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Biochemistry

Uracil-डीएनए Glycosylase मैट्रिक्स द्वारा परख-सहायता प्राप्त लेजर Desorption / Ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

एक गैर लेबल, गैर-रेडियो-आइसोटोपिक विधि परख uracil-डीएनए ग्लाइकोसिलेस गतिविधि प्रत्यक्ष apurinic / apyrimidinic साइट युक्त उत्पाद विश्लेषण के लिए MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर विकसित किया गया था। परख काफी सरल, विशिष्ट, तेजी से, और डीएनए ग्लाइकोसिलेज माप के लिए उपयोग करने में आसान साबित हुआ।

Abstract

यूरेसिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज (यूडीजी) साइटोसिन के हाइड्रोलाइटिक डिमिनेशन से गठित यूरेसिल के सुधार के लिए आधार उच्छेदन मरम्मत मार्ग में एक महत्वपूर्ण घटक है। इस प्रकार, यह जीनोम अखंडता रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। यूडीजी गतिविधि को मापने के लिए एक अत्यधिक विशिष्ट, गैर-लेबल, गैर-रेडियो-आइसोटोपिक विधि विकसित की गई थी। एक सिंथेटिक डीएनए डुप्लेक्स जिसमें एक साइट-विशिष्ट यूरेसिल होता है, को यूडीजी द्वारा क्लीव किया गया था और फिर मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर विशोषण / आयनीकरण टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MALDI-TOF MS) विश्लेषण के अधीन किया गया था। स्ट्रैंड ब्रेक के बिना डीएनए में apurinic / apyrimidinic साइट (AP) उत्पाद को संरक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था। सब्सट्रेट से उत्पाद में एम / जेड मान में परिवर्तन का उपयोग यूडीजी द्वारा यूरेसिल हाइड्रोलिसिस का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। एक G: U सब्सट्रेट का उपयोग UDG गतिज विश्लेषण के लिए किया गया था, जो Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s, और Kcat = 9.31 s-1 को उत्पन्न करता है। एक uracil ग्लाइकोसिलेज अवरोधक (UGI) परख के लिए इस विधि के आवेदन 7.6 पीएम के एक IC50 मूल्य उपज. एकल-फंसे हुए और डबल-फंसे डीएनए सब्सट्रेट के भीतर विभिन्न पदों पर यूरेसिल का उपयोग करके यूडीजी विशिष्टता ने विभिन्न दरार क्षमताओं का प्रदर्शन किया। इस प्रकार, यह सरल, तेजी से, और बहुमुखी MALDI-TOF एमएस विधि विभिन्न monofunctional डीएनए ग्लाइकोसिलेस के लिए एक उत्कृष्ट संदर्भ विधि हो सकती है। इसमें डीएनए ग्लाइकोसिलेज इनहिबिटर स्क्रीनिंग के लिए एक उपकरण के रूप में क्षमता भी है।

Introduction

यद्यपि यूरेसिल आरएनए में एक सामान्य आधार है, यह जीनोमिक डीएनए में एक सामान्य और अत्यधिक म्यूटाजेनिक घाव है। यूरेसिल एक डीऑक्सीसाइटिडीन के सहज / एंजाइमेटिक हाइड्रोलाइटिक डिमिनेशन से उत्पन्न हो सकता है। प्रत्येक जीवित कोशिका में, यह deamination शारीरिक परिस्थितियों में प्रति दिन 100-500 बार होता है1,2। यदि इन परिवर्तनों की मरम्मत नहीं की जाती है, तो डीएनए अनुक्रम संरचना में परिवर्तन हो सकता है, जिससे उत्परिवर्तन हो सकता है। जैसा कि डीएनए में यूरेसिल प्रतिकृति के दौरान डीएटीपी के साथ जोड़ी बनाना पसंद करता है, यदि साइटोसिन यूरेसिल को डीमिनेट करता है, तो दो प्रतिकृति घटनाओं में, संतान डीएनए 3 के आधे हिस्से में एक नया जी: सी से ए: टी संक्रमण उत्परिवर्तन होगा।

आनुवांशिक स्थिरता को बनाए रखने के लिए सेलुलर रणनीतियों में से, बेस उच्छेदन मरम्मत (बीईआर) एक आवश्यक तंत्र है जो डीएनए 4 में यूरेसिल जैसे क्षतिग्रस्त ठिकानों की मरम्मत करता है। बीईआर एक अत्यधिक विकासवादी रूप से संरक्षित प्रक्रिया है। दो सामान्य बीईआर मार्ग हैं: शॉर्ट-पैच मार्ग जो एकल न्यूक्लियोटाइड की मरम्मत पथ की ओर जाता है और लंबे पैच मार्ग जो कम से कम दो न्यूक्लियोटाइड्स 5 की मरम्मत पथ का उत्पादन करता है। बीईआर एक समन्वित तंत्र है जो कई चरणों में होता है। बीईआर में पहला कदम क्षतिग्रस्त न्यूक्लियोटाइड बेस का एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस है जो एक क्षति-विशिष्ट डीएनए ग्लाइकोसिलेज द्वारा एक एपुरीनिक / एपिरिमिडिनिक (एपी) मध्यवर्ती साइट 6 उत्पन्न करने के लिए है। इसके बाद एक एंडोन्यूक्लिएज द्वारा एपी साइट पर चीनी-फॉस्फेट बैकबोन की दरार, डीएनए की सफाई एक लाइस द्वारा समाप्त होती है, डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा गैप-फिलिंग, और एक लिगाज़ 5 द्वारा अंतिम निक को सील करना।

यूरेसिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज (यूडीजी) एस्चेरिचिया कोलाई में बीईआर के लिए यूरेसिल युक्त डीएनए से यूरेसिल को हाइड्रोलाइज करता है। रेडियोलेबल डीएनए का उपयोग करके पारंपरिक UDG assays जिसमें विभिन्न पृथक्करण तकनीकें शामिल हैं6,7,8,9,10,11,12,13 आमतौर पर समय लेने वाली, श्रम-गहन, महंगी लेबलिंग अभिकर्मकों, जटिल प्रक्रियाओं के साथ, और रेडियोधर्मी सामग्रियों के संपर्क के जोखिम को कम करने के लिए गहन प्रशिक्षण और अभ्यास की आवश्यकता होती है। फ्लोरोमेट्रिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड एसेस को रेडियोआइसोटोप लेबलिंग 14 के प्रतिस्थापन के रूप में विकसित किया गया है, इसके अलावा आणविक बीकन और फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण प्रौद्योगिकी 15,16,17,18,19,20। हालांकि, सभी उपर्युक्त विधियों के लिए विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता होती है। हाल ही में लेबल मुक्त बायोसेंसर assays21,22,23 और एक जी-quadruplex24,25,26 के गठन के आधार पर colorimetric तरीकों को विकसित किया गया है। हालांकि, कई ए: यू जोड़े या विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए अनुक्रमों में जांच एंजाइम इकाई परिभाषा को जटिल बनाती है।

MALDI-TOF MS एक ऐसी तकनीक है जो डीएनए विश्लेषण में बहुत उपयोगी हो सकती है। विकसित अनुप्रयोगों में एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता जीनोटाइपिंग 27,28, संशोधित न्यूक्लियोटाइड विश्लेषण 29, और डीएनए मरम्मत मध्यवर्ती पहचान 30,31,32,33,34 शामिल हैं। MALDI-TOF MS को AP-साइट-युक्त डीएनए उत्पादों का पता लगाने के लिए डीएनए ग्लाइकोसिलेज विश्लेषण के लिए आसानी से अपनाया जाना चाहिए। हालांकि, डीएनए में एपी-साइटें कई प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत स्ट्रैंड ब्रेक के लिए प्रवण हैं33। एक UDG परख यहाँ MALDI-TOF एमएस का उपयोग कर सीधे महत्वपूर्ण स्ट्रैंड तोड़ने शोर के बिना एपी साइट उत्पादन को मापने के लिए प्रस्तुत किया जाता है. इस लेबल-मुक्त विधि के साथ काम करना आसान है और इसमें डीएनए ग्लाइकोसिलेज इनहिबिटर स्क्रीनिंग के फार्मास्यूटिकल अनुप्रयोग के लिए एक उच्च क्षमता है।

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Protocol

1. सब्सट्रेट /

  1. ~ 50 ± 10% और डुप्लेक्स क्षेत्र के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के न्यूनतम पिघलने के तापमान की संतुलित जी + सी सामग्री के साथ यूरेसिल सब्सट्रेट / टेम्पलेट डुप्लेक्स को डिजाइन करें।
    नोट: 18 nt substrates और 19 nt टेम्पलेट्स (तालिका 1 और चित्रा 1) के बीच एक न्यूक्लियोटाइड अंतर बेहतर एमएस सिग्नल व्याख्या और उचित एनीलिंग में मदद करता है। टेम्पलेट स्ट्रैंड ए-यू या जी-यू बेमेल (तालिका 1) उत्पन्न करने के लिए पूरक डीएनए के रूप में कार्य करता है, लेकिन एमएस माप में संदर्भ संकेत के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। एचपीएलसी-शुद्ध सिंथेटिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग इस अध्ययन के लिए संतोषजनक है।
  2. 1 mM EDTA और 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 पर 25 °C) (TE) में डीएनए को 100 μmol / L की एकाग्रता पर एक स्टॉक और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के रूप में भंग करें। TE के साथ इस 20 μL स्टॉक को 800 μL की अंतिम मात्रा में पतला करें (4 μmol / L के लिए 25 गुना कमजोर पड़ने)। निर्माता की असाइन की गई एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में डीएनए समाधान के अवशोषण को मापने के लिए π = 260 एनएम पर। उदाहरण के लिए: A260 = U+9 के 4 μmol/L के लिए 0.204 और T1 के 4 μmol/L के लिए A260 = 0.192 (तालिका 1)।
  3. निर्दिष्ट m/z मानों पर अद्वितीय शिखर संकेतों का निरीक्षण करके और साथ ही यह जांचकर कि सिग्नल-टू-शोर अनुपात >100 है (चित्रा 1B और चित्रा 1D) ओलिगोन्यूक्लियोटाइड गुणवत्ता नियंत्रण के लिए MALDI-TOF MS विश्लेषण (अनुभाग 4-6) निष्पादित करें।

2. डीएनए ग्लाइकोसिलेज परख

  1. ग्लाइकोसिलेज प्रतिक्रिया के लिए T1/U+9 डुप्लेक्स (तालिका 1 और चित्रा 1A) के G:U सब्सट्रेट का उपयोग करना, उदाहरण के लिए, 1.5 mL बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, H2O के 70 μL, 10x UDG प्रतिक्रिया बफर के 10 μL, T1 स्टॉक के 5 μL, और U + 9 स्टॉक के 5 μL (चरण 1.2.) जोड़ें।
    नोट:: माइक्रोपिपेट का सही प्रकार चुनें और आवश्यक मात्रा को संभालने के लिए निर्माताओं के निर्देशों का पालन करें। उदाहरण के लिए, तरल के 0.1-2 μL को वितरित करने के लिए 2 μL पिपेट का उपयोग करें, 2-10 μL तरल को वितरित करने के लिए 10 μL पिपेट का उपयोग करें, और परिणामों की सटीकता और सटीकता सुनिश्चित करने के लिए तरल के 20-100 μL को वितरित करने के लिए 100 μL पिपेट का उपयोग करें। अभिकर्मक मिश्रण की वर्णित मात्रा 10 assays के लिए है; प्रतिक्रियाओं की वांछित संख्या के लिए वॉल्यूम समायोजित करें। 1x UDG प्रतिक्रिया बफर में 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, और 20 mM Tris-HCl (25 °C पर pH 8.0) शामिल हैं। 10x UDG प्रतिक्रिया बफर के स्रोत के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  2. सुरक्षित रूप से ट्यूब को बंद करें; 65 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए, और अंत में सब्सट्रेट / टेम्पलेट डुप्लेक्स की उचित एनीलिंग सुनिश्चित करने के लिए 3 मिनट के लिए बर्फ पर।
  3. एक 1.5 mL बाँझ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में, 49 μL बर्फ-ठंडा 1x UDG प्रतिक्रिया बफर और UDG के 1 μL (5,000 इकाइयों / mL; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, 0.1 इकाइयों / μL को पतला करें। 0.05, 0.02, या 0.01 इकाइयों / μL की वांछित एंजाइम सांद्रता के लिए 1x UDG बफर के साथ सीरियल dilutions बनाएं। हमेशा बर्फ पर पतला UDG रखें।
    नोट: एक 10 μL प्रतिक्रिया में, UDG की 0.1 इकाइयाँ 3 मिनट में T1/U+9 डुप्लेक्स से यूरेसिल के 30 से अधिक pmol को क्लीव कर सकती हैं।
  4. एक 1.5 mL बाँझ microcentrifuge ट्यूब में, चरण 2.2 से सब्सट्रेट मिश्रण के 9.0 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए ट्यूब prewarm। चरण 2.3 से पतला UDG का 1.0 μL जोड़ें। प्रतिक्रिया को समय देने के लिए एक टाइमर का उपयोग करें और सामग्री को मिश्रण करने के लिए ट्यूब को झटका दें।
    नोट: एक इकाई परिभाषा परख के लिए, इनक्यूबेशन समय 30 मिनट है. एक गतिज परख के लिए, प्रारंभिक दर प्राप्त करने के लिए 0.5, 1, 2, 3, 5 मिनट के समय-पाठ्यक्रम विश्लेषण का उपयोग करें। एक UGI निषेध परख के लिए, 15 मिनट के लिए प्रतिक्रिया समय.
  5. परिवेश के तापमान पर 3,200 × g पर 3-5 s के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के साथ ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। फिर, प्रतिक्रिया को तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
  6. प्रतिक्रिया समाप्ति
    1. 0.25 M HCl और 0.23 M Tris आधार के समाधान तैयार करें। एक 15 mL टेस्ट ट्यूब में, 1x UDG प्रतिक्रिया बफर की नकल करने के लिए 1 mM EDTA और 20 mM Tris-HCl (25 °C पर pH 8.0) के समाधान के 10 mL जोड़ें। 0.25 M HCl के 1 mL के साथ अम्लीकृत करें और यह सुनिश्चित करने के लिए pH मीटर के साथ जाँच करें कि pH ~ 2 ± 0.5 है। 0.23 M Tris आधार के 1 mL के साथ बेअसर और 6.5 ± 0.5 के अंतिम पीएच के लिए एक पीएच मीटर के साथ जाँच करें।
      नोट: पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग करना अभिकर्मक मिश्रण के पीएच स्तरों की पुन: पुष्टि करने का एक त्वरित और आसान तरीका है।
    2. एंजाइम को निष्क्रिय करने के लिए 10 μL प्रतिक्रिया मिश्रण को अम्लीकृत करने के लिए 0.25 M HCl का 1 μL जोड़ें और इसे 6 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। एसिड के लंबे समय तक संपर्क द्वारा एपी साइट टूटने से बचने के लिए डीएनए उत्पादों को बेअसर करने के लिए 0.23 एम ट्रिस बेस के 1 μL जोड़ें। मैट्रिक्स चिप स्थानांतरण के लिए उत्पाद मिश्रण की मात्रा बढ़ाने के लिए 13 μL TE जोड़ें और फिर इसे बर्फ पर रखें।
      नोट: AP उत्पाद रासायनिक रूप से अस्थिर है और 2 दिनों के भीतर MALDI-TOF MS द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए। एक सप्ताह से अधिक समय तक भंडारण के बाद, स्ट्रैंड ब्रेक के एक बड़े हिस्से का संचय एपी उत्पादों (चित्रा 1 डी-जी) की β / δ उन्मूलन प्रतिक्रियाओं के कारण होता है।
  7. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों से सभी 25 μL UDG प्रतिक्रिया उत्पादों को 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट में स्थानांतरित करें।
    नोट: धनायनों की उच्च सांद्रता, जैसे कि बफ़र्स में सोडियम या पोटेशियम, MALDI-TOF MS विश्लेषण में हस्तक्षेप उत्पन्न करते हैं और इस प्रकार desalting की आवश्यकता होती है। जैसा कि ई कोलाई UDG प्रतिक्रिया बफर में धनायनों की बहुत कम सांद्रता होती है, desalting आवश्यक नहीं है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को अन्य डीएनए ग्लाइकोसिलेज प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए संशोधित करें जिसमें धातु धनायन होते हैं जिन्हें पहले वर्णित डिसाल्टिंग की आवश्यकता होती है35।

3. एक मैट्रिक्स चिप के लिए UDG प्रतिक्रिया उत्पादों को स्थानांतरित करें

  1. नैनोलीटर डिस्पेंसर का दरवाजा खोलें ( सामग्री की तालिका देखें) और डेक के प्लेट धारक पर चरण 2.7 से 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट लोड करें।
  2. इसी स्काउट प्लेट स्थिति में मैट्रिक्स चिप सरणी डालें। नैनोलीटर डिस्पेंसर के प्रसंस्करण डेक पर लोडेड स्काउट प्लेट रखें और दरवाजा बंद करें।
  3. स्थानांतरण स्क्रीन पर रन बटन को स्पर्श करें, और मैट्रिक्स चिप के लिए 384-अच्छी तरह से माइक्रोटिटर प्लेट से नमूनों को वितरित करना शुरू करने के लिए उपकरण की प्रतीक्षा करें।
  4. वितरण के दौरान प्रत्येक स्थान के लिए चिप की छवि और डिस्पेंस वॉल्यूम दिखाने के लिए विजन टैब विकल्प का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि चिप पर स्पॉटेड वॉल्यूम 5-10 एनएल की सीमा में है।

4. सेटअप द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर पर परख पैरामीटर

  1. आयात करने के लिए अनुमानित संकेत m/z मान वाली एक .xlsx फ़ाइल तैयार करने के लिए अनुप्रयोग प्रोग्राम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें.
    नोट:: फ़ाइल I.xlsx (तालिका 2) में सेटिंग्स अनुभाग 2 में G:U सब्सट्रेट के UDG परख के लिए उदाहरण सेटिंग्स हैं।
  2. बनाने के लिए और डिजाइनर स्वरूप विकल्प में आयात परख समूह राइट-क्लिक करके और ड्रॉपडाउन सूची से .xlsx फ़ाइल का चयन करके एक नया UDG परख परिभाषित करने के लिए आवेदन कार्यक्रम का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, फ़ाइल मैं चरण 4.1 से .xlsx).
  3. ग्राहक: प्रोजेक्ट: प्लेट बटन पर राइट-क्लिक करें और एक नई परख प्लेट स्थापित करने के लिए ड्रॉपडाउन विकल्प पेड़ के शीर्ष पर क्लिक करें। संवाद बॉक्स में, फ़ाइल नाम में टाइप करें (उदाहरण के लिए, CTT20210620 लैब कोड और परख दिनांक के लिए), और प्लेट प्रकार ड्रॉपडाउन में, 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रकार का चयन करें और ठीक दबाएँ। स्क्रीन के दाईं ओर दिखाई देने के लिए एक खाली प्लेट की तलाश करें।
  4. परख विकल्प पर क्लिक करें; ड्रॉपडाउन सूची से परख (जैसे, फ़ाइल मैं.xlsx) का चयन करें।
  5. प्लेट पर प्रत्येक नमूना स्पॉट स्थिति के लिए चयनित परख (जैसे, फ़ाइल I.xlsx) असाइन करने के लिए, कर्सर को खाली प्लेट की प्रत्येक स्थिति में ले जाएं, अच्छी तरह से हाइलाइट करने के लिए क्लिक करें, और Plex जोड़ें का चयन करने के लिए राइट-क्लिक करें।
  6. चरण 2.7 से चिप पर सभी नमूनों के लिए बिना शीर्ष लेख (जैसे, तालिका 3 का 0620.xlsx) के साथ .xlsx स्वरूप में कार्य सूची तैयार करने के लिए डेस्कटॉप या लैपटॉप कंप्यूटर का उपयोग करें। नया नमूना प्रोजेक्ट जोड़ें बटन क्लिक करें; कार्य सूची आयात करने के लिए ड्रॉपडाउन सूची से फ़ाइल (जैसे, 0620.xlsx) का चयन करें.
  7. स्क्रीन के बाईं ओर कार्य सूची (उदाहरण के लिए, 0620.xlsx से) में सभी परीक्षण नमूना कोड की तलाश करें। कार्य सूची में नमूना कोड पर क्लिक करें, और प्रत्येक स्थिति के लिए परीक्षण लिंक करने के लिए प्लेट की संबंधित स्थिति पर राइट-क्लिक करें।

5. मास स्पेक्ट्रोमीटर आपरेशन

  1. विश्लेषण करने के लिए नमूना चिप (अनुभाग 3 से) के लिए द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) को लिंक करने के लिए आवेदन कार्यक्रम का उपयोग करें।
  2. डिफ़ॉल्ट सेटिंग पर क्लिक करें। संवाद बॉक्स में, चरण 4.3 (जैसे, CTT20210620) से फ़ाइल नाम लिखें; प्रयोग का नाम में, चिप बारकोड में चिप ID में टाइप करें, और सेटिंग्स सहेजें।
  3. मास स्पेक्ट्रोमीटर नियंत्रण कार्यक्रम शुरू करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के इन / आउट बटन को पुश करें और डेक को विस्तारित होने दें। चिप धारक को बाहर निकालें और चिप धारक में चरण 3.4 से नमूना चिप डालें। लोड चिप धारक को विस्तारित डेक पर रखें और उपकरण में प्रवेश करने के लिए नमूना चिप के लिए इन / आउट बटन दबाएं।
  5. अनुप्रयोग प्रोग्राम का प्राप्त करें चिह्न डबल-क्लिक करें। प्राप्त करें विंडो में, उपकरण शुरू करने के लिए ऑटो रन टैब पर क्लिक करें और चिप पर नमूनों से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।

6. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा देखने और डेटा का विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण प्रोग्राम चलाएँ ( सामग्री की तालिका देखें).
  2. डेटाबेस ट्री ब्राउज़ करें और चरण 5.2 से चिप ID का चयन करें। चिप पर अच्छी तरह से एक लक्ष्य को उजागर करने के लिए क्लिक करें, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम दिखाने के लिए स्पेक्ट्रम आइकन पर क्लिक करें।
  3. किसी नई विंडो में स्पेक्ट्रम की एक विशिष्ट श्रेणी क्रॉप करने के लिए अनुकूलन संवाद चुनने के लिए राइट-क्लिक करें. m/z की ऊपरी और निचली सीमाओं में टाइप करने के लिए X-Axis पर क्लिक करें, और ब्याज के संकेतों सहित निर्दिष्ट रेंज स्पेक्ट्रम दिखाने के लिए ठीक दबाएँ.
    नोट: डीएनए की मात्रा प्रत्येक m/z मान इकाई पर शिखर तीव्रता के लिए आनुपातिक है।
  4. यू सब्सट्रेट, एपी-उत्पाद और टेम्पलेट के अनुरूप संकेतों के m/z मानों की चोटी की ऊंचाई को मापें। चोटी पर क्लिक करें और स्क्रीन के ऊपरी बाएं कोने में चोटी की ऊंचाई देखें।
    नोट: 1,600 चौड़ाई / 1,200 इकाई का एक स्पेक्ट्रम एक कंप्यूटर स्क्रीन पर निरीक्षण के साथ-साथ रिकॉर्डकीपिंग के लिए एक उचित आयाम है।
  5. रिकॉर्डकीपिंग के लिए स्पेक्ट्रम को सहेजने के लिए, निर्यात करें राइट-क्लिक करें और ड्रॉपडाउन सूची में JPEG फ़ाइल प्रकार का चयन करें। ड्रॉपडाउन सूची में भंडारण डिवाइस का चयन करने के लिए गंतव्य और ब्राउज़ डिस्क पर क्लिक करें (उदाहरण के लिए, फ़्लैश डिस्क E:). फ़ाइल नाम (जैसे, 0620_1-2.jpg) टाइप करें और निर्यात करेंक्लिक करें।
  6. यदि आवश्यक हो, तो एक निर्यात की गई JPEG फ़ाइल को प्रिंट करें और किसी मापनी का उपयोग करके मैन्युअल रूप से चोटी की ऊंचाई को मापें।

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Representative Results

टेम्पलेट्स और substrates
केंद्र (यू + 9) में यू के साथ सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स लेते हुए एक उदाहरण के रूप में जी टेम्पलेट के साथ जोड़ा जाता है (चित्रा 1 ए), टेम्पलेट और यूरेसिल युक्त सब्सट्रेट की सममोलर मात्रा का एक खाली नियंत्रण सिंथेटिक ओलिगोन्यूक्लियोटाइड शुद्धता के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 1 बी; सिग्नल निर्दिष्ट एम / जेड और कम पृष्ठभूमि शोर से मेल खाते हैं)। एमएस डेटा विश्लेषण के लिए, चोटी की ऊंचाइयों को मापा गया था (चित्रा 2)। ग्लाइकोसिलेज हाइड्रोलिसिस के बाद 19 एनटी टेम्पलेट डीएनए को अपरिवर्तित रहने की उम्मीद थी; इसलिए, संकेत एपी-उत्पाद (चित्रा 1 सी) की मात्रा के लिए एक संदर्भ के रूप में काम कर सकता है।

प्रतिक्रिया की स्थिति और द्रव्यमान स्पेक्ट्रा
यह डीएनए ग्लाइकोसिलेज परख सरल और आसान है एक गैर लेबल oligonucleotide का उपयोग कर एक मानक प्रतिक्रिया के लिए स्वच्छ और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए (चित्रा 1). एमएस स्पेक्ट्रा की सीमा को सब्सट्रेट, टेम्पलेट्स और प्रतिक्रिया उत्पादों (चित्रा 1 बी) से उत्पन्न सभी संकेतों को कवर करना चाहिए। सब्सट्रेट और संबंधित टेम्पलेट के बीच 1 nt के अंतर ने टेम्पलेट और सब्सट्रेट दोनों के लिए एक अच्छी तरह से अलग सिग्नल प्रोफ़ाइल का उत्पादन किया (चित्रा 1 B)। Equimolar प्राइमर U + 9 और T1 ने महत्वपूर्ण अंतर के बिना समान शिखर तीव्रता दिखाई। UDG के व्यापक पाचन (30 मिनट की प्रतिक्रिया के लिए 0.5 इकाइयाँ) ने पूर्ण यूरेसिल दरार का प्रदर्शन किया। एपी-उत्पाद का संकेत भी यूरेसिल-युक्त सब्सट्रेट से अच्छी तरह से अलग किया गया था (चित्रा 1C d + 9 AP-उत्पाद m / z = 5447.6 बनाम चित्रा 1B U + 9 सब्सट्रेट m / z = 5541.6)। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली अपेक्षाकृत हल्के MALDI आयनीकरण तकनीक 36 ने एपी साइटों 37 पर β-उन्मूलन प्रतिक्रिया से प्रेरित स्ट्रैंड ब्रेक से जुड़े संकेतों को कम किया, जो द्रव्यमान स्पेक्ट्रा में महत्वपूर्ण नहीं थे। कुल मिलाकर, प्रतिक्रिया पृष्ठभूमि ध्यान देने योग्य शोर (चित्रा 1 सी) के बिना बहुत साफ है।

सममोलर स्थितियों के तहत, एपी-उत्पाद की सापेक्ष संकेत तीव्रता यू-सब्सट्रेट के बराबर थी, जो एक संदर्भ के रूप में टी 1 टेम्पलेट का उपयोग कर रही थी (चित्रा 1 बी, यू + 9 / टी 1 बनाम डी + 9 / टी 1)। इस प्रकार, UDG गतिविधि की गणना Eq (1) के अनुसार U-युक्त सब्सट्रेट (50 pmol या 20 pmol) के सटीक इनपुट पर आधारित है।

UDG गतिविधि = (AP-उत्पाद का संकेत) / (U सब्सट्रेट का संकेत + AP-उत्पाद का संकेत) × [U] (1)

UDG गतिज पैरामीटर MALDI-TOF एमएस परख द्वारा निर्धारित
जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, 3 मिनट की प्रतिक्रिया के दौरान, 0.01 इकाइयों से 0.1 इकाइयों तक UDG प्रतिक्रियाओं ने खुराक और समय-निर्भरता दोनों का प्रदर्शन किया। जी: यू सब्सट्रेट (तालिका 1) के लिए गतिज मापदंडों, केएम और केकैट के निर्धारण के लिए 3.2 पीएम (0.1 इकाइयां प्रति 100 μL प्रतिक्रिया) की एकाग्रता का उपयोग किया गया था। UDG प्रतिक्रिया के एलीकोट को हटा दिया गया और 30 s और 60 s के लिए बुझाया गया। काइनेटिक डेटा उन परिस्थितियों में प्राप्त किया गया था जब यूरेसिल युक्त सब्सट्रेट 50% से कम पचा हुआ था, और 10 से 200 एनएम तक के पांच सब्सट्रेट सांद्रता को विश्लेषण के अधीन किया गया था। Presteady-state time course ने दर विश्लेषण के लिए उत्कृष्ट रैखिकता दिखाई। एक प्रतिक्रिया दर प्लॉट का एक उदाहरण चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, जहां उत्पाद और सब्सट्रेट की सापेक्ष एमएस सिग्नल तीव्रता एकाग्रता (एनएम) में परिवर्तित हो जाती है। UDG प्रतिक्रिया दर (v) प्रति सेकंड उत्पादित AP साइट के nM के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। Km और Vmax की गणना Lineweaver-Burk प्लॉट (चित्रा 3B) से की गई थी। MALDI-TOF MS परख से व्युत्पन्न UDG गतिज पैरामीटर इस प्रकार Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM s-1, और Kcat = 9.31 s-1 होने के लिए निर्धारित किए गए थे। मान पिछले 3H-uracil रिलीज assays जहां Km = 40 nM और Kcat = 13.3 s-138 जारी के परिणामों के लिए तुलनीय हैं। 

जी: यू + 9 डुप्लेक्स को यूडीजी संवेदनशीलता के अधीन किया गया था। MALDI-TOF एमएस परख द्वारा मापा इकाई एक पारंपरिक 3H-uracil-रिलीजिंग विधि 38 द्वारा निर्माता की परिभाषित इकाई के खिलाफ प्लॉट किया गया था। जैसा कि चित्र 3C में दिखाया गया है, MALDI-TOF MS-मापी गई इकाई 0.001 इकाइयों से 0.02 इकाइयों तक परिभाषित इकाई के आनुपातिक थी, जिसमें y = 0.933x + 0.0003 का सहसंबंध समीकरण और निर्धारण का गुणांक R2 = 0.9974 था। पता लगाने की सीमा 0.001 इकाइयों के रूप में भिन्नता का गुणांक = 9.2%, ~ 5 बार संकेत-से-शोर अनुपात है। इस प्रकार, इस MALDI-TOF एमएस परख UDG ज्यादातर इकाई स्तर 39 पर प्रयोग किया जाता है के रूप में पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान करता है.

UDG की सब्सट्रेट विशिष्टता
इस UDG MALDI-TOF एमएस परख की विशेषता विशेषताओं में से एक यह है कि यह लेबल मुक्त है, जो सब्सट्रेट डिजाइन के लिए उच्च बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है। यह सुविधा UDG की सब्सट्रेट विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए बहुत उपयोगी है। जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, यूरेसिल को एक विशिष्टता परख के लिए एकल-फंसे हुए या डबल-फंसे डीएनए के 5 'या 3' के अंत के पास किसी भी स्थान पर डाला जा सकता है। सब्सट्रेट विशिष्टता के लिए, यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि यूडीजी एकल-फंसे डीएनए 38 से यूरासिल को हटाने में अत्यधिक सक्रिय है। दरअसल, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, एकल-फंसे हुए सब्सट्रेट (एसएसयू) से यूरेसिल उच्छेदन 3.7-गुना कम हो गया था जब पूरक डीएनए स्ट्रैंड को annealed किया गया था, जिससे G: U डुप्लेक्स बनता है। आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले ए: यू डुप्लेक्स 6, 7,8 के लिए, प्रतिक्रिया दर को एसएसयू के सापेक्ष लगभग 10 गुना कम कर दिया गया था। UDG ने डीएनए टर्मिनस पर U पर कार्य नहीं किया (G:U+1, G:U-1, और G:U-2 की तालिका 1 सब्सट्रेट्स), जो पिछले अध्ययन40,41 के अनुरूप है। दिलचस्प बात यह है कि 5'-टर्मिनस से दूसरे और तीसरे स्थान पर U ने केंद्र में U की तुलना में क्रमशः 2-गुना और 1.5-गुना तक एक उच्च UDG उत्प्रेरक दर प्रदर्शित की , (तालिका 1, G: U + 2 और G: U + 3 बनाम G: U)। UDG ने केंद्र में U की तुलना में 8% कम गतिविधि के साथ 3'-अंत से U 3-nt को एक्साइज किया (तालिका 1, जी: यू -3 बनाम जी: यू)।

यूडीजी प्रतिक्रिया के यूरेसिल ग्लाइकोसिलेज अवरोधक निषेध
यूरेसिल ग्लाइकोसिलेज इनहिबिटर (यूजीआई) एक बैक्टीरियोफेज प्रोटीन है, जो 1: 142 के स्टोइकोमेट्री के साथ प्रतिवर्ती प्रोटीन बंधन द्वारा ई कोलाई यूडीजी को रोकता है। UGI द्वारा UDG गतिविधि का निषेध चित्र 4 में दिखाया गया है। यूजीआई की 0.05 इकाइयों (100 पीएम) की उपस्थिति में, यूडीजी (8 पीएम) की 0.05 इकाइयों की गतिविधि को एक अज्ञात स्तर तक रोक दिया गया था। IC50 7.6 pm था। इस प्रकार, UDG MALDI-TOF एमएस परख आसानी से अन्य डीएनए ग्लाइकोसिलेस के अवरोधकों की खोज के लिए एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग परख के लिए संशोधित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक डीएनए ग्लाइकोसिलेज परख के लिए मॉडल प्रणाली( ए) एक एकल यूरिडिन (यू + 9) वाले घाव स्ट्रैंड को एक टेम्पलेट (टी 1) में annealed किया गया था, जो एक G: U बेमेल (बोल्ड) बनाता है। यूरेसिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज यूरेसिल का पता लगाता है और हटा देता है, जिससे एक एपी साइट (डी) बनती है। जब MALDI-TOF MS के अधीन किया जाता है, तो U-युक्त DNA और AP उत्पादों के बीच m/z मानों में अंतर को हल किया जा सकता है जैसा कि B में दिखाया गया है। (बी) एक 18 एनटी डीएनए जिसमें एक एकल यूरिडीन (यू + 9) होता है, जिसे 19 एनटी टेम्पलेट (टी 1) (तालिका 1) के लिए annealed किया गया था, प्रतिक्रिया बफर के 40 μL में सब्सट्रेट के 50 pmol के एंजाइम रिक्त के रूप में परीक्षण किया गया था और एमएस विश्लेषण के अधीन था। (C) 30 मिनट के लिए 37 °C पर UDG की 0.5 इकाइयों का उपयोग करके 10 μL प्रतिक्रिया में सब्सट्रेट के 50 pmol का एक निकट-पूर्ण एंजाइम पाचन (D) एक 18 nt DNA जिसमें एक एकल यूरिडीन (U + 3) होता है, जो 40 μL प्रतिक्रिया बफर में 50 pmol सब्सट्रेट के T1 एंजाइम रिक्त के लिए annealed होता है। (ई) डी + 3 का उत्पादन करने के लिए 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यूडीजी की 0.5 इकाइयों का उपयोग करके 10 μL प्रतिक्रिया में यू + 3 सब्सट्रेट के 50 pmol का एक निकट-पूर्ण एंजाइम पाचन और 30 घंटे के भीतर एमएस विश्लेषण के अधीन था (एफ) प्रतिक्रिया की स्थिति ई के समान थी, सिवाय इसके कि डी + 3 उत्पाद 0.1 M NaOH में 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 30 मिनट के लिए था ताकि बी 15 खंडित उत्पाद का उत्पादन करने वाले बीटा-उन्मूलन प्रतिक्रिया को ट्रिगर किया जा सके। और एमएस विश्लेषण के अधीन है। (जी) प्रतिक्रिया की स्थिति ई के समान थी सिवाय इसके कि डी + 3 उत्पाद को 7 दिनों से अधिक समय तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था; D+3 का एक अंश B15 खंडित उत्पादों में परिवर्तित हो जाता है। इस आंकड़े को 43 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त रूप: nt = न्यूक्लियोटाइड; एमएस = मास स्पेक्ट्रोमेट्री; MALDI-TOF MS = मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर Desorption/ AP = apurinic/ apyrimidinic; UDG = Uracil-DNA ग्लाइकोसिलेज; T1 = 19 nt जी युक्त टेम्पलेट; U+9 = 18 nt U-युक्त सब्सट्रेट; d+9 = 18 nt AP साइट युक्त उत्पाद; U+3 = 18 nt U-युक्त सब्सट्रेट; d+3 = 18 nt AP साइट युक्त उत्पाद; B15 = 15 nt बीटा उन्मूलन खंडित उत्पाद. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: विभिन्न एंजाइम सांद्रता में UDG गतिविधि के लिए समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। सब्सट्रेट डीएनए, 50 pmol, जिसमें एक जी: यू घाव होता है, को 0.01, 0.02, 0.05, और 37 डिग्री सेल्सियस पर यूडीजी की 0.1 इकाइयों के साथ इनक्यूबेट किया गया था। ऐलीकोट (10 μL) को प्रतिक्रिया मिश्रण से 0, 0.5, 1, 2 और 3 मिनट में लिया गया था और फिनोल / क्लोरोफॉर्म की समान मात्रा के साथ बुझाया गया था। (ए) MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रा UDG द्वारा प्रसंस्करण G: U substrates की एकाग्रता निर्भरता को दर्शाता है। (बी) उत्पाद की मात्रा को समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया गया था। UDG: 0.01 (ठोस रेखा के साथ बंद त्रिकोण), 0.02 (धराशायी रेखा के साथ खुला त्रिकोण), 0.05 (ठोस रेखा के साथ बंद सर्कल), और 0.1 इकाइयों (ठोस रेखा के साथ खुले हलकों)। डेटा तीन स्वतंत्र निर्धारणों के औसत हैं, और त्रुटि पट्टियाँ 1 एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को 43 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त रूप: nt = न्यूक्लियोटाइड; MALDI-TOF = मैट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर Desorption / Ionization समय की उड़ान; AP = apurinic/ apyrimidinic; UDG = Uracil-DNA ग्लाइकोसिलेज; T = 19 nt G-युक्त टेम्पलेट; U = 18 nt U-युक्त सब्सट्रेट; AP = 18 nt AP साइट युक्त उत्पाद. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: MALDI-TOF विश्लेषण का उपयोग करके UDG के गतिज मापदंडों का निर्धारण। Michaelis-Menten वक्र और Lineweaver-Burk भूखंडों के लिए KM और Kcat UDG एंजाइम के लिए kcat निर्धारित करने के लिए-डीएनए से Uracil के उत्प्रेरित उच्छेदन. डीएनए ग्लाइकोसिलेज MALDI-TOF एमएस परख UDG और विभिन्न सांद्रता (10, 30, 60, 100, 200 nM) की 0.1 इकाइयों का उपयोग करके किया गया था सब्सट्रेट ्स 100 μL प्रतिक्रिया में 30 s और 60 s के लिए (ए) माइकलिस-मेंटेन वक्र तीन स्वतंत्र प्रयोगों से उत्पन्न। त्रुटि सलाखों परख के लिए 1 एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) Lineweaver-Burk साजिश; संकेतित अवरोधन गणना Km और Vmax की अनुमति देते हैं. (सी) निर्माता-असाइन की गई इकाई की तुलना में MALDI-TOF MS विश्लेषण द्वारा UDG परख। एंजाइम गतिविधि को 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 18/19 nt डीएनए डुप्लेक्स के भीतर G: U के 50 pmol (0.56 μg) वाले 10 μL प्रतिक्रिया में AP साइट बनाने वाले यूरेसिल हटाने से मापा गया था। UDG को बर्फ पर बफर [50% ग्लिसरॉल, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 30 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] के साथ पतला किया गया था। एक इकाई को एंजाइम की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया था जो प्रति मिनट यूरेसिल के 60 पीएमओएल की रिहाई को उत्प्रेरित करता था। त्रुटि पट्टियाँ छह प्रयोगों के मानक विचलन को दर्शाती हैं. इस आंकड़े को 43 से संशोधित किया गया है। संक्षिप्त रूप: nt = न्यूक्लियोटाइड; MALDI-TOF = मैट्रिक्स-सहायता प्राप्त लेजर Desorption / Ionization समय की उड़ान; UDG = Uracil-DNA ग्लाइकोसिलेज; AP = apurinic/ apyrimidinic; V, प्रतिक्रिया वेग nM/s. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: UGI के अतिरिक्त द्वारा UDG एंजाइम निषेध वक्र. निषेध वक्र को UDG (8 pM) की 0.05 इकाइयों और सब्सट्रेट के 50 pmol के साथ 20 μL की प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके 0.001 इकाइयों (5 pmM) से 0.1 इकाइयों (200 pM) तक UGI की उपस्थिति में 15 मिनट के लिए निर्धारित किया गया था। डेटा तीन स्वतंत्र निर्धारणों के औसत हैं, और त्रुटि सलाखों का प्रतिनिधित्व करते हैं 1 एसडी डेटा एक ऑनलाइन IC50 कैलकुलेटर के साथ फिट ( सामग्री की तालिका देखें)। इस आंकड़े को 43 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: UDG = Uracil-DNA ग्लाइकोसिलेज; UGI = uracil ग्लाइकोसिलेज अवरोधक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डीएनए सब्सट्रेट्स ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्सा DNA Sequenceb प्रारंभिक ratec k बिल्ली
(pmol/sec) (s-1)
ssU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0.560 ± 0.098 35
ssU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0.756 ± 0.083 47.3
ssU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0.448 ± 0.087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.149 ± 0.046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
A:U T2 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0.053 ± 0.018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G:U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.256 ± 0.044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 3'-CGGGTCAGGCCCCTGCAACCG-5' 0.567 ± 0.016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+1 T4 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDD मरोड़ना
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0.138 ± 0.015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' मरोड़ना मरोड़ना
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' मरोड़ना मरोड़ना
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

तालिका 1: सब्सट्रेट रचनाएं और UDG विशिष्टताएं। यह तालिका U±N द्वारा नामित 18 nt U-युक्त DNA को दिखाती है। '+' 5 'टर्मिनस से यूरेसिल स्थिति की गिनती को इंगित करता है, और'-' 3 'टर्मिनस से यूरेसिल स्थिति की गणना को इंगित करता है। उदाहरण के लिए, U +9 5 'टर्मिनस से 9 वां स्थान है, U-3 3' टर्मिनस से तीसरा स्थान है। T1 से T7 के पूरक 19 nt टेम्पलेट को U-युक्त DNA के साथ जोड़ा जाएगा जो G:U या A:U बेमेल बनाता है जैसा कि इंगित किया गया है। यूरेसिल बेस बोल्ड में हैं। प्रतिक्रियाएं यू सब्सट्रेट्स के 50 पीएमओएल, यूडीजी की 0.05 इकाइयों का उपयोग कर रही थीं, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 2 में वर्णित 10 μL में किया गया है। इस तालिका को 43 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: UDG = uracil डीएनए ग्लाइकोसिलेज; nt = न्यूक्लियोटाइड; एनडी, पता लगाने योग्य नहीं है।

2nd-PCRP प्रथम-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_ कॉल EXT1_ मास
ना ना ना ना ना ना ना F 5789.8 GCCAACGTCCGGGGGGTC
ना ना ना ना ना ना ना F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

तालिका 2: फ़ाइल I.xlsx फ़ाइल. सेटिंग्स का उपयोग चित्र 1B, C और चित्रा 2A के लिए किया गया था; 0 मिनट प्रविष्टियाँ. इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली MALDI-TOF MS प्रणाली को विशेष रूप से प्रवर्धित जीन अनुक्रम भिन्नता के क्षेत्र में विस्तारित प्राइमर के एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार द्वारा एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। UDG परख के लिए, परख समूह फ़ाइल I. संक्षेप की तैयारी करते समय केवल छह क्षेत्रों का उपयोग किया गया था: अच्छी तरह से = परख को सौंपा अच्छी तरह से संख्या; TERM = समाप्ति मिश्रण; SNP_ID = एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता के इनपुट अनुक्रम का नाम; 2-PCRP = आगे amplicon प्राइमर; 1-PCRP = रिवर्स amplicon प्राइमर; AMP_LEN = amplicon लंबाई; UP_CONF = uniplex प्रवर्धन स्कोर; MP_CONF = मल्टीप्लेक्स प्रवर्धन स्कोर; Tm = पिघलने का तापमान; PcGC = प्रतिशत जीसी सामग्री; PWARN = परख डिजाइन चेतावनी कोड; UEP_DIR = प्राइमर विस्तार की दिशा; UEP_MASS = unextended-प्राइमर द्रव्यमान; UEP_SEQ = unextended-primer अनुक्रम; EXT1_CALL = विश्लेषक 1 द्रव्यमान शिखर को दिया गया नाम; EXT1_MASS = विश्लेषक 1 का द्रव्यमान।

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

तालिका 3: 0620.xlsx फ़ाइल. इन सेटिंग्स का उपयोग चित्र 4A में UGI निषेध प्रतिक्रियाओं के लिए किया गया था। संक्षिप्त नाम: UGI = uracil ग्लाइकोसिलेस अवरोधक।

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Discussion

यह पेपर सीधे एपी युक्त डीएनए उत्पादों का पता लगाने के लिए एक UDG MALDI-TOF एमएस परख विधि का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रदान करता है। इस विधि के मुख्य लाभ यह हैं कि यूरेसिल युक्त सब्सट्रेट लेबल-मुक्त, स्केलेबल, काम करने में आसान हैं, और सब्सट्रेट डिजाइन में अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं।

UDG सप्लायर-अनुशंसित फिनोल / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण उत्पाद डीएनए के क्षरण को रोकने के लिए एंजाइम की निष्क्रियता को सक्षम बनाता है। हालांकि, फिनोल निष्कर्षण प्रोटोकॉल में खतरनाक रसायनों का थकाऊ चरण-पृथक्करण शामिल है। प्रतिक्रिया पीएच को 2 ± 0.5 तक कम करने के लिए एचसीएल का उपयोग करके एक वैकल्पिक एसिड समाप्ति विधि भी प्रभावी रूप से निष्क्रिय यूडीजी। ट्रिस बेस के साथ बाद में न्यूट्रलाइजेशन डीएनए क्षति को रोक सकता है। जब एपी उत्पाद को 30 घंटे के भीतर एमएस विश्लेषण के अधीन किया गया था, तो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा (चित्रा 1 ई) में आधार हानि या संशोधन के कोई संकेत नहीं थे। प्रतिक्रियाओं में Tris बफर वाणिज्यिक UDG के साथ प्रदान की गई थी। हालांकि, ट्रिस सहित विभिन्न अमीन्स, बीटा-उन्मूलन के माध्यम से एपी साइटों को शामिल कर सकते हैं, हालांकि उच्च अभिकर्मक सांद्रता 44 पर। कुछ विकल्प, जैसे HEPES और फॉस्फेट बफर, बीटा-उन्मूलन द्वारा एपी साइट की दरार के जोखिम से बचने के लिए माना जा सकता है।

एक संभावित UDG संदर्भ विधि के रूप में, केंद्रित G: U सब्सट्रेट (तालिका 1, T1 / U + 9) का एक डुप्लेक्स निम्नलिखित कारणों से मानक सब्सट्रेट के रूप में अनुशंसित है: 1. शारीरिक प्रासंगिकता के लिए, G: U A: U से बेहतर है क्योंकि G: C जोड़े में साइटोसिन के deamination के परिणामस्वरूप G: U घाव होते हैं। 2. जबकि ई कोलाई UDG एकल फंसे डीएनए से यू hydrolyze करने के लिए उच्च विशिष्टता को दर्शाता है, एकल फंसे हुए डीएनए में एक यू घाव की मरम्मत असामान्य है. 3. सभी जी: यू सब्सट्रेट परीक्षण के लिए, जी: यू + 2 और जी: यू + 3 ने जी: यू + 9 की तुलना में उच्च प्रतिक्रिया दर का प्रदर्शन किया। हालांकि, एक स्ट्रैंड ब्रेक से सटे एक डीएनए डिमिनेशन घाव असामान्य है। देशी घावों की नकल करने के लिए, डीएनए डुप्लेक्स के केंद्र में जी: यू रखना अधिक उपयुक्त होगा।

दिलचस्प बात यह है कि MALDI-TOF MS विधि ने UDG गतिज मापदंडों को उत्पन्न किया, और G: U प्रतिक्रिया (चित्रा 3A-C) की एंजाइम इकाइयां 3H-uracil38 का उपयोग करके पारंपरिक रूप से व्युत्पन्न परिणामों के समान थीं। हालांकि, इस अध्ययन में एकल जी: यू सब्सट्रेट पीबीएस 1 बैक्टीरियोफेज डीएनए से बहुत अलग है जो पहले डीएनए संश्लेषण त्रुटियों से कई ए: यू के साथ वर्णित था। इसके अलावा, UDG ने A:U सब्सट्रेट (तालिका 1, Km और Kcat of G:U बनाम A:U) की तुलना में G:U के साथ 3 गुना अधिक गतिविधि दिखाई। इस प्रतीत होता है कि विरोधाभासी परिणाम को PBS1 सब्सट्रेट के DNA अनुक्रम के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जिसमें कई A:U घाव45 के रूप में U का 36% होता है, जबकि G में U के केवल 3% की तुलना में: यू सब्सट्रेट (तालिका 1)। इस बीच, UDG एक बहुत ही 'processive' एंजाइम है, यानी, एक एकल प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी घटना कई uracil दरारें 12 प्राप्त करती है। इन दो UDG विधियों के बीच एक निकट-सही एक-से-एक सहसंबंध की खोज इस एमएस विधि को पारंपरिक रेडियोआइसोटोप परख के बजाय एक आकर्षक विकल्प बनाती है।

यह दृष्टिकोण आसानी से स्केलेबल है। इस अध्ययन में सभी UDG प्रतिक्रियाओं को माइक्रोपिपेट्स और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके मैन्युअल रूप से निष्पादित किया गया था, जिसमें किसी दिए गए दिन में ~ 30 परीक्षण किए गए थे। इस प्रकार, MALDI-TOF MS सिस्टम के लिए 384-well plate format चिप सरणी की क्षमता के दसवें भाग से भी कम ( सामग्री की तालिका देखें) अनुभाग 3-5 में वर्णित का उपयोग किया गया था। इसके विपरीत, 384-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के लिए एक स्वचालित पिपेटिंग सिस्टम का अनुकूलन एसिड समाप्ति विधि का उपयोग करके इस दृष्टिकोण के दैनिक आउटपुट को आसानी से बढ़ा सकता है। इस प्रकार, 300 UDG प्रतिक्रियाओं में ~ 1 घंटे लगेंगे। MALDI-TOF MS सिस्टम ( सामग्री की तालिका देखें) 1 घंटे में 300 प्रतिक्रियाओं के लिए द्रव्यमान स्पेक्ट्रा डेटा आउटपुट कर सकता है। इसलिए, एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया को 300 UDG MALDI-TOF MS assays को पूरा करने के लिए 2 h की आवश्यकता होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम कार्यात्मक जीनोमिक्स (ताइपे, ताइवान) और एनआरपीबी फार्माकोजेनोमिक्स लैब (ताइपे, ताइवान) के लिए एनसीएफपीबी एकीकृत कोर सुविधा को उनके तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान, आर.ओ.C द्वारा समर्थित किया गया था[ अनुदान संख्या MOST109-2314-B-002 -186 K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 से S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 से W.-h.F.] एच.-एल.C नेशनल ताइवान विश्वविद्यालय से डॉक्टरेट फैलोशिप का प्राप्तकर्ता है। ओपन एक्सेस चार्ज के लिए फंडिंग: विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, आर.ओ.C।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

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References

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जैव रसायन अंक 182 बेस उच्छेदन मरम्मत MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री Uracil-DNA ग्लाइकोसिलेज apurinic / apyrimidinic साइट ग्लाइकोसिलेस अवरोधक
Uracil-डीएनए Glycosylase मैट्रिक्स द्वारा परख-सहायता प्राप्त लेजर Desorption / Ionization समय की उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
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