Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo para medir a taxa metabólica basal e a capacidade oxidativa de adipócitos termogênicos em camundongos obesos.
Abstract
As medidas de gasto energético são necessárias para entender como as mudanças no metabolismo podem levar à obesidade. O gasto energético basal pode ser determinado em camundongos medindo o consumo de oxigênio do corpo inteiro, a produção de CO2 e a atividade física usando gaiolas metabólicas. Os adipócitos castanhos/bege termogênicos (BA) contribuem significativamente para o gasto energético dos roedores, particularmente em baixas temperaturas ambientais. Aqui, as medidas do gasto de energia basal e da capacidade total da BA de gastar energia em camundongos obesos são descritas em dois protocolos detalhados: o primeiro explicando como configurar o ensaio para medir o gasto de energia basal utilizando a análise da covariância (ANCOVA), uma análise necessária dado que o gasto energético co-varia com a massa corporal. O segundo protocolo descreve como medir a capacidade de gasto energético da BA in vivo em camundongos. Este procedimento envolve anestesia, necessária para limitar os gastos causados pela atividade física, seguida da injeção de agonista beta3-adrenérgico, CL-316.243, que ativa o gasto energético na BA. Estes dois protocolos e suas limitações são descritos em detalhes suficientes para permitir um primeiro experimento bem sucedido.
Introduction
O metabolismo pode ser definido como a integração das reações bioquímicas responsáveis pela absorção de nutrientes, armazenamento, transformação e quebra que as células usam para crescer e desempenhar suas funções. Reações metabólicas transformam a energia contida em nutrientes em uma forma que pode ser usada pelas células para sintetizar novas moléculas e executar o trabalho. Essas reações bioquímicas são inerentemente ineficientes em transformar essa energia em uma forma utilizável para sustentar a vida1. Tal ineficiência resulta em dissipação de energia na forma de calor, com esta produção de calor sendo usada para quantificar a Taxa Metabólica Padrão (RMR) de um organismo1. A condição Padrão foi definida clássicamente como a produção de calor ocorrendo em um adulto acordado, mas descansando, não ingerindo ou digerindo alimentos, na termoneutralidade e sem estresse1. A Taxa Metabólica Basal (RMC) ou o gasto energético basal em camundongos é referido como A RMS, mas em indivíduos que ingerem e digerem alimentos sob leve estresse térmico (temperaturas ambientais 21-22 °C)1. Os desafios e dificuldades de medir diretamente a produção de calor fizeram com que a calorimetria indireta, ou seja, calculando a produção de calor a partir de medições de consumo de oxigênio, se tornasse a abordagem mais popular para determinar a RMC. O cálculo da RMC a partir do consumo de oxigênio é possível porque a oxidação de nutrientes por mitocôndrias para sintetizar ATP é responsável por 72% do oxigênio total consumido em um organismo, com 8% do consumo total de oxigênio também ocorrendo em mitocôndrias, mas sem gerar ATP (respiração não alcoólica)1. A maioria dos 20% restantes do oxigênio consumido pode ser atribuída à oxidação de nutrientes em outros locais subcelulares (oxidação de ácido graxo peroxisômico), processos anabólicos e formação de espécies reativas de oxigênio1. Assim, em 1907, a Lusk estabeleceu uma equação, baseada em medições empíricas, amplamente utilizada para transformar o consumo de oxigênio e a produção de CO2 em dissipação de energia como calor. Em humanos, o cérebro é responsável por ~25% da RMC, o sistema musculoesquelético para ~18,4%, o fígado por ~20 %, o coração por ~10%, e o tecido adiposo para ~3-7%2. Em camundongos, a contribuição tecidual para a RMC é ligeiramente diferente, com o cérebro representando ~6,5%, o músculo esquelético ~13%, o fígado ~52%, o coração ~3,7%, e tecido adiposo ~5%3.
Notavelmente, as reações bioquímicas que definem a RMC não são fixas e mudam em resposta a diferentes necessidades, como trabalho externo (atividade física), desenvolvimento (crescimento tecidual), estresses internos (contra-infecções, lesões, rotatividade de tecidos) e alterações na temperatura ambiente (defesa fria)1. Alguns organismos recrutam ativamente processos para gerar calor na exposição ao frio, implicando que o calor produzido pelo metabolismo não é apenas um subproduto acidental. Em vez disso, a evolução selecionou mecanismos regulatórios que poderiam especificamente aumentar a produção de calor alterando a taxa de reações metabólicas1. Assim, essas mesmas medidas de consumo de oxigênio podem ser usadas para determinar a capacidade de um organismo de gerar calor em resposta ao frio.
Dois grandes processos contribuem para a geração de calor após a exposição ao frio. O primeiro é o tremor, que gera calor aumentando a fosforilação oxidativa mitocondrial e a glicólise no músculo para cobrir o trabalho físico feito por contração muscular involuntária. Portanto, a exposição ao frio aumentará o consumo de oxigênio nos músculos1. A segunda é a Termogênese Não-Trêmula, que ocorre através de um aumento no consumo de oxigênio em adipócitos marrons e bege (BA). A dissipação de energia em calor na BA é mediada pela proteína de desacoplamento mitocondrial 1 (UCP1), que permite a reentrada de prótons na matriz mitocondrial, diminuindo o gradiente de próton mitocondrial. A dissipação do gradiente de próton mitocondrial por UCP1 aumenta a produção de calor pela elevação na transferência de elétrons e consumo de oxigênio e pela energia liberada pela dissipação de prótons em si sem gerar ATP (desacoplamento). Além disso, a BA termogênica pode recrutar mecanismos adicionais que elevam o consumo de oxigênio sem causar uma grande dissipação no gradiente de prótons, ativando ciclos fúteis de síntese oxidativa de ATP e de consumo. As gaiolas metabólicas descritas aqui, ou seja, o sistema CLAMS-Oxymax da Columbus Instruments, oferecem a possibilidade de medir o gasto energético em diferentes temperaturas ambientes. No entanto, para determinar a capacidade termogênica da BA utilizando medidas de consumo de oxigênio do corpo inteiro, é preciso: (1) eliminar a contribuição de tremores, e outros processos metabólicos não-BA para o gasto energético, e (2) ativar especificamente a atividade termogênica ba in vivo. Assim, um segundo protocolo descreve como ativar seletivamente a BA in vivo utilizando farmacologia em camundongos anestesiados na termoneutralidade (30 °C), com anestesia e termoneutralidade limitando outros processos termogênicos não-BA (ou seja, atividade física). A estratégia farmacológica para ativar a BA é tratar camundongos com o receptor β3-adrenérgico agonista CL-316.246. A razão é que a exposição a frio promove uma resposta simpática liberando norepinefrina para ativar receptores β-adrenérgicos na BA, o que ativa UCP1 e oxidação de gordura. Além disso, a expressão do receptor β3-adrenérgico é altamente enriquecida em tecido adiposo em camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A calimemetria indireta é usada há anos para avaliar os gastos energéticos do corpo inteiro4. Este protocolo descrito aqui fornece um método simples de medir a taxa metabólica basal e determinar a capacidade termogênica ba in vivo usando gaiolas metabólicas.
O método de calimemetria indireta descrito aqui confirma que dividir os valores do gasto energético por valores de peso corporal pode ser enganoso. Por exemplo, pode concluir que o gasto energétic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML é financiado pelo Departamento de Medicina da UCLA, subsídios piloto do P30 DK 41301 (UCLA:DDRC NIH) e P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).
Materials
| CLAMS-Oxymax System | Columbus Instruments | CLAMS-center feeder-ENC | Including enviromental enclosure and Zirconia oxygen sensor |
| Desktop PC with Oxymax Software | HP/Columbus | N/A | PC needed to be purchased separately |
| Drierite jug (Calcium Sulfate with Cobalt Chloride Indicator) | Fisher Scientific | 23-116681 | Needed to dry the gas entering the oxygen sensor, humidity can damage the sensor |
| NMR for body composition | Echo-MRI | Echo-MRI 100 | Measure lean and fat mass in alive mice. It is necessary for ANCOVA analyses. |
| CL-316-243 | Sigma | C5976 | Injected to the mice subcutaneously to activate thermogenesis |
| High fat diet | Research Diets | D12266B | Provided to the mice prior and during measurements |
| Pentobarbital/Nembutal | Pharmacy at DLAM | N/A | Anesthesia for the mice |
| Primary standard grade gas (tank and regulator) | Praxair | NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590 | 20.50% Oxygen, 0.50% CO2 balanced with nitrogen used for calibration |
References
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