Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uracil-DNA Glykosylaseanalyse ved matriseassistert laserdesorpsjon/ioniseringstid for massespektrometrianalyse

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

En ikke-merket, ikke-radio-isotopisk metode for å analysere uracil-DNA glykosylaseaktivitet ble utviklet ved hjelp av MALDI-TOF massespektrometri for direkte apurinic / apyrimidinisk produktanalyse. Analysen viste seg å være ganske enkel, spesifikk, rask og enkel å bruke til DNA glykosylasemåling.

Abstract

Uracil-DNA glykosylase (UDG) er en nøkkelkomponent i base excision reparasjonsveien for korreksjon av uracil dannet av hydrolytisk deaminering av cytosin. Dermed er det avgjørende for genomintegritetsvedlikehold. En svært spesifikk, ikke-merket, ikke-radio-isotopisk metode ble utviklet for å måle UDG-aktivitet. En syntetisk DNA-dupleks som inneholder en stedsspesifikk uracil ble spaltet av UDG og deretter utsatt for Matrix-assistert Laser Desorption / Ionization time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) analyse. Det ble etablert en protokoll for å bevare det apurinic/apyrimidinic site (AP) produktet i DNA uten strandbrudd. Endringen i m/z-verdien fra substratet til produktet ble brukt til å evaluere uracilhydrolyse ved UDG. Et G:U-substrat ble brukt til UDG kinetisk analyse som ga Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s og Kcat = 9,31 s-1. Påføring av denne metoden til en uracil glykosylasehemmer (UGI) analyse ga en IC50-verdi på 7,6 pM. UDG-spesifisiteten ved hjelp av uracil i ulike posisjoner innen enkeltstrengede og dobbeltstrengede DNA-substrater viste forskjellig spaltingseffektivitet. Dermed kan denne enkle, raske og allsidige MALDI-TOF MS-metoden være en utmerket referansemetode for ulike monofunksjonelle DNA-glykosylaser. Det har også potensialet som et verktøy for DNA glykosylasehemmer screening.

Introduction

Selv om uracil er en normal base i RNA, er det en vanlig og svært mutagene lesjon i genomisk DNA. Uracil kan oppstå ved spontan/enzymatisk hydrolytisk deaminering av et deoksycytidin. I hver levende celle oppstår denne deaminering 100-500 ganger per dag under fysiologiske forhold1,2. Hvis disse endringene ikke repareres, kan det være en endring i DNA-sekvenssammensetningen, noe som forårsaker mutasjon. Som uracil i DNA foretrekker å parre med dATP under replikering, hvis cytosin deaminaterer til uracil, i to replikasjonshendelser, vil det være en ny G:C til A:T overgangsmutasjon i halvparten av avkom DNA3.

Blant de cellulære strategiene for å opprettholde genetisk stabilitet er base eksisjonsreparasjon (BER) en viktig mekanisme som reparerer skadede baser, for eksempel uracil, i DNA4. BER er en svært evolusjonært bevart prosess. Det er to generelle BER-veier: kortplasterveien som fører til en reparasjonskanal av et enkelt nukleotid og den lange patchbanen som produserer en reparasjonskanal på minst to nukleotider5. BER er en koordinert mekanisme som oppstår i flere trinn. Det første trinnet i BER er den enzymatiske hydrolysen til den skadede nukleotidbasen av et skadespesifikt DNA-glykosylase for å generere et apurinic / apyrimidinisk (AP) mellomliggende sted6. Dette etterfølges av spaltingen av sukkerfosfat-ryggraden på AP-anlegget av en endonuklease, opprydding av DNA-endene med en lyase, gapfylling av en DNA-polymerase og forseglet den endelige nick av en ligase5.

Uracil-DNA glykosylase (UDG) hydrolyserer uracil fra uracilholdig DNA for BER i Escherichia coli. Konvensjonelle UDG-analyser ved hjelp av radiomerket DNA som involverer forskjellige separasjonsteknikker6,7,8,9,10,11,12,13 er vanligvis tidkrevende, arbeidskrevende, med kostbare merkingsreagenser, kompliserte prosedyrer og krever intensiv trening og praksis for å redusere risikoen for eksponering for radioaktive materialer. Fluorometriske oligonukleotidanalyser er utviklet som en erstatning for radioisotopemerking14, i tillegg til molekylære beacons og Förster resonansenergioverføringsteknologi15,16,17,18,19,20. Det kreves imidlertid spesifikk merking for alle de nevnte metodene. Nylig etikettfrie biosensorer assays21,22,23 og kolorimetriske metoder basert på dannelsen av en G-quadruplex24,25,26 er utviklet. Imidlertid kompliserer flere A: U-par eller spesialdesignede sekvenser i sondene enzymenhetsdefinisjonen.

MALDI-TOF MS er en teknologi som kan være til stor nytte i DNA-analyse. Programmer utviklet inkluderer enkeltkjernepolymorfisme genotyping27,28, modifisert nukleotidanalyse29, og DNA-reparasjon mellomliggende identifikasjon30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS bør lett vedtas for DNA glykosylaseanalyse for å oppdage AP-site-inneholdende DNA-produkter. Imidlertid er AP-nettsteder i DNA utsatt for strandbrudd under mange eksperimentelle forhold33. En UDG-analyse presenteres her ved hjelp av MALDI-TOF MS for direkte å måle AP-anleggsproduksjon uten betydelig strand-break støy. Denne etikettfrie metoden er enkel å jobbe med og har et høyt potensial for farmasøytisk anvendelse av DNA glykosylasehemmerscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av substrat/mal

  1. Design uracil substrat/ mal dupleks med et balansert G + C-innhold på ~ 50 ± 10% og minimum smeltetemperatur på 50 ° C for dupleksområdet.
    MERK: En nukleotidforskjell mellom 18 nt-substrater og 19 nt-maler (tabell 1 og figur 1) bidrar til bedre MS-signaltolkning og passende gløding. Malstrengen fungerer som komplementært DNA for å generere A-U- eller G-U-uoverensstemmelser (tabell 1), men kan også brukes som referansesignal i MS-målinger. Bruken av HPLC-rensede syntetiske oligonukleotider er tilfredsstillende for denne studien.
  2. Løs opp DNA i 1 mM EDTA og 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 ved 25 °C) (TE) i en konsentrasjon på 100 μmol/L som lager og oppbevar ved -20 °C. Fortynn denne 20 μL-bestanden med TE til et endelig volum på 800 μL (25 ganger fortynning til 4 μmol/l). Mål absorbansen av DNA-løsningen i et UV-synlig spektrofotometer ved λ = 260 nm for å sikre produsentens tildelte konsentrasjon. For eksempel: A260 = 0,204 for 4 μmol/L av U+9 og A260 = 0,192 for 4 μmol/L T1 (tabell 1).
  3. Utfør MALDI-TOF MS-analyse (avsnitt 4-6) for kvalitetskontroll av oligonukleotid ved å inspisere unike toppsignaler ved angitte m/z-verdier, samt ved å kontrollere at signal-til-støy-forholdet er >100 (figur 1B og figur 1D).

2. DNA glykosylase analyse

  1. Bruk av et G:U-substrat av T1/U+9 dupleks (tabell 1 og figur 1A) for glykosylasereaksjonen, For eksempel, i et 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerør, tilsett 70 μL H2O, 10 μL 10x UDG reaksjonsbuffer, 5 μL T1-lager og 5 μL U +9-lager (trinn 1.2.).
    MERK: Velg riktig type mikropipette og følg produsentens instruksjoner for å håndtere ønsket volum. Bruk for eksempel en 2 μL pipette for å dispensere 0,1-2 μL væske, bruk en 10 μL pipette for å dispensere 2-10 μL væske, og bruk en 100 μL pipette for å dispensere 20-100 μL væske for å sikre nøyaktighet og presisjon av resultatene. Det beskrevne volumet av reagensblandingen er for 10 analyser; justere volumet for ønsket antall reaksjoner. 1x UDG-reaksjonsbufferen inneholder 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol og 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 ved 25 °C). Se materialtabellen for kilden til 10x UDG-reaksjonsbuffer.
  2. Lukk røret sikkert; inkuber i et vannbad i 30 min ved 65 °C, deretter i 30 minutter ved 37 °C, og til slutt på is i 3 minutter for å sikre riktig gløding av substratet/maldupleksen.
  3. I et 1,5 ml sterilt mikrosenterrør tilsettes 49 μL iskald 1x UDG reaksjonsbuffer og 1 μL UDG (5000 enheter/ml; se materialtabellen), fortynning til 0,1 enheter/μL. Lag serielle fortynninger med 1x UDG-buffer til ønsket enzymkonsentrasjoner på 0,05, 0,02 eller 0,01 enheter/μL. Hold alltid den fortynnede UDG på is.
    MERK: I en 10 μL reaksjon kan 0,1 enheter av UDG spalte mer enn 30 pmol av uracil fra en T1 / U + 9 dupleks på 3 min.
  4. I et 1,5 ml sterilt mikrosenterrør, tilsett 9,0 μL substratblanding fra trinn 2.2 og forvarm røret til 37 °C. Tilsett 1,0 μL av den fortynnede UDG fra trinn 2.3. Bruk en timer til å tidsangang reaksjonen og flikk røret for å blande innholdet.
    MERK: For en enhetsdefinisjonsanalyse er inkubasjonstiden 30 min. For en kinetisk analyse, bruk en tidskursanalyse på 0,5, 1, 2, 3, 5 min for å oppnå startraten. For en UGI-hemmingsanalyse, ta tiden reaksjonen i 15 min.
  5. Sentrifuger rørene med reaksjonsblandingen i 3-5 s ved 3200 × g ved omgivelsestemperatur. Overfør deretter reaksjonen umiddelbart til 37 °C.
  6. Reaksjonsavslutning
    1. Forbered løsninger på 0,25 M HCl og 0,23 M Tris base. I et 15 ml reagensrør tilsettes 10 ml av en oppløsning på 1 mM EDTA og 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 ved 25 °C) for å etterligne 1x UDG reaksjonsbuffer. Acidify med 1 ml 0,25 M HCl og sjekk med en pH-måler for å sikre at pH er ~ 2 ± 0,5. Nøytraliser med 1 ml 0,23 M Tris-base og sjekk med en pH-måler for en endelig pH på 6,5 ± 0,5.
      MERK: Bruk av pH-teststrimmler er en rask og enkel måte å bekrefte pH-nivåene på reagensblandingen på.
    2. Tilsett 1 μL 0,25 M HCl for å surgjøre 10 μL reaksjonsblandingen for å inaktivere enzymet og plassere det på is i 6 minutter. Tilsett 1 μL 0,23 M Tris-base for å nøytralisere DNA-produktene for å unngå brudd på AP-området ved langvarig eksponering for syre. Tilsett 13 μL TE for å øke volumet på produktblandingen for matrisebrikkeoverføring , og legg den deretter på is.
      MERK: AP-produktet er kjemisk ustabilt og bør analyseres av MALDI-TOF MS innen 2 dager. Etter langvarig lagring i mer enn en uke oppstår akkumulering av en betydelig del av strandbrudd på grunn av β/δ elimineringsreaksjoner av AP-produktene (figur 1D-G).
  7. Overfør alle 25 μL UDG reaksjonsprodukter fra mikrocentrifuge rør til en 384-brønns mikrotiter plate.
    MERK: Høye konsentrasjoner av kasjoner, som natrium eller kalium i buffere, genererer forstyrrelser i MALDI-TOF MS-analysen og krever dermed avsalting. Siden E. coli UDG-reaksjonsbuffer inneholder svært lave konsentrasjoner av kasjoner, er det ikke nødvendig å avsalte. Modifiser imidlertid denne protokollen for å måle andre DNA glykosylasereaksjoner som inneholder metallkvisasjoner som krever avsalting som beskrevet tidligere35.

3. Overfør UDG-reaksjonsprodukter til en matrisebrikke

  1. Åpne døren til nanoliterdispenseren (se materialbordet) og legg den 384-brønns mikrotiterplaten fra trinn 2.7 på plateholderen på decket.
  2. Sett matrisebrikkematrisen inn i tilsvarende speiderplateposisjon. Plasser den lastede speiderplaten på prosesseringsdekket til nanoliterdispenseren og lukk døren.
  3. Trykk på løpeknappen på overføringsskjermen, og vent til instrumentet begynner å dispensere prøver fra 384-brønns mikrotiterplaten til matrisebrikken.
  4. Bruk fanealternativet Visjon til å vise bildet av brikken og dispenservolumene for hvert sted under utlevering. Forsikre deg om at det flekkete volumet på brikken er i området 5-10 nL.

4. Sett opp analyseparametrene på massespektrometeret

  1. Bruk programmet (se materialfortegnelsen) til å klargjøre en .xlsx fil som inneholder den anslåtte signal m/z-verdien for import.
    MERK: Innstillingene i FIL I.xlsx (tabell 2) er eksempelinnstillinger for UDG-analysen til G:U-substratet i avsnitt 2.
  2. Bruk programmet til å opprette og definere en ny UDG-analyse ved å høyreklikke alternativet Importer analysegruppe i designerformat og velge .xlsx filen fra rullegardinlisten (for eksempel FIL I.xlsx fra trinn 4.1).
  3. Høyreklikk Knappen Kunde:Prosjekt:Plate , og klikk på toppen av rullegardinalternativtreet for å opprette en ny analyseplate. I dialogboksen skriver du inn et filnavn (for eksempel CTT20210620 for labkoden og analysedatoen), og i rullegardinlisten for platetype velger du platetypen 384 brønn og trykker OK. Se etter en tom plate til høyre på skjermen.
  4. Klikk analysealternativet. velg analysen (f.eks. FIL I.xlsx) fra rullegardinlisten.
  5. Hvis du vil tilordne den valgte analysen (f.eks. FIL I.xlsx) til hver prøveplass på platen, flytter du markøren til hver posisjon på den tomme platen, klikker for å utheve brønnen og høyreklikker for å velge Legg til Pleksisett.
  6. Bruk en stasjonær eller bærbar datamaskin til å klargjøre en arbeidsliste i .xlsx-format uten topptekst (f.eks. 0620.xlsx i tabell 3) for alle prøvene på brikken fra trinn 2.7. Klikk knappen Legg til nytt eksempelprosjekt . Velg filen (f.eks. 0620.xlsx) fra rullegardinlisten for å importere arbeidslisten.
  7. Se etter alle testeksempelkodene i arbeidslisten (f.eks. fra 0620.xlsx) til venstre på skjermen. Klikk eksempelkoden i arbeidslisten, og høyreklikk på den tilsvarende posisjonen til platen for å koble testene til hver posisjon.

5. Massespektrometerdrift

  1. Bruk programmet til å koble massespektrometeret (se materialtabellen) til prøvebrikken (fra avsnitt 3) som skal analyseres.
  2. Klikk på standardinnstillingen. I dialogboksen skriver du inn et filnavn fra trinn 4.3 (for eksempel CTT20210620); i eksperimentnavnet skriver du inn chip-IDen i chipstrekkoden og lagrer innstillingene.
  3. Start massespektrometerkontrollprogrammet (se materialtabellen).
  4. Trykk på inn/ut-knappen på massespektrometeret og la aggregatet strekke seg. Ta ut sponholderen og sett prøvebrikken fra trinn 3.4 inn i sponholderen. Plasser den lastede sponholderen på det forlengede decket og trykk på Inn/Ut-knappen for prøvebrikken for å komme inn i instrumentet.
  5. Dobbeltklikk Hent -ikonet for programmet. I Acquire-vinduet klikker du på fanen automatisk kjøring for å starte instrumentet og skaffe massespektra fra prøvene på brikken.

6. Vise massespektra og analysere dataene

  1. Kjør dataanalyseprogrammet (se Materialfortegnelser).
  2. Bla gjennom databasetreet, og velg brikke-IDen fra trinn 5.2. Klikk for å markere et mål godt på brikken, og klikk på spektrumikonet for å vise massespekteret.
  3. Høyreklikk for å velge Tilpassingsdialogboks for å beskjære et bestemt spekterområde i et nytt vindu. Klikk på X-aksen for å skrive inn de øvre og nedre grensene for m / z, og trykk OK for å vise det angitte rekkeviddespekteret, inkludert signalene av interesse.
    MERK: Mengden DNA er proporsjonal med toppintensiteten ved hver m/z-verdienhet.
  4. Mål topphøyden på signalenes m/z-verdier som tilsvarer U-substratet, AP-produktet og malen. Klikk på toppen og se topphøyden øverst til venstre på skjermen.
    MERK: Et spektrum på 1600 bredde/1200-enhet er en rimelig dimensjon for inspeksjon på en dataskjerm så vel som for registrering.
  5. Hvis du vil lagre spekteret for postføring, høyreklikker du Eksporter og velger JPEG-filtype i rullegardinlisten. Klikk på Destinasjon og Bla gjennom plate for å velge lagringsenheten i rullegardinlisten (f.eks. flash-plate E:). Skriv inn filnavnet (for eksempel 0620_1-2.jpg), og klikk Eksporter.
  6. Skriv om nødvendig ut en eksportert JPEG-fil og mål topphøyden manuelt ved hjelp av en linjal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Maler og underlag
Ved å ta syntetiske oligonukleotider med U i midten (U+9) sammen med en G-mal som eksempel (figur 1A), kan en blank kontroll av likevektsmengder av mal og uracilholdig substrat brukes til kvalitetskontroll av syntetisk oligonukleotidrenhet (figur 1B; signalene samsvarer med den angitte m/z og den lave bakgrunnsstøyen). For MS-dataanalysen ble topphøydene målt (figur 2). 19 nt mal DNA var forventet å forbli uendret etter glykosylase hydrolyse; Signalet kan derfor fungere som en referanse for kvantiteten av AP-produktet (figur 1C).

Reaksjonstilstand og massespektra
Denne DNA glykosylaseanalysen er enkel og enkel å utføre ved hjelp av et ikke-merket oligonukleotid for en standardreaksjon for å oppnå rene og pålitelige resultater (figur 1). Utvalget av MS-spektra skal dekke alle signalene som genereres fra substrater, maler og reaksjonsprodukter (figur 1B). Forskjellen på 1 nt mellom substratet og den tilsvarende malen ga en godt separert signalprofil for både malen og substratet (figur 1B). Equimolar primers U +9 og T1 viste lignende toppintensiteter uten betydelige forskjeller. Omfattende fordøyelse av UDG (0,5 enheter for en 30 min reaksjon) demonstrerte fullstendig uracil spalting. Signalet til AP-produktet ble også godt skilt fra det uracilholdige substratet (figur 1C d+9 AP-produkt m/z = 5447,6 versus figur 1B U+9 substrat m/z = 5541,6). Den relativt milde MALDI-iioniseringsteknikken36 som ble brukt i denne studien, minimerte signalene forbundet med strandbrudd forårsaket av β-elimineringsreaksjon på AP-anlegg37, som ikke var signifikante i massespektraet. Totalt sett er reaksjonsbakgrunnen veldig ren uten merkbar støy (figur 1C).

Under likevektsforhold var den relative signalintensiteten til AP-produktet sammenlignbar med den for U-substratet ved hjelp av T1-malen som referanse (figur 1B, U+9/T1 versus d+9/T1). Beregningen av UDG-aktivitet er derfor basert på den nøyaktige inngangen til det U-inneholdende substratet (50 pmol eller 20 pmol) i henhold til Eq (1).

UDG-aktivitet = (signal for AP-produkt) / (Signal of U substrat + signal of AP-product) × [U] (1)

UDG kinetiske parametere bestemt av MALDI-TOF MS-analyse
Som vist i figur 2, gjennom hele 3 min-reaksjonen, viste UDG-reaksjoner fra 0,01 enheter til 0,1 enheter både dose- og tidsavhengighet. En konsentrasjon på 3,2 pM (0,1 enheter per 100 μL-reaksjon) ble brukt til bestemmelse av kinetiske parametere, Km og kcat, for et G:U-substrat (tabell 1). Aliquots av UDG-reaksjonen ble fjernet og slukket i 30 s og 60 s. Kinetiske data ble innhentet under forhold da det uracilholdige substratet var mindre enn 50% fordøyd, og fem substratkonsentrasjoner fra 10 til 200 nM ble utsatt for analyse. Tidsforløpet for presteady-state viste utmerket linearitet for hastighetsanalyse. Et eksempel på en reaksjonshastighetsplott er vist i figur 3A, der de relative MS-signalintensitetene til produktet og substratet omdannes til konsentrasjon (nM). UDG-reaksjonsraten (v) presenteres som nM for AP-nettstedet produsert per sekund. Km og Vmax ble beregnet fra en Lineweaver-Burk-tomt (figur 3B). De kinetiske UDG-parametrene avledet fra MALDI-TOF MS-analysen ble dermed fastslått å være Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1, og Kcat = 9,31 s-1. Verdiene kan sammenlignes med resultatene fra tidligere 3H-uracil-frigjøringsanalyser der Km = 40 nM og Kcat = 13,3 s-138. 

G:U+9-dupleksen ble utsatt for UDG-sensitivitetsanalyser. Enheten målt ved MALDI-TOF MS-analyse ble plottet mot produsentens definerte enhet ved hjelp av en konvensjonell 3H-uracil-utgivelsesmetode38. Som vist i figur 3C var den MS-målte enheten IALDI-TOF proporsjonal med den definerte enheten fra 0,001 enheter til 0,02 enheter med korrelasjonsligningen y = 0,933x + 0,0003 og bestemmelseskoeffisienten R2 = 0,9974. Deteksjonsgrensen er 0,001 enheter som variasjonskoeffisient = 9,2%, ~ 5 ganger signal-til-støy-forholdet. Dermed gir denne MALDI-TOF MS-analysen tilstrekkelig følsomhet da UDG for det meste brukes på enhetsnivå39.

Substrat spesifisitet av UDG
En av de karakteristiske egenskapene til denne UDG MALDI-TOF MS-analysen er at den er etikettfri, noe som gir høy allsidighet for substratdesign. Denne funksjonen er veldig nyttig for å analysere substratspesifikk UDG. Som vist i tabell 1, kan uracil settes inn hvor som helst i nærheten av 5' eller 3' enden av enkeltstrenget eller dobbeltstrenget DNA for en spesifisitetsanalyse. For substratspesifikk er det velkjent at UDG er svært aktiv i å fjerne uracil fra enkeltstrenget DNA38. Faktisk, som vist i tabell 1, ble uracil-eksisjonen fra det enstrengede substratet (ssU) redusert 3,7 ganger når det ble annealert til den komplementære DNA-strengen, og dannet G:U-dupleks. For den ofte brukte A:U-dupleksen6,7,8 ble reaksjonsraten ytterligere senket med nesten 10 ganger i forhold til ssU. UDG handlet ikke på U ved DNA-endestasjonen (tabell 1-substrater av G:U+1, G:U-1 og G:U-2), som er i samsvar med tidligere studier40,41. Interessant nok viste U i andre og tredje posisjon fra 5'-terminus en høyere UDG katalytisk hastighet enn U i midten med 2-fold og 1,5 ganger, (tabell 1, G:U+2 og G:U+3 versus G:U). UDG utskilte U 3-nt fra 3'-enden med 8 % mindre aktivitet enn U i midten (tabell 1, G:U-3 mot G:U).

Uracil glykosylasehemmerinhibering av UDG-reaksjonen
Uracil glykosylasehemmer (UGI) er et bakteriofageprotein, som hemmer E. coli UDG ved reversibel proteinbinding med et stoichiometri på 1:142. Hemming av UDG-aktivitet ved UGI er vist i figur 4. I nærvær av 0,05 enheter (100 pM) UGI ble aktiviteten til 0,05 enheter av UDG (8 pM) hemmet til et uoppdagelig nivå. IC50 var 7,6 pM. Dermed kan UDG MALDI-TOF MS-analysen enkelt endres til en massescreeningsanalyse for oppdagelsen av hemmere av andre DNA-glykosylaser.

Figure 1
Figur 1: Modellsystem for en DNA-glykosylaseanalyse. (A) Lesjonsstreng som inneholder en enkelt uridin (U+9) ble annealert til en mal (T1), og dannet en G:U-u-uoverensstemmelse (fet). Uracil-DNA glykosylase oppdager og fjerner uracil, og danner et AP-nettsted (d). Når den utsettes for MALDI-TOF MS, kan forskjellen i m/z-verdier mellom U-inneholdende DNA- og AP-produkter løses som vist i B. (B) Et 18 nt DNA som inneholder en enkelt uridin (U+9) glødet til en 19 nt mal (T1) (tabell 1) ble testet som et enzym blankt på 50 pmol av substrat i 40 μL reaksjonsbuffer og utsatt for MS-analyse. (C) En nesten fullstendig enzym fordøyelse av 50 pmol av substrat i en 10 μL reaksjon ved hjelp av 0,5 enheter av UDG ved 37 °C i 30 min. (D) En 18 nt DNA som inneholder en enkelt uridine (U +3) annealed til T1 enzym blank av 50 pmol substrat i 40 μL reaksjon buffer ble utsatt for MS analyse. (E) En nesten fullstendig enzym fordøyelse av 50 pmol av U +3 substrat i en 10 μL reaksjon ved hjelp av 0,5 enheter av UDG ved 37 °C i 30 minutter for å produsere d +3 og utsatt for MS-analyse innen 30 timer. (F) Reaksjonstilstanden var den samme som i E , bortsett fra at d+3-produktet var i 0,1 M NaOH ved 95 °C i 30 minutter for å utløse en beta-eliminasjonsreaksjon som produserte B15 fragmentert produkt og utsatt for MS-analyse. (G) Reaksjonstilstanden var den samme som i E , bortsett fra at d+3-produktet ble lagret ved -20 °C i mer enn 7 dager; en brøkdel av d+3 konvertert til B15 fragmenterte produkter. Denne figuren er endret fra 43. Forkortelser: nt = nukleotid; MS = massespektrometri; MALDI-TOF MS = Matriseassistert laseravledning/iioniseringstid for flyvningen MS; AP = apurinic/apyrimidinic; UDG = Uracil-DNA glykosylase; T1 = 19 nt G-inneholdende mal; U+9 = 18 nt U-inneholdende substrat; d+9 = 18 nt AP stedsholdig produkt; U+3 = 18 nt U-inneholdende substrat; d+3 = 18 nt AP områdeholdig produkt; B15 = 15 nt beta-eliminering fragmentert produkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Tidskursanalyse for UDG-aktivitet ved ulike enzymkonsentrasjoner. Substrat-DNA, 50 pmol, som inneholder en G:U-lesjon, ble inkubert med 0,01, 0,02, 0,05 og 0,1 enheter av UDG ved 37 °C. Aliquots (10 μL) ble tatt fra reaksjonsblandingen ved 0, 0,5, 1, 2 og 3 min og slukket med et likt volum fenol / kloroform. (A) MALDI-TOF massespektra som illustrerer konsentrasjonsavhengigheten av behandling av G:U-substrater av UDG. (B) Mengden produkt ble plottet som en funksjon av tid. UDG: 0,01 (lukkede trekanter med heltrukket linje), 0,02 (åpen trekant med stiplet linje), 0,05 (lukket sirkel med heltrukket linje) og 0,1 enheter (åpne sirkler med heltrukket linje). Dataene er gjennomsnittet av tre uavhengige bestemmelser, og feilfeltene representerer 1 S.D. Denne figuren er endret fra 43. Forkortelser: nt = nukleotid; MALDIV-TOF = Matriseassistert laseravledning/iioniseringstid for flyvning; AP = apurinic/apyrimidinic; UDG = Uracil-DNA glykosylase; T = 19 nt G-inneholdende mal; U = 18 nt U-inneholdende substrat; AP = 18 nt AP nettstedholdig produkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse av kinetiske parametere for UDG ved bruk av MALDI-TOF-analyse. Michaelis-Menten kurve og Lineweaver-Burk tomter for å bestemme Km og kcat for UDG enzym-katalysert eksisjon av Uracil fra DNA. DNA glykosylase MALDI-TOF MS-analyse ble utført ved hjelp av 0,1 enheter av UDG og forskjellige konsentrasjoner (10, 30, 60, 100, 200 nM) substrater i 100 μL reaksjon for 30 s og 60 s. (A) Michaelis-Menten kurve generert fra tre uavhengige eksperimenter. Feilfeltene representerer 1 SD. (B) Lineweaver-Burk-plott for analysen. de angitte avskjæringene tillater beregning Km og Vmax. (C) UDG-analyse ved MALDI-TOF MS-analyse sammenlignet med den produsenttilordnede enheten. Enzymaktivitet ble målt ved uracilfjerning som dannet AP-anlegg i en 10 μL-reaksjon som inneholdt 50 pmol (0,56 μg) av G:U innen en 18/19 nt DNA-dupleks i 30 minutter ved 37 °C. UDG ble fortynnet med buffer [50% glyserol, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] på is. En enhet ble definert som mengden enzym som katalyserte frigjøringen av 60 pmol av uracil per minutt. Feilfelt viser standardavviket for seks eksperimenter. Denne figuren er endret fra 43. Forkortelser: nt = nukleotid; MALDIV-TOF = Matriseassistert laseravledning/iioniseringstid for flyvning; UDG = Uracil-DNA glykosylase; AP = apurinic/apyrimidinic; V, reaksjonshastighet nM/s. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: UDG-enzymhemmingskurve ved tilsetning av UGI. Hemmingskurven ble bestemt ved hjelp av reaksjoner på 20 μL med 0,05 enheter UDG (8 pM) og 50 pmol substrat i 15 minutter i nærvær av UGI fra 0,001 enheter (5 pM) til 0,1 enheter (200 pM). Data er gjennomsnittet av tre uavhengige bestemmelser, og feilfeltene representerer 1 S.D. Data som passer med en online IC50-kalkulator (se materialtabellen). Denne figuren er endret fra 43. Forkortelser: UDG = Uracil-DNA glykosylase; UGI = uracil glykosylasehemmer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-substrater Oligonukleotidera DNA-sekvensb Innledende prisc k katt
(pmol/sek) (s-1)
ssU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0,560 ± 0,098 35
ssU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0,756 ± 0,083 47.3
ssU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0,448 ± 0,087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.149 ± 0.046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
A:U T2 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0,053 ± 0,018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G:U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0,256 ± 0,044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0,567 ± 0,016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+1 T4 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDD ND
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0.138 ± 0.015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' ND ND
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' ND ND
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

Tabell 1: Substratsammensetninger og UDG-spesifisiteter. Denne tabellen viser 18 nt U-inneholdende DNA utpekt av U±N. '+' indikerer telling av uracil-posisjonen fra 5'-terminus, og '-' indikerer telling av uracil-posisjonen fra 3' terminus. U+9 er for eksempel den 9. posisjonen fra 5' terminus, U-3 er den tredje posisjonen fra 3' terminus. Den komplementære 19 nt-malen til T1 til T7 vil være forbundet med U-inneholdende DNA-forming G:U- eller A:U-u-ukonflikter som angitt. Uracil baser er i fet skrift. Reaksjonene brukte 50 pmol av U-substrater, 0,05 enheter av UDG, i 10 μL som beskrevet i protokoll pkt. 2. Denne tabellen er endret fra 43. Forkortelser: UDG = uracil DNA glykosylase; nt = nukleotid; ND, kan ikke påvises.

Andre PCRP 1. PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_ RING EXT1_ MESSE
NA NA NA NA NA NA NA F 5789.8 GCCAACGTCCGGACTGGTC
NA NA NA NA NA NA NA F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

Tabell 2: FIL I.xlsx fil. Innstillingene ble brukt for figur 1B, C og figur 2A. 0 min oppføringer. MALDI-TOF MS-systemet som brukes i denne studien ble designet spesielt for å analysere polymorfisme med ett enkelt nukleotid av den utvidede primeren i området forsterket gensekvensvariasjon. For UDG-analyse ble det bare brukt seks felt ved klargjøring av analysegruppen FILE I. Forkortelser: WELL = brønnnummeret som er tilordnet analysen; TERM = avslutningsblanding; SNP_ID = navnet på inngangssekvensen til den enkle nukleotidpolymorfismen; 2nd-PCRP = fremover amplicon primer; 1st-PCRP = omvendt amplicon primer; AMP_LEN = amplikon lengde; UP_CONF = uniplex forsterkning score; MP_CONF = multipleksforsterkningspoeng; Tm = smeltetemperatur; PcGC = prosent GC-innhold; PWARN = advarselskoder for analyseutforming; UEP_DIR = retning av primer forlengelse; UEP_MASS = unextended-primer masse; UEP_SEQ = uutforsket primersekvens; EXT1_CALL = navn gitt til analytten 1 masse topp; EXT1_MASS = masse analytt 1.

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

Tabell 3: 0620.xlsx fil. Disse innstillingene ble brukt for UGI-hemmingsreaksjonene i figur 4A. Forkortelse: UGI = uracil glykosylasehemmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette dokumentet gir en detaljert prosedyre for bruk av en UDG MALDI-TOF MS analysemetode for å direkte oppdage AP-inneholdende DNA-produkter. De viktigste fordelene med denne metoden er at uracilholdige substrater er etikettfrie, skalerbare, enkle å jobbe med og har større fleksibilitet i substratdesign.

Den UDG leverandør-anbefalte fenol / kloroform ekstraksjon muliggjør inaktivering av enzymet for å forhindre nedbrytning av produktet DNA. Fenolutvinningsprotokollen innebærer imidlertid kjedelig faseseparasjon av farlige kjemikalier. En alternativ syreavslutningsmetode som bruker HCl for å senke reaksjonen pH til 2 ± 0,5 også effektivt inaktivert UDG. Etterfølgende nøytralisering med Tris base kan forhindre DNA-skade. Da AP-produktet ble utsatt for MS-analyse innen 30 timer, var det ingen tegn til grunntap eller modifikasjon i massespektraet (figur 1E). Tris-bufferen i reaksjonene ble forsynt med den kommersielle UDG. Imidlertid kan ulike aminer, inkludert Tris, insise AP-nettsteder via beta-eliminering, om enn ved høye reagenskonsentrasjoner44. Noen alternativer, for eksempel HEPES og fosfatbuffer, kan vurderes for å unngå risikoen for spalting av AP-nettstedet ved beta-eliminering.

Som en potensiell UDG-referansemetode anbefales en dupleks av sentrert G:U-substrat (tabell 1, T1/U+9) som standard substrat av følgende årsaker: 1. Av fysiologisk relevans er G:U overlegen A:U som deaminering av cytosin i G:C-par resulterer i G:U-lesjoner. 2. Mens E. coli UDG viser høyere spesifisitet for å hydrolysere U fra enkeltstrenget DNA, er reparasjon av en U-lesjon i enkeltstrenget DNA uvanlig. 3. For alle G:U-substratet som ble testet, viste G:U+2 og G:U+3 høyere reaksjonshastigheter enn G:U+9. Imidlertid er en DNA-deamineringslesjon ved siden av en strandbrudd uvanlig. For å etterligne innfødte lesjoner, ville det være mer hensiktsmessig å plassere en G:U i sentrum av DNA-dupleksen.

Interessant nok genererte MALDI-TOF MS-metoden UDG kinetiske parametere, og enzymenhetene til G:U-reaksjonen (figur 3A-C) var svært lik konvensjonelt avledede resultater ved hjelp av 3H-uracil38. Imidlertid er det enkle G:U-substratet i denne studien svært forskjellig fra PBS1 bakteriofage DNA som tidligere er beskrevet med flere A:U fra DNA-syntesefeil38. Videre viste UDG 3 ganger høyere aktivitet med G:U enn med A:U-substratet (tabell 1, Km og Kcat av G:U versus A:U). Dette tilsynelatende motstridende resultatet kan tilskrives DNA-sekvensen av PBS1-substrat som inneholder 36% av U i form av flere A:U-lesjoner45 sammenlignet med bare 3% av U i G: U-substrat (tabell 1). I mellomtiden er UDG et veldig "prosesjonsmessig" enzym, det vil si at en enkelt protein-DNA-bindingshendelse fremkaller flere uracil-spaltinger12. Å finne en nesten perfekt en-til-en-korrelasjon mellom disse to UDG-metodene gjør denne MS-metoden til et attraktivt alternativ i stedet for den tradisjonelle radioisotopanalysen.

Denne tilnærmingen er lett skalerbar. Alle UDG-reaksjoner i denne studien ble utført manuelt ved hjelp av mikropipetter og mikrocentrifugerør, med ~ 30 tester utført på en gitt dag. Dermed ble mindre enn en tiendedel av kapasiteten til 384-brønns plateformatbrikkematrisen for MALDI-TOF MS-systemet (se materialtabellen) beskrevet i avsnitt 3-5 brukt. Tilpasningen av et automatisert pipetteringssystem for en mikroplate på 384 brønner kan derimot lett øke den daglige produksjonen av denne tilnærmingen ved å bruke syreavslutningsmetoden. Dermed ville 300 UDG-reaksjoner ta ~ 1 time. MALDI-TOF MS-systemet (se materialtabellen) kan sende massespektradata for opptil 300 reaksjoner i 1 time. Derfor vil en strømlinjeformet prosess kreve 2 timer for å fullføre 300 UDG MALDI-TOF MS-analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) og NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av Vitenskaps- og teknologidepartementet, Taiwan, R.O.C. [tilskuddsnummer MOST109-2314-B-002 -186 til K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 til S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 til W.-h.F.]. H.-L.C. er mottaker av et doktorgradsstipend fra National Taiwan University. Støtte til åpen tilgang: Vitenskaps- og teknologidepartementet, R.O.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Biokjemi Utgave 182 Base eksisjonsreparasjon MALDI-TOF massespektrometri Uracil-DNA glykosylase apurinic / apyrimidinisk sted glykosylasehemmer
Uracil-DNA Glykosylaseanalyse ved matriseassistert laserdesorpsjon/ioniseringstid for massespektrometrianalyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. … More

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. D., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Chang, S. Y., Fang, W. h. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter