Summary
Se desarrolló un método no radioisotópico no marcado para evaluar la actividad de la uracilo-ADN glicosilasa utilizando la espectrometría de masas MALDI-TOF para el análisis directo de productos que contienen sitios apurínicos/apirimidínicos. El ensayo demostró ser bastante simple, específico, rápido y fácil de usar para la medición de la GLICosilasa de ADN.
Abstract
La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) es un componente clave en la vía de reparación de la escisión de base para la corrección del uracilo formado por la desaminación hidrolítica de la citosina. Por lo tanto, es crucial para el mantenimiento de la integridad del genoma. Se desarrolló un método altamente específico, no etiquetado, no radioisotópico para medir la actividad de UDG. Un dúplex de ADN sintético que contenía un uracilo específico del sitio fue escindido por UDG y luego sometido a un análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistido por láser / ionización asistido por matrix (MALDI-TOF MS). Se estableció un protocolo para preservar el producto del sitio apurínico/apirimidínico (AP) en el ADN sin rotura de hebra. El cambio en el valor m/z del sustrato al producto se utilizó para evaluar la hidrólisis de uracilo por UDG. Se utilizó un sustrato G:U para el análisis cinético UDG que arrojó el Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s y Kcat = 9.31 s-1. La aplicación de este método a un ensayo de inhibidor de la uraciloglicosasa (UGI) arrojó un valor de IC50 de 7,6 pM. La especificidad de UDG utilizando uracilo en varias posiciones dentro de sustratos de ADN de cadena simple y doble cadena demostró diferentes eficiencias de escisión. Por lo tanto, este método SIMPLE, rápido y versátil MALDI-TOF MS podría ser un excelente método de referencia para varias glucosilasas de ADN monofuncionales. También tiene el potencial como una herramienta para la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.
Introduction
Aunque el uracilo es una base normal en el ARN, es una lesión común y altamente mutagénica en el ADN genómico. El uracilo puede surgir de la desaminación hidrolítica espontánea/enzimática de una desoxicitidina. En cada célula viva, esta desaminación ocurre 100-500 veces al día en condiciones fisiológicas1,2. Si estas alteraciones no se reparan, puede haber un cambio en la composición de la secuencia de ADN, causando mutación. Como el uracilo en el ADN prefiere emparejarse con dATP durante la replicación, si la citosina se desamina a uracilo, en dos eventos de replicación, habrá una nueva mutación de transición de G:C a A:T en la mitad de la progenie DNA3.
Entre las estrategias celulares para mantener la estabilidad genética, la reparación por escisión de bases (BER) es un mecanismo esencial que repara las bases dañadas, como el uracilo, en el ADN4. BER es un proceso altamente conservado evolutivamente. Existen dos vías generales de BER: la vía de parche corto que conduce a un tracto de reparación de un solo nucleótido y la vía de parche largo que produce un tracto de reparación de al menos dos nucleótidos5. BER es un mecanismo coordinado que se produce en varios pasos. El primer paso en BER es la hidrólisis enzimática de la base de nucleótidos dañada por una GLICosilasa de ADN específica del daño para generar un sitio intermedio apurínico/apirimidínico (AP)6. Esto es seguido por la escisión de la columna vertebral de azúcar-fosfato en el sitio AP por una endonucleasa, la limpieza de los extremos del ADN por una liasa, el llenado de huecos por una ADN polimerasa y el sellado del corte final por una ligasa5.
La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) hidroliza el uracilo del ADN que contiene uracilo para BER en Escherichia coli. Los ensayos convencionales de UDG que utilizan ADN radiomarcado que involucran diferentes técnicas de separación6,7,8,9,10,11,12,13 suelen requerir mucho tiempo, mano de obra, con costosos reactivos de etiquetado, procedimientos complicados y que requieren capacitación y práctica intensivas para reducir los riesgos de exposición a materiales radiactivos. Se han desarrollado ensayos fluorométricos de oligonucleótidos como sustituto del etiquetado de radioisótopos14, además de balizas moleculares y tecnología de transferencia de energía de resonancia de Förster15,16,17,18,19,20. Sin embargo, se requiere un etiquetado específico para todos los métodos antes mencionados. Recientemente se han desarrollado ensayos de biosensores libres de etiquetas21,22,23 y métodos colorimétricos basados en la formación de un G-quadruplex24,25,26. Sin embargo, múltiples pares A:U o secuencias especialmente diseñadas en las sondas complican la definición de la unidad enzimática.
MALDI-TOF MS es una tecnología que podría ser de gran utilidad en el análisis de ADN. Las aplicaciones desarrolladas incluyen el genotipado de polimorfismo de un solo nucleótido27,28, el análisis de nucleótidos modificados29 y la identificación intermedia de reparación de ADN30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS debe adoptarse fácilmente para el análisis de glicosilasa de ADN para detectar productos de ADN que contienen sitios AP. Sin embargo, los sitios AP en el ADN son propensos a la rotura de hebras bajo muchas condiciones experimentales33. Aquí se presenta un ensayo UDG utilizando MALDI-TOF MS para medir directamente la producción del sitio AP sin un ruido significativo de rotura de hebras. Este método sin etiqueta es fácil de trabajar y tiene un alto potencial para la aplicación farmacéutica de la detección de inhibidores de la GLUCosilasa de ADN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de sustrato/plantilla
- Diseñe sustrato de uracilo / dúplex de plantilla con un contenido equilibrado de G + C de ~ 50 ± 10% y una temperatura de fusión mínima de 50 ° C para la región dúplex.
NOTA: Una diferencia de nucleótidos entre sustratos de 18 nt y plantillas de 19 nt (Tabla 1 y Figura 1) ayuda a una mejor interpretación de la señal de EM y al recocido apropiado. La hebra de plantilla sirve como ADN complementario para generar desajustes A-U o G-U (Tabla 1), pero también se puede utilizar como señal de referencia en las mediciones de EM. El uso de oligonucleótidos sintéticos purificados con HPLC es satisfactorio para este estudio. - Disolver el ADN en 1 mM EDTA y 10 mM Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) (TE) a una concentración de 100 μmol/L como caldo y almacenar a -20 °C. Diluir esta cepa de 20 μL con TE a un volumen final de 800 μL (dilución de 25 veces a 4 μmol/L). Mida la absorbancia de la solución de ADN en un espectrofotómetro UV-visible a λ = 260 nm para garantizar la concentración asignada por el fabricante. Por ejemplo: A260 = 0,204 para 4 μmol/L de U+9 y A260 = 0,192 para 4 μmol/L de T1 (Tabla 1).
- Realizar el análisis MALDI-TOF MS (secciones 4-6) para el control de calidad de oligonucleótidos inspeccionando señales pico únicas a valores m/z designados, así como comprobando que la relación señal-ruido sea >100 (Figura 1B y Figura 1D).
2. Ensayo de ADN glicosilasa
- Usando un sustrato G:U de dúplex T1/U+9 (Tabla 1 y Figura 1A) para la reacción de la glicosilasa, por ejemplo, en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL, agregue 70 μL de H2O, 10 μL de tampón de reacción 10x UDG, 5 μL de stock T1 y 5 μL de stock U+9 (paso 1.2.).
NOTA: Elija el tipo correcto de micropipeta y siga las instrucciones del fabricante para manejar el volumen requerido. Por ejemplo, use una pipeta de 2 μL para dispensar 0.1-2 μL de líquido, use una pipeta de 10 μL para dispensar 2-10 μL de líquido y use una pipeta de 100 μL para dispensar 20-100 μL de líquido para garantizar la exactitud y precisión de los resultados. El volumen descrito de la mezcla de reactivos es para 10 ensayos; ajustar el volumen para el número deseado de reacciones. El tampón de reacción 1x UDG contiene 1 mM EDTA, 1 mM de ditiotreitol y 20 mM de Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C). Consulte la Tabla de materiales para la fuente del tampón de reacción UDG 10x. - Cierre el tubo de forma segura; incubar en un baño de agua durante 30 min a 65 °C, luego durante 30 min a 37 °C, y finalmente en hielo durante 3 min para asegurar el recocido adecuado del sustrato/plantilla dúplex.
- En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, agregue 49 μL de tampón de reacción UDG helado 1x y 1 μL de UDG (5,000 unidades / ml; consulte la Tabla de materiales), diluyendo a 0.1 unidades / μL. Haga diluciones en serie con 1 tampón UDG a las concentraciones enzimáticas deseadas de 0.05, 0.02 o 0.01 unidades / μL. Siempre mantenga el UDG diluido en hielo.
NOTA: En una reacción de 10 μL, 0,1 unidades de UDG pueden escindir más de 30 pmol de uracilo de un dúplex T1/U+9 en 3 min. - En un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml, agregue 9,0 μL de mezcla de sustrato del paso 2.2 y precaliente el tubo a 37 °C. Añadir 1,0 μL del UDG diluido a partir del paso 2.3. Use un temporizador para cronometrar la reacción y mueva el tubo para mezclar el contenido.
NOTA: Para un ensayo de definición de unidad, el tiempo de incubación es de 30 min. Para un ensayo cinético, utilice un análisis de curso de tiempo de 0.5, 1, 2, 3, 5 min para obtener la tasa inicial. Para un ensayo de inhibición de UGI, cronometre la reacción durante 15 min. - Centrifugar los tubos con la mezcla de reacción durante 3-5 s a 3.200 × g a temperatura ambiente. Luego, transfiera la reacción inmediatamente a 37 ° C.
- Terminación de la reacción
- Preparar soluciones de 0,25 M HCl y 0,23 M de base Tris. En un tubo de ensayo de 15 ml, agregue 10 ml de una solución de 1 mM de EDTA y 20 mM de Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) para imitar 1x tampón de reacción UDG. Acidifique con 1 ml de HCl de 0,25 M y verifique con un medidor de pH para asegurarse de que el pH sea de ~ 2 ± 0.5. Neutralice con 1 mL de base Tris de 0,23 M y compruebe con un medidor de pH un pH final de 6,5 ± 0,5.
NOTA: El uso de tiras reactivas de pH es una forma rápida y fácil de reconfirmar los niveles de pH de la mezcla de reactivos. - Añadir 1 μL de 0,25 M HCl para acidificar la mezcla de reacción de 10 μL para inactivar la enzima y colocarla en hielo durante 6 min. Agregue 1 μL de base Tris de 0,23 M para neutralizar los productos de ADN y evitar la rotura del sitio AP por exposición prolongada al ácido. Agregue 13 μL TE para aumentar el volumen de la mezcla de productos para la transferencia de virutas de matriz y luego colóquelo en hielo.
NOTA: El producto AP es químicamente inestable y debe ser analizado por MALDI-TOF MS dentro de los 2 días. Después de un almacenamiento prolongado durante más de una semana, la acumulación de una parte sustancial de las roturas de hebras se produce debido a las reacciones de eliminación de β/δ de los productos AP (Figura 1D-G).
- Preparar soluciones de 0,25 M HCl y 0,23 M de base Tris. En un tubo de ensayo de 15 ml, agregue 10 ml de una solución de 1 mM de EDTA y 20 mM de Tris-HCl (pH 8.0 a 25 °C) para imitar 1x tampón de reacción UDG. Acidifique con 1 ml de HCl de 0,25 M y verifique con un medidor de pH para asegurarse de que el pH sea de ~ 2 ± 0.5. Neutralice con 1 mL de base Tris de 0,23 M y compruebe con un medidor de pH un pH final de 6,5 ± 0,5.
- Transfiera todos los productos de reacción UDG de 25 μL de los tubos de microcentrífuga a una placa de microtitulación de 384 pocillos.
NOTA: Las altas concentraciones de cationes, como el sodio o el potasio en tampones, generan interferencias en el análisis MALDI-TOF MS y, por lo tanto, requieren desalinización. Como el tampón de reacción UDG de E. coli contiene concentraciones muy bajas de cationes, no es necesario desalinizar. Sin embargo, modifique este protocolo para medir otras reacciones de LA ADN glicosilasa que contengan cationes metálicos que requieran desalinización como se describió anteriormente35.
3. Transfiera productos de reacción UDG a un chip de matriz
- Abra la puerta del dispensador de nanolitros (consulte la Tabla de materiales) y cargue la placa de microtitulación de 384 pocillos del paso 2.7 en el soporte de la placa de la cubierta.
- Inserte la matriz de chips en la posición correspondiente de la placa exploradora. Coloque la placa de exploración cargada en la plataforma de procesamiento del dispensador de nanolitros y cierre la puerta.
- Toque el botón de ejecución en la pantalla de transferencia y espere a que el instrumento comience a dispensar muestras desde la placa de microtitulación de 384 pocillos al chip de matriz.
- Utilice la opción de la pestaña Visión para mostrar la imagen del chip y los volúmenes de dispensación para cada punto durante la dispensación. Asegúrese de que el volumen manchado en el chip esté en el rango de 5-10 nL.
4. Configure los parámetros de ensayo en el espectrómetro de masas
- Utilice el programa de aplicación (consulte la Tabla de materiales) para preparar un archivo .xlsx que contenga el valor de señal previsto m/z para la importación.
NOTA: La configuración del ARCHIVO I.xlsx (Tabla 2) es una configuración de ejemplo para el ensayo UDG del sustrato G:U de la sección 2. - Utilice el programa de aplicación para crear y definir un nuevo ensayo UDG haciendo clic con el botón derecho en la opción Importar grupo de ensayo en formato de diseñador y seleccionando el archivo .xlsx de la lista desplegable (por ejemplo, ARCHIVO I.xlsx del paso 4.1).
- Haga clic con el botón derecho en el botón Cliente:Proyecto:Placa y haga clic en la parte superior del árbol de opciones desplegable para establecer una nueva placa de ensayo. En el cuadro de diálogo, escriba un nombre de archivo (por ejemplo, CTT20210620 para el código de laboratorio y la fecha de ensayo) y, en el menú desplegable Tipo de placa , seleccione el tipo de placa de 384 pocillos y presione OK. Busque una placa en blanco para que aparezca a la derecha de la pantalla.
- Haga clic en la opción Ensayo ; seleccione el ensayo (por ejemplo, ARCHIVO I.xlsx) en la lista desplegable.
- Para asignar el ensayo seleccionado (por ejemplo, ARCHIVO I.xlsx) a cada posición del punto de muestra en la placa, mueva el cursor a cada posición de la placa en blanco, haga clic para resaltar el pozo y haga clic con el botón derecho para seleccionar Agregar Plex.
- Utilice una computadora de escritorio o portátil para preparar una lista de trabajo en formato .xlsx sin encabezado (por ejemplo, 0620.xlsx de la Tabla 3) para todas las muestras en el chip del paso 2.7. Haga clic en el botón Agregar nuevo proyecto de ejemplo; seleccione el archivo (por ejemplo, 0620.xlsx) en la lista desplegable para importar la lista de trabajo.
- Busque todos los códigos de muestra de prueba en la lista de trabajo (por ejemplo, de 0620.xlsx) a la izquierda de la pantalla. Haga clic en el código de ejemplo en la lista de trabajo y haga clic con el botón derecho en la posición correspondiente de la placa para vincular las pruebas a cada posición.
5. Funcionamiento del espectrómetro de masas
- Utilice el programa de aplicación para vincular el espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales) al chip de muestra (de la sección 3) que se va a analizar.
- Haga clic en la configuración predeterminada. En el cuadro de diálogo, escriba un nombre de archivo del paso 4.3 (por ejemplo, CTT20210620); en el Nombre del experimento, escriba el ID del chip en el código de barras del chip y guarde la configuración.
- Inicie el programa de control del espectrómetro de masas (consulte la Tabla de materiales).
- Presione el botón de entrada / salida del espectrómetro de masas y deje que la cubierta se extienda. Saque el soporte del chip e inserte el chip de muestra del paso 3.4 en el soporte del chip. Coloque el soporte de chip cargado en la cubierta extendida y presione el botón de entrada / salida para que el chip de muestra ingrese al instrumento.
- Haga doble clic en el icono Adquirir del programa de aplicación. En la ventana Adquirir , haga clic en la pestaña de ejecución automática para iniciar el instrumento y adquirir espectros de masas de las muestras del chip.
6. Visualización de espectros de masas y análisis de los datos
- Ejecute el programa de análisis de datos (consulte la Tabla de materiales).
- Explore el árbol de la base de datos y seleccione el ID del chip en el paso 5.2. Haga clic para resaltar un pozo objetivo en el chip y haga clic en el icono de espectro para mostrar el espectro de masas.
- Haga clic con el botón derecho para elegir Cuadro de diálogo de personalización para recortar un rango específico de espectro en una ventana nueva. Haga clic en el eje X para escribir los límites superior e inferior de m/z, y pulse OK para mostrar el espectro de rango especificado, incluidas las señales de interés.
NOTA: La cantidad de ADN es proporcional a la intensidad máxima en cada unidad de valor m/z. - Mida la altura máxima de los valores m/z de las señales correspondientes al sustrato U, al producto AP y a la plantilla. Haga clic en el pico y vea la altura del pico en la esquina superior izquierda de la pantalla.
NOTA: Un espectro de 1.600 de ancho/1.200 unidades es una dimensión razonable para la inspección en una pantalla de computadora, así como para el mantenimiento de registros. - Para guardar el espectro para el mantenimiento de registros, haga clic con el botón derecho en Exportar y seleccione tipo de archivo JPEG en la lista desplegable. Haga clic en Destino y Examinar disco para seleccionar el dispositivo de almacenamiento en la lista desplegable (por ejemplo, disco flash E:). Escriba el nombre del archivo (por ejemplo, 0620_1-2.jpg) y haga clic en Exportar.
- Si es necesario, imprima un archivo JPEG exportado y mida la altura máxima manualmente con una regla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plantillas y sustratos
Tomando como ejemplo los oligonucleótidos sintéticos con U en el centro (U+9) emparejados con una plantilla G (Figura 1A), se puede utilizar un control en blanco de las cantidades equimolares de plantilla y sustrato que contiene uracilo para el control de calidad de la pureza de los oligonucleótidos sintéticos (Figura 1B; las señales coinciden con el m/z designado y el bajo ruido de fondo). Para el análisis de los datos de EM, se midieron las alturas máximas (Figura 2). Se esperaba que la plantilla de ADN de 19 nt permaneciera sin cambios después de la hidrólisis de la glicosilasa; por lo tanto, la señal podría servir como referencia para la cuantificación del producto AP (Figura 1C).
Condición de reacción y espectros de masas
Este ensayo de ADN glicosilasa es simple y fácil de realizar utilizando un oligonucleótido no marcado para una reacción estándar para obtener resultados limpios y confiables (Figura 1). El rango de espectros MS debe cubrir todas las señales generadas a partir de sustratos, plantillas y productos de reacción (Figura 1B). La diferencia de 1 nt entre el sustrato y la plantilla correspondiente produjo un perfil de señal bien separado tanto para la plantilla como para el sustrato (Figura 1B). Los cebadores equimolares U+9 y T1 mostraron intensidades máximas similares sin diferencias significativas. La digestión extensa de UDG (0,5 unidades para una reacción de 30 minutos) demostró una escisión completa de uracilo. La señal del producto AP también estaba bien separada de la del sustrato que contenía uracilo (Figura 1C d+9 AP-producto m/z = 5447,6 frente a la Figura 1B U+9 sustrato m/z = 5541.6). La técnica de ionización MALDI relativamente leve36 utilizada en este estudio minimizó las señales asociadas a roturas de hebras inducidas por la reacción de eliminación de β en los sitios AP37, que no fueron significativas en los espectros de masas. En general, el fondo de reacción es muy limpio sin ruido notable (Figura 1C).
En condiciones equimolares, la intensidad relativa de la señal del producto AP fue comparable a la del sustrato U utilizando la plantilla T1 como referencia (Figura 1B, U+9/T1 versus d+9/T1). Por lo tanto, el cálculo de la actividad de UDG se basa en la entrada exacta del sustrato que contiene U (50 pmol o 20 pmol) de acuerdo con Eq (1).
Actividad UDG = (señal de ap-producto) / (señal de sustrato U + señal de ap-producto) × [U] (1)
Parámetros cinéticos UDG determinados por el ensayo MALDI-TOF MS
Como se muestra en la Figura 2, a lo largo de la reacción de 3 minutos, las reacciones de UDG de 0,01 unidades a 0,1 unidades demostraron dependencia de la dosis y del tiempo. Se utilizó una concentración de 3,2 pM (0,1 unidades por reacción de 100 μL) para la determinación de los parámetros cinéticos, Km y kcat, para un sustrato G:U (Tabla 1). Las alícuotas de la reacción UDG fueron removidas y apagadas durante 30 s y 60 s. Los datos cinéticos se obtuvieron en condiciones en las que el sustrato que contenía uracilo estaba menos del 50% digerido, y se sometieron a análisis cinco concentraciones de sustrato que oscilaban entre 10 y 200 nM. El curso de tiempo presteady-state mostró una excelente linealidad para el análisis de tasas. Un ejemplo de una gráfica de velocidad de reacción se muestra en la Figura 3A, donde las intensidades relativas de la señal MS del producto y el sustrato se convierten en concentración (nM). La velocidad de reacción UDG (v) se presenta como nM del sitio AP producido por segundo. El Km y el Vmax se calcularon a partir de una gráfica de Lineweaver-Burk (Figura 3B). Por lo tanto, se determinó que los parámetros cinéticos UDG derivados del ensayo MALDI-TOF MS eran Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1 y Kcat = 9,31 s-1. Los valores son comparables a los resultados de ensayos previos de liberación de uracilo 3H donde el Km = 40 nM y Kcat = 13.3 s-138.
El dúplex G:U+9 fue sometido a ensayos de sensibilidad UDG. La unidad medida por el ensayo MALDI-TOF MS se trazó contra la unidad definida por el fabricante mediante un método convencional de liberación de uracilo 3H38. Como se muestra en la Figura 3C, la unidad medida por MALDI-TOF MS fue proporcional a la unidad definida de 0.001 unidades a 0.02 unidades con la ecuación de correlación de y = 0.933x + 0.0003 y el coeficiente de determinación R2 = 0.9974. El límite de detección es de 0,001 unidades como coeficiente de variación = 9,2%, ~5 veces la relación señal-ruido. Por lo tanto, este ensayo MALDI-TOF MS proporciona suficiente sensibilidad, ya que UDG se utiliza principalmente a nivel de unidad39.
Especificidad del sustrato de UDG
Uno de los rasgos característicos de este ensayo UDG MALDI-TOF MS es que no contiene etiquetas, lo que brinda una gran versatilidad para el diseño de sustratos. Esta característica es muy útil para analizar la especificidad del sustrato de UDG. Como se demuestra en la Tabla 1, el uracilo podría insertarse en cualquier lugar cerca del extremo 5' o 3' del ADN monocatenario o de doble cadena para un ensayo de especificidad. Para la especificidad del sustrato, es bien sabido que la UDG es altamente activa en la eliminación del uracilo del ADN monocatenario38. De hecho, como se muestra en la Tabla 1, la escisión de uracilo del sustrato monocatenario (ssU) disminuyó 3,7 veces cuando se recoció a la cadena de ADN complementaria, formando G: U dúplex. Para el dúplex A:U comúnmente utilizado6,7,8, la velocidad de reacción se redujo aún más en casi 10 veces en relación con ssU. La UDG no actuó sobre U en el extremo del ADN (sustratos de la Tabla 1 de G:U+1, G:U-1 y G:U-2), lo que es consistente con estudios previos40,41. Curiosamente, U en las posiciones 2ª y 3ª del extremo 5' exhibió una tasa catalítica UDG más alta que la U en el centro por 2 veces y 1,5 veces, respectivamente (Tabla 1, G:U+2 y G:U+3 versus G:U). UDG eliminó U 3-nt del extremo 3'con un 8% menos de actividad que la U en el centro (Tabla 1, G:U-3 versus G:U).
Inhibición del inhibidor de la uraciloglicosasa de la reacción UDG
El inhibidor de la uraciloglicosasa (UGI) es una proteína bacteriófago, que inhibe la E. coli UDG mediante la unión reversible a proteínas con una estequiometría de 1:142. La inhibición de la actividad de UDG por UGI se muestra en la Figura 4. En presencia de 0,05 unidades (100 pM) de UGI, la actividad de 0,05 unidades de UDG (8 pM) se inhibió a un nivel indetectable. El IC50 era de 7,6 pM. Por lo tanto, el ensayo UDG MALDI-TOF MS se puede modificar fácilmente a un ensayo de detección masiva para el descubrimiento de inhibidores de otras glucosilasas de ADN.
Figura 1: Sistema modelo para un ensayo de ADN glicosilasa. (A) La hebra de lesión que contiene una sola uridina (U + 9) se recoció en una plantilla (T1), formando un desajuste G: U (negrita). La uracilo-ADN glicosilasa detecta y elimina el uracilo, formando un sitio AP (d). Cuando se somete a MALDI-TOF MS, la diferencia en los valores de m/z entre el ADN que contiene U y los productos AP se puede resolver como se muestra en B. (B) Un ADN de 18 nt que contenía una sola uridina (U+9) recocido a una plantilla de 19 nt (T1) (Tabla 1) se probó como un espacio en blanco enzimático de 50 pmol de sustrato en 40 μL de tampón de reacción y se sometió a análisis de EM. (C) Una digestión enzimática casi completa de 50 pmol de sustrato en una reacción de 10 μL utilizando 0,5 unidades de UDG a 37 °C durante 30 min. (D) Se sometió a análisis de EM un ADN de 18 nt que contenía una sola uridina (U+3) recocida a la enzima T1 en blanco de 50 pmol de sustrato en tampón de reacción de 40 μL. (E) Una digestión enzimática casi completa de 50 pmol de sustrato U+3 en una reacción de 10 μL utilizando 0,5 unidades de UDG a 37 °C durante 30 min para producir d+3 y sometida a análisis de EM en un plazo de 30 h. (F) La condición de reacción fue la misma que en E , excepto que el producto d+3 estuvo en 0,1 M NaOH a 95 °C durante 30 min para desencadenar una reacción de eliminación de betaproducción produciendo producto fragmentado de B15 y sometido a análisis de EM. (G) La condición de reacción fue la misma que en E , excepto que el producto d+3 se almacenó a -20 °C durante más de 7 días; una fracción de d+3 convertida en productos fragmentados B15. Esta cifra se modifica de 43. Abreviaturas: nt = nucleótido; MS = espectrometría de masas; MALDI-TOF MS = MS de desorción/Ionización láser asistida por matriz; AP = apurínico/apirimidínico; UDG = Uracilo-ADN glicosilasa; T1 = plantilla que contiene G de 19 nt; U+9 = sustrato que contiene 18 nt U; d+9 = producto que contiene sitio AP de 18 nt; U+3 = sustrato que contiene 18 nt U; d+3 = producto que contiene sitio AP de 18 nt; B15 = producto fragmentado de eliminación beta de 15 nt. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis del curso de tiempo para la actividad de UDG a diferentes concentraciones de enzimas. El ADN del sustrato, 50 pmol, que contiene una lesión G:U se incubó con 0,01, 0,02, 0,05 y 0,1 unidades de UDG a 37 °C. Las alícuotas (10 μL) se tomaron de la mezcla de reacción a 0, 0,5, 1, 2 y 3 min y se apagaron con un volumen igual de fenol/cloroformo. (A) Espectros de masas MALDI-TOF que ilustran la dependencia de la concentración del procesamiento de sustratos G:U por UDG. (B) La cantidad de producto se graficó en función del tiempo. UDG: 0.01 (triángulos cerrados con línea sólida), 0.02 (triángulo abierto con línea discontinua), 0.05 (círculo cerrado con línea sólida) y 0.1 unidades (círculos abiertos con línea sólida). Los datos son los promedios de tres determinaciones independientes, y las barras de error representan 1 S.D. Esta cifra se modifica de 43. Abreviaturas: nt = nucleótido; MALDI-TOF = Tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asistido por matriz; AP = apurínico/apirimidínico; UDG = Uracilo-ADN glicosilasa; T = plantilla que contiene G de 19 nt; U = sustrato que contiene U de 18 nt; AP = producto que contiene sitio AP de 18 nt. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Determinación de parámetros cinéticos de UDG mediante análisis MALDI-TOF. La curva de Michaelis-Menten y las gráficas de Lineweaver-Burk para determinar el Km y el kcat para la escisión catalizada por enzimas UDG de uracilo del ADN. El ensayo de ADN glicosilasa MALDI-TOF MS se realizó utilizando 0,1 unidades de UDG y diferentes concentraciones (10, 30, 60, 100, 200 nM) de sustratos en reacción de 100 μL durante 30 s y 60 s. (A) Curva de Michaelis-Menten generada a partir de tres experimentos independientes. Las barras de error representan 1 SD. (B) Diagrama de Lineweaver-Burk para el ensayo; las interceptaciones indicadas permiten el cálculo Km y Vmax. (C) Ensayo UDG mediante análisis MALDI-TOF MS en comparación con la unidad asignada por el fabricante. La actividad enzimática se midió mediante la eliminación de uracilo formando el sitio AP en una reacción de 10 μL que contenía 50 pmol (0,56 μg) de G:U dentro de un dúplex de ADN de 18/19 nt durante 30 min a 37 °C. El UDG se diluyó con tampón [50% de glicerol, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 30 mM de NaCl, 0.5 mM de EDTA, 1 mM de ditiotreitol] en hielo. Una unidad se definió como la cantidad de enzima que catalizó la liberación de 60 pmol de uracilo por minuto. Las barras de error muestran la desviación estándar de seis experimentos. Esta cifra se modifica de 43. Abreviaturas: nt = nucleótido; MALDI-TOF = Tiempo de vuelo de desorción/ionización por láser asistido por matriz; UDG = Uracilo-ADN glicosilasa; AP = apurínico/apirimidínico; V, velocidad de reacción nM/s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Curva de inhibición de la enzima UDG mediante la adición de UGI. La curva de inhibición se determinó mediante reacciones de 20 μL con 0,05 unidades de UDG (8 pM) y 50 pmol de sustrato durante 15 min en presencia de UGI de 0,001 unidades (5 pM) a 0,1 unidades (200 pM). Los datos son los promedios de tres determinaciones independientes, y las barras de error representan 1 S.D. Los datos encajan con una calculadora IC50 en línea (consulte la Tabla de materiales). Esta cifra se modifica de 43. Abreviaturas: UDG = Uracilo-ADN glicosilasa; UGI = inhibidor de la uracilo glicosilasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sustratos de ADN | Oligonucleótidos | Secuencia de ADNb | Tasa inicialc | k gato | |
| (pmol/seg) | (s-1) | ||||
| ssU+9 | U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | 0,560 ± 0,098 | 35 | |
| ssU+3 | U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | 0,756 ± 0,083 | 47.3 | |
| ssU-3 | Sub-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | 0,448 ± 0,087 | 28 | |
| G:U | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,149 ± 0,046 | 9.31 | |
| U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| A:U | T2 | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0,053 ± 0,018 | 3.31 | |
| U+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+3 | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,256 ± 0,044 | 16 | |
| U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+2 | T3 | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,567 ± 0,016 | 35.4 | |
| U+2 | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+1 | T4 | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | NDd | ND | |
| U+1 | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U3'-3 | T5 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0,138 ± 0,015 | 8.63 | |
| Sub-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | ||||
| G:U3'-2 | T6 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' | ND | ND | |
| Sub-2 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3' | ||||
| G:U3'-1 | T7 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | ND | ND | |
| Sub-1 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3' | ||||
Tabla 1: Composiciones de sustrato y especificidades UDG. Esta tabla muestra el ADN que contiene 18 nt U designado por U±N. El '+' indica contar la posición del uracilo desde el extremo 5', y el '-' indica contar la posición del uracilo desde el extremo 3'. Por ejemplo, U+9 es la 9ª posición de la terminal de 5', U-3 es la 3ª posición de la terminal de 3'. La plantilla complementaria de 19 nt de T1 a T7 se emparejaría con el ADN que contiene U formando desajustes G:U o A:U como se indica. Las bases de uracilo están en negrita. Las reacciones fueron utilizando 50 pmol de sustratos U, 0,05 unidades de UDG, en 10 μL como se describe en la sección 2 del protocolo. Esta tabla se modifica de 43. Abreviaturas: UDG = uracilo ADN glicosilasa; nt = nucleótido; ND, no detectable.
| 2º PCRP | 1º-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | PcGC | ADVERTENCIA | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_ LLAMADA | EXT1_ MISA |
| NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
Tabla 2: ARCHIVO I.xlsx archivo. Los ajustes se utilizaron para la Figura 1B, C y figura 2A; Entradas de 0 min. El sistema MALDI-TOF MS utilizado en este estudio fue diseñado específicamente para analizar el polimorfismo de un solo nucleótido mediante una extensión de un solo nucleótido del cebador extendido en la región de variación de secuencia de genes amplificada. Para el ensayo UDG, solo se utilizaron seis campos al preparar el grupo de ensayo ARCHIVO I. Abreviaturas: WELL = el número de pozo asignado al ensayo; TÉRMINO = mezcla de terminación; SNP_ID = nombre de la secuencia de entrada del polimorfismo de un solo nucleótido; 2º-PCRP = imprimación de amplicón hacia adelante; 1º-PCRP = imprimación de amplicón inverso; AMP_LEN = longitud del amplicón; UP_CONF = puntuación de amplificación uniplex; MP_CONF = puntuación de amplificación multiplex; Tm = temperatura de fusión; PcGC = porcentaje de contenido gc; PWARN = códigos de advertencia de diseño de ensayo; UEP_DIR = dirección de la extensión de la imprimación; UEP_MASS = masa de imprimación no extendida; UEP_SEQ = secuencia de imprimación no extendida; EXT1_CALL = nombre dado al pico de masa del analito 1; EXT1_MASS = masa del analito 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
| 0620_1-8 |
Tabla 3: Archivo 0620.xlsx. Estos ajustes se utilizaron para las reacciones de inhibición de UGI en la Figura 4A. Abreviatura: UGI = inhibidor de la uraciloglicosasa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este documento proporciona un procedimiento detallado para el uso de un método de ensayo UDG MALDI-TOF MS para detectar directamente productos de ADN que contienen AP. Las principales ventajas de este método son que los sustratos que contienen uracilo no contienen etiquetas, son escalables, fáciles de trabajar y ofrecen una mayor flexibilidad en el diseño del sustrato.
La extracción de fenol/cloroformo recomendada por el proveedor de UDG permite la inactivación de la enzima para evitar la degradación del ADN del producto. Sin embargo, el protocolo de extracción de fenol implica una tediosa separación de fases de productos químicos peligrosos. Un método alternativo de terminación ácida que utiliza HCl para reducir el pH de reacción a 2 ± 0.5 también inactiva eficazmente UDG. La neutralización posterior con la base Tris podría prevenir el daño al ADN. Cuando el producto AP se sometió a análisis de EM dentro de las 30 h, no hubo signos de pérdida de base o modificación en los espectros de masas (Figura 1E). El tampón Tris en las reacciones se proporcionó con el UDG comercial. Sin embargo, varias aminas, incluyendo Tris, pueden incidir sitios AP a través de la eliminación beta, aunque a altas concentraciones de reactivos44. Algunas alternativas, como HEPES y tampón de fosfato, se pueden considerar para evitar el riesgo de escisión del sitio AP por eliminación beta.
Como posible método de referencia UDG, se recomienda un dúplex de sustrato G:U centrado (Tabla 1, T1/U+9) como sustrato estándar por las siguientes razones: 1. por relevancia fisiológica, G:U es superior a A:U ya que la desaminación de citosina en pares G:C da como resultado lesiones G:U. 2. Mientras que E. coli UDG demuestra una mayor especificidad para hidrolizar U a partir de ADN monocatenario, la reparación de una lesión U en ADN monocatenario es poco común. 3. Para todo el sustrato G:U probado, G:U+2 y G:U+3 demostraron velocidades de reacción más altas que G:U+9. Sin embargo, una lesión de desaminación de ADN adyacente a una rotura de hebra es poco común. Para imitar las lesiones nativas, colocar un G: U en el centro del dúplex de ADN sería más apropiado.
Curiosamente, el método MALDI-TOF MS generó parámetros cinéticos UDG, y las unidades enzimáticas de la reacción G:U (Figura 3A-C) fueron muy similares a los resultados derivados convencionalmente utilizando 3H-uracilo38. Sin embargo, el sustrato único de G:U en este estudio es muy diferente del ADN del bacteriófago PBS1 previamente descrito con múltiples A:U de errores de síntesis de ADN38. Además, UDG mostró una actividad 3 veces mayor con G:U que con el sustrato A:U (Tabla 1, Km y Kcat de G:U versus A:U). Este resultado aparentemente contradictorio puede atribuirse a la secuencia de ADN del sustrato PBS1 que contiene el 36% de U en forma de múltiples lesiones A:U45 en comparación con solo el 3% de U en el G: Sustrato U (Tabla 1). Mientras tanto, la UDG es una enzima muy "procesiva", es decir, un solo evento de unión proteína-ADN provoca múltiples escisión de uracilo12. El hallazgo de una correlación uno a uno casi perfecta entre estos dos métodos UDG hace que este método de EM sea una opción atractiva en lugar del ensayo tradicional de radioisótopos.
Este enfoque es fácilmente escalable. Todas las reacciones de UDG en este estudio se realizaron manualmente utilizando micropipetas y tubos de microcentrífugas, con ~ 30 pruebas realizadas en un día determinado. Por lo tanto, se utilizó menos de una décima parte de la capacidad de la matriz de chips de formato de placa de 384 pocillos para el sistema MALDI-TOF MS (consulte la Tabla de Materiales) descrita en las secciones 3-5. Por el contrario, la adaptación de un sistema de pipeteo automatizado para una microplaca de 384 pocillos podría aumentar fácilmente la producción diaria de este enfoque mediante el uso del método de terminación ácida. Por lo tanto, 300 reacciones UDG tomarían ~ 1 h. El sistema MALDI-TOF MS (ver la Tabla de Materiales) podría producir datos de espectros de masas para hasta 300 reacciones en 1 h. Por lo tanto, un proceso simplificado requeriría 2 h para completar 300 ensayos UDG MALDI-TOF MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwán) y al Laboratorio de Farmacogenómica del NRPB (Taipei, Taiwán) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán, R.O.C. [número de subvención MOST109-2314-B-002 -186 a K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 a S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 a W.-h.F.]. H.-L.C. ha recibido una beca de doctorado de la Universidad Nacional de Taiwán. Financiación para la tasa de acceso abierto: Ministerio de Ciencia y Tecnología, R.O.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
- Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
- Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
- Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
- Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
- Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
- Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
- Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
- Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
- Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
- Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
- Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
- Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
- Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
- Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
- Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
- Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
- Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
- Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
- Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
- McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
- Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
- Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
- Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
- Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
- Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
- Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
- Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
- Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
- Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
- Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
- Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
- Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
- Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
- Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
- Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
- Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
- Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
- Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
- Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
- Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).
