocoles de prélèvement de tissu adipeux ont été établis, mais il n’y a pas de consensus dans la littérature sur une méthode normalisée pour isoler l’ADSC à des fins cliniques23,24. Les méthodes de traitement des lipoaspires pendant et après la chirurgie peuvent affecter directement la viabilité cellulaire, le rendement cellulaire final25 et la qualité de la population ADSC20. En ce qui concerne le prétraitement chirurgical, il n’est pas bien établi quelle technique chirurgicale de prétraitement produit un nombre plus significatif de cellules viables après isolement ou si la solution anesthésique injectée dans le tissu adipeux affecte le rendement cellulaire et ses fonctions26. De même, la différence entre les techniques d’obtention de cellules adipeuses peut entraîner une diminution allant jusqu’à 70% du nombre d’ADSC20 viables. Selon la littérature, les traitements mécaniques visant à obtenir des populations cellulaires à haute viabilité – y compris les ultrasons – doivent être évités, car ils peuvent décomposer le tissu adipeux20. Cependant, la méthode d’aspiration manuelle des graisses avec des seringues est moins nocive, causant moins de destruction cellulaire, la liposuccion tumescente produisant un nombre important de cellules de la meilleure qualité26.

Cette technique utilise une solution saline avec de la lidocaïne et de l’épinéphrine qui est injectée dans la zone de liposuccion. Pour chaque volume de 3 mL de solution injecté, 1 mL est aspiré. Dans cette étude, la technique de liposuccion humide a été réalisée, dans laquelle pour chaque 1 mL d’adrénaline et de solution saline injectée, 0,2 mL de tissu adipeux est aspiré. L’utilisation d’enzymes digestives, en particulier de collagénase, est courante pour le processus d’isolement de l’ADSC.

Après la première étape d’isolement en laboratoire, la pastille finale est appelée fraction vasculaire stromale (SVF). Il contient différents types de cellules27, y compris les cellules précurseurs endothéliales, les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules musculaires lisses, les lymphocytes, les péricytes, les pré-adipocytes et les ADSC, qui sont capables d’adhérence. Une fois l’isolement final conclu à partir de cultures in vitro , les cellules qui n’adhéraient pas au plastique sont éliminées dans des échanges de milieu. Après huit semaines d’expansion, de changements moyens et de passages, les ADSC représentent la majeure partie de la population cellulaire dans les flacons20. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de cellules souches isolées dérivées du tissu adipeux pour une éventuelle thérapie future est la possibilité de cryoconservation. Il a été démontré que la lipoaspiration cryoconservée est une source potentielle de cellules SVF même après 6 semaines de congélation28, avec une activité biologique même après 2 ans de cryoconservation29, et une capacité totale de croissance et de différenciation en culture30. Cependant, au cours du processus de décongélation, un pourcentage considérable de cellules est généralement perdu31. Par conséquent, le processus d’élimination des lipoaspires et les méthodes suivantes d’isolement cellulaire doivent assurer le rendement cellulaire le plus élevé.

Cette étude décrit une méthodologie plus rapide pour collecter et isoler l’ADSC, démontrant un rendement cellulaire élevé et une viabilité pour une meilleure efficacité des thérapies cellulaires. De plus, l’effet de cette technique améliorée après cryoconservation à long terme de la SVF a été évalué.

Protocol

La présente étude est approuvée par le Comité d’éthique de l’UNIFESP (numéro de protocole : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505), réalisée après avoir obtenu le consentement éclairé écrit des patients conformément à la Déclaration d’Helsinki (2004). L’échantillon de la présente étude est composé de neuf patientes, âgées de 33 à 50 ans (âge moyen de 41,5 ans) et d’un indice de masse corporelle initial (IMC) moyen de 24,54 (allant de 22,32 à 26,77) (tableau 1) qui ont su…

Representative Results

La caractérisation des neuf personnes étudiées, y compris leur âge, leur poids, leur taille et leur IMC, est présentée au tableau 1. Selon le rendement cellulaire initialement présenté, le volume cellulaire inoculé en culture a été calculé pour être le plus proche possible de la capacité du ballon de culture de 75cm2. Le volume d’échantillon ensemencé dans chaque cas est décrit au tableau 2. Ensuite, selon le rendement cellulaire …

Discussion

Rendement d’isolement
Il est bien établi que le procédé de cryoconservation, fréquemment requis en thérapie cellulaire, entraîne une perte cellulaire importante, parfois supérieure à 50%29,30,35. Ainsi, une amélioration technique pour obtenir un rendement cellulaire initial élevé isolément est fondamentale. La méthode de collecte des lipoaspirations et la méthode d’isolement des cellules doi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les patients qui se sont portés volontaires pour participer et le personnel médical et infirmier de l’hôpital de São Paulo. Cette étude a été soutenue par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brésil.

Materials

1.8 mL cryovials Nunc Thermo Fisher Scientific 340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag JP FARMA 80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 Sigma Aldrich A5533
Adrenaline (1 mg/mL) Hipolabor NA
Alcian Blue solution Sigma Aldrich 1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis BD BioSciences NA
Calcium chloride 10% Merck 102379
Chlorhexidine gluconate 4% VIC PHARMA NA
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) Gibco 11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285601
Fetal bovine serum Gibco 10500056
Formaldehyde 4% Sigma Aldrich 1,00,496
Inverted light microscope Nikon Eclipse TS100 NA
Live and Dead Cell Assay Thermofisher 01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105 BD BioSciences 745927
Monoclonal antibody: CD11B BD BioSciences 746004
Monoclonal antibody: CD19 BD BioSciences 745907
Monoclonal antibody: CD34 BD BioSciences 747822
Monoclonal antibody: CD45 DAKO M0701
Monoclonal antibody: CD73 BD BioSciences 746000
Monoclonal antibody: CD90 BD BioSciences 553011
Monoclonal antibody: HLA-DR BD BioSciences 340827
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 Gibco  10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Gibco A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Gibco A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Gibco A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site Origen Biomedical Connector, USA NA Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4% Sigma Aldrich 93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red Gibco 25200056

References

  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol’Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol’Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. . US National Institutes of Health Website Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019)
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
  32. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , (2001).
  33. . Spearman’s Rho Calculator Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020)
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).

Play Video

Cite This Article
Pola-Silva, L., Xerfan Nahas, F., Nascimento, F., Santos, T. R., Malinverni, A. M., Alves, A., Ferreira, L. M., Melaragno, M. I. Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation. J. Vis. Exp. (178), e63036, doi:10.3791/63036 (2021).

View Video