Summary

Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos

Published: November 11, 2021
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Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para medir a taxa metabólica basal e a capacidade oxidativa de adipócitos termogênicos em camundongos obesos.

Abstract

As medidas de gasto energético são necessárias para entender como as mudanças no metabolismo podem levar à obesidade. O gasto energético basal pode ser determinado em camundongos medindo o consumo de oxigênio do corpo inteiro, a produção de CO2 e a atividade física usando gaiolas metabólicas. Os adipócitos castanhos/bege termogênicos (BA) contribuem significativamente para o gasto energético dos roedores, particularmente em baixas temperaturas ambientais. Aqui, as medidas do gasto de energia basal e da capacidade total da BA de gastar energia em camundongos obesos são descritas em dois protocolos detalhados: o primeiro explicando como configurar o ensaio para medir o gasto de energia basal utilizando a análise da covariância (ANCOVA), uma análise necessária dado que o gasto energético co-varia com a massa corporal. O segundo protocolo descreve como medir a capacidade de gasto energético da BA in vivo em camundongos. Este procedimento envolve anestesia, necessária para limitar os gastos causados pela atividade física, seguida da injeção de agonista beta3-adrenérgico, CL-316.243, que ativa o gasto energético na BA. Estes dois protocolos e suas limitações são descritos em detalhes suficientes para permitir um primeiro experimento bem sucedido.

Introduction

O metabolismo pode ser definido como a integração das reações bioquímicas responsáveis pela absorção de nutrientes, armazenamento, transformação e quebra que as células usam para crescer e desempenhar suas funções. Reações metabólicas transformam a energia contida em nutrientes em uma forma que pode ser usada pelas células para sintetizar novas moléculas e executar o trabalho. Essas reações bioquímicas são inerentemente ineficientes em transformar essa energia em uma forma utilizável para sustentar a vida1. Tal ineficiência resulta em dissipação de energia na forma de calor, com esta produção de calor sendo usada para quantificar a Taxa Metabólica Padrão (RMR) de um organismo1. A condição Padrão foi definida clássicamente como a produção de calor ocorrendo em um adulto acordado, mas descansando, não ingerindo ou digerindo alimentos, na termoneutralidade e sem estresse1. A Taxa Metabólica Basal (RMC) ou o gasto energético basal em camundongos é referido como A RMS, mas em indivíduos que ingerem e digerem alimentos sob leve estresse térmico (temperaturas ambientais 21-22 °C)1. Os desafios e dificuldades de medir diretamente a produção de calor fizeram com que a calorimetria indireta, ou seja, calculando a produção de calor a partir de medições de consumo de oxigênio, se tornasse a abordagem mais popular para determinar a RMC. O cálculo da RMC a partir do consumo de oxigênio é possível porque a oxidação de nutrientes por mitocôndrias para sintetizar ATP é responsável por 72% do oxigênio total consumido em um organismo, com 8% do consumo total de oxigênio também ocorrendo em mitocôndrias, mas sem gerar ATP (respiração não alcoólica)1. A maioria dos 20% restantes do oxigênio consumido pode ser atribuída à oxidação de nutrientes em outros locais subcelulares (oxidação de ácido graxo peroxisômico), processos anabólicos e formação de espécies reativas de oxigênio1. Assim, em 1907, a Lusk estabeleceu uma equação, baseada em medições empíricas, amplamente utilizada para transformar o consumo de oxigênio e a produção de CO2 em dissipação de energia como calor. Em humanos, o cérebro é responsável por ~25% da RMC, o sistema musculoesquelético para ~18,4%, o fígado por ~20 %, o coração por ~10%, e o tecido adiposo para ~3-7%2. Em camundongos, a contribuição tecidual para a RMC é ligeiramente diferente, com o cérebro representando ~6,5%, o músculo esquelético ~13%, o fígado ~52%, o coração ~3,7%, e tecido adiposo ~5%3.

Notavelmente, as reações bioquímicas que definem a RMC não são fixas e mudam em resposta a diferentes necessidades, como trabalho externo (atividade física), desenvolvimento (crescimento tecidual), estresses internos (contra-infecções, lesões, rotatividade de tecidos) e alterações na temperatura ambiente (defesa fria)1. Alguns organismos recrutam ativamente processos para gerar calor na exposição ao frio, implicando que o calor produzido pelo metabolismo não é apenas um subproduto acidental. Em vez disso, a evolução selecionou mecanismos regulatórios que poderiam especificamente aumentar a produção de calor alterando a taxa de reações metabólicas1. Assim, essas mesmas medidas de consumo de oxigênio podem ser usadas para determinar a capacidade de um organismo de gerar calor em resposta ao frio.

Dois grandes processos contribuem para a geração de calor após a exposição ao frio. O primeiro é o tremor, que gera calor aumentando a fosforilação oxidativa mitocondrial e a glicólise no músculo para cobrir o trabalho físico feito por contração muscular involuntária. Portanto, a exposição ao frio aumentará o consumo de oxigênio nos músculos1. A segunda é a Termogênese Não-Trêmula, que ocorre através de um aumento no consumo de oxigênio em adipócitos marrons e bege (BA). A dissipação de energia em calor na BA é mediada pela proteína de desacoplamento mitocondrial 1 (UCP1), que permite a reentrada de prótons na matriz mitocondrial, diminuindo o gradiente de próton mitocondrial. A dissipação do gradiente de próton mitocondrial por UCP1 aumenta a produção de calor pela elevação na transferência de elétrons e consumo de oxigênio e pela energia liberada pela dissipação de prótons em si sem gerar ATP (desacoplamento). Além disso, a BA termogênica pode recrutar mecanismos adicionais que elevam o consumo de oxigênio sem causar uma grande dissipação no gradiente de prótons, ativando ciclos fúteis de síntese oxidativa de ATP e de consumo. As gaiolas metabólicas descritas aqui, ou seja, o sistema CLAMS-Oxymax da Columbus Instruments, oferecem a possibilidade de medir o gasto energético em diferentes temperaturas ambientes. No entanto, para determinar a capacidade termogênica da BA utilizando medidas de consumo de oxigênio do corpo inteiro, é preciso: (1) eliminar a contribuição de tremores, e outros processos metabólicos não-BA para o gasto energético, e (2) ativar especificamente a atividade termogênica ba in vivo. Assim, um segundo protocolo descreve como ativar seletivamente a BA in vivo utilizando farmacologia em camundongos anestesiados na termoneutralidade (30 °C), com anestesia e termoneutralidade limitando outros processos termogênicos não-BA (ou seja, atividade física). A estratégia farmacológica para ativar a BA é tratar camundongos com o receptor β3-adrenérgico agonista CL-316.246. A razão é que a exposição a frio promove uma resposta simpática liberando norepinefrina para ativar receptores β-adrenérgicos na BA, o que ativa UCP1 e oxidação de gordura. Além disso, a expressão do receptor β3-adrenérgico é altamente enriquecida em tecido adiposo em camundongos.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). Os camundongos foram administrados sua dieta e ad libitum de água na gaiola metabólica, abrigada em um ambiente controlado pela temperatura (~21-22 ou 30 °C) com um ciclo claro/escuro de 12h. Camundongos fêmeas de 8 semanas alimentados com dieta rica em gordura ou dieta de comida por 8 semanas foram usados para este estudo. 1. Medi…

Representative Results

A Figura 4 mostra valores de atividade física VO2, VCO2, Produção de Calor/Energia (EE), Relação de Troca Respiratória (RER) e X, Y, Z valores de atividade física obtidos utilizando as gaiolas metabólicas do sistema CLAMS. O VO2 e VCO2 fornecidos pelo sistema CLAMS é o volume de gás (mL) por minuto e já pode ser dividido pelo peso corporal ou pelos valores de massa magra inserindo esses valores de peso no software CLAMS antes de iniciar …

Discussion

A calimemetria indireta é usada há anos para avaliar os gastos energéticos do corpo inteiro4. Este protocolo descrito aqui fornece um método simples de medir a taxa metabólica basal e determinar a capacidade termogênica ba in vivo usando gaiolas metabólicas.

O método de calimemetria indireta descrito aqui confirma que dividir os valores do gasto energético por valores de peso corporal pode ser enganoso. Por exemplo, pode concluir que o gasto energétic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ML é financiado pelo Departamento de Medicina da UCLA, subsídios piloto do P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) e P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Materials

CLAMS-Oxymax System Columbus Instruments CLAMS-center feeder-ENC Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor
Desktop PC with Oxymax Software HP/Columbus N/A PC needed to be purchased separately
Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) Fisher Scientific 23-116681 Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor
NMR for body composition Echo-MRI Echo-MRI 100 Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses.
CL-316-243 Sigma C5976 Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis
High fat diet Research Diets D12266B Provided to the mice prior and during measurements
Pentobarbital/Nembutal Pharmacy at DLAM N/A Anesthesia for the mice
Primary standard grade gas (tank and regulator) Praxair NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration

References

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Cite This Article
Shum, M., Zhou, Z., Liesa, M. Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice. J. Vis. Exp. (177), e63066, doi:10.3791/63066 (2021).

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