Summary
Немаркированный, нерадиоизотопный метод анализа активности урацил-ДНК-гликозилазы был разработан с использованием масс-спектрометрии MALDI-TOF для прямого анализа апуринового/апиримидинического сайта,содержащего продукт. Анализ оказался довольно простым, специфическим, быстрым и удобным в использовании для измерения ДНК-гликозилазы.
Abstract
Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) является ключевым компонентом в базовом пути иссечения для коррекции урацила, образующегося в результате гидролитического дезаминирования цитозина. Таким образом, это имеет решающее значение для поддержания целостности генома. Для измерения активности UDG был разработан высокоспецифичный, немаркированный, нерадиоизотопный метод. Синтетический дуплекс ДНК, содержащий сайт-специфический урацил, был расщеплен UDG, а затем подвергнут анализу лазерной десорбции / ионизации во время полета (MALDI-TOF MS). Был установлен протокол для сохранения продукта апуринового/апиримидинового сайта (AP) в ДНК без разрыва цепи. Изменение значения m/z от субстрата к продукту использовалось для оценки гидролиза урацила UDG. Субстрат G:U использовался для кинетического анализа UDG, в результате которого Km = 50 нМ, Vmax = 0,98 нМ/с и Kcat = 9,31 с-1. Применение этого метода к анализу ингибитора урацилгликозилазы (UGI) дало значение IC50 7,6 пМ. Специфичность UDG с использованием урацила в различных положениях в одноцепочечных и двухцепочечных субстратах ДНК продемонстрировала различную эффективность расщепления. Таким образом, этот простой, быстрый и универсальный метод MALDI-TOF MS может стать отличным эталонным методом для различных монофункциональных гликозилаз ДНК. Он также имеет потенциал в качестве инструмента для скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.
Introduction
Хотя урацил является нормальным основанием в РНК, он является распространенным и высокомутагенным поражением в геномной ДНК. Урацил может возникать в результате спонтанного/ферментативного гидролитического дезаминирования дезоксицитидина. В каждой живой клетке это дезаминирование происходит 100-500 раз в сутки при физиологических условиях1,2. Если эти изменения не восстанавливаются, может произойти изменение в составе последовательности ДНК, вызывающее мутацию. Поскольку урацил в ДНК предпочитает спариваться с dATP во время репликации, если цитозин деаминтируется в урацил, в двух событиях репликации в половине ДНК потомства будет новая мутация перехода G:C в A:T.
Среди клеточных стратегий для поддержания генетической стабильности восстановление иссечения оснований (BER) является важным механизмом, который восстанавливает поврежденные основания, такие как урацил, в ДНК4. BER является высоко эволюционно сохраненным процессом. Существует два общих пути BER: короткий путь, ведущий к репарации одного нуклеотида, и путь длинного пятна, который производит репарационный тракт по крайней мере из двух нуклеотидов5. BER является скоординированным механизмом, который происходит в несколько этапов. Первым шагом в BER является ферментативный гидролиз поврежденного нуклеотидного основания повреждающей ДНК-гликозилазой для генерации промежуточного сайта апуринина/апиримидинового (AP)6. За этим следует расщепление сахарно-фосфатной основы в месте AP эндонуклеазой, очистка концов ДНК лиазой, заполнение промежутков ДНК-полимеразой и герметизация конечного ника лигазой5.
Урацил-ДНК-гликозилаза (UDG) гидролизует урацил из урацилсодержащей ДНК для BER в Escherichia coli. Обычные анализы UDG с использованием радиомаркированной ДНК с использованием различных методов разделения6,7,8,9,10,11,12,13 обычно являются трудоемкими, трудоемкими, с дорогостоящими реагентами маркировки, сложными процедурами и требуют интенсивной подготовки и практики для снижения рисков воздействия радиоактивных материалов. Фторометрические олигонуклеотидные анализы были разработаны в качестве замены для радиоизотопной маркировки14, в дополнение к молекулярным маякам и технологии резонансного переноса энергии Фёрстера15,16,17,18,19,20. Тем не менее, для всех вышеупомянутых методов требуется специальная маркировка. В последнее время были разработаны безметочные биосенсорные анализы21,22,23 и колориметрические методы, основанные на формировании G-квадруплекса24,25,26. Однако несколько пар A:U или специально разработанные последовательности в зондах усложняют определение ферментной единицы.
MALDI-TOF MS - это технология, которая может быть очень полезна в анализе ДНК. Разработанные приложения включают генотипирование однонуклеотидного полиморфизма27,28, модифицированный нуклеотидный анализ29 и промежуточную идентификацию репарации ДНК30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS должен быть легко принят для анализа ДНК-гликозилазы для обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP-сайт. Однако AP-сайты в ДНК склонны к разрыву нити при многих экспериментальных условиях33. Анализ UDG представлен здесь с использованием MALDI-TOF MS для непосредственного измерения производства на площадке AP без значительного шума разрыва пряди. Этот метод без меток прост в работе и имеет высокий потенциал для фармацевтического применения скрининга ингибиторов ДНК-гликозилазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка подложки/шаблона
- Конструкция урациловой подложки/шаблона дуплексная с сбалансированным содержанием G+C ~50 ± 10% и минимальной температурой плавления 50 °C для дуплексной области.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна нуклеотидная разница между 18 нт субстратами и 19 нт шаблонами (таблица 1 и рисунок 1) помогает улучшить интерпретацию сигнала MS и соответствующий отжиг. Шаблонная нить служит комплементарной ДНК для генерации несоответствий A-U или G-U (таблица 1), но также может использоваться в качестве эталонного сигнала в измерениях MS. Использование очищенных ВЭЖХ синтетических олигонуклеотидов является удовлетворительным для этого исследования. - Растворить ДНК в 1 мМ ЭДТА и 10 мМ Tris-HCl(рН 8,0 при 25 °C) (TE) в концентрации 100 мкмоль/л в качестве запаса и хранить при -20 °C. Разбавьте этот запас 20 мкл с TE до конечного объема 800 мкл (25-кратное разбавление до 4 мкмоль/л). Измерьте поглощение раствора ДНК в УФ-видимом спектрофотометре при λ = 260 нм для обеспечения назначенной производителем концентрации. Например: A260 = 0,204 для 4 мкмоль/л U+9 и A260 = 0,192 для 4 мкмоль/л T1 (таблица 1).
- Выполните анализ MALDI-TOF MS (разделы 4-6) для контроля качества олигонуклеотидов путем проверки уникальных пиковых сигналов при заданных значениях m/z, а также путем проверки того, что отношение сигнал/шум составляет >100 (рисунок 1B и рисунок 1D).
2. Анализ ДНК-гликозилазы
- Используя субстрат G:U дуплекса T1/U+9 (таблица 1 и рисунок 1A) для гликозилазной реакции, например, в стерильной микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл, добавляют 70 мкл H2O, 10 мкл реакционного буфера 10x UDG, 5 мкл запаса T1 и 5 мкл запаса U+9 (стадия 1.2.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите правильный тип микропипетки и следуйте инструкциям производителя для обработки требуемого объема. Например, используйте пипетку 2 мкл для дозирования 0,1-2 мкл жидкости, используйте пипетку 10 мкл для дозирования 2-10 мкл жидкости и используйте пипетку 100 мкл для дозирования 20-100 мкл жидкости для обеспечения точности и точности результатов. Описанный объем смеси реагентов рассчитан на 10 анализов; отрегулируйте громкость для нужного количества реакций. Реакционный буфер 1x UDG содержит 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтола и 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0 при 25 °C). В таблице материалов приведен источник 10-кратного реакционного буфера UDG. - Надежно закройте трубку; инкубировать на водяной бане в течение 30 мин при 65 °C, затем в течение 30 мин при 37 °C и, наконец, на льду в течение 3 мин, чтобы обеспечить надлежащий отжиг субстрата/шаблона дуплекса.
- В стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл добавьте 49 мкл ледяного реакционного буфера 1x UDG и 1 мкл UDG (5000 ед/мл; см. Таблицу материалов), разбавляя до 0,1 единицы/мкл. Делайте последовательные разведения с буфером 1x UDG до желаемых концентраций ферментов 0,05, 0,02 или 0,01 мкл. Всегда держите разбавленный UDG на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: В реакции 10 мкл 0,1 единицы UDG могут расщеплять более 30 пмоль урацила из дуплекса T1/U+9 за 3 мин. - В стерильную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл добавляют 9,0 мкл субстратной смеси со стадии 2,2 и предварительно прогрейте трубку до 37 °C. Добавьте 1,0 мкл разбавленного UDG со стадии 2.3. Используйте таймер, чтобы рассчитать время реакции, и проведите трубкой, чтобы перемешать содержимое.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа определения единицы измерения время инкубации составляет 30 минут. Для кинетического анализа используют анализ времени курса 0,5, 1, 2, 3, 5 мин для получения начальной нормы. Для анализа ингибирования UGI время реакции в течение 15 мин. - Центрифугирование трубок реакционной смесью в течение 3-5 с при температуре окружающей среды составляет 3 200 × г . Затем немедленно переведите реакцию на 37 °C.
- Прекращение реакции
- Готовят растворы 0,25 М HCl и 0,23 М Трис основания. В пробирке объемом 15 мл добавляют 10 мл раствора 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0 при 25 °C), чтобы имитировать 1x UDG реакционный буфер. Подкисляют 1 мл 0,25 М HCl и проверяют с помощью рН-метра, чтобы убедиться, что рН составляет ~ 2 ± 0,5. Нейтрализуют 1 мл основания 0,23 М Tris и проверяют рН-метром конечный рН 6,5 ± 0,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тест-полосок pH является быстрым и простым способом подтверждения уровней pH смеси реагентов. - Добавьте 1 мкл 0,25 M HCl для подкисления реакционной смеси 10 мкл для инактивации фермента и поместите его на лед на 6 мин. Добавьте 1 мкл основания 0,23 M Tris для нейтрализации продуктов ДНК, чтобы избежать разрушения сайта AP путем длительного воздействия кислоты. Добавьте 13 мкл TE, чтобы увеличить объем смеси продукта для переноса матричного чипа , а затем поместите его на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт AP химически нестабилен и должен быть проанализирован MALDI-TOF MS в течение 2 дней. После длительного хранения более недели накопление значительной части разрывов нитей происходит вследствие реакций β/δ элиминации продуктов АП (рис. 1D-G).
- Готовят растворы 0,25 М HCl и 0,23 М Трис основания. В пробирке объемом 15 мл добавляют 10 мл раствора 1 мМ ЭДТА и 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0 при 25 °C), чтобы имитировать 1x UDG реакционный буфер. Подкисляют 1 мл 0,25 М HCl и проверяют с помощью рН-метра, чтобы убедиться, что рН составляет ~ 2 ± 0,5. Нейтрализуют 1 мл основания 0,23 М Tris и проверяют рН-метром конечный рН 6,5 ± 0,5.
- Перенесите все 25 мкл реакционных продуктов UDG из микроцентрифужных трубок на 384-луночную микротитровую пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации катионов, таких как натрий или калий в буферах, создают помехи в анализе MALDI-TOF MS и, таким образом, требуют обессоливания. Поскольку реакционный буфер UDG E. coli содержит очень низкие концентрации катионов, обессоливание не требуется. Однако модифицируйте этот протокол для измерения других реакций ДНК-гликозилазы, содержащих катионы металлов, которые требуют обессоливания, как описано ранее35.
3. Перенос продуктов реакции UDG на матричную микросхему
- Откройте дверцу нанолитрового дозатора (см. Таблицу материалов) и загрузите 384-луночную микротитровую пластину со шага 2.7 на держатель пластины палубы.
- Вставьте матрицу чипа в соответствующее положение разведчика. Поместите загруженную скаутскую пластину на обрабатывающую палубу нанолитрового дозатора и закройте дверцу.
- Нажмите кнопку запуска на экране передачи и подождите, пока прибор начнет дозировать образцы с 384-луночной микротитровой пластины на матричную микросхему.
- Используйте опцию вкладки Vision , чтобы показать изображение чипа и объемы дозирования для каждого пятна во время дозирования. Убедитесь, что пятнистый объем на чипе находится в пределах 5-10 нл.
4. Настройка параметров анализа на масс-спектрометре
- С помощью прикладной программы (см. Таблицу материалов) для подготовки .xlsx файла, содержащего прогнозируемое значение сигнала m/z для импорта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки в ФАЙЛЕ I.xlsx (таблица 2) являются примерами настроек для анализа UDG субстрата G:U в разделе 2. - Используйте прикладную программу для создания и определения нового анализа UDG, щелкнув правой кнопкой мыши опцию «Импортировать группу анализа в формате конструктора» и выбрав .xlsx файл из выпадающего списка (например, FILE I.xlsx из шага 4.1).
- Щелкните правой кнопкой мыши кнопку Customer:Project:Plate и щелкните верхнюю часть раскрывающегося списка , чтобы установить новую пробирную пластину. В диалоговом окне введите имя файла (например, CTT20210620 для кода лаборатории и даты анализа), а затем в раскрывающемся списке тип пластины выберите тип пластины на 384 скважины и нажмите OK. Найдите пустую пластину, которая появится в правой части экрана.
- Выберите опцию Анализ ; выберите анализ (например, ФАЙЛ I.xlsx) из выпадающего списка.
- Чтобы назначить выбранный анализ (например, FILE I.xlsx) каждой позиции пятна образца на пластине, переместите курсор в каждое положение пустой пластины, щелкните, чтобы выделить колодец, и щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать Добавить Plex.
- Используйте настольный или портативный компьютер для подготовки рабочего списка в формате .xlsx без заголовка (например, 0620.xlsx таблицы 3) для всех образцов на чипе из шага 2.7. Нажмите кнопку Добавить новый образец проекта ; выберите файл (например, 0620.xlsx) из выпадающего списка, чтобы импортировать рабочий список.
- Найдите все тестовые образцы кодов в рабочем списке (например, от 0620.xlsx) в левой части экрана. Щелкните пример кода в рабочем списке и щелкните правой кнопкой мыши соответствующую позицию пластины, чтобы связать тесты с каждой позицией.
5. Работа масс-спектрометра
- Используйте прикладную программу для связывания масс-спектрометра (см. Таблицу материалов) с образцом чипа (из раздела 3) для анализа.
- Нажмите на настройку по умолчанию. В диалоговом окне введите имя файла из шага 4.3 (например, CTT20210620); в поле Имя эксперимента введите идентификатор микросхемы в штрих-коде чипа и сохраните настройки.
- Запустите программу управления масс-спектрометром (см. Таблицу материалов).
- Нажмите кнопку In/Out масс-спектрометра и дайте палубе расшириться. Выньте держатель чипа и вставьте образец чипа из шага 3.4 в держатель чипа. Поместите загруженный держатель чипа на расширенную палубу и нажмите кнопку «Вход/выход», чтобы чип образца вошел в инструмент.
- Дважды щелкните значок Получить прикладную программу. В окне Получение щелкните вкладку автозапуск , чтобы запустить прибор и получить масс-спектры из образцов на чипе.
6. Просмотр масс-спектров и анализ данных
- Запустите программу анализа данных (см. Таблицу материалов).
- Просмотрите дерево базы данных и выберите идентификатор чипа из шага 5.2. Щелкните, чтобы выделить целевой колодец на чипе, и щелкните значок спектра , чтобы отобразить массовый спектр.
- Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать Диалоговое окно настройки , чтобы обрезать определенный диапазон спектра в новом окне. Нажмите на ось X , чтобы ввести верхнюю и нижнюю границы m/z, и нажмите OK , чтобы показать указанный спектр диапазона, включая интересующие сигналы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ДНК пропорционально пиковой интенсивности на каждой единице значения m/z. - Измерьте пиковую высоту значений m/z сигналов, соответствующих U-подложке, AP-продукту и шаблону. Нажмите на пик и просмотрите высоту пика в левом верхнем углу экрана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр шириной 1 600 на 1 200 единиц является разумным размером для проверки на экране компьютера, а также для ведения учета. - Чтобы сохранить спектр для ведения записей, щелкните правой кнопкой мыши Экспорт и выберите тип файла JPEG в раскрывающемся списке. Нажмите Пункт назначения и Обзор диска , чтобы выбрать запоминающее устройство в раскрывающемся списке (например, флэш-диск E:). Введите имя файла (например, 0620_1-2.jpg) и нажмите кнопку Экспорт.
- При необходимости распечатайте экспортированный файл JPEG и измерьте пиковую высоту вручную с помощью линейки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаблоны и подложки
Взяв в качестве примера синтетические олигонуклеотиды с U в центре (U+9) в паре с шаблоном G (рис. 1А), для контроля качества чистоты синтетических олигонуклеотидов может быть использован пустой контроль эквимолярных количеств шаблона и урацилсодержащей подложки (рис. 1В; сигналы соответствуют обозначенному m/z и низкому фоновому шуму). Для анализа данных MS были измерены пиковые высоты (рисунок 2). Ожидается, что 19-нтовая шаблонная ДНК останется неизменной после гидролиза гликозилазы; поэтому сигнал может служить ориентиром для количественного определения AP-продукта (рисунок 1С).
Состояние реакции и масс-спектры
Этот анализ ДНК-гликозилазы прост и легко выполняется с использованием немаркированного олигонуклеотида для стандартной реакции с целью получения чистых и надежных результатов (рисунок 1).. Диапазон спектров MS должен охватывать все сигналы, генерируемые субстратами, шаблонами и продуктами реакции (рисунок 1B). Разница в 1 nt между подложкой и соответствующим шаблоном привела к хорошо разделенному профилю сигнала как для шаблона, так и для подложки (рисунок 1B). Эквимолярные праймеры U+9 и T1 показали сходные пиковые интенсивности без существенных различий. Обширное сбраживание UDG (0,5 единицы для 30-минутной реакции) продемонстрировало полное расщепление урацила. Сигнал AP-продукта также был хорошо отделен от сигнала урацилсодержащей подложки (Фиг.1C d+9 AP-продукт m/z = 5447.6 против Фиг.1B U+9 подложки m/z = 5541.6). Относительно мягкий метод ионизации MALDI36, использованный в этом исследовании, минимизировал сигналы, связанные с разрывами нитей, вызванными реакцией β элиминации на участках AP37, которые не были значимыми в масс-спектрах. В целом, фон реакции очень чистый без заметного шума (рисунок 1С).
В эквимолярных условиях относительная интенсивность сигнала AP-продукта была сопоставима с интенсивностью U-подложки с использованием шаблона T1 в качестве эталона (рисунок 1B, U+9/T1 против d+9/T1). Таким образом, расчет активности UDG основан на точном входе U-содержащего субстрата (50 пмоль или 20 пмоль) согласно экв (1).
Активность UDG = (сигнал AP-продукта) / (Сигнал U-подложки + сигнал AP-продукта) × [U] (1)
Кинетические параметры UDG, определяемые методом анализа MALDI-TOF MS
Как показано на фиг.2, на протяжении 3-минутной реакции UDG-реакции от 0,01 до 0,1 единицы демонстрировали как дозо-, так и временную зависимость. Концентрация 3,2 пМ (0,1 единицы на реакцию 100 мкл) использовалась для определения кинетических параметров, Км и ккат, для субстрата G:U (таблица 1). Аликвоты реакции UDG удалялись и гасялись в течение 30 с и 60 с. Кинетические данные были получены в условиях, когда урацилсодержащий субстрат переваривался менее чем на 50%, а анализу подвергали пять концентраций субстрата в диапазоне от 10 до 200 нМ. Курс времени достационального состояния показал отличную линейность для анализа скоростей. Пример графика скорости реакции показан на фиг.3А, где относительная интенсивность сигнала MS продукта и подложки преобразуется в концентрацию (нМ). Скорость реакции UDG (v) представлена как nM участка AP, производимого в секунду. Km и Vmax были рассчитаны по графику Линеуивера-Берка (рисунок 3B). Таким образом, кинетические параметры UDG, полученные из анализа MALDI-TOF MS, были определены как Km = 50 нМ, Vmax = 0,98 нМ s-1 и Kcat = 9,31 s-1. Значения сопоставимы с результатами предыдущих анализов высвобождения 3H-урацила, где Km = 40 нМ и Kcat = 13,3 с-138.
Дуплекс G:U+9 был подвергнут анализу чувствительности UDG. Единица измерения, измеренная с помощью анализа MALDI-TOF MS, была нанесена на определенную производителем единицу обычным методом высвобождения 3H-урацила38. Как показано на рисунке 3C, единица измерения MS MALDI-TOF была пропорциональна определенной единице от 0,001 единицы до 0,02 единицы с уравнением корреляции y = 0,933x + 0,0003 и коэффициентом определения R2 = 0,9974. Предел обнаружения составляет 0,001 единицы, так как коэффициент вариации = 9,2%, что в 5 раз превышает отношение сигнал/шум. Таким образом, этот анализ MALDI-TOF MS обеспечивает достаточную чувствительность, поскольку UDG в основном используется на уровне единицы39.
Субстратная специфика UDG
Одной из характерных особенностей этого анализа UDG MALDI-TOF MS является то, что он не содержит этикеток, что обеспечивает высокую универсальность для проектирования подложки. Эта функция очень полезна для анализа субстратной специфичности UDG. Как показано в таблице 1, урацил может быть вставлен в любое место вблизи 5' или 3' конца одноцепочечной или двухцепочечной ДНК для анализа специфичности. Что касается субстратной специфичности, хорошо известно, что UDG очень активен в удалении урацила из одноцепочечной ДНК38. Действительно, как показано в таблице 1, иссечение урацила из одноцепочечного субстрата (ssU) было уменьшено в 3,7 раза при отжиге до комплементарной цепи ДНК, образуя дуплекс G:U. Для широко используемого дуплекса A:U6,7,8 скорость реакции была дополнительно снижена почти в 10 раз по сравнению с ssU. UDG не действовал на U на конце ДНК (субстраты Таблицы 1 G:U+1, G:U-1 и G:U-2), что согласуется с предыдущими исследованиями40,41. Интересно, что U на 2-й и 3-й позициях от 5'-конечной точки демонстрировал более высокую каталитическую скорость UDG, чем U в центре, в 2 раза и в 1,5 раза соответственно (Таблица 1, G:U+2 и G:U+3 против G:U). UDG вырезал U 3-nt из 3'-конца с 8% меньшей активностью, чем U в центре (Таблица 1, G:U-3 против G:U).
Ингибирование ингибитора урацилгликозилазы реакции UDG
Ингибитор урацилгликозилазы (UGI) представляет собой белок бактериофага, который ингибирует E. coli UDG путем обратимого связывания белка со стехиометрией 1:142. Ингибирование UDG-активности UGI показано на рисунке 4. При наличии 0,05 единиц (100 пМ) УГИ активность 0,05 единиц УДГ (8 пМ) ингибировалась до неопределяемого уровня. IC50 составлял 7,6 пМ. Таким образом, анализ UDG MALDI-TOF MS может быть легко модифицирован для массового скринингового анализа для обнаружения ингибиторов других гликозилаз ДНК.
Рисунок 1: Модельная система для анализа ДНК-гликозилазы. (A) Цепь поражения, содержащая один уридин (U+9), отжигали до шаблона (T1), образуя несоответствие G:U (жирный шрифт). Урацил-ДНК-гликозилаза обнаруживает и удаляет урацил, образуя сайт AP (d). При воздействии MALDI-TOF MS разница в значениях m/z между U-содержащей ДНК и продуктами AP может быть разрешена, как показано в B. (B) ДНК 18 нт, содержащая один уридин (U+9), отожженный до шаблона 19 нт (Т1) (Таблица 1), тестировали как ферментную заготовку из 50 пмоль субстрата в 40 мкл реакционного буфера и подвергали анализу РС. (C) Почти полное переваривание фермента 50 пмоль субстрата в реакции 10 мкл с использованием 0,5 единиц UDG при 37 °C в течение 30 мин. (D) ДНК 18 нт, содержащую один уридин (U+3), отожженный до заготовки фермента Т1 50 пмоль субстрата в реакционном буфере 40 мкл, подвергали анализу РС. (E) Почти полное сбраживание фермента 50 пмоль субстрата U+3 в реакции 10 мкл с использованием 0,5 единиц UDG при 37 °C в течение 30 мин для получения d+3 и подвергнутое анализу MS в течение 30 ч. (F) Состояние реакции было таким же, как и в E , за исключением того, что продукт d+3 был в 0,1 М NaOH при 95 °C в течение 30 мин, чтобы вызвать бета-элиминационную реакцию с образованием фрагментированного продукта B15 и подвергся анализу РС. G) состояние реакции было таким же, как и в Е , за исключением того, что продукт d+3 хранился при температуре -20°С более 7 дней; фракция d+3, преобразованная в фрагментированные продукты B15. Эта цифра изменена с 43. Сокращения: nt = нуклеотид; MS = масс-спектрометрия; MALDI-TOF MS = Матричная лазерная десорбция/ионизация время полета MS; AP = апуринный/апиримидинический; UDG = урацил-ДНК-гликозилаза; T1 = 19 nt G-содержащий шаблон; U+9 = 18 нт U-содержащего субстрата; d+9 = 18 nt AP сайт-содержащий продукт; U+3 = 18 nt U-содержащий субстрат; d+3 = 18 nt AP site-содержащий продукт; B15 = 15 nt бета-элиминационный фрагментированный продукт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ временного хода активности UDG при различных концентрациях ферментов. Субстратную ДНК, 50 пмоль, содержащую поражение G:U, инкубировали с 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 единицами UDG при 37 °C. Аликвоты (10 мкл) брали из реакционной смеси через 0, 0,5, 1, 2 и 3 мин и закаляли равным объемом фенола/хлороформа. (A) Масс-спектры MALDI-TOF, иллюстрирующие зависимость концентрации при обработке субстратов G:U U UDG. (B) Количество продукта было построено в зависимости от времени. UDG: 0,01 (замкнутые треугольники с сплошной линией), 0,02 (открытый треугольник с пунктирной линией), 0,05 (замкнутый круг с сплошной линией) и 0,1 единицы (открытые круги с сплошной линией). Данные представляют собой средние значения трех независимых определений, а полосы погрешностей представляют 1 S.D. Эта цифра изменена с 43. Сокращения: nt = нуклеотид; MALDI-TOF = матричная лазерная десорбция/ионизация времени полета; AP = апуринный/апиримидинический; UDG = урацил-ДНК-гликозилаза; T = 19 nt G-содержащий шаблон; U = 18 nt U-содержащий субстрат; AP = 18 nt AP сайт-содержащий продукт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Определение кинетических параметров UDG с помощью анализа MALDI-TOF. Кривая Михаэлиса-Ментена и графики Линеуивера-Берка для определения Km и kcat для катализируемого ферментом UDG иссечения урацила из ДНК. Анализ ДНК-гликозилазы MALDI-TOF MS проводили с использованием 0,1 единицы UDG и различных концентраций (10, 30, 60, 100, 200 нМ) субстратов в реакции 100 мкл в течение 30 с и 60 с. (A) Кривая Михаэлиса-Ментена, полученная из трех независимых экспериментов. Полосы ошибок представляют 1 SD. (B) Участок Линеуивера-Берка для анализа; указанные перехваты позволяют рассчитывать Km и Vmax. (C) Анализ UDG с помощью анализа MALDI-TOF MS в сравнении с устройством, назначенным производителем. Активность фермента измеряли путем удаления урацила, образуя ap-сайт в реакции 10 мкл, содержащей 50 пмоль (0,56 мкг) G:U в дуплексе ДНК 18/19 нт в течение 30 мин при 37 °C. UDG разбавляли буфером [50% глицерина, 20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 30 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтола] на льду. Единица была определена как количество фермента, которое катализировало высвобождение 60 пмоль урацила в минуту. Полосы погрешностей показывают стандартное отклонение шести экспериментов. Эта цифра изменена с 43. Сокращения: nt = нуклеотид; MALDI-TOF = матричная лазерная десорбция/ионизация времени полета; UDG = урацил-ДНК-гликозилаза; AP = апуринный/апиримидинический; V, скорость реакции nM/s. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Кривая ингибирования фермента UDG путем добавления UGI. Кривую ингибирования определяли с помощью реакций 20 мкл с 0,05 единицами UDG (8 пМ) и 50 пмоль субстрата в течение 15 мин в присутствии UGI от 0,001 единицы (5 пМ) до 0,1 единицы (200 пМ). Данные представляют собой средние значения трех независимых определений, а полосы ошибок представляют собой 1 S.D. Данные соответствуют онлайн-калькулятору IC50 (см. Таблицу материалов). Эта цифра изменена с 43. Сокращения: UDG = Урацил-ДНК-гликозилаза; UGI = ингибитор урацилгликозилазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Субстраты ДНК | Олигонуклеотиды | Последовательность ДНКb | Начальная ставкаc | k кошка | |
| (пмоль/сек) | (с-1) | ||||
| ссУ+9 | У+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | 0.560 ± 0.098 | 35 | |
| ссУ+3 | У+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | 0,756 ± 0,083 | 47.3 | |
| сСУ-3 | У-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | 0,448 ± 0,087 | 28 | |
| Г:У | Т1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,149 ± 0,046 | 9.31 | |
| У+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| А:У | Т2 | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0.053 ± 0.018 | 3.31 | |
| У+9 | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| Г:U5'+3 | Т1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,256 ± 0,044 | 16 | |
| У+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| Г:U5'+2 | Т3 | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,567 ± 0,016 | 35.4 | |
| У+2 | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| Г:U5'+1 | Т4 | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | НДД | НД | |
| У+1 | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U3'-3 | Т5 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0.138 ± 0.015 | 8.63 | |
| У-3 | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | ||||
| G:U3'-2 | Т6 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' | НД | НД | |
| У-2 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3' | ||||
| Г:У3'-1 | Т7 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | НД | НД | |
| У-1 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3' | ||||
Таблица 1: Составы субстратов и специфика UDG. В этой таблице показаны 18 нт U-содержащей ДНК, обозначенной U±N. «+» указывает на подсчет положения урацила от 5'-конца, а '-' указывает на подсчет положения урацила от 3' конца. Например, U+9 - это 9-я позиция от 5''конечной точки, U-3 - 3-я позиция от 3''конечной. Комплементарный шаблон 19 nt от T1 до T7 будет сопряжен с U-содержащей ДНК, образующей несоответствия G:U или A:U, как указано. Основания Uracil выделены жирным шрифтом. Реакции проводились с использованием 50 пмоль U-субстратов, 0,05 единиц UDG, в 10 мкл, как описано в разделе протокола 2. Эта таблица изменена с 43. Сокращения: UDG = урацил ДНК гликозилаза; nt = нуклеотид; ND, не обнаруживается.
| 2-й ПКРП | 1-й ПКРП | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Тм | ПкГК | ПВАРН | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_ ЗВОНОК | EXT1_ МАССА |
| Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
Таблица 2: ФАЙЛ I.xlsx файл. Настройки использовались для рисунков 1B, C и 2A; 0 мин входов. Система MALDI-TOF MS, используемая в этом исследовании, была разработана специально для анализа однонуклеотидного полиморфизма путем однонуклеотидного расширения расширенного праймера в область амплифицированной вариации последовательности генов. Для анализа UDG при подготовке группы анализа FILE I. Сокращения: WELL = номер скважины, присвоенный анализу; TERM = терминальный микс; SNP_ID = название входной последовательности однонуклеотидного полиморфизма; 2-й PCRP = праймер прямого ампликона; 1st-PCRP = праймер обратного ампликона; AMP_LEN = длина ампликона; UP_CONF = балл односложного усиления; MP_CONF = оценка мультиплексного усиления; Tm = температура плавления; PcGC = процентное содержание GC; PWARN = коды предупреждения о дизайне анализа; UEP_DIR = направление растяжения грунтовки; UEP_MASS = нерасширенная масса грунтовки; UEP_SEQ = нерасширенная последовательность праймеров; EXT1_CALL = имя, данное пику массы анализируемого 1; EXT1_MASS = масса анализируемого вещества 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
| 0620_1-8 |
Таблица 3: 0620.xlsx файл. Эти настройки были использованы для реакций ингибирования UGI на рисунке 4A. Аббревиатура: UGI = ингибитор урацилгликозилазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлена подробная процедура использования метода анализа UDG MALDI-TOF MS для непосредственного обнаружения ПРОДУКТОВ ДНК, содержащих AP. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что субстраты, содержащие урацил, не содержат этикеток, масштабируемы, просты в работе и обеспечивают большую гибкость в конструкции подложки.
Рекомендованная поставщиком UDG экстракция фенола/хлороформа позволяет инактивировать фермент для предотвращения деградации ДНК продукта. Однако протокол экстракции фенола включает в себя утомительное фазовое разделение опасных химических веществ. Альтернативный кислотный метод прекращения с использованием HCl для снижения рН реакции до 2 ± 0,5 также эффективно инактивировал UDG. Последующая нейтрализация основанием Триса может предотвратить повреждение ДНК. Когда продукт AP подвергали анализу MS в течение 30 ч, не было никаких признаков потери основания или модификации в масс-спектрах (рисунок 1E). Буфер Tris в реакциях был обеспечен коммерческим UDG. Однако различные амины, включая Tris, могут разрезать участки AP посредством бета-элиминации, хотя и при высоких концентрациях реагентов44. Некоторые альтернативы, такие как HEPES и фосфатный буфер, могут быть рассмотрены, чтобы избежать риска расщепления сайта AP путем бета-элиминации.
В качестве потенциального эталонного метода UDG дуплекс центрированного субстрата G:U (таблица 1, T1/U+9) рекомендуется в качестве стандартного субстрата по следующим причинам: 1. для физиологической значимости G:U превосходит A:U, поскольку дезаминирование цитозина в парах G:C приводит к поражениям G:U. 2. В то время как E. coli UDG демонстрирует более высокую специфичность гидролиза U из одноцепочечной ДНК, восстановление поражения U в одноцепочечной ДНК встречается редко. 3. Для всех протестированных субстратов G:U G:U+2 и G:U+3 продемонстрировали более высокую скорость реакции, чем G:U+9. Тем не менее, поражение деаминации ДНК, прилегающее к разрыву нити, встречается редко. Для имитации нативных поражений размещение G:U в центре дуплекса ДНК было бы более уместным.
Интересно, что метод MALDI-TOF MS генерировал кинетические параметры UDG, а ферментные единицы реакции G:U (рисунок 3A-C) были очень похожи на традиционно полученные результаты с использованием 3H-uracil38. Однако один субстрат G:U в этом исследовании сильно отличается от ДНК бактериофага PBS1, ранее описанной с множественными ошибками синтеза ДНК A:U38. Более того, UDG показал в 3 раза более высокую активность с G:U, чем с субстратом A:U (Таблица 1, Km и Kcat G:U против A:U). Этот, казалось бы, противоречивый результат можно отнести к последовательности ДНК субстрата PBS1, содержащей 36% U в виде множественных поражений A:U45 по сравнению с 3% U в G: U подложка (табл. 1). Между тем, UDG является очень «процессивным» ферментом, то есть одно событие связывания белка с ДНК вызывает множественные расщепления урацила12. Обнаружение почти идеальной корреляции один к одному между этими двумя методами UDG делает этот метод MS привлекательным вариантом вместо традиционного радиоизотопного анализа.
Такой подход легко масштабируется. Все реакции UDG в этом исследовании были выполнены вручную с использованием микропипеток и микроцентрифужных трубок, с ~ 30 тестами, выполненными в данный день. Таким образом, было использовано менее одной десятой емкости 384-луночного пластинчатого чип-массива для системы MALDI-TOF MS (см. Таблицу материалов), описанной в разделах 3-5. Напротив, адаптация автоматизированной системы пипетирования для микропластины из 384 скважин может легко увеличить суточную производительность этого подхода с использованием метода кислотного завершения. Таким образом, 300 реакций UDG займут ~ 1 ч. Система MALDI-TOF MS (см. Таблицу материалов) может выдавать данные масс-спектров до 300 реакций за 1 ч. Следовательно, для упрощенного процесса потребуется 2 часа для завершения 300 анализов UDG MALDI-TOF MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы благодарим NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Тайбэй, Тайвань) и NRPB Pharmacogenomics Lab (Тайбэй, Тайвань) за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий Тайваня, R.O.C. [номер гранта MOST109-2314-B-002 -186 для K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 для S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 для W.-h.F.]. H.-L.C. является получателем докторской стипендии от Национального университета Тайваня. Финансирование сбора за открытый доступ: Министерство науки и технологий, R.O.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
- Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
- Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
- Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
- Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
- Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
- Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
- Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
- Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
- Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
- Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
- Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
- Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
- Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
- Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
- Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
- Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
- Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
- Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
- Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
- McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
- Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
- Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
- Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
- Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
- Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
- Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
- Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
- Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
- Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
- Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
- Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
- Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
- Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
- Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
- Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
- Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
- Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
- Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
- Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
- Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).
