Summary
Le présent protocole décrit une méthodologie améliorée pour l’isolement ADSC résultant en un rendement cellulaire énorme avec gain de temps par rapport à la littérature. Cette étude fournit également une méthode simple pour obtenir un nombre relativement important de cellules viables après cryoconservation à long terme.
Abstract
Les cellules souches mésenchymateuses humaines dérivées du tissu adipeux sont devenues de plus en plus attrayantes car elles présentent des caractéristiques appropriées et constituent une source accessible pour des applications cliniques régénératives. Différents protocoles ont été utilisés pour obtenir des cellules souches dérivées du tissu adipeux. Cet article décrit les différentes étapes d’un protocole amélioré permettant de gagner du temps pour obtenir une quantité plus importante d’ADSC, en montrant comment cryopréserver et décongeler l’ADSC pour obtenir des cellules viables pour l’expansion de la culture. Cent millilitres de lipoaspiration ont été prélevés, à l’aide d’une liposuccion à seringue de calibre trois trous de 26 cm et de calibre 3 mm, dans la région abdominale de neuf patients qui ont ensuite subi une abdominoplastie élective. L’isolement des cellules souches a été réalisé avec une série de lavages avec la solution de solution de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco supplémentée en calcium et en utilisant de la collagénase. Les cellules de la fraction vasculaire stromale (SVF) ont été cryopréservées et leur viabilité a été vérifiée par immunophénotypage. Le rendement cellulaire SVF était de 15,7 x 105 cellules/mL, variant entre 6,1 et 26,2 cellules/mL. Les cellules SVF adhérentes ont atteint la confluence après une moyenne de 7,5 (±4,5) jours, avec un rendement cellulaire moyen de 12,3 (± 5,7) x 105 cellules / mL. La viabilité de la SVF décongelée après 8 mois, 1 an et 2 ans variait entre 23,06 % et 72,34 %, avec une moyenne de 47,7 % (±24,64), la viabilité la plus faible étant corrélée aux cas de gel de deux ans. L’utilisation de la solution DPBS complétée par du calcium et des temps de repos en sac pour la précipitation des graisses avec un temps de digestion de collagénase plus court a entraîné une augmentation du rendement cellulaire final des cellules souches. La procédure détaillée pour obtenir des rendements élevés de cellules souches viables était plus efficace en termes de temps et de rendement cellulaire que les techniques des études précédentes. Même après une longue période de cryoconservation, des cellules ADSC viables ont été trouvées dans le SVF.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont avantageuses en recherche fondamentale et appliquée. L’utilisation de ce type de cellules adultes dépasse les questions éthiques - par rapport à l’utilisation de cellules embryonnaires ou autres - étant l’un des domaines d’étude les plus prometteurs en ingénierie de la régénération tissulaire autologue et en thérapie cellulaire1, tels que le domaine néoplasique, le traitement des maladies dégénératives et les applications thérapeutiques dans le domaine de la chirurgie reconstructive 2,3,4, 5. Il a été précédemment rapporté qu’il existe une source abondante de cellules souches mésenchymateuses multipotentes et pluripotentes dans la fraction cellulaire vasculaire stromale du tissu adipeux 6,7. Ces ADSC sont considérés comme d’excellents candidats pour une utilisation en thérapie cellulaire et en transplantation/perfusion car un nombre considérable de cellules ayant une forte capacité d’expansion ex vivo peuvent être facilement obtenues avec un rendement élevé à partir d’une procédure invasive minimale 5,8.
Il a également été démontré que le tissu adipeux présente une plus grande capacité à fournir des cellules souches mésenchymateuses que deux autres sources (moelle osseuse et tissu du cordon ombilical)9. En plus d’être peu immunogène et d’avoir une grande capacité à s’intégrer dans le tissu hôte et à interagir avec les tissus environnants4,10, l’ADSC a une capacité multipotente de différenciation en lignées cellulaires, avec des rapports de différenciation chondromogène, ostéogénique et myogénique dans des conditions de culture appropriées11,12,13, et dans les cellules, telles que le pancréas, les hépatocytes, et cellules neurogènes14,15,16.
La communauté scientifique s’accorde à dire que l’effet immunomodulateur des cellules souches mésenchymateuses est un mécanisme d’action plus pertinent pour la thérapie cellulaire17,18,19 que leur propriété de différenciation. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de l’ADSC est la possibilité de perfusion ou de greffe autologue, devenant un traitement alternatif pour plusieurs maladies. Pour la médecine régénérative, les ADSC ont déjà été utilisés dans les cas de lésions hépatiques, de reconstruction du muscle cardiaque, de régénération du tissu nerveux, d’amélioration de la fonction musculaire squelettique, de régénération osseuse, de traitement du cancer et de traitement du diabète20,21.
À ce jour, il existe 263 essais cliniques enregistrés pour l’évaluation du potentiel de l’ADSC, répertoriés sur le site Web des National Institutes of Health des États-Unis22. Différents protocoles de prélèvement de tissu adipeux ont été établis, mais il n’y a pas de consensus dans la littérature sur une méthode normalisée pour isoler l’ADSC à des fins cliniques23,24. Les méthodes de traitement des lipoaspires pendant et après la chirurgie peuvent affecter directement la viabilité cellulaire, le rendement cellulaire final25 et la qualité de la population ADSC20. En ce qui concerne le prétraitement chirurgical, il n’est pas bien établi quelle technique chirurgicale de prétraitement produit un nombre plus significatif de cellules viables après isolement ou si la solution anesthésique injectée dans le tissu adipeux affecte le rendement cellulaire et ses fonctions26. De même, la différence entre les techniques d’obtention de cellules adipeuses peut entraîner une diminution allant jusqu’à 70% du nombre d’ADSC20 viables. Selon la littérature, les traitements mécaniques visant à obtenir des populations cellulaires à haute viabilité - y compris les ultrasons - doivent être évités, car ils peuvent décomposer le tissu adipeux20. Cependant, la méthode d’aspiration manuelle des graisses avec des seringues est moins nocive, causant moins de destruction cellulaire, la liposuccion tumescente produisant un nombre important de cellules de la meilleure qualité26.
Cette technique utilise une solution saline avec de la lidocaïne et de l’épinéphrine qui est injectée dans la zone de liposuccion. Pour chaque volume de 3 mL de solution injecté, 1 mL est aspiré. Dans cette étude, la technique de liposuccion humide a été réalisée, dans laquelle pour chaque 1 mL d’adrénaline et de solution saline injectée, 0,2 mL de tissu adipeux est aspiré. L’utilisation d’enzymes digestives, en particulier de collagénase, est courante pour le processus d’isolement de l’ADSC.
Après la première étape d’isolement en laboratoire, la pastille finale est appelée fraction vasculaire stromale (SVF). Il contient différents types de cellules27, y compris les cellules précurseurs endothéliales, les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules musculaires lisses, les lymphocytes, les péricytes, les pré-adipocytes et les ADSC, qui sont capables d’adhérence. Une fois l’isolement final conclu à partir de cultures in vitro , les cellules qui n’adhéraient pas au plastique sont éliminées dans des échanges de milieu. Après huit semaines d’expansion, de changements moyens et de passages, les ADSC représentent la majeure partie de la population cellulaire dans les flacons20. L’un des avantages les plus importants de l’utilisation de cellules souches isolées dérivées du tissu adipeux pour une éventuelle thérapie future est la possibilité de cryoconservation. Il a été démontré que la lipoaspiration cryoconservée est une source potentielle de cellules SVF même après 6 semaines de congélation28, avec une activité biologique même après 2 ans de cryoconservation29, et une capacité totale de croissance et de différenciation en culture30. Cependant, au cours du processus de décongélation, un pourcentage considérable de cellules est généralement perdu31. Par conséquent, le processus d’élimination des lipoaspires et les méthodes suivantes d’isolement cellulaire doivent assurer le rendement cellulaire le plus élevé.
Cette étude décrit une méthodologie plus rapide pour collecter et isoler l’ADSC, démontrant un rendement cellulaire élevé et une viabilité pour une meilleure efficacité des thérapies cellulaires. De plus, l’effet de cette technique améliorée après cryoconservation à long terme de la SVF a été évalué.
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Protocol
La présente étude est approuvée par le Comité d’éthique de l’UNIFESP (numéro de protocole : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505), réalisée après avoir obtenu le consentement éclairé écrit des patients conformément à la Déclaration d’Helsinki (2004). L’échantillon de la présente étude est composé de neuf patientes, âgées de 33 à 50 ans (âge moyen de 41,5 ans) et d’un indice de masse corporelle initial (IMC) moyen de 24,54 (allant de 22,32 à 26,77) (tableau 1) qui ont subi une abdominoplastie esthétique due à un excès de peau après la grossesse, à la Division de chirurgie plastique de l’Université fédérale de São Paulo (UNIFESP), Brésil. Pour réduire les biais, les patients ont été sélectionnés comme un groupe homogène en tenant compte du sexe, de l’âge et de l’IMC. Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de cette étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable.
1. Collecte de lipoaspiration
REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans le centre de chirurgie.
- Utilisez du gluconate de chlorhexidine à 4 % (voir le tableau des matières) pour la préparation de la peau et l’asepsie.
- Effectuer une incision cutanée sous-cutanée de 2 mm (entre le sous-derme et l’aponévrose). Insérer une canule Klein de calibre 3 trous et 3 mm de 26 mm et une seringue pour injecter un volume total de 500 mL d’une solution d’adrénaline (1 mg/mL) (voir le tableau des matières) diluée dans une solution saline (1:1 000 000) dans la zone infra-ombilicale.
- Connectez une seringue de 60 ml à une canule de liposuccion de calibre 3 G à trois trous et 3 mm de 26 mm et insérez-la à travers l’incision cutanée, en verrouillant le piston pour créer un vide.
- Faites des mouvements de poussée et de traction de sorte que, avec le vide créé, le lipoaspirateur reste dans la seringue de 60 mL.
- À l’aide d’un connecteur stérile muni d’une valve, transférer les 100 mL de lipoaspiration recueillie dans un sac de transfert de polychlorure de vinyle de 150 mL (voir le tableau des matières).
- Emballez le sac de transfert dans une boîte en polystyrène à température ambiante (~25 °C) et apportez-le immédiatement au laboratoire. Ne prenez pas plus de 30 minutes pour commencer le traitement des tissus.
2. Traitement de la lipoaspiration
NOTE: Cette étape doit être effectuée en laboratoire.
- Tout d’abord, pesez le sac, mesurez la température avec un thermomètre clinique infrarouge numérique sans contact et laissez le sac reposer pendant 5 minutes à l’intérieur de la chambre d’écoulement laminaire pour la précipitation des couches graisseuses (bulles) et la séparation tissulaire contenant les cellules d’intérêt.
- Effectuez une série de lavages de tissus. Premier lavage : injecter 100 mL de DPBS avec du calcium (1x) dans le sac de transfert et mélanger avec les mains.
- Laisser reposer pendant 5 minutes et enlever la majeure partie du liquide basal qui précipite.
- Jetez le liquide basal à l’aide d’une seringue de 60 ml fixée à l’adaptateur de sac. Ce processus doit être répété deux fois.
- Ajouter 100 mL de solution de digestion dans le sac (93 mL de DPBS sans calcium + 60 μL de chlorure de calcium (1 g/L) + 7 mL de collagénase stérile à 0,075 %, voir le tableau des matières) et laisser à 37 °C pendant 30 min sous agitation lente.
- Transvaser tout le contenu du sac dans quatre tubes coniques de 50 ml et les centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant et ajouter 5 mL de faible teneur en glucose du milieu d’Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 20 % de FBS (sérum fœtal bovin) à la pastille cellulaire (Figure 1).
3. Comptage des cellules SVF
- Mélanger une solution fraîche de 10 μL de bleu de trypan à 0,05% dans de l’eau distillée avec 10 μL de suspension cellulaire pendant 5 min.
- Compter les cellules viables dans une chambre de comptage des cellules de Neubauer32 à l’aide d’un microscope à lumière inversée (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 20x.
- Resuspendre la pastille cellulaire dans un milieu cryoprotecteur (5 mL de FBS + 10% de Dimethyl Sulfoxide - DMSO) à une concentration de 1 x 106 cellules/mL.
- Placez 1 mL de ce mélange dans des cryovials. Utiliser un contenant congélateur (voir le tableau des matières) avec une vitesse de refroidissement de (1 °C/min à -80 °C).
- Conserver à -80 °C pendant 1 an.
- Passé ce délai, conserver dans des boîtes de cassettes standard immergées dans la phase vapeur d’azote liquide (-165 °C).
4. Processus de décongélation des cellules
- Retirez les flacons de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans le bain-marie à 37 °C pendant 1 min.
- Placer les cellules SVF dans un tube conique contenant 4 mL de DMEM (faible teneur en glucose supplémentée en FBS à 20 %) préchauffée à 37 °C.
- Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min.
- Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de DMEM (faible teneur en glucose) + 10% FBS. Effectuez l’immunophénotypage en suivant les étapes ci-dessous.
5. Technique de cytométrie en flux (marquage multiple de l’immunophénotype)
- Placer 1 mL de pastille cellulaire (concentration de 1 000 cellules/μL) dans cinq tubes de cytométrie (200 μL chacun).
- Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Ajouter 300 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (10x), centrifuger à 400 x g à 22 °C et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Préparer cinq tubes pour différentes combinaisons de marqueurs comme suit : 5 μL de CD11B/5 μL de CD19/20 μL de CD45; 5 μL de CD73/20 μL de CD90/5 μL de CD105/20 μL de CD45; 20 μL de CD34/5 μL de HLA-DR/20 μL de CD45; Essai de viabilité cellulaire - 5 μL de colorant réactif fluorescent. (voir le tableau des matériaux) et un tube avec des cellules non colorées et du PBS comme témoin négatif. Homogénéiser dans un vortex et incuber à 4 °C pendant 30 min.
- Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter 500 μL de PBS (10x) et procéder au tri des cellules.
REMARQUE: Cinq mille événements sont acquis par anticorps défini dans le cytomètre en flux de quatre couleurs et cinq paramètres et analysés avec le logiciel CellQuest.
- Centrifuger à 400 x g à 22 °C pendant 5 min, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, ajouter 500 μL de PBS (10x) et procéder au tri des cellules.
6. Ensemencement du passage 1 (P1)
- Semer 2 x 105 cellules dans une fiole de culture de 75 cm2 .
- Ajouter 12 mL de DMEM à faible taux de glucose + 20 % de FBS + 10 % d’antibiotiques/antimycotiques (avec 10 000 unités de pénicilline, 10 mg de streptomycine et 25 μg d’amphotéricine B par mL, 0,1 μm).
- Lorsque les cellules atteignent entre 80% et 90% de confluence, effectuer la trypsinisation des cellules adhérentes avec 2 mL d’EDTA-trypsine à 0,25% pendant 3 min.
- Comptez à nouveau les cellules (comme mentionné à l’étape 3).
- Effectuez à nouveau l’immunophénotypage (comme mentionné à l’étape 5).
7. Analyse statistique
- Utilisez le calculateur Rho33 de Spearman pour mesurer la force d’association entre les variables suivantes avec P < 0,05, comme mentionné ci-dessous.
- Sélectionnez le rendement cellulaire SVF et le nombre de jours SVF reste en culture dans le premier passage (P1) jusqu’à 80%-90% de confluence (jours à P1).
- Sélectionnez le rendement cellulaire SVF avant et après le passage à P1.
- Considérez les jours à P1 et le rendement cellulaire avant de passer à P1.
- Sélectionnez le rendement cellulaire SVF avec le pourcentage moyen d’ADSC confirmé.
- Calculez le pourcentage d’ADSC confirmé et le rendement cellulaire avant de passer à P1.
- Déterminez le rendement cellulaire de l’IMC et du SVF.
8. Essai de différenciation
- Effectuer le test de différenciation en suivant un protocole de kit de différenciation (voir Tableau des matériaux). La figure 4 illustre les résultats pour le cas 1.
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Representative Results
La caractérisation des neuf personnes étudiées, y compris leur âge, leur poids, leur taille et leur IMC, est présentée au tableau 1.
Selon le rendement cellulaire initialement présenté, le volume cellulaire inoculé en culture a été calculé pour être le plus proche possible de la capacité du ballon de culture de 75cm2. Le volume d’échantillon ensemencé dans chaque cas est décrit au tableau 2. Ensuite, selon le rendement cellulaire initial, un volume variable de cellules pour chaque échantillon a été déterminé : 1 mL pour les échantillons avec un rendement cellulaire plus élevé, 1,1 mL pour les échantillons avec un rendement cellulaire intermédiaire et 2 mL pour les échantillons avec un rendement cellulaire plus faible afin d’effectuer un ensemencement cellulaire plus similaire entre les cas. Lorsque la culture a atteint une confluence d’environ 80 % à 90 % (figure 2A) (environ 7,5 ± 4,5 jours), une trypsinisation des cellules adhérentes a été effectuée (tableau 2 et figure 2B).
Le rendement cellulaire avant le passage 1 variait largement, même lorsque la même confluence avant trypsinisation était observée (tableau 2). Cela peut s’expliquer par le fait que les cellules peuvent avoir grandi en couches. Différents paramètres de l’ADSC des patients ont également été évalués à différentes périodes, comme le montre le tableau 2.
Certains échantillons (cas 1, cas 2, cas 7) n’ont pas pu être évalués en ce qui concerne le pourcentage d’ADSC confirmé et le nombre estimé d’ADSC en culture en raison de la contamination bactérienne et du manque de cellules disponibles pour effectuer l’immunophénotypage cryoconservé de la SVF. Selon le Spearman’s Rho Calculator 33, aucune différence statistique n’a été trouvée entre le rendement cellulaire SVF et les jours jusqu’à P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), entre le rendement cellulaire SVF avant et après être passé à P1 (r = -0,33333, p = 0,38071), et entre les jours à P1 et le rendement cellulaire avant d’aller à P1 (r = -0,53783, p = 0,13529). De plus, aucune différence significative n’a été observée lors de la corrélation du rendement cellulaire SVF avec le pourcentage moyen d’ADSC confirmé (r = -0,02857, p = 0,95716) et entre le pourcentage moyen d’ADSC confirmé et le rendement cellulaire avant de passer à P1 (r = 0,42857, p = 0,3965). De plus, la corrélation entre l’IMC et le rendement cellulaire SVF n’a pas pu être considérée comme statistiquement significative (r = -0,46667, p = 0,20539). Le tableau 3 montre les données de cytométrie en flux effectuées sur des cellules SVF cryoconservées. Les cellules SVF initiales contenaient un sous-ensemble de cellules positives pour les marqueurs hématopoïétiques (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. À partir de la population initiale de cellules SVF, un sous-groupe particulier a exprimé les marqueurs associés aux cellules stromales CD11b 34 et CD1934. Les niveaux de CD73 34, CD90 34 et CD10534 étaient intermédiaires entre ces valeurs. La SVF initiale contenait une sous-population de cellules positives pour les marqueurs associés aux cellules souches (Figure 3). Une moyenne de 79 % des SVF ont exprimé le marqueur associé au CSH CD3434.
Au total, 21 min ont été nécessaires pour les trois lavages, 30 min pour la digestion de la collagénase, 10 min pour la centrifugation et 5 min pour le comptage cellulaire et le placage.
Figure 1 : Étapes du protocole d’isolement des cellules souches dérivées du tissu adipeux. (A) Sac pour le transport des lipoaspires dans un système fermé. (B) L’étape du sac de repos répétée trois fois, après le lavage. (C) Lipoaspiration après trois lavages avec DPBS. (D) Lipoaspire après digestion de la collagénase. (E) La lipoaspiration après digestion est distribuée dans un tube de 50 mL. (F) Lipoaspiration digérée après centrifugation. (G) Isolement final du processus avec la pastille avec la fraction vasculaire stromale (SVF). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Morphologie et viabilité des ADSC. (A) Cellules souches adipeuses mésenchymateuses adhérentes plastiques au premier passage après isolement en microscopie optique. Les cellules montrent une adhésion à la morphologie plastique et fibroblastique. (B) Dosage du bleu de trypan montrant des cellules viables comptées dans la chambre de Neubauer à l’aide d’un microscope optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Sous-population de cellules positives pour les marqueurs associés aux cellules souches dans la SVF du cas 9 après 8 mois de cryoconservation. R1 : Région cellulaire totale analysée en FSC (diffusion directe) x SSC (diffusion latérale) (taille x complexité); R2 : région CD45 négative, dont les populations CD73, CD90 et CD105 sont positives dans cette région. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Essai de différenciation. (A) Différenciation ADSC dans les chondrocytes. (B) Différenciation ADSC dans les ostéocytes. (C) Différenciation ADSC dans les adipocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Patient | Âge au moment de la collecte (années) | Poids (kg) | Hauteur (mètre) | IMC* |
| Cas 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Cas 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Cas 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Cas 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Cas 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Cas 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Cas 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Cas 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Cas 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tableau 1 : Données provenant des échantillons des personnes étudiées. *IMC : indice de masse corporelle.
| Patient | Volume collecté (mL) | SVF Rendement cellulaire (cellule/mL) (x 105) | Volume en culture (mL) | Pourcentage moyen d’ADSC confirmée (%) | Nombre de cellules en culture initiale (x 105) | Nombre estimé d’ADSC en culture (x 105) | Jours à P1 | Rendement cellulaire avant de passer à P1 (x 105) |
| Cas 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Cas 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Cas 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Cas 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Cas 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Cas 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Cas 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Cas 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Cas 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tableau 2 : Données des différentes étapes de la procédure des neuf patients analysés. SVF: fraction vasculaire stromale; ADSC: cellule souche dérivée du tissu adipeux; P1: passage 1; S.O. : Données non disponibles.
| ÉCHANTILLON | % d’ADSC DÉTERMINÉ PAR LES ANTICORPS MONOCLONAUX | % DE CELLULES HÉMATOPOÏÉTIQUES DÉTERMINÉES PAR DES ANTICORPS MONOCLONAUX | ESSAI DE VIABILITÉ CELLULAIRE ET TEMPS DE CRYOCONSERVATION SVF | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Méchant | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | VIVANT/MORT + | |||
| Cas 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39,54 % (2 ans) | ||
| Cas 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38,30 % (2 ans) | ||
| Cas 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23,06 % (2 ans) | ||
| Cas 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56,76 % (2 ans) | ||
| Cas 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55,56 % (1 an) | ||
| Cas 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72,34 % (8 mois) | ||
Tableau 3 : Données de cytométrie en flux de six des patients. (*) À partir de ces cellules CD45, le pourcentage d’ADSC avec différentes combinaisons de marqueurs de cellules souches a été déterminé. ADSC: cellule souche dérivée du tissu adipeux; SVF: fraction vasculaire stromale; (*) À partir de ces cellules CD45, le pourcentage d’ADSC avec différentes combinaisons de marqueurs de cellules souches a été déterminé.
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Discussion
Rendement d’isolement
Il est bien établi que le procédé de cryoconservation, fréquemment requis en thérapie cellulaire, entraîne une perte cellulaire importante, parfois supérieure à 50%29,30,35. Ainsi, une amélioration technique pour obtenir un rendement cellulaire initial élevé isolément est fondamentale. La méthode de collecte des lipoaspirations et la méthode d’isolement des cellules doivent se concentrer sur la préservation d’un plus grand nombre de cellules, le maintien d’une viabilité élevée et l’extraction du nombre maximal de cellules du matériel initial tout en tenant compte de la culture et de la manipulation à long terme des cellules. Par conséquent, le maintien de la culture directe est nécessaire pour garder les cellules à l’écart de l’apoptose, de la sénescence ou de l’instabilité génétique, car la thérapie cellulaire est susceptible d’être efficace et sûre pour les patients.
À notre connaissance, aucun article précédent n’utilise cet ensemble d’étapes pour l’isolement de cellules souches mésenchymateuses dérivées du lipoaspirate, ce qui permet de gagner du temps et d’améliorer les coûts. Dans cette étude, chaque étape méthodologique a été raisonnée en fonction de la littérature qui a montré le rendement cellulaire final le plus élevé dans l’isolement cellulaire. La nouveauté de la technique réalisée dans cette étude était l’utilisation de l’aspiration manuelle associée à une série de lavages lipoaspirates, avec le repos du sac ultérieur. Le sac de collecte utilisé pour transporter et traiter les lipoaspirations a permis aux fragments de tissus non digérés de ne pas participer à la digestion de la collagénase. L’étape la plus critique consiste à ajouter du chlorure de calcium à la solution de digestion fraîche, car il potentialise l’action de la collagénase. Le gain de temps n’est pas encore rapporté dans la littérature avec une méthode de décongélation cellulaire qui permet des cellules viables même après un long temps de cryoconservation. Le rendement cellulaire de la SVF trouvé dans cette étude variait considérablement de 6,15 à 26,2 x 10 5 cellules/mL avec une moyenne de 15,7 x 105 cellules/mL. Cela peut être dû à la présence d’une quantité plus importante de solution d’adrénaline aspirée, qui peut avoir été supérieure ou inférieure selon le stade de l’intervention chirurgicale et au nombre d’autres types de cellules connus généralement trouvés dans la SVF. Bien que certaines études aient trouvé des corrélations négatives entre l’IMC et le rendement de l’ADSC 36,37, cette étude n’a trouvé aucune corrélation significative, comme les deux autres études38,39, ce qui diminue la possibilité que cela soit la cause de l’incroyable variété de rendement cellulaire SVF trouvée dans cette étude. Ces données montrent que le rendement cellulaire SVF le plus faible obtenu était de 6,15 x 105 cellules/mL. Certaines études avaient déjà mesuré l’efficacité de l’isolement ADSC selon la technique chirurgicale d’obtention du lipoaspirate. Une étude a obtenu 0,087 x 10 5 cellules/mL dans du SVF fraîchement isolé pour la technique de liposuccion en utilisant une solution d’adrénaline (telle qu’utilisée dans cette étude) et 0,143 x 105 cellules/mL sans elle26. Ce travail a mis en évidence l’importance de l’injection de solution d’adrénaline en raison de l’effet vasoconstricteur qui diminue les saignements peropératoires et les ecchymoses, comme la majorité des chirurgiens choisissent de le faire en pratique clinique. Une autre étude a démontré que les CSDA vivants isolés variaient de 0 à 0,59 x 10 5 cellules/g de lipoaspiration récoltées, avec une moyenne de 0,295 (±0,25) x 105 cellules/gde tissu 31. Certaines études ont testé différentes façons d’obtenir un rendement ADSC plus élevé. L’une de ces études a atteint environ 350 x 105 pour la méthode qui présentait divers constituants dans le tampon de digestion de la collagénase et l’utilisation d’un agitateur orbital40. Une autre étude a montré 29,7 (±0,2) x 105 cellules/mL comme nombre total de cellules SVF de la région abdominale41. La région abdominale choisie dans cette étude reste la zone de référence pour la meilleure disponibilité et accessibilité de lipoaspiration42. La région du corps pour la collecte des lipoaspirations, entre autres facteurs tels que l’âge du donneur et la méthode de prélèvement choisie, est un déterminant important de la qualité des rendements ADSC.
La possibilité que la contamination des micro-organismes entraîne l’indisponibilité des cellules pour poursuivre les expériences a été le seul problème d’exécution qui a limité la réalisation de cette étude. Même en utilisant des antibiotiques et les exigences des bonnes pratiques de fabrication, la contamination peut se produire en raison de l’absence d’un environnement aseptique total pour effectuer l’aspiration de la graisse.
Immunophénotypage SVF
Selon le Comité des cellules souches mésenchymateuses et tissulaires de la Société internationale de thérapie cellulaire 34, l’un des trois critères minimaux pour définir les cellules souches mésenchymateuses humaines est que les cellules doivent exprimer CD105 34, CD73 34 et CD90 34 et ne doivent pas exprimer CD45 34, CD34 34, CD14 34, ou CD11b 34, CD79a 34 ou CD19 34, et les molécules de membrane de surface HLA-DR34. Mitchell43 a testé des cellules SVF fraîches par immunophénotypage et a trouvé un maximum de 54% de cellules avec des marqueurs de surface ADSC. Dans cette étude, l’immunophénotypage a révélé un pourcentage plus élevé d’ADSC (cellules non hématopoïétiques) confirmées allant jusqu’à 78,91% dans la SVF après cryoconservation à long terme (allant de 37,95% à 78,91% avec une moyenne de 53,68%). Les preuves montrent que les progéniteurs d’une population de cellules souches non encore engagés n’expriment pas le marqueur CD3434,44,45. Selon le stade de différenciation, les cellules souches CD3434 négatives peuvent générer non seulement des progéniteurs hématopoïétiques, mais aussi des précurseurs mésenchymateux plus spécifiques, tels que les ostéoclastes, les chondrocytes, les myocytes, les adipocytes et autres. Certaines études ont démontré la plasticité frappante de la population primitive de cellules souches, composée de cellules à fonction stromale et de progéniteurs hématopoïétiques et mésenchymateux45. Selon la littérature, le rôle fonctionnel complet de CD3434 dans la formation tissulaire dans les cellules SVF est encore inconnu46. Mitchell43 a montré une moyenne de 60% de cellules de SVF exprimant le marqueur CD3434, alors que, dans cette étude, la moyenne était de 78,81%. On sait que l’expression du marqueur de surface CD3434 diminue au fil des passages.
Cellules adhérentes et dosage de différenciation
Selon le nombre de cellules obtenues après isolement, le nombre de cellules ensemencées dans la première culture variait. Le premier temps de culture pour atteindre une confluence de 80 % à 90 % dans des flacons de 75 cm2 a pris en moyenne 8,4 jours et un écart-type de 7,5 (±4,5) jours allant de 6,6 à 16,1 x 105 cellules/mL. Il est à noter que même pour les cas avec un rendement cellulaire plus faible, le premier temps de culture a conduit à des indices de rendement cellulaire élevés par rapport à la littérature, probablement en raison de la meilleure disponibilité de cellules viables maintenues pendant tout le processus de collecte et d’isolement. Une étude a obtenu un rendement cellulaire de 3,75 (±1,42) x 105 ADSC par mL de lipoaspiration au cours d’une période de culture de 4,1 (±0,7) jour47. Une autre étude a démontré un rendement des cellules SVF nucléées de 3,08 (±1,40) x 105 par millimètre avec une moyenne de 6,0 (±2,4) jours dans la première période de culture43. Dans cette étude, en estimant le nombre d’ADSC ensemencés en culture, qui variait en fonction du nombre de cellules observées dans le SVF à partir de la collecte du même volume de 100 mL de lipoaspirate, il a été vérifié que le nombre de jours pour atteindre P1 n’avait aucun rapport avec le volume cellulaire. Par exemple, pour le cas 9, dans lequel 12,2 x 105 cellules ont été incubées, 6 jours ont été nécessaires pour atteindre 80% à 90% de confluence. Pour le cas 6, dans lequel 14,6 x 105 cellules ont été ensemencées en culture, une période plus longue a été nécessaire (10 jours) pour atteindre le même niveau de confluence. Peut-être qu’un nombre minimum d’ADSC est suffisant pour la première période d’adhésion. Il peut y avoir des variations interindividuelles importantes, telles que les comorbidités, l’âge et l’état de santé général. Certaines études dans la littérature ont remis en question l’importance de prendre en compte la variabilité interindividuelle des patients pour le rendement cellulaire SVF48,49.
Selon le Comité des cellules souches mésenchymateuses et tissulaires de la Société internationale de thérapie cellulaire34, les cellules mésenchymateuses doivent avoir la capacité de se différencier en trois types cellulaires différents en tant que lignées ostéogène, adipogénique et chondrogénique, comme le montre la figure 4.
Viabilité cellulaire, cryoconservation et instabilité génétique
Différentes méthodes ont été utilisées pour déterminer la perte de viabilité, définie comme des dommages à l’intégrité de la membrane plasmique50. Cependant, les cultures peuvent également présenter des cellules apoptotiques précoces que ces approches peuvent ignorer parce qu’elles maintiennent une membrane plasmique intacte, mais elles ne sont pas viables. Les résultats rapportés ici montrent une grande gamme de marqueurs de viabilité, de 23,06% à 72,34%, avec une moyenne de 47,6% après cryoconservation à long terme. Considérant que la cryoconservation est une étape importante concernant la thérapie cellulaire, la récupération du maximum de cellules souches viables et fonctionnelles après décongélation est l’un des enjeux prioritaires pour le succès de la thérapie cellulaire. La littérature a montré qu’au moins 50% de la viabilité cellulaire est perdue de 1 à 4 mois après la cryoconservation43. Notamment, les indices les plus bas présentés dans cette étude proviennent des cas 5, 4 et 2, qui sont les échantillons cryoconservés les plus anciens (environ 2 ans). Bien qu’ils aient présenté les indices de viabilité les plus bas, ils ont démontré un rendement cellulaire élevé dans le test d’exclusion du colorant bleu de trypan dans la SVF fraîche. Bien que la littérature soutienne les causes de la perte de viabilité, ces taux sont inférieurs aux prévisions. Les fluctuations de température dans le stockage cellulaire dues à des raisons techniques peuvent provoquer l’augmentation et l’accumulation de stress et favoriser l’accumulation de portions aqueuses, générant des cristaux qui endommagent la membrane plasmique lors de la cryoconservation à long terme51. La littérature montre une viabilité de plus de 70 % pour les échantillons ayant le même temps de congélation ou plus. Cependant, le contrôle de viabilité a été effectué avec une technique différente de celle effectuée dans cette étude52. Une autre étude a montré qu’une cryoconservation plus longue affecte négativement la viabilité cellulaire31, ce qui peut s’expliquer par les variations de température dans le congélateur à -80 °C. Par conséquent, les cellules doivent souvent rester trop longtemps en culture, ce qui augmente le stress du cycle cellulaire, entraîne des risques d’instabilité génétique et, par conséquent, compromet la thérapie cellulaire. Il existe également un consensus dans la littérature indiquant certains facteurs de stress et comment ils affectent la stabilité cytogénétique cellulaire, ce qui est essentiel pour maintenir la culture prolongée de cellules souches requise pour la thérapie cellulaire35,53.
Avantage de la méthodologie
À ce jour, la littérature ne montre aucun protocole standardisé pour isoler l’ADSC visant des applications cliniques. La plupart des études démontrent des protocoles complexes et longs24. Dans cette étude, l’efficacité de la méthode par rapport au temps requis pour compléter le rendement cellulaire initial doit être soulignée: environ 1,5 h. Selon la littérature, l’isolement des cellules souches dérivées du tissu adipeux peut prendre environ 3 h à 8 h54,55. Ainsi, le gain de temps associé au revenu cellulaire élevé est essentiel pour l’avancement thérapeutique de la médecine régénérative. Davantage d’évaluations de la viabilité cellulaire devraient être effectuées parallèlement à celles effectuées dans le cadre de ce travail afin d’améliorer cette méthode. D’autres essais contrôlés randomisés intégrant un échantillon plus vaste utilisant cette méthodologie sont nécessaires pour contresigner ces résultats.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions les patients qui se sont portés volontaires pour participer et le personnel médical et infirmier de l’hôpital de São Paulo. Cette étude a été soutenue par la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) et le Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brésil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
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