Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uracil-DNA Glykosylasanalys av Matrix-assisterad laserdesorption/joniseringStid för flygning Masspektrometrianalys

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

En icke-märkt, icke-radio-isotopisk metod för att analysera uracil-DNA glykosylas aktivitet utvecklades med maldi-TOF masspektrometri för direkt apurinic/apyrimidinic platsinnehållande produktanalys. Analysen visade sig vara ganska enkel, specifik, snabb och lätt att använda för DNA-glykosylasmätning.

Abstract

Uracil-DNA glykosylas (UDG) är en nyckelkomponent i den grundläggande excisionsreparationsvägen för korrigering av uracil som bildas av hydrolytisk deamination av cytosin. Därför är det avgörande för genomintegritetsunderhåll. En mycket specifik, icke-märkt, icke-radio-isotopisk metod utvecklades för att mäta UDG verksamhet. En syntetisk DNA duplex som innehåller en plats-specifika uracil klyvs av UDG och sedan utsattes för Matrix-assisterad laser desorption/jonisering tid-av-flygning masspektrometri (MALDI-TOF MS) analys. Ett protokoll upprättades för att bevara den apurinic/apyrimidinic plats (AP) produkten i DNA utan strandbrytning. Förändringen i m/z-värdet från substratet till produkten användes för att utvärdera uracil hydrolys av UDG. Ett G:U substrat användes för UDG kinetisk analys som gav Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s och Kcat = 9,31 s-1. Tillämpningen av denna metod på en uracil glykosylashämmare (UGI) visade ett IC50-värde på 7, 6 pM. UDG-specificiteten med hjälp av uracil på olika positioner inom enkelsträngade och dubbelsträngade DNA-substrat visade olika klyvningseffektivitet. Således kan denna enkla, snabba och mångsidiga MALDI-TOF MS-metod vara en utmärkt referensmetod för olika monofunktionella DNA-glykosylaser. Det har också potential som ett verktyg för DNA glykosylashämmare screening.

Introduction

Även om uracil är en normal bas i RNA, är det en vanlig och mycket mutagena lesion i genomisk DNA. Uracil kan uppstå från spontana/enzymatiska hydrolytiska deamination av en deoxycytidin. I varje levande cell sker denna deamination 100-500 gånger per dag under fysiologiska förhållanden1,2. Om dessa förändringar inte repareras kan det ske en förändring i DNA-sekvenssammansättningen, vilket orsakar mutation. Som uracil i DNA föredrar att para ihop med dATP under replikering, om cytosin deaminerar till uracil, i två replikeringshändelser, kommer det att finnas en ny G:C till A: T övergångsmutation i hälften av avkomman DNA3.

Bland de cellulära strategierna för att upprätthålla genetisk stabilitet är basexcisionsreparation (BER) en viktig mekanism som reparerar skadade baser, såsom uracil, i DNA4. BER är en mycket evolutionärt bevarad process. Det finns två allmänna BER-vägar: kortplåstervägen som leder till ett reparationsorgan av en enda nukleotid och den långa plåstervägen som producerar ett reparationsområde på minst två nukleotider5. BER är en samordnad mekanism som sker i flera steg. Det första steget i BER är den enzymatiska hydrolysen av den skadade nukleotidbasen genom en skadespecifik DNA-glykosylas för att generera en apurinisk/apyrimidinisk (AP) mellanliggande plats6. Detta följs av klyvningen av sockerfosfatstommen på AP-platsen genom en endonukleas, sanering av DNA-ändarna med en lyas, gapfyllning av ett DNA-polymeras och förseglar det sista smeknamnet med en ligase5.

Uracil-DNA glykosylas (UDG) hydrolyserar uracilen från uracilinnehållande DNA för BER i Escherichia coli. Konventionella UDG-analyser som använder radiomärkt DNA med olika separationstekniker6,7,8,9,10,11,12,13 är vanligtvis tidskrävande, arbetsintensiva, med kostsamma märkning av reagenser, komplicerade förfaranden och kräver intensiv utbildning och övning för att minska riskerna för exponering för radioaktiva material. Fluorometriska oligonukleotidanalyser har utvecklats som en ersättning för radioisotopemärkning14, förutom molekylära fyrar och Försters resonansenergiöverföringsteknik15,16,17,18,19,20. Särskild märkning krävs dock för alla ovannämnda metoder. Nyligen etikettfria biosensorer analyser21,22,23 och kolorimetriska metoder baserade på bildandet av en G-quadruplex24,25,26 har utvecklats. Flera A:U-par eller specialdesignade sekvenser i sonderna komplicerar dock enzymenhetsdefinitionen.

MALDI-TOF MS är en teknik som kan vara till stor nytta i DNA-analys. Tillämpningar som utvecklats inkluderar single-nucleotide polymorphism genotyping27,28, modifierad nukleotidanalys29 och DNA-reparation mellanliggande identifiering30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS bör lätt antas för DNA-glykosylasanalys för att upptäcka DNA-produkter som innehåller AP-plats. AP-platser i DNA är dock benägna att stranda under många experimentella förhållanden33. En UDG-analys presenteras här med MALDI-TOF MS för att direkt mäta produktionen av AP-anläggningen utan betydande strandbrytningsbuller. Denna etikettfria metod är lätt att arbeta med och har en hög potential för läkemedelstillämpning av DNA-glykosylashämmare screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av substrat/mall

  1. Designa uracil substrat/mall duplex med en balanserad G +C-innehåll på ~50 ± 10% och minsta smälttemperatur på 50 °C för duplexregionen.
    OBS: En nukleotidskillnad mellan 18 ton substrat och 19 ton mallar (tabell 1 och figur 1) hjälper till att förbättra MS-signaltolkningen och lämplig glödgning. Mallsträngen fungerar som kompletterande DNA för att generera A-U- eller G-U-missmatchningar (tabell 1) men kan också användas som referenssignal i MS-mätningar. Användningen av HPLC-renade syntetiska oligonukleotider är tillfredsställande för denna studie.
  2. Lös upp DNA i 1 mM EDTA och 10 mM Tris-HCl(pH 8,0 vid 25 °C) (TE) vid en koncentration av 100 μmol/L som lager och förvara vid -20 °C. Späd detta 20 μL-lager med TE till en slutlig volym på 800 μL (25-faldig utspädning till 4 μmol/L). Mät absorbansen av DNA-lösningen i en UV-synlig spektrofotometer vid λ = 260 nm för att säkerställa tillverkarens tilldelade koncentration. Till exempel: A260 = 0,204 för 4 μmol/L U+9 och A260 = 0,192 för 4 μmol/L T1 (tabell 1).
  3. Utför MALDI-TOF MS-analys (avsnitten 4–6) för kvalitetskontroll av oligonukleotid genom att inspektera unika toppsignaler vid angivna m/z-värden samt genom att kontrollera att signal-till-brus-förhållandet är >100 (figur 1B och figur 1D).

2. DNA-glykosylasanalys

  1. Använd ett G:U-substrat av T1/U+9 duplex (tabell 1 och figur 1A) för glykosylasreaktionen, till exempel i ett 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerör, tillsätt 70 μL H2O, 10 μL 10x UDG-reaktionsbuffert, 5 μL T1-buljong och 5 μL U+9-bestånd (steg 1).
    OBS: Välj rätt typ av mikropipett och följ tillverkarens instruktioner för att hantera önskad volym. Använd till exempel en 2 μL-pipett för att dispensera 0,1–2 μL vätska, använd en 10 μL-pipett för att dispensera 2–10 μL vätska och använd en 100 μL-pipett för att dispensera 20–100 μL vätska för att säkerställa att resultaten är korrekta och precision. Den beskrivna volymen av reagensblandningen är för 10 analyser. justera volymen för önskat antal reaktioner. 1x UDG reaktionsbufferten innehåller 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol och 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 vid 25 °C). Se materialförteckningen för källan till 10x UDG-reaktionsbuffert.
  2. Stäng röret ordentligt; inkubera i ett vattenbad i 30 min vid 65 °C, sedan i 30 min vid 37 °C och slutligen på is i 3 minuter för att säkerställa korrekt glödgning av substratet/mallduplexen.
  3. I ett 1,5 ml sterilt mikrocentrifugerör tillsätt 49 μL iskall 1x UDG-reaktionsbuffert och 1 μL UDG (5 000 enheter/ml; se materialtabellen), späd till 0,1 enheter/μL. Gör alltid seriella utspädningar med 1x UDG-buffert till önskade enzymkoncentrationer på 0,05, 0,0.
    OBS: I en 10 μL-reaktion kan 0,1 enheter UDG klyva mer än 30 pmol uracil från en T1/U +9 duplex på 3 min.
  4. Tillsätt 9,0 μL substratblandning från steg 2,2 i ett sterilt mikrocentrifugerör på 1,5 mL och förvarna röret till 37 °C. Tillsätt 1,0 μL av den utspädda UDG från steg 2,3. Använd en timer för att tajta reaktionen och snärta röret för att blanda innehållet.
    OBS: För en enhetsdefinitionsanalys är inkubationstiden 30 min. För en kinetisk analys, använd en tidskursanalys på 0,5, 1, 2, 3, 5 min för att få den ursprungliga hastigheten. För en UGI-hämningsanalys, tajmen reaktionen i 15 minuter.
  5. Centrifugera rören med reaktionsblandningen i 3-5 s vid 3 200 × g vid omgivningstemperatur. Överför sedan reaktionen omedelbart till 37 °C.
  6. Reaktionsavslut
    1. Förbered lösningar på 0,25 M HCl och 0,23 M Tris-basen. I ett provrör på 15 mL tillsätt 10 ml lösning på 1 mM EDTA och 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 vid 25 °C) för att efterlikna 1x UDG reaktionsbuffert. Surna med 1 ml 0,25 M HCl och kontrollera med ett pH-mätare för att säkerställa att pH-värdet är ~2 ± 0,5. Neutralisera med 1 ml 0,23 M Tris-bas och kontrollera med ett pH-mätare för ett slutligt pH på 6,5 ± 0,5.
      OBS: Att använda pH-testremsor är ett snabbt och enkelt sätt att bekräfta pH-nivåerna i reagensblandningen.
    2. Tillsätt 1 μL på 0,25 M HCl för att försura reaktionsblandningen på 10 μL för att inaktivera enzymet och placera det på is i 6 minuter. Tillsätt 1 μL 0,23 M Tris-basen för att neutralisera DNA-produkterna för att undvika att AP-platsen bryts genom långvarig exponering för syra. Tillsätt 13 μL TE för att öka volymen på produktblandningen för överföring av matrischip och placera den sedan på is.
      OBS: AP-produkten är kemiskt instabil och bör analyseras av MALDI-TOF MS inom 2 dagar. Efter långvarig lagring i mer än en vecka sker ackumuleringen av en betydande del av strandbrytningar på grund av β/δ elimineringsreaktioner av AP-produkterna (figur 1D-G).
  7. Överför alla 25 μL UDG-reaktionsprodukter från mikrocentrifugerör till en 384-väl mikrotiterplatta.
    OBS: Höga koncentrationer av katjoner, såsom natrium eller kalium i buffertar, genererar störningar i MALDI-TOF MS-analysen och kräver därför avsaltning. Eftersom E. coli UDG reaktionsbuffert innehåller mycket låga koncentrationer av katjoner är avsaltning inte nödvändig. Ändra dock detta protokoll för att mäta andra DNA-glykosylasreaktioner som innehåller metallkatjoner som kräver avsaltning enligt beskrivningen tidigare35.

3. Överför UDG-reaktionsprodukter till ett matrischip

  1. Öppna dörren till nanoliterdispensern (se materialbordet) och lasta den 384-brunns microtiterplattan från steg 2.7 på däckets plåthållare.
  2. För in matrischipmatrisen i motsvarande scoutplatta. Placera den laddade spaningsplattan på nanoliterdispenserns bearbetningsdäck och stäng dörren.
  3. Tryck på körningsknappen på överföringsskärmen och vänta tills instrumentet börjar dela ut prover från 384-brunnsmikrotiterplattan till matrischipet.
  4. Använd fliken Vision för att visa bilden av chipet och dispensvolymerna för varje plats under dispensering. Se till att den prickiga volymen på chipet ligger inom intervallet 5-10 nL.

4. Ställ in analysparametrarna på masspektrometern

  1. Använd programprogrammet (se tabellen över material) för att förbereda en .xlsx fil som innehåller det förväntade signal m/z-värdet för import.
    Inställningarna i FIL I.xlsx (tabell 2) är exempelinställningar för UDG-analysen av G:U-substrat i avsnitt 2.
  2. Använd programmet för att skapa och definiera en ny UDG-analys genom att högerklicka på alternativet Importera analysgrupp i designerformat och välja .xlsx-filen i listrutan (t.ex. FIL I.xlsx från steg 4.1).
  3. Högerklicka på knappen Customer:Project:Plate och klicka längst upp i listrutan för att upprätta en ny analysplatta. I dialogrutan skriver du in ett filnamn (t.ex. CTT20210620 för labbkoden och analysdatumet) och väljer 384-brunnsplåtstypen i listrutan 384 och trycker på OK. Leta efter en tom platta som visas till höger på skärmen.
  4. Klicka på alternativet Analys . välj analysen (t.ex. FIL I.xlsx) i listrutan.
  5. Om du vill tilldela den valda analysen (t.ex. FIL I.xlsx) till varje provpunktplats på plattan flyttar du markören till varje plats på den tomma plattan, klickar för att markera brunnen och högerklickar för att välja Lägg till Plex.
  6. Använd en stationär eller bärbar dator för att förbereda en arbetslista i .xlsx format utan rubrik (t.ex. 0620.xlsx i tabell 3) för alla prover på chipet från steg 2.7. Klicka på knappen Lägg till nytt exempelprojekt . välj filen (t.ex. 0620.xlsx) i listrutan för att importera arbetslistan.
  7. Leta efter alla provkoder i arbetslistan (t.ex. från 0620.xlsx) till vänster på skärmen. Klicka på exempelkoden i arbetslistan och högerklicka på plattans motsvarande position för att länka testerna till varje position.

5. Masspektrometerdrift

  1. Använd applikationsprogrammet för att länka masspektrometern (se materialtabellen) till provchipet (från avsnitt 3) som ska analyseras.
  2. Klicka på standardinställningen. Skriv in ett filnamn från steg 4.3 (t.ex. CTT20210620) i dialogrutan). I experimentnamnet skriver du in chip-ID:t i chipstreckkoden och sparar inställningarna.
  3. Starta masspektrometerkontrollprogrammet (se tabellen över material).
  4. Tryck på in/ut-knappen på masspektrometern och låt däcket sträcka sig. Ta ut spånhållaren och för in provchipet från steg 3.4 i spånhållaren. Placera den laddade spånhållaren på det förlängda däcket och tryck på in/ut-knappen för att provchipet ska komma in i instrumentet.
  5. Dubbelklicka på ikonen Hämta i programprogrammet. I fönstret Hämta klickar du på fliken Auto Run för att starta instrumentet och skaffa massspektra från exemplen på chipet.

6. Visa masspektra och analysera data

  1. Kör dataanalysprogrammet (se materialförteckningen).
  2. Bläddra i databasträdet och välj chip-ID från steg 5.2. Klicka här om du vill markera ett mål väl på chipet och klicka på spektrumikonen för att visa massspektrumet.
  3. Högerklicka här om du vill välja Anpassningsdialogruta om du vill beskära ett visst spektrumområde i ett nytt fönster. Klicka på X-axeln för att skriva in de övre och nedre gränserna för m/z och tryck på OK för att visa det angivna intervallspektrumet, inklusive signaler av intresse.
    OBS: Mängden DNA står i proportion till toppintensiteten vid varje m/z-värdeenhet.
  4. Mät topphöjden för signalernas m/z-värden motsvarande U-substrat, AP-produkt och mall. Klicka på toppen och visa topphöjden i det övre vänstra hörnet av skärmen.
    OBS: Ett spektrum av 1 600 bredd/1 200 enheter är en rimlig dimension för inspektion på en datorskärm såväl som för registrering.
  5. Om du vill spara spektrumet för postunderhållning högerklickar du på Exportera och väljer JPEG-filtyp i listrutan. Klicka på Mål och Bläddra skiva för att välja lagringsenheten i listrutan (t.ex. flashskiva E:). Skriv filnamnet (t.ex. 0620_1-2.jpg) och klicka på Exportera.
  6. Om det behövs skriver du ut en exporterad JPEG-fil och mäter topphöjden manuellt med hjälp av en linjal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mallar och substrat
Med syntetiska oligonukleotider med U i mitten (U+9) parat med en G-mall som exempel (figur 1A), kan en tom kontroll av likmolära mängder mall och uracilhaltigt substrat användas för kvalitetskontroll av syntetisk oligonukleotidrenhet (figur 1B; signalerna matchar den angivna m/z och det låga bakgrundsljudet). För analysen av MS-data mättes topphöjderna (figur 2). 19 nt mall DNA förväntades förbli oförändrade efter glykosylas hydrolys; Signalen skulle därför kunna fungera som referens för kvantiteten av AP-produkten (figur 1C).

Reaktionstillstånd och masspektra
Denna DNA-glykosylasanalys är enkel och enkel att utföra med hjälp av en icke-märkt oligonukleotid för en standardsa reaktion för att få rena och tillförlitliga resultat (figur 1). Utbudet av MS-spektra bör omfatta alla signaler som genereras från substrat, mallar och reaktionsprodukter (figur 1B). Skillnaden på 1 nt mellan substratet och motsvarande mall gav en väl separerad signalprofil för både mallen och substratet (figur 1B). Equimolar primers U +9 och T1 visade liknande toppintensiteter utan signifikanta skillnader. Omfattande matsmältning av UDG (0,5 enheter för en 30 min reaktion) visat fullständig uracil klyvning. Signalen från AP-produkten var också väl skild från signalen från det uracilhaltiga substratet (figur 1C d+9 AP-produkt m/z = 5447,6 jämfört med figur 1B U+9 substrat m/z = 5541,6). Den relativt milda MALDI joniseringsteknik36 som används i denna studie minimerade signalerna i samband med strandbrytningar inducerad av β-elimineringsreaktion vid AP-platser37, som inte var signifikanta i masspektra. Sammantaget är reaktionsbakgrunden mycket ren utan märkbart brus (figur 1C).

Under hästförhållanden var AP-produktens relativa signalintensitet jämförbar med U-substratets som referens (figur 1B, U+9/T1 jämfört med d+9/T1). Beräkningen av UDG-aktivitet baseras således på den exakta inmatningen av det U-innehållande substratet (50 pmol eller 20 pmol) enligt Eq (1).

UDG-aktivitet = (signal av AP-produkt) / (Signal av U-substrat + signal av AP-produkt) × [U] (1)

UDG kinetiska parametrar som bestäms av MALDI-TOF MS-analys
Som visas i figur 2 visade UDG-reaktioner från 0, 01 enheter till 0, 1 enheter både dos- och tidsberoende. En koncentration på 3,2 pM (0,1 enheter per 100 μL-reaktion) användes för bestämning av de kinetiska parametrarna, Km och kcat, för ett G:U-substrat (tabell 1). Alikvoterna i UDG reaktionen togs bort och släckts för 30 s och 60 s. Kinetiska data erhölls under förhållanden då det uracil-innehållande substratet var mindre än 50% smält och fem substratkoncentrationer från 10 till 200 nM utsattes för analys. Presteady-state tidskursen visade utmärkt linjäritet för hastighetsanalys. Ett exempel på ett reaktionshastighetsdiagram visas i figur 3A, där produktens och substratets relativa MS-signalintensiteter omvandlas till koncentration (nM). UDG-reaktionshastigheten (v) presenteras som nM för den ap-plats som produceras per sekund. Km och Vmax beräknades från en Lineweaver-Burk-tomt (figur 3B). De UDG kinetiska parametrar som härletts från MALDI-TOF MS-analysen fastställdes således vara Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1 och Kcat = 9,31 s-1. Värdena är jämförbara med resultaten från tidigare 3H-uracil-frisläppande analyser där Km = 40 nM och Kcat = 13,3 s-138. 

G:U+9 duplex utsattes för UDG känslighet analyser. Den enhet som mättes med MALDI-TOF MS-analys ritades mot tillverkarens definierade enhet med en konventionell 3H-uracil-frisläppande metod38. Som visas i figur 3C var den MALDI-TOF MS-uppmätta enheten proportionell mot den definierade enheten från 0,001 enheter till 0,02 enheter med korrelationsekvationen y = 0,933x + 0,0003 och bestämningskoefficienten R2 = 0,9974. Detektionsgränsen är 0,001 enheter som variationskoefficient = 9,2 %, ~5 gånger signal-till-brus-förhållandet. Denna MALDI-TOF MS-analys ger således tillräcklig känslighet eftersom UDG oftast används på enhetsnivå39.

UDG:s substrat specificitet
En av de karakteristiska egenskaperna hos denna UDG MALDI-TOF MS-analys är att den är etikettfri, vilket ger hög mångsidighet för substratdesign. Denna funktion är mycket användbar för att analysera UDG: s substrat specificitet. Som framgår av tabell 1 kan uracil införas var som helst nära 5' eller 3' änden av enkelsträngat eller dubbelsträngat DNA för en specificitetsanalys. För substrat specificitet är det välkänt att UDG är mycket aktiv i att ta bort uracil från enkelsträngat DNA38. Som visas i tabell 1 minskade uracil excision från enkelsträngat substrat (ssU) 3,7 gånger när glödgat till den kompletterande DNA-strängen och bildade G:U duplex. För den vanliga A:U duplex6,7,8 sänktes reaktionshastigheten ytterligare med nästan 10 gånger i förhållande till ssU. UDG agerade inte på U vid DNA-ändstationen (tabell 1 substrat av G:U+1, G:U-1 och G:U-2), vilket överensstämmer med tidigare studier40,41. Intressant nog uppvisade U på 2: a och 3: e positionerna från 5'-ändstationen en högre UDG-katalytisk frekvens än U i mitten med 2-faldig respektive 1,5-faldig (tabell 1, G:U + 2 och G: U + 3 mot G:U). UDG strukit U 3-nt från 3'-end med 8% mindre aktivitet än U vid mitten (Tabell 1, G: U + 3 mot G:U). UDG strukit U 3-nt från 3'-end med 8% mindre aktivitet än U vid mitten (Tabell 1, G: U + 3 mot G:U). UDG strukit U 3-nt från 3'-slutet med 8% mindre aktivitet än U vid mitten (Tabell 1, G:U +3 mot G:U). UDG strukit U 3-nt från 3'-end med 8% mindre aktivitet än U vid mitten (Tabell 1, G:U +3 mot G:U). UDG strukit U 3-nt från 3'-end med 8% mindre aktivitet än U vid mitten (Tabell 1, G:U +3 mot G:U). UDG strukit U 3-nt från 3'-end med 8% mindre aktivitet än U vid mitten (Tabell 1, G:U +3 mot G:U). UDG strukit U G:U-3 mot G:U).

Uracil glykosylashämmare hämning av UDG-reaktionen
Uracil glykosylashämmare (UGI) är ett bakteriofagprotein som hämmar E. coli UDG genom reversibel proteinbindning med en stökiometri på 1:142. Hämningen av UDG-aktivitet med UGI visas i figur 4. I närvaro av 0,05 enheter (100 pM) UGI hämmades aktiviteten hos 0,05 enheter UDG (8 pM) till en oidentifierbar nivå. IC50 var 7,6 pM. Således kan UDG MALDI-TOF MS-analysen enkelt ändras till en massscreeningsanalys för upptäckt av hämmare av andra DNA-glykosylaser.

Figure 1
Figur 1: Modellsystem för en DNA-glykosylasanalys. (A) Lesionssträng som innehåller en enda uridin (U+9) glödgades till en mall (T1), vilket bildar en G:U-matchning (fet). Uracil-DNA glykosylas detekterar och tar bort uracilen och bildar en AP-plats (d). När det utsätts för MALDI-TOF MS kan skillnaden i m/z-värden mellan U-innehållande DNA- och AP-produkter lösas enligt B. B) Ett 18 nt DNA som innehåller en enda uridin (U+9) som glödgats till en 19 nt-mall (T1) (tabell 1) testades som ett enzym som var blindt på 50 pmol substrat i 40 μL reaktionsbuffert och genomgicks av MS-analys. C) En nästan fullständig enzymrötning av 50 pmol substrat i en 10 μL-reaktion med 0,5 enheter UDG vid 37 °C under 30 min. (E) En nästan fullständig enzymrötning av 50 pmol U+3 substrat i en 10 μL-reaktion med 0,5 enheter UDG vid 37 °C i 30 minuter för att producera d+3 och utsattes för MS-analys inom 30 h. (F) Reaktionsförhållandet var detsamma som i E utom d+3-produkten var i 0,1 M NaOH vid 95 °C för 30 °C för 30 °C för att utlösa en beta-elimineringsreaktion och föremål för MS-analys. g) Reaktionstillståndet var detsamma som i E, förutom att d+3-produkten förvarades vid -20 °C i mer än 7 dagar. en bråkdel av d+3 som omvandlats till B15-fragmenterade produkter. Denna siffra ändras från 43. Förkortningar: nt = nukleotid; MS = masspektrometri; MALDI-TOF MS = Matrisassisterad laserdesorption/joniseringstid för flygning MS; AP = apurinic/apyrimidinic; UDG = Uracil-DNA glykosylas; T1 = 19 nt G-innehållande mall; U+9 = 18 nt U-innehållande substrat; d+9 = 18 nt AP platsinnehållande produkt; U+3 = 18 nt U-innehållande substrat; d+3 = 18 nt AP platsinnehållande produkt; B15 = 15 nt beta-eliminering fragmenterad produkt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Tidskursanalys för UDG-aktivitet vid olika enzymkoncentrationer. Substrat DNA, 50 pmol, som innehåller en G:U lesion inkuberades med 0,01, 0,02, 0,05 och 0,1 enheter UDG vid 37 °C. Alikvoter (10 μL) togs från reaktionsblandningen vid 0, 0, 5, 1, 2 och 3 min och släckts med en lika stor mängd fenol/kloroform. A) Masspektrat maldi-tof som illustrerar koncentrationsberoendet av bearbetning av G:U-substrat från UDG:s behandling. B) Mängden produkt ritades som en funktion av tiden. UDG: 0,01 (slutna trianglar med heldragen linje), 0,02 (öppen triangel med streckad linje), 0,05 (sluten cirkel med heldragen linje) och 0,1 enheter (öppna cirklar med heldragen linje). Uppgifterna är medelvärden för tre oberoende bestämningar, och felstaplarna representerar 1 S.D. Denna siffra ändras från 43. Förkortningar: nt = nukleotid; MALDI-TOF = Matrisassisterad laserdesorption/joniseringstid för flygning. AP = apurinic/apyrimidinic; UDG = Uracil-DNA glykosylas; T = 19 nt G-innehållande mall; U = 18 nt U-innehållande substrat; AP = 18 nt AP platsinnehållande produkt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Bestämning av kinetiska parametrar för UDG med hjälp av MALDI-TOF-analys. Michaelis-Menten kurva och Lineweaver-Burk plottar för att bestämma Km och kcat för UDG enzym-katalyserad excision av Uracil från DNA. DNA glykosylas MALDI-TOF MS-analys utfördes med hjälp av 0, 1 enheter UDG och olika koncentrationer (10, 30, 60, 100, 200 nM) substrat i 100 μL reaktion för 30 s och 60 s. (A) Michaelis-Menten kurvade från tre oberoende experiment. Felstaplarna representerar 1 SD. (B) Lineweaver-Burk-plot för analysen. de angivna avlyssningarna tillåter beräkning Km och Vmax. C) UDG-analys genom MALDI-TOF MS-analys jämfört med den enhet som tilldelats av tillverkaren. Enzymaktiviteten mättes genom uracilborttagning som bildar AP-plats i en 10 μL-reaktion som innehöll 50 pmol (0,56 μg) G:U inom en 18/19 nt DNA-duplex i 30 min vid 37 °C. UDG späddes ut med buffert [50% glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] på is. En enhet definierades som mängden enzym som katalyserade frisättningen av 60 pmol uracil per minut. Felstaplar visar standardavvikelsen för sex experiment. Denna siffra ändras från 43. Förkortningar: nt = nukleotid; MALDI-TOF = Matrisassisterad laserdesorption/joniseringstid för flygning. UDG = Uracil-DNA glykosylas; AP = apurinic/apyrimidinic; V, reaktionshastighet nM/s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: UDG enzymhämningskurva genom tillsats av UGI. Hämningskurvan bestämdes med hjälp av reaktioner på 20 μL med 0, 05 enheter UDG (8 pM) och 50 pmol substrat i 15 min i närvaro av UGI från 0, 001 enheter (5 pM) till 0, 1 enheter (200 pM). Data är medelvärden för tre oberoende bestämningar, och felstaplarna representerar 1 S.D. Data som passar med en IC50-kalkylator online (se tabellen över material). Denna siffra ändras från 43. Förkortningar: UDG = Uracil-DNA glykosylas; UGI = uracil glykosylashämmare. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

DNA-substrat Oligonucleotidesa DNA-sekvensb Initial ratec k katt
(pmol/sek) (s-1)
ssU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0.560 ± 0.098 35
ssU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0.756 ± 0.083 47.3
ssU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0.448 ± 0.087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.149 ± 0.046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
A:U T2 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0,053 ± 0,018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G:U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.256 ± 0.044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0,567 ± 0,016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+1 T4 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDD ND
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0.138 ± 0.015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' ND ND
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' ND ND
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

Tabell 1: Substratsammansättningar och UDG-särdrag. Den här tabellen visar det 18 nt U-innehållande DNA som betecknas av U±N. "+" anges räkna uracilpositionen från 5'-ändstationen, och "-" anger att uracilpositionen ska räknas från 3-ändstationen. U+9 är till exempel den 9: e positionen från 5' ändstation, U-3 är den tredje positionen från 3' ändstation. Den kompletterande 19 nt-mallen för T1 till T7 skulle paras ihop med U-innehållande DNA som bildar G:U eller A:U-missmatchningar enligt angivna. Uracil baser är i fetstil. Reaktionerna använde 50 pmol U-substrat, 0, 05 enheter UDG, i 10 μL enligt beskrivningen i protokoll avsnitt 2. Tabellen ändras från 43. Förkortningar: UDG = uracil DNA glykosylas; nt = nukleotid; ND, inte detekterbart.

2:a-PCRP 1:a-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_ SAMTAL EXT1_ MASSA
NA NA NA NA NA NA NA F 5789.8 GCCAACGTCCGGACTGGTC
NA NA NA NA NA NA NA F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

Tabell 2: ARKIV Jag .xlsx fil. Inställningarna användes för figur 1B, C och figur 2A. 0 min poster. MALDI-TOF MS-systemet som används i denna studie utformades specifikt för att analysera enstaka nukleotidpolymorfism genom en enda nukleotid förlängning av den utökade primern till regionen för förstärkt gensekvens variation. För UDG-analys användes endast sex fält vid utarbetandet av analysgruppen FIL I. Förkortningar: WELL = det brunnsnummer som tilldelats analysen; TERM = uppsägningsmix; SNP_ID = namn på indatasekvensen för den enda nukleotidpolymorfismen; 2nd-PCRP = framåt amplicon primer; 1st-PCRP = omvänd ampliconprimer; AMP_LEN = ampliconlängd; UP_CONF = uniplex förstärkningspoäng; MP_CONF = multiplexförstärkningspoäng; Tm = smälttemperatur; PcGC = procent GC-innehåll; PWARN = varningskoder för analysdesign; UEP_DIR = riktning för primerförlängning; UEP_MASS = ej utextenderad primermassa; UEP_SEQ = sekvens med ej uttöend primer; EXT1_CALL = namn som ges till analyt 1-masstoppen; EXT1_MASS = massa av analyt 1.

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

Tabell 3: 0620.xlsx fil. Dessa inställningar användes för UGI-hämningsreaktionerna i figur 4A. Förkortning: UGI = uracil glykosylashämmare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument ger en detaljerad procedur för att använda en UDG MALDI-TOF MS-analysmetod för att direkt upptäcka AP-innehållande DNA-produkter. De främsta fördelarna med denna metod är att uracilhaltiga substrat är etikettfria, skalbara, lätta att arbeta med och ger större flexibilitet i substratdesign.

UDG-leverantörsrekommenderad fenol/kloroform extraktion möjliggör inaktivering av enzymet för att förhindra nedbrytning av produktens DNA. Fenol extraktion protokollet innebär dock tråkig fas-separation av farliga kemikalier. En alternativ syratermineringsmetod med HCl för att sänka reaktionspH till 2 ± 0,5 också effektivt inaktiverad UDG. Efterföljande neutralisering med Tris bas kan förhindra DNA-skador. När AP-produkten utsattes för MS-analys inom 30 timmar fanns det inga tecken på basförlust eller modifiering i masspektrat (figur 1E). Tris-bufferten i reaktionerna tillhandahölls med den kommersiella UDG. Olika aminer, inklusive Tris, kan dock incise AP platser via beta-eliminering, om än vid höga reagenskoncentrationer44. Vissa alternativ, såsom HEPES och fosfatbuffert, kan anses undvika risken för klyvning av AP-platsen genom betaeliminering.

Som en potentiell UDG referensmetod rekommenderas en duplex av centrerat G:U substrat (tabell 1, T1/U +9) som standardsubstrat av följande skäl: 1. för fysiologisk relevans är G:U överlägsen A:U eftersom deamination av cytosin i G:C-par resulterar i G:U-lesioner. 2. Medan E. coli UDG visar högre specificitet att hydrolysera U från enkelsträngat DNA, är reparation av en U-lesion i enkelsträngat DNA ovanligt. 3. För alla G:U-substrat som testades uppvisade G:U+2 och G:U+3 högre reaktionshastigheter än G:U+9. En DNA deamination lesion intill en strand bryta är dock ovanligt. För att efterlikna inhemska skador, placera en G:U i mitten av DNA duplex skulle vara lämpligare.

Intressant nog genererade MALDI-TOF MS-metoden UDG kinetiska parametrar och enzymenheterna i G:U-reaktionen (figur 3A-C) mycket lik konventionellt härledda resultat med 3H-uracil38. Det enda G:U-substratet i denna studie skiljer sig dock mycket från PBS1 bakteriofag-DNA som tidigare beskrivits med flera A:U från DNA-syntesfel38. Dessutom visade UDG 3 gånger högre aktivitet med G:U än med A:U-substratet (tabell 1, Km och Kcat av G:U jämfört med A:U). Detta till synes motsägelsefulla resultat kan hänföras till DNA-sekvensen av PBS1 substrat som innehåller 36% av U i form av flera A:U-lesioner45 jämfört med endast 3% av U i G: U substrat (tabell 1). Samtidigt är UDG ett mycket "processivt" enzym, dvs. en enda protein-DNA-bindningshändelse framkallar flera uracil klyftor12. Konstaterandet av en nästan perfekt en-till-en korrelation mellan dessa två UDG metoder gör denna MS metod ett attraktivt alternativ i stället för den traditionella radioisotope analysen.

Den här metoden är lätt skalbar. Alla UDG-reaktioner i denna studie utfördes manuellt med hjälp av mikropipetter och mikrocentrifugerör, med ~ 30 tester utförda en viss dag. Således användes mindre än en tiondel av kapaciteten hos chipmatrisen med 384 brunnsplåtformat för MALDI-TOF MS-systemet (se materialförteckningen) som beskrivs i avsnitten 3-5. Däremot kan anpassningen av ett automatiserat pipetteringssystem för en 384-brunns mikroplatta enkelt öka den dagliga produktionen av detta tillvägagångssätt med hjälp av syraavslutningsmetoden. Således skulle 300 UDG-reaktioner ta ~ 1 h. MALDI-TOF MS-systemet (se tabellen över material) kan producera massspektradata för upp till 300 reaktioner på 1 timme. En strömlinjeformad process skulle därför kräva 2 timmar för att slutföra 300 UDG MALDI-TOF MS-analyser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) och NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av ministeriet för vetenskap och teknik, Taiwan, R.O.C. [bidragsnummer MOST109-2314-B-002 -186 till K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-016-MY3 till S H.-L.C. är mottagare av ett doktorandstipendium från National Taiwan University. Finansiering av öppen tillgångsavgift: Ministeriet för vetenskap och teknik, R.O.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Biokemi nummer 182 Basexcision reparation MALDI-TOF masspektrometri Uracil-DNA glykosylas apurinisk/apyrimidinisk plats glykosylashämmare
Uracil-DNA Glykosylasanalys av Matrix-assisterad laserdesorption/joniseringStid för flygning Masspektrometrianalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. … More

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. D., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Chang, S. Y., Fang, W. h. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter