Summary
우라실-DNA 글리코실라제 활성을 분석하기 위한 비표지, 비-방사성-동위원소 방법은 직접 아푸린산/아피리미딘 부위 함유 생성물 분석을 위해 MALDI-TOF 질량 분광법을 사용하여 개발되었다. 이 분석은 DNA 글리코실라제 측정에 매우 간단하고, 구체적이며, 빠르고, 사용하기 쉬운 것으로 판명되었습니다.
Abstract
우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 시토신의 가수분해 탈아민화로부터 형성된 우라실의 교정을 위한 염기 절제 복구 경로의 핵심 성분이다. 따라서 게놈 무결성 유지에 중요합니다. UDG 활성을 측정하기 위해 매우 특이적이고 라벨링되지 않은 비방사성 동위원소 방법이 개발되었다. 부위 특이적 우라실을 함유하는 합성 DNA 듀플렉스를 UDG에 의해 절단한 다음, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광분석법(MALDI-TOF MS) 분석을 실시하였다. 가닥 파괴 없이 DNA에서 아푸린산/아피리미딘 부위(AP) 생성물을 보존하기 위한 프로토콜이 확립되었다. 기질에서 생성물로의 m/z 값의 변화는 UDG에 의한 우라실 가수분해를 평가하기 위해 사용되었다. UDG 동역학 분석에 G:U 기질을 사용하여 Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM/s 및 Kcat = 9.31 s-1을 산출하였다. 이 방법을 우라실 글리코실라제 억제제 (UGI) 분석법에 적용하면 7.6 pM의 IC50 값이 산출되었다. 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 기질 내의 다양한 위치에서 우라실을 사용한 UDG 특이성은 상이한 절단 효율을 입증하였다. 따라서, 이러한 간단하고, 신속하고, 다재다능한 MALDI-TOF MS 방법은 다양한 단기능 DNA 글리코실라제에 대한 우수한 참조 방법이 될 수 있었다. 또한 DNA 글리코실라제 억제제 스크리닝을 위한 도구로서의 잠재력을 갖는다.
Introduction
우라실은 RNA에서 정상적인 염기이지만, 게놈 DNA에서 흔하고 고도로 돌연변이 유발 병변입니다. 우라실은 데옥시시티딘의 자발적/효소적 가수분해 탈아민화로부터 발생할 수 있다. 각 살아있는 세포에서,이 탈아민화는 생리 학적 조건 하에서 하루에 100-500 번 발생합니다1,2. 이러한 변화가 복구되지 않으면 DNA 서열 조성에 변화가 생겨 돌연변이를 일으킬 수 있습니다. DNA의 우라실이 복제 중에 dATP와 쌍을 이루는 것을 선호하기 때문에, 시토신이 우라실로 deaminates되면, 두 개의 복제 이벤트에서, 자손 DNA3의 절반에서 새로운 G:C에서 A:T 전이 돌연변이가 있을 것이다.
유전 적 안정성을 유지하기위한 세포 전략 중 염기 절제 복구 (BER)는 DNA4에서 우라실과 같은 손상된 염기를 복구하는 필수 메커니즘입니다. BER은 고도로 진화적으로 보존된 과정이다. 두 개의 일반적인 BER 경로가 있습니다 : 단일 뉴클레오티드의 복구 관으로 이어지는 짧은 패치 경로와 적어도 두 뉴클레오티드의 복구 관을 생성하는 긴 패치 경로5. BER은 여러 단계에서 발생하는 조정된 메커니즘입니다. BER의 첫 번째 단계는 아푸린산/아피리미딘(AP) 중간체 부위6를 생성하기 위해 손상 특이적 DNA 글리코실라제에 의해 손상된 뉴클레오티드 염기를 효소적으로 가수분해하는 것이다. 이것은 엔도뉴클레아제에 의한 AP 부위에서의 당-포스페이트 골격의 절단, 분해효소에 의한 DNA 말단의 정리, DNA 중합효소에 의한 갭-필링, 및 리가아제5에 의해 최종 닉을 밀봉하는 것에 뒤따른다.
우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 대장균에서 BER에 대한 우라실 함유 DNA로부터 우라실을 가수분해한다. 다양한 분리 기술 6,7,8,9,10,11,12,13을 포함하는 방사성 표지 DNA를 사용하는 기존의 UDG 분석은 일반적으로 비용이 많이 드는 라벨링 시약, 복잡한 절차, 방사성 물질에 대한 노출 위험을 줄이기 위해 집중적 인 교육 및 실습이 필요한 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 플루오로메트릭 올리고뉴클레오티드 분석은 분자 비콘 및 Förster 공명 에너지 전달 기술15,16,17,18,19,20 이외에 방사성 동 위원소 표지14의 대체물로서 개발되었다. 그러나, 특정 라벨링은 전술한 모든 방법에 대해 요구된다. 최근 라벨이 없는 바이오센서 분석법21,22,23 및 G-quadruplex24,25,26의 형성에 기초한 비색법이 개발되었다. 그러나 프로브에서 여러 A:U 쌍 또는 특별히 설계된 서열은 효소 단위 정의를 복잡하게 만듭니다.
MALDI-TOF MS는 DNA 분석에 큰 도움이 될 수 있는 기술입니다. 개발된 응용분야에는 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형27,28, 변형된 뉴클레오티드 분석29, 및 DNA 복구 중간체 동정30,31,32,33,34가 포함된다. MALDI-TOF MS는 AP 부위 함유 DNA 생성물을 검출하기 위해 DNA 글리코실라제 분석에 쉽게 채택되어야 한다. 그러나, DNA 내의 AP-부위는 많은 실험 조건 하에서 가닥이 부서지기 쉽다33. UDG 분석은 MALDI-TOF MS를 사용하여 상당한 가닥 파단 잡음 없이 AP 사이트 생산을 직접 측정하기 위해 여기에 제시됩니다. 이 라벨 프리 방법은 작업하기 쉽고 DNA 글리코실라제 억제제 스크리닝의 제약 적용에 대한 높은 잠재력을 가지고 있습니다.
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Protocol
1. 기판/템플릿 준비
- 듀플렉스 영역에 대해 ~50 ± 10%의 균형 잡힌 G+C 함량과 50°C의 최소 용융 온도로 우라실 기판/템플릿 듀플렉스를 설계하십시오.
참고: 18 nt 기질과 19 nt 주형(표 1 및 그림 1) 사이의 한 뉴클레오티드 차이는 MS 신호 해석 및 적절한 어닐링을 개선하는 데 도움이 됩니다. 주형 가닥은 A-U 또는 G-U 미스매치를 생성하는 상보적 DNA로서 기능하지만(표 1), MS 측정에서 기준 신호로서 사용될 수도 있다. HPLC-정제된 합성 올리고뉴클레오티드의 사용은 본 연구에 만족한다. - DNA를 스톡으로서 100 μmol/L의 농도로 1 mM EDTA 및 10 mM Tris-HCl (25°C에서 pH 8.0) (TE)에 용해시키고 -20°C에서 저장한다. 이 20μL 스톡을 TE로 희석하여 최종 부피 800μL(4μmol/L로 25배 희석)로 희석합니다. λ = 260 nm의 UV 가시 분광 광도계에서 DNA 용액의 흡광도를 측정하여 제조업체가 할당 한 농도를 확인하십시오. 예: U+9의 4μmol/L에 대해 A260 = 0.204, T1의 4μmol/L에 대해 A260 = 0.192입니다(표 1).
- 지정된 m/z 값에서 고유한 피크 신호를 검사하고 신호 대 잡음비가 >100인지 확인하여 올리고뉴클레오티드 품질 관리에 대한 MALDI-TOF MS 분석(섹션 4-6)을 수행합니다(그림 1B 및 그림 1D).
2. DNA 글리코실라제 분석
- 글리코실라제 반응을 위해 T1/U+9 듀플렉스(표 1 및 도 1A)의 G:U 기질을 사용하여, 예를 들어, 1.5 mL 멸균 마이크로원심분리 튜브에서, 70 μL의 H2O, 10 μL의 10x UDG 반응 완충액, 5 μL의 T1 스톡, 및 5 μL의 U+9 스톡을 첨가한다(단계 1.2.).
참고: 올바른 유형의 마이크로피펫을 선택하고 제조업체의 지침에 따라 필요한 볼륨을 처리하십시오. 예를 들어, 2 μL 피펫을 사용하여 0.1-2 μL의 액체를 분배하고, 10 μL 피펫을 사용하여 2-10 μL의 액체를 분주하고, 100 μL 피펫을 사용하여 20-100 μL의 액체를 분주하여 결과의 정확성과 정밀도를 보장하십시오. 시약 믹스의 기재된 부피는 10개의 검정을 위한 것이고; 원하는 수의 반응에 대해 부피를 조절한다. 1x UDG 반응 완충액은 1 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨 및 20 mM 트리스-HCl (25°C에서 pH 8.0)을 함유한다. 10x UDG 반응 완충액의 공급원에 대한 물질의 표를 참조한다. - 튜브를 단단히 닫으십시오. 수조에서 65°C에서 30분, 37°C에서 30분 동안 배양한 다음, 마지막으로 3분 동안 얼음 위에서 배양하여 기판/템플릿 듀플렉스의 적절한 어닐링을 보장한다.
- 1.5mL 멸균 마이크로원심분리 튜브에 빙냉 1x UDG 반응 버퍼 49μL와 UDG 1μL(5,000 units/mL, 재료 표 참조)를 0.1 unit/μL로 희석합니다. 1x UDG 버퍼로 연속 희석액을 0.05, 0.02 또는 0.01 units/μL의 원하는 효소 농도로 만듭니다. 희석된 UDG는 항상 얼음 위에 보관하십시오.
참고: 10 μL 반응에서, UDG의 0.1 유닛은 3분 안에 T1/U+9 듀플렉스로부터 30 pmol 이상의 우라실을 절단할 수 있다. - 1.5 mL 멸균 마이크로원심분리 튜브에서, 단계 2.2로부터 9.0 μL의 기질 믹스를 첨가하고, 튜브를 37°C로 예열한다. 단계 2.3으로부터 희석된 UDG 1.0 μL를 첨가한다. 타이머를 사용하여 반응 시간을 정하고 튜브를 휙 휙 돌려 내용물을 혼합하십시오.
참고: 단위 정의 분석의 경우, 인큐베이션 시간은 30분입니다. 운동 분석의 경우, 0.5, 1, 2, 3, 5분의 시간-코스 분석을 사용하여 초기 속도를 구한다. UGI 억제 분석의 경우, 15분 동안 반응할 때이다. - 반응 혼합물로 튜브를 주변 온도에서 3,200 × g 에서 3-5 s 동안 원심분리한다. 이어서, 반응물을 즉시 37°C로 옮긴다.
- 반응 종결
- 0.25 M HCl 및 0.23 M 트리스 염기의 용액을 준비한다. 15 mL 시험관에서, 1x UDG 반응 완충액을 모방하기 위해 1 mM EDTA 및 20 mM Tris-HCl (25°C에서 pH 8.0)의 용액 10 mL를 첨가한다. 1 mL의 0.25 M HCl로 산성화하고 pH 측정기로 확인하여 pH가 ∼2 ± 0.5인지 확인하십시오. 1 mL의 0.23 M 트리스 염기로 중화시키고 최종 pH가 6.5 ± 0.5인지 pH 측정기로 확인한다.
참고: pH 테스트 스트립을 사용하는 것은 시약 혼합물의 pH 수준을 재확인하는 빠르고 쉬운 방법입니다. - 1 μL의 0.25 M HCl을 첨가하여 10 μL 반응 혼합물을 산성화시켜 효소를 불활성화시키고 6분 동안 얼음 위에 놓는다. 1 μL의 0.23 M 트리스 염기를 첨가하여 DNA 생성물을 중화시켜 산에 장기간 노출시킴으로써 AP 부위 파손을 방지한다. 매트릭스 칩 전달을 위해 생성물 혼합물의 부피를 증가시키기 위해 13 μL TE를 첨가한 다음, 이를 얼음 위에 놓는다.
참고: AP 제품은 화학적으로 불안정하므로 2일 이내에 MALDI-TOF MS에 의해 분석되어야 합니다. 일주일 이상 장기간 보관 한 후, AP 제품의 β / δ 제거 반응으로 인해 가닥 파단의 상당 부분이 축적됩니다 (그림 1D-G).
- 0.25 M HCl 및 0.23 M 트리스 염기의 용액을 준비한다. 15 mL 시험관에서, 1x UDG 반응 완충액을 모방하기 위해 1 mM EDTA 및 20 mM Tris-HCl (25°C에서 pH 8.0)의 용액 10 mL를 첨가한다. 1 mL의 0.25 M HCl로 산성화하고 pH 측정기로 확인하여 pH가 ∼2 ± 0.5인지 확인하십시오. 1 mL의 0.23 M 트리스 염기로 중화시키고 최종 pH가 6.5 ± 0.5인지 pH 측정기로 확인한다.
- 모든 25 μL UDG 반응 생성물을 마이크로원심분리 튜브로부터 384-웰 마이크로타이터 플레이트로 옮긴다.
참고: 완충액의 나트륨 또는 칼륨과 같은 고농도의 양이온은 MALDI-TOF MS 분석에서 간섭을 발생하므로 탈염이 필요합니다. 대장균 UDG 반응 완충액에는 매우 낮은 농도의 양이온이 포함되어 있으므로 탈염이 필요하지 않습니다. 그러나, 앞서 기술된 바와 같이 탈염이 필요한 금속 양이온을 함유하는 다른 DNA 글리코실라제 반응을 측정하기 위해 이 프로토콜을 수정한다35.
3. UDG 반응 생성물을 매트릭스 칩으로 전송
- 나노리터 디스펜서의 도어를 열고( 재료 표 참조) 2.7단계의 384웰 마이크로타이터 플레이트를 데크의 플레이트 홀더에 로드합니다.
- 매트릭스 칩 어레이를 해당 스카우트 플레이트 위치에 삽입합니다. 적재 된 스카우트 플레이트를 나노 리터 디스펜서의 처리 데크에 놓고 문을 닫으십시오.
- 전사 스크린의 실행 버튼을 터치하고 계측기가 384-웰 마이크로타이터 플레이트에서 매트릭스 칩으로 샘플을 분배하기 시작할 때까지 기다립니다.
- Vision 탭 옵션을 사용하여 분배 중 칩의 이미지와 각 지점의 분배 볼륨을 표시합니다. 칩의 적층된 부피가 5-10 nL 범위에 있는지 확인하십시오.
4. 질량 분석기에 분석 파라미터 설정
- 응용 프로그램( 자료 표 참조)을 사용하여 가져오기를 위해 예측된 신호 m/z 값이 포함된 .xlsx 파일을 준비합니다.
참고: FILE I.xlsx (표 2)의 설정은 섹션 2의 G:U 기질의 UDG 분석에 대한 예제 설정입니다. - 애플리케이션 프로그램을 사용하여 디자이너 형식 옵션에서 어세이 그룹 가져오기 옵션을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 목록에서 .xlsx 파일(예: 4.1단계 의 FILE I.xlsx)을 선택하여 새 UDG 어세이를 작성하고 정의합니다.
- 고객:프로젝트:플레이트 버튼을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 드롭다운 옵션 트리의 상단을 클릭하여 새 분석 플레이트를 설정합니다. 대화 상자에서 파일 이름(예: 랩 코드 및 분석 날짜의 경우 CTT20210620)을 입력하고 플레이트 유형 드롭다운에서 384웰 플레이트 유형을 선택하고 OK를 누릅니다. 화면 오른쪽에 나타날 빈 플레이트를 찾습니다.
- 분석 옵션을 클릭합니다. 드롭 다운 목록에서 분석법 (예 : FILE I.xlsx)을 선택하십시오.
- 선택된 분석법(예: FILE I.xlsx)을 플레이트 상의 각 샘플 스폿 위치에 할당하려면 커서를 빈 플레이트의 각 위치로 이동하고 웰을 클릭하여 강조 표시한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 플렉스 추가를 선택합니다.
- 데스크탑 또는 랩탑 컴퓨터를 사용하여 2.7단계에서 칩 상의 모든 샘플에 대해 헤더가 없는 .xlsx 포맷(예: 표 3의 0620.xlsx)으로 작업 목록을 준비합니다. 새 샘플 프로젝트 추가 단추를 클릭합니다. 드롭다운 목록에서 파일(예: 0620.xlsx)을 선택하여 작업 목록을 가져옵니다.
- 화면 왼쪽의 작업 목록(예: 0620.xlsx부터)에서 모든 테스트 샘플 코드를 찾습니다. 작업 목록에서 샘플 코드를 클릭하고 플레이트의 해당 위치를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 테스트를 각 위치에 연결합니다.
5. 질량 분광계 작동
- 응용 프로그램을 사용하여 질량 분광계 ( 재료 표 참조)를 분석 할 샘플 칩 (섹션 3에서)에 연결하십시오.
- 기본 설정을 클릭합니다. 대화 상자에서 단계 4.3의 파일 이름(예: CTT20210620)을 입력합니다. 실험 이름에 칩 바코드에 칩 ID를 입력하고 설정을 저장합니다.
- 질량 분광계 제어 프로그램을 시작하십시오 ( 재료 표 참조).
- 질량 분광계의 In/Out 버튼을 누르고 데크를 확장시킵니다. 칩 홀더를 꺼내 3.4단계의 샘플 칩을 칩 홀더에 삽입합니다. 로드된 칩 홀더를 확장 데크에 놓고 샘플 칩이 계측기에 들어갈 수 있도록 In/Out 버튼을 누릅니다.
- 응용 프로그램의 가져오기 아이콘을 두 번 클릭합니다. 획득 창에서 자동 실행 탭을 클릭하여 계측기를 시작하고 칩의 샘플에서 질량 스펙트럼을 획득합니다.
6. 질량 스펙트럼보기 및 데이터 분석
- 데이터 분석 프로그램을 실행 하십시오 (재료 표 참조).
- 데이터베이스 트리를 찾아보고 5.2단계에서 칩 ID를 선택합니다. 칩에서 타겟을 강조 표시하려면 클릭하고 스펙트럼 아이콘을 클릭하여 질량 스펙트럼을 표시합니다.
- 마우스 오른쪽 단추를 클릭하여 사용자 지정 대화 상자를 선택하여 새 창에서 특정 범위의 스펙트럼을 자릅니다. X축 을 클릭하여 m/z의 상한과 하한을 입력하고 OK 를 눌러 관심 신호를 포함하여 지정된 범위 스펙트럼을 표시합니다.
참고: DNA의 양은 각 m/z 값 단위에서의 피크 강도에 비례합니다. - U 기판, AP 제품 및 템플릿에 해당하는 신호의 m/z 값의 피크 높이를 측정합니다. 피크를 클릭하고 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 피크 높이를 봅니다.
참고: 1,600 폭/1,200 단위의 스펙트럼은 컴퓨터 화면에서의 검사 및 기록 보관을 위한 합리적인 차원입니다. - 기록 보관을 위해 스펙트럼을 저장하려면 내보내기 를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 드롭다운 목록에서 JPEG 파일 형식을 선택합니다. 대상 및 디스크 찾아보기를 클릭하여 드롭다운 목록에서 저장 장치 (예: 플래시 디스크 E:)를 선택합니다. 파일 이름 (예: 0620_1-2.jpg)을 입력하고 내보내기를 클릭합니다.
- 필요한 경우 내보낸 JPEG 파일을 인쇄하고 눈금자를 사용하여 수동으로 피크 높이를 측정합니다.
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Representative Results
템플릿 및 기판
예를 들어 G 주형과 짝을 이룬 중앙(U+9)에 U를 갖는 합성 올리고뉴클레오티드를 취하면(그림 1A), 등몰량의 주형 및 우라실 함유 기질의 블랭크 조절을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드 순도의 품질 관리를 할 수 있습니다(그림 1B; 신호는 지정된 m/z 및 낮은 배경 잡음과 일치합니다). MS 데이터 분석을 위해, 피크 높이를 측정하였다(도 2). 19 nt 주형 DNA는 글리코실라제 가수분해 후에 변하지 않은 채로 남아있을 것으로 예상되었다; 따라서, 신호는 AP-생성물의 정량화를 위한 기준 역할을 할 수 있다(그림 1C).
반응 조건 및 질량 스펙트럼
이러한 DNA 글리코실라제 분석은 깨끗하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 표준 반응에 대해 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 간단하고 쉽게 수행할 수 있다 (도 1). MS 스펙트럼의 범위는 기질, 템플릿 및 반응 생성물로부터 생성된 모든 신호를 포괄해야 한다(그림 1B). 기판과 해당 템플릿 사이의 1 nt의 차이는 템플릿과 기판 모두에 대해 잘 분리된 신호 프로파일을 생성하였다(그림 1B). 등몰 프라이머 U+9 및 T1은 유의한 차이 없이 유사한 피크 강도를 나타내었다. UDG의 광범위한 소화 (30 분 반응의 경우 0.5 단위)는 완전한 우라실 절단을 입증했습니다. AP 생성물의 신호는 또한 우라실 함유 기질의 신호와 잘 분리되었다(그림 1C d+9 AP-생성물 m/z = 5447.6 대 도 1B U+9 기질 m/z = 5541.6). 본 연구에 사용된 비교적 온화한 MALDI 이온화 기술(36 )은 질량 스펙트럼에서 유의하지 않은 AP 부위37에서의 β-제거 반응에 의해 유도된 가닥 파단과 관련된 신호를 최소화하였다. 전반적으로 반응 배경은 눈에 띄는 소음 없이 매우 깨끗합니다(그림 1C).
등몰 조건 하에서, AP-생성물의 상대적 신호 강도는 T1 템플리트를 참조로 사용하는 U-기판의 그것과 비슷하였다(도 1B, U+9/T1 대 d+9/T1). 따라서, UDG 활성의 계산은 Eq (1)에 따른 U 함유 기질 (50 pmol 또는 20 pmol)의 정확한 투입에 기초한다.
UDG 활성 = (AP 생성물의 신호) / (U 기질의 신호 + AP 생성물의 신호) × [U] (1)
MALDI-TOF MS 분석에 의해 결정된 UDG 동역학적 파라미터
도 2에 나타낸 바와 같이, 3분 반응을 통하여, 0.01 유닛 내지 0.1 유닛의 UDG 반응은 용량- 및 시간-의존성 둘 다를 입증하였다. 3.2 pM (반응 100 μL 당 0.1 단위)의 농도를 G:U 기질에 대한 운동 파라미터, Km 및 kcat의 결정을 위해 사용하였다 (표 1). UDG 반응의 분취량을 제거하고 30초 및 60초 동안 켄칭하였다. 우라실 함유 기질이 50% 미만으로 소화되었을 때의 조건 하에서 동역학적 데이터가 얻어졌고, 10 내지 200 nM 범위의 5개의 기질 농도가 분석을 실시하였다. 정상 상태 이전 시간 과정은 속도 분석을위한 우수한 선형성을 보여주었습니다. 반응 속도 플롯의 예가 도 3A에 도시되어 있으며, 여기서 생성물 및 기질의 상대적인 MS 신호 강도는 농도 (nM)로 변환된다. UDG 반응 속도(v)는 초당 생성된 AP 부위의 nM으로서 제시된다. Km 및 Vmax는 Lineweaver-Burk 플롯으로부터 계산되었다(그림 3B). 따라서 MALDI-TOF MS 분석으로부터 유도된 UDG 동역학적 파라미터는 Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM s-1, 및 Kcat = 9.31 s-1로 결정되었다. 이 값은 Km = 40 nM 및 Kcat = 13.3 s-138인 이전의 3H-우라실 방출 분석의 결과와 비교할 수 있다.
G:U+9 듀플렉스를 UDG 감도 분석을 실시하였다. MALDI-TOF MS 분석법에 의해 측정된 단위는 통상적인 3H-우라실-방출 방법38에 의해 제조자의 정의된 단위에 대해 플롯팅되었다. 도 3C에 도시된 바와 같이, MALDI-TOF MS-측정 단위는 y = 0.933x + 0.0003의 상관 방정식과 함께 0.001 단위에서 0.02 단위까지 정의된 단위에 비례하였고 결정 계수 R2 = 0.9974이다. 감지 한계는 변동 계수 = 9.2%로 0.001단위이며, 신호 대 잡음비의 ~5배입니다. 따라서, 이러한 MALDI-TOF MS 분석은 UDG가 주로 유닛 레벨39에서 사용되기 때문에 충분한 감도를 제공한다.
UDG의 기질 특이성
이 UDG MALDI-TOF MS 분석의 특징 중 하나는 라벨이 없어 기판 설계에 높은 다기능성을 제공한다는 것입니다. 이 특징은 UDG의 기질 특이성을 분석하는데 매우 유용하다. 표 1에서 입증된 바와 같이, 우라실은 특이성 분석을 위해 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA의 5' 또는 3' 말단 근처의 임의의 장소에 삽입될 수 있었다. 기질 특이성에 대해, UDG가 단일 가닥 DNA38로부터 우라실을 제거하는데 매우 활성이라는 것은 잘 알려져 있다. 실제로, 표 1에 나타낸 바와 같이, 단일 가닥 기질(ssU)로부터의 우라실 절제는 상보적 DNA 가닥으로 어닐링하여, G:U 듀플렉스를 형성하였을 때 3.7배 감소하였다. 일반적으로 사용되는 A:U 듀플렉스6,7,8의 경우, 반응 속도는 ssU에 비해 거의 10배 더 낮아졌다. UDG는 DNA 말단에서 U에 대해 작용하지 않았으며(표 1의 G:U+1, G:U-1 및 G:U-2의 기질), 이는 이전 연구40,41과 일치한다. 흥미롭게도, 5'-말단으로부터 2번째와 3번째 위치에서의 U는 중앙에 있는 U보다 각각 2배 및 1.5배 더 높은 UDG 촉매 속도를 나타내었다(표 1, G:U+2 및 G:U+3 대 G:U). UDG는 중앙에서 U보다 8% 적은 활성으로 3'-말단에서 U3-nt를 적출하였다(표 1, G : U-3 대 G : U).
UDG 반응의 우라실 글리코실라제 억제제 억제
우라실 글리코실라제 억제제 (UGI)는 박테리오파지 단백질로, 1:142의 화학량론으로 가역적 단백질 결합에 의해 대장균 UDG를 억제합니다. UGI에 의한 UDG 활성의 억제는 도 4에 도시되어 있다. UGI의 0.05 유닛 (100 pM)의 존재하에, UDG (8 pM)의 0.05 유닛의 활성은 검출 불가능한 수준으로 억제되었다. IC50은 7.6pM이었다. 따라서, UDG MALDI-TOF MS 분석은 다른 DNA 글리코실라제의 억제제의 발견을 위한 대량 스크리닝 분석으로 용이하게 변형될 수 있다.
도 1: DNA 글리코실라제 분석을 위한 모델 시스템. (A) 단일 우리딘(U+9)을 함유하는 병변 가닥을 주형(T1)에 어닐링하여, G:U 미스매치(굵은 글씨)를 형성하였다. 우라실-DNA 글리코실라제는 우라실을 검출 및 제거하여, AP 부위(d)를 형성한다. MALDI-TOF MS를 투여할 때, U-함유 DNA와 AP 생성물 사이의 m/z 값의 차이는 B에 표시된 바와 같이 해결될 수 있다. (b) 19 nt 주형(T1)에 어닐링된 단일 우리딘(U+9)을 함유하는 18 nt DNA(표 1)를 40 μL의 반응 완충액 중의 50 pmol의 기질의 효소 블랭크로서 시험하고, MS 분석을 실시하였다. (c) 37°C에서 30분 동안 0.5 유닛의 UDG를 사용하여 10 μL 반응에서 기질 50 pmol의 거의 완전한 효소를 소화시켰다. (D) 40 μL 반응 완충액 중의 50 pmol 기질의 T1 효소 블랭크에 어닐링된 단일 우리딘(U+3)을 함유하는 18 nt DNA를 MS 분석을 행하였다. (e) 10 μL 반응에서 U+3 기질 50 pmol을 거의 완전한 효소 소화하여 37°C에서 30분 동안 0.5 unit의 UDG를 사용하여 d+3을 생성하고 30시간 이내에 MS 분석을 실시하였다. (F) 반응 조건은 d+3 생성물을 95°C에서 30분 동안 0.1 M NaOH로 하여 베타 제거 반응을 촉발시켜 B15 단편화된 생성물을 생산하는 베타 제거 반응을 촉발시킨 것을 제외하고는 E에서와 동일하였다. MS 분석을 실시하였다. (g) 반응 조건은 d+3 생성물을 7일 이상 -20°C에서 보관한 것을 제외하고는 E에서와 동일하였다; d + 3의 일부가 B15 조각난 제품으로 변환되었습니다. 이 수치는 43에서 수정되었습니다. 약어: nt = 뉴클레오티드; MS = 질량 분광법; MALDI-TOF MS = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 MS; AP = 아푸린산/아피리미딘성; UDG = 우라실-DNA 글리코실라제; T1=19 nt G 함유 주형; U+9 = 18 nt U 함유 기재; d+9 = 18 nt AP 부위-함유 생성물; U+3 = 18 nt U 함유 기재; d+3 = 18 nt AP 부위-함유 생성물; B15 = 15 nt 베타-제거 단편화된 생성물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 다양한 효소 농도에서의 UDG 활성에 대한 시간 과정 분석. G:U 병변을 함유하는 기질 DNA, 50 pmol을 37°C에서 0.01, 0.02, 0.05, 및 0.1 단위의 UDG와 함께 인큐베이션하였다. 분취량 (10 μL)을 0, 0.5, 1, 2 및 3 분에 반응 혼합물로부터 취하고, 동일한 부피의 페놀/클로로포름으로 켄칭하였다. (a) UDG에 의한 처리 G:U 기판의 농도 의존성을 보여주는 MALDI-TOF 질량 스펙트럼. (B) 생성물의 양은 시간의 함수로서 플롯팅되었다. UDG: 0.01(실선이 있는 닫힌 삼각형), 0.02(파선이 있는 열린 삼각형), 0.05(실선이 있는 닫힌 원) 및 0.1단위(실선이 있는 열린 원). 데이터는 세 개의 독립적인 결정의 평균이며 오류 막대는 1S.D.를 나타냅니다. 이 수치는 43에서 수정되었습니다. 약어: nt = 뉴클레오티드; MALDI-TOF = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간; AP = 아푸린산/아피리미딘성; UDG = 우라실-DNA 글리코실라제; T=19 nt G 함유 주형; U = 18 nt U 함유 기질; AP = 18 nt AP 사이트 함유 제품. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MALDI-TOF 분석을 이용한 UDG의 운동 파라미터 측정. Michaelis-Menten 곡선과 Lineweaver-Burk은 UDG 효소 촉매 DNA로부터 우라실을 절제하기 위한 Km 및 kcat을 결정하기 위해 플롯을 그립니다. DNA 글리코실라제 MALDI-TOF MS 분석은 30 s 및 60 s 동안 100 μL 반응에서 0.1 유닛의 UDG 및 상이한 농도 (10, 30, 60, 100, 200 nM)의 기질을 사용하여 수행되었다. 오차 막대는 1SD를 나타낸다. (B) 검정에 대한 라인위버-버크 플롯; 표시된 인터셉트는 Km 및 Vmax 계산을 허용합니다. (c) MALDI-TOF MS 분석에 의한 UDG 분석과 비교하여 제조업체-할당 유닛. 효소 활성은 37°C에서 30분 동안 18/19 nt DNA 듀플렉스 내에 G:U의 50 pmol (0.56 μg)을 함유하는 10 μL 반응에서 AP 부위를 형성하는 우라실 제거에 의해 측정되었다. UDG를 얼음 상에서 완충액 [50% 글리세롤, 20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 30 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨]로 희석하였다. 단위는 분당 60 pmol의 우라실의 방출을 촉매하는 효소의 양으로 정의되었다. 오차 막대는 여섯 실험의 표준 편차를 보여줍니다. 이 수치는 43에서 수정되었습니다. 약어: nt = 뉴클레오티드; MALDI-TOF = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간; UDG = 우라실-DNA 글리코실라제; AP = 아푸린산/아피리미딘성; V, 반응 속도 nM/s. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: UGI의 첨가에 의한 UDG 효소 억제 곡선. 억제 곡선은 0.001 유닛 (5 pM)에서 0.1 유닛 (200 pM)까지 UGI의 존재하에 15 분 동안 0.05 유닛의 UDG (8 pM) 및 50 pmol의 기질과 20 μL의 반응을 사용하여 결정되었다. 데이터는 세 가지 독립적인 결정의 평균이며, 오류 막대는 온라인 IC50 계산기에 적합한 1개의 S.D. 데이터를 나타냅니다( 재료 표 참조). 이 수치는 43에서 수정되었습니다. 약어: UDG = 우라실-DNA 글리코실라제; UGI = 우라실 글리코실라제 억제제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| DNA 기질 | 올리고뉴클레오티드 | DNA 시퀀서 | 초기 비율 | k 고양이 | |
| (pmol/초) | (s-1) | ||||
| ssU+9 | U+9 | 5'-가카gtcUGGACGTTGG-3' | 0.560 ± 0.098 | 35 | |
| ssU+3 | U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | 0.756 ± 0.083 | 47.3 | |
| ssU-3 | U-3 | 5'-가카그ccggacgtUGG-3' | 0.448 ± 0.087 | 28 | |
| G:U | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.149 ± 0.046 | 9.31 | |
| U+9 | 5'-가카gtcUGGACGTTGG-3' | ||||
| A: U | T2 | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0.053 ± 0.018 | 3.31 | |
| U+9 | 5'-가카gtcUGGACGTTGG-3' | ||||
| G : U5 '+ 3 | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.256 ± 0.044 | 16 | |
| U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G : U5 '+ 2 | T3 | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.567 ± 0.016 | 35.4 | |
| U+2 | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G : U5 '+ 1 | T4 | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 증권 시세 표시기 | ND | |
| U+1 | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G: U3'-3 | T5 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0.138 ± 0.015 | 8.63 | |
| U-3 | 5'-가카그ccggacgtUGG-3' | ||||
| G: U3'-2 | T6 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' | ND | ND | |
| U-2 | 5'-가카그ccggacgttUG-3' | ||||
| G : U3 '-1 | T7 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | ND | ND | |
| U-1 | 5'-가카그카그카gtgttgU-3' | ||||
표 1: 기질 조성물 및 UDG 특이성. 이 표는 U±N에 의해 지정된 18 nt U-함유 DNA를 보여준다. '+'는 5' 종점에서 우라실 위치를 세는 것을 나타내고, '-'는 3' 종점에서 우라실 위치를 세는 것을 나타냅니다. 예를 들어, U+9는 5' 종점에서 9번째 위치이고, U-3은 3' 종점에서 3번째 위치입니다. T1 내지 T7의 상보적인 19 nt 주형은 지시된 바와 같이 G:U 또는 A:U 미스매치를 형성하는 U-함유 DNA와 짝을 이룬다. 우라실 기지는 대담합니다. 반응은 프로토콜 섹션 2에 기재된 바와 같이 10 μL의 U 기질 0.05 유닛, 0.05 유닛의 U 기질을 사용하였다. 이 테이블은 43에서 수정되었습니다. 약어: UDG = 우라실 DNA 글리코실라제; nt = 뉴클레오티드; ND, 감지할 수 없습니다.
| 2차 PCRP | 1차 PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | PcGC | 경고 | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_ 전화 | EXT1_ 질량 |
| 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | 북미 | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
표 2 : 파일 I.xlsx 파일. 설정은 그림 1B, C 및 그림 2A에 사용되었습니다. 0 분 항목. 본 연구에 사용된 MALDI-TOF MS 시스템은 증폭된 유전자 서열 변이의 영역 내로의 확장된 프라이머의 단일 뉴클레오티드 확장에 의해 단일 뉴클레오티드 다형성을 분석하도록 특별히 설계되었다. UDG 분석의 경우, 분석 그룹 FILE I. 약어를 제조할 때 단지 여섯 개의 필드만이 사용되었다: WELL = 분석에 할당된 웰 번호; 용어 = 종단 혼합; SNP_ID = 단일 뉴클레오티드 다형성의 입력 서열의 이름; 2nd-PCRP = 정방향 앰플리콘 프라이머; 1st-PCRP = 역방향 앰플리콘 프라이머; AMP_LEN = 앰플리콘 길이; UP_CONF = 단이중 증폭 점수; MP_CONF = 멀티플렉스 증폭 점수; Tm = 용융 온도; PcGC = 퍼센트 GC 함량; PWARN = 분석 설계 경고 코드; UEP_DIR = 프라이머 연장의 방향; UEP_MASS = 연장되지 않은 프라이머 질량; UEP_SEQ = 연장되지 않은 프라이머 서열; EXT1_CALL = 분석물 1 질량 피크에 주어진 이름; EXT1_MASS = 분석물의 질량 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
| 0620_1-8 |
표 3: 0620.xlsx 파일. 이들 설정은 도 4A의 UGI 억제 반응을 위해 사용되었다. 약어: UGI = 우라실 글리코실라제 억제제.
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Discussion
이 논문은 UDG MALDI-TOF MS 분석 방법을 사용하여 AP 함유 DNA 생성물을 직접 검출하기 위한 상세한 절차를 제공한다. 이 방법의 주요 장점은 우라실 함유 기판이 라벨이 없고 확장 가능하며 작업하기 쉽고 기판 설계에 더 큰 유연성을 제공한다는 것입니다.
UDG 공급업체가 권장하는 페놀/클로로포름 추출은 효소의 불활성화를 가능하게 하여 생성물 DNA의 분해를 방지합니다. 그러나 페놀 추출 프로토콜은 유해 화학 물질의 지루한 상 분리를 포함합니다. 반응 pH를 2 내지 0.5로 낮추기 위해 HCl을 사용하는 대안적인 산 종결 방법도 UDG±를 효과적으로 불활성화시켰다. 트리스 염기를 사용한 후속 중화는 DNA 손상을 예방할 수 있었다. AP 생성물이 30시간 이내에 MS 분석을 실시했을 때, 질량 스펙트럼에서 염기 손실 또는 변형의 징후는 없었다(도 1E). 반응에서 트리스 완충제를 상용 UDG와 함께 제공하였다. 그러나, 트리스를 포함한 다양한 아민은 높은 시약 농도에서도 베타 제거를 통해 AP 부위를 절개할 수 있다44. HEPES 및 포스페이트 버퍼와 같은 일부 대안은 베타 제거에 의한 AP 부위의 절단 위험을 피하기 위해 고려될 수 있다.
잠재적인 UDG 참조 방법으로서, 다음과 같은 이유로 중심을 잡은 G:U 기질의 이중(표 1, T1/U+9)이 표준 기질로 권장된다: 1. 생리학적 관련성을 위해, G:U는 G:C 쌍에서 시토신을 탈아민화함으로써 G:U 병변을 초래하기 때문에 A:U보다 우수하다. 2. 대장균 UDG가 단일 가닥 DNA로부터 U를 가수분해하는 데 더 높은 특이성을 입증하는 반면, 단일 가닥 DNA에서 U 병변의 복구는 드물다. 3. 테스트 된 모든 G : U 기질에 대해 G : U + 2 및 G : U + 3은 G : U + 9보다 높은 반응 속도를 보여주었습니다. 그러나, 가닥 파단에 인접한 DNA 탈아민화 병변은 드물다. 네이티브 병변을 모방하기 위해서는 DNA 듀플렉스의 중앙에 G : U를 배치하는 것이 더 적절합니다.
흥미롭게도, MALDI-TOF MS 방법은 UDG 동역학적 파라미터를 생성하고, G:U 반응의 효소 단위(도 3A-C)는 3H-uracil38을 사용하여 통상적으로 유도된 결과와 매우 유사하였다. 그러나, 본 연구에서 단일 G:U 기질은 DNA 합성 오류38로부터 다중 A:U로 이전에 기술된 PBS1 박테리오파지 DNA와 매우 다르다. 더욱이, UDG는 A:U 기질보다 G:U에서 3배 더 높은 활성을 보였다(표 1, G:U의 Km 및 Kcat은 A:U 대 A:U). 이러한 겉보기에는 모순된 결과는 다수의 A:U 병변의 형태로 U의 36%를 포함하는 PBS1 기질의 DNA 서열에 기인할 수 있다.45 G에서 U의 단지 3%에 비해: U 기질 (표 1). 한편, UDG는 매우 '가공성' 효소, 즉 단일 단백질-DNA 결합 사건이 다중 우라실 절단을 유도한다12. 이 두 UDG 방법 사이의 거의 완벽한 일대일 상관 관계의 발견은이 MS 방법을 전통적인 방사성 동위 원소 분석 대신 매력적인 옵션으로 만듭니다.
이 접근 방식은 쉽게 확장 가능합니다. 이 연구의 모든 UDG 반응은 마이크로 피펫과 마이크로 원심분리 튜브를 사용하여 수동으로 수행되었으며 주어진 날에 ~ 30 건의 테스트가 수행되었습니다. 따라서, 섹션 3-5에 설명된 MALDI-TOF MS 시스템에 대한 384-웰 플레이트 포맷 칩 어레이의 용량( 표 재료 참조)의 10분의 1 미만이 사용되었다. 대조적으로, 384-웰 마이크로플레이트를 위한 자동화된 피펫팅 시스템의 적응은 산 종결 방법을 사용하여 이 접근법의 일일 출력을 쉽게 증가시킬 수 있었다. 따라서 300 UDG 반응은 ~ 1 시간이 걸릴 것입니다. MALDI-TOF MS 시스템 ( 재료 표 참조)은 1 시간 내에 최대 300 개의 반응에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 출력 할 수 있습니다. 따라서 간소화된 프로세스는 300개의 UDG MALDI-TOF MS 분석을 완료하기 위해 2시간이 필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (대만 타이페이)와 NRPB Pharmacogenomics Lab (대만 타이페이)의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작업은 대만 R.O..C 과학 기술부에서 지원했습니다. [허가 번호 MOST109-2314-B-002 -186 to K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 to S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 to W.-h.F.]. H.-L.C.는 국립 대만 대학에서 박사 학위 펠로우십을 받았습니다. 오픈 액세스 요금에 대한 자금 조달 : 과학 기술부, R.O.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
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