Summary
使用MALDI-TOF质谱法开发了一种非标记，非放射性同位素方法来测定尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，用于直接分析含阳离子/嘧啶位点的产品。该测定被证明是非常简单，特异性，快速且易于使用的DNA糖基化酶测量。
Abstract
尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）是碱基切除修复途径中的关键成分，用于校正由胞嘧啶水解脱氨形成的尿嘧啶。因此，它对于基因组完整性的维持至关重要。开发了一种高度特异性，无标记，非放射性同位素的方法来测量UDG活性。UDG切割含有位点特异性尿嘧啶的合成DNA双链体，然后进行基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。建立了一种方案来保存DNA中的apurinic/apyrimidinic位点（AP）产物而不会断裂。利用底物到产物的m/z值变化来评价UGG对尿嘧啶的水解作用。使用G：U底板进行UDG动力学分析，得到Km = 50 nM，Vmax = 0.98 nM /s，Kcat = 9.31 s-1。将该方法应用于尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）测定，IC50值为7.6 pM。在单链和双链DNA底物中不同位置使用尿嘧啶的UDG特异性显示出不同的切割效率。因此，这种简单，快速和多功能的MALDI-TOF MS方法可以成为各种单功能DNA糖基化酶的极好参考方法。它还具有作为DNA糖基化酶抑制剂筛选工具的潜力。
Introduction
虽然尿嘧啶是RNA中的正常碱基，但它是基因组DNA中常见且高度致突变的病变。尿嘧啶可由脱氧胞苷的自发/酶解脱氨引起。在每个活细胞中，这种脱氨在生理条件下每天发生100-500次1，2。如果这些改变没有得到修复，DNA序列组成可能会发生变化，从而导致突变。由于DNA中的尿嘧啶在复制过程中更喜欢与dATP配对，如果胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，在两个复制事件中，在一半的后代DNA3中将出现新的G：C到A：T过渡突变。
在维持遗传稳定性的细胞策略中，碱基切除修复（BER）是修复DNA4中受损碱基（如尿嘧啶）的重要机制。BER是一个高度进化保守的过程。有两种常见的 BER 通路：短贴片通路，通向单个核苷酸的修复束，以及产生至少两个核苷酸修复束的长贴片通路5。BER 是一种协调机制，分几个步骤进行。BER的第一步是通过损伤特异性DNA糖基酶水解受损的核苷酸碱基，以产生阳极/嘧啶（AP）中间位点6。随后，通过核酸内切酶在AP位点切割糖磷酸主链，通过裂解酶清除DNA末端，通过DNA聚合酶填充间隙，并通过连接酶密封最终的缺口5。
尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）从含有尿嘧啶的DNA中水解尿嘧啶，用于大肠杆菌中的BER。使用放射性标记DNA的传统UDG测定涉及不同的分离技术6，7，8，9，10，11，12，13通常耗时，劳动密集型，标记试剂昂贵，程序复杂，并且需要强化培训和实践以降低暴露于放射性物质的风险。除了分子信标和Förster共振能量转移技术15，16，17，18，19，20之外，荧光定量寡核苷酸测定已被开发出来作为放射性同位素标记的替代品14。但是，上述所有方法都需要特定的标签。最近开发了无标记生物传感器测定法21，22，23和基于G-四链体24，25，26形成的比色方法。然而，探针中的多个A：U对或专门设计的序列使酶单元定义复杂化。
MALDI-TOF MS是一种在DNA分析中可能非常有用的技术。开发的应用包括单核苷酸多态性基因分型27，28，修饰核苷酸分析29和DNA修复中间体鉴定30，31，32，33，34。应易于用于DNA糖基化酶分析的MALDI-TOF MS，以检测含AP位点的DNA产物。然而，在许多实验条件下，DNA中的AP位点容易断裂33。这里介绍了一种UDG测定，使用MALDI-TOF MS直接测量AP位点的产生，没有明显的断链噪声。这种无标记方法易于使用，并且在DNA糖基化酶抑制剂筛选的药物应用中具有很高的潜力。
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Protocol
1. 基材/模板准备
- 双相区域设计 G+C 含量平衡至 50 ± 10% 且最低熔化温度为 50 °C 的 uracil 基板/模板双相。
注：18 nt底物和19 nt模板之间的一个核苷酸差异（表1 和 图1）有助于更好的MS信号解释和适当的退火。模板链可作为互补DNA以产生A-U或G-U不匹配（表1），但也可以用作MS测量中的参考信号。HPLC纯化的合成寡核苷酸的使用对本研究是令人满意的。 - 将DNA溶解在100μmol/L浓度的1mM EDTA和10mM Tris-HCl（25°C时pH 8.0）（TE）中作为储备，并储存在-20°C。 用TE稀释20μL储备液至800μL的最终体积（稀释25倍至4μmol/ L）。在紫外可见分光光度计中以λ = 260nm测量DNA溶液的吸光度，以确保制造商的指定浓度。例如：对于U + 9的4μmol / L，A260 = 0.204，对于4μmol/ L的T1，A260 = 0.192（表1）。
- 通过在指定的m/ z值下检测独特的峰值信号以及检查信噪比是否为>100，对寡核苷酸质量控制进行MALDI-TOF MS分析（第4-6节）（图1B 和 图1D）。
2. DNA糖基化酶测定
- 例如，在1.5mL无菌微量离心管中使用T1 / U + 9双链G：U底物（表1和图1A）进行糖基化酶反应，加入70μLH 2O，10μL1x UDG反应缓冲液，5μLT1储备液和5μLU + 9储备液（步骤1.2）。
注：选择正确类型的微量移液器，并按照制造商的说明处理所需的体积。例如，使用2 μL移液器分配0.1-2μL液体，使用10μL移液器分配2-10μL液体，使用100μL移液器分配20-100μL液体，以确保结果的准确性和精确性。所述试剂混合物的体积为10次测定;调整所需反应次数的体积。1x UDG反应缓冲液含有1mM EDTA，1mM二硫磷脂醇和20mM Tris-HCl（25°C时pH 8.0）。参见 材料表 ，了解10x UDG反应缓冲液的来源。 - 牢固地关闭管子;在65°C下在水浴中孵育30分钟，然后在37°C下孵育30分钟，最后在冰上孵育3分钟，以确保基板/模板双相正确退火。
- 在1.5mL无菌微量离心管中，加入49μL冰冷的1x UDG反应缓冲液和1μLUDG（5，000单位/ mL;参见 材料表），稀释至0.1单位/ μL。用1x UDG缓冲液连续稀释至所需的酶浓度为0.05，0.02或0.01单位/ μL。始终将稀释的UDG保持在冰上。
注意：在10μL反应中，0.1单位的UDG可以在3分钟内从T1 / U + 9双链中切割出超过30 pmol的尿嘧啶。 - 在1.5mL无菌微量离心管中，从步骤2.2加入9.0μL底物混合物，并将管预热至37°C。 从步骤2.3中加入1.0μL稀释的UDG。使用计时器对反应进行计时，然后轻拂试管以混合内容物。
注意：对于单位定义测定，孵育时间为30分钟。对于动力学测定，使用0.5，1，2，3，5分钟的时间过程分析来获得初始速率。对于UGI抑制测定，将反应时间定时15分钟。 - 在环境温度下，将管与反应混合物在3，200×g下离心3-5 秒 。然后，立即将反应转移到37°C。
- 反应终止
- 制备0.25 M HCl和0.23 M Tris基的溶液。在15 mL试管中，加入10 mL 1 mM EDTA和20 mM Tris-HCl溶液（25°C时pH 8.0）以模拟1x UDG反应缓冲液。用1 mL 0.25 M HCl酸化，并用pH计检查以确保pH值约为2±0.5。用 1 mL 的 0.23 M Tris 碱基中和，并用 pH 计检查最终 pH 值是否为 6.5 ± 0.5。
注意：使用pH试纸是重新确认试剂混合物的pH值的快速简便方法。 - 加入1μL0.25M HCl酸化10μL反应混合物以灭活酶并将其置于冰上6分钟。加入1μL0.23M Tris碱以中和DNA产物，以避免AP位点因长时间暴露于酸而破裂。加入13μL TE以增加用于 基质芯片 转移的产物混合物的体积，然后将其放在冰上。
注：AP产物化学性质不稳定，应在2天内通过MALDI-TOF MS进行分析。在长时间储存超过一周后，由于AP产物的β/δ消除反应，发生了大部分断裂的积累（图1D-G）。
- 制备0.25 M HCl和0.23 M Tris基的溶液。在15 mL试管中，加入10 mL 1 mM EDTA和20 mM Tris-HCl溶液（25°C时pH 8.0）以模拟1x UDG反应缓冲液。用1 mL 0.25 M HCl酸化，并用pH计检查以确保pH值约为2±0.5。用 1 mL 的 0.23 M Tris 碱基中和，并用 pH 计检查最终 pH 值是否为 6.5 ± 0.5。
- 将所有25μL UDG反应产物从微量离心管转移到384孔微量滴定板中。
注意：高浓度的阳离子，如缓冲液中的钠或钾，会在MALDI-TOF MS分析中产生干扰，因此需要脱盐。由于 大肠杆菌 UDG反应缓冲液含有非常低浓度的阳离子，因此不需要脱盐。然而，修改该协议以测量含有需要脱盐的金属阳离子的其他DNA糖基化酶反应，如前所述35。
3. 将UDG反应产物转移到基质芯片上
- 打开纳升分配器的门（见 材料表），将步骤2.7中的384孔微量滴定板加载到甲板的板架上。
- 将矩阵芯片阵列插入相应的侦察板位置。将装载的侦察板放在纳升分配器的处理甲板上，然后关闭门。
- 触摸转印屏幕上的 运行 按钮，然后等待仪器开始将样品从384孔微量滴定板分配到基质芯片。
- 使用 “视觉”选项卡 选项可显示点胶过程中每个光斑的芯片图像和点胶量。确保芯片上的斑点体积在5-10 nL范围内。
4. 在质谱仪上设置测定参数
- 使用应用程序（参见 材料表）准备一个.xlsx文件，其中包含用于导入的预测信号m/ z值。
注： FILE I.xlsx （表2）中的设置是第2节中G：U底物的UDG测定的示例设置。 - 使用应用程序创建和定义新的UDG测定，方法是右键单击“ 以设计器格式导入测定组 ”选项，然后从下拉列表中选择.xlsx文件（例如，步骤4.1 中的FILE I.xlsx ）。
- 右键单击 “客户：项目：板 ”按钮，然后单击下拉 选项 树的顶部以建立新的检测板。在对话框中，键入文件名（例如， CTT20210620 表示实验室代码和测定日期），然后在 板类型 下拉列表中，选择 384 孔板 类型并按 OK。查找屏幕右侧显示的空白板。
- 点击 分析 选项;从下拉列表中选择 检测方法 （例如， FILE I.xlsx）。
- 要将所选测定（例如， FILE I.xlsx）分配给板上的每个样品点位置，请将光标移动到空白板的每个位置，单击以突出显示孔，然后单击以选择 添加Plex。
- 使用台式机或笔记本电脑为步骤2.7中芯片上的所有样品准备.xlsx格式的工作清单，没有标题（例如，表3的0620.xlsx）。点击 添加新的示例项目 按钮;从下拉列表中选择文件（例如，0620.xlsx）以导入工作列表。
- 在屏幕左侧的工作列表中查找所有测试示例代码（例如，从 0620.xlsx）。单击工作列表中 的示例代码 ，然后右键单击板的相应位置以将测试链接到每个位置。
5. 质谱仪操作
- 使用应用程序将质谱仪（见 材料表）链接到要分析的样品芯片（从第3部分开始）。
- 单击 默认设置。在对话框中，键入步骤 4.3 中的文件名（例如， CTT20210620）;在 “实验名称”中，键入“ 芯片条形码”中的芯片 ID，然后保存设置。
- 启动质谱仪控制程序（见 材料表）。
- 按下质谱仪的 “入/出 ”按钮，让甲板伸展。取出芯片支架并将步骤3.4中的样品芯片插入芯片支架。将装载的芯片支架放在扩展的甲板上，然后按下进/出按钮，使样品芯片进入仪器。
- 双击应用程序的 “获取” 图标。在 “采集 ”窗口中，单击 “自动运行 ”选项卡以启动仪器并从芯片上的样品中获取质谱。
6. 查看质谱并分析数据
- 运行数据分析程序（请参见 材料表）。
- 浏览数据库树，从步骤 5.2 中选择芯片 ID。单击以突出显示芯片上的目标孔，然后单击 光谱 图标以显示质谱。
- 右键单击以选择 “自定义对话框” 以在新窗口中裁剪特定范围的频谱。单击 X 轴 以键入 m/z 的上限和下限，然后按 OK 显示指定的范围频谱，包括感兴趣的信号。
注意：DNA的量与每个m / z值单位的峰值强度成正比。 - 测量对应于U基板，AP积和模板的信号的m / z值的峰值高度。单击峰值，并在屏幕左上角查看峰值高度。
注：1，600宽度/1，200单位的光谱是计算机屏幕上检查和记录保存的合理尺寸。 - 要保存频谱以进行记录保存，请右键单击 导出 ，然后在下拉列表中选择 JPEG文件类型 。单击“ 目标 ”和“ 浏览光盘 ”以在下拉列表中选择 存储设备 （例如，闪存光盘 E：）。键入 文件名 （例如，0620_1-2.jpg），然后单击 导出。
- 如果需要，请打印导出的 JPEG 文件，并使用标尺手动测量峰高。
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Representative Results
模板和基材
以以U为中心（U+9）的合成寡核苷酸与G模板配对为例（图1A），对模板和含尿嘧啶的底物的等摩尔量的空白控制可用于合成寡核苷酸纯度的质量控制（图1B;信号与指定的m/ z和低背景噪声相匹配）。对于MS数据分析，测量了峰高（图2）。预计19 nt模板DNA在糖基化酶水解后保持不变;因此，该信号可以作为AP产物定量的参考（图1C）。
反应条件和质谱
该DNA糖基化酶测定简单易行，使用未标记的寡核苷酸进行标准反应，以获得干净可靠的结果 （图1）。MS光谱的范围应涵盖底物，模板和反应产物产生的所有信号（图1B）。基板和相应模板之间1 nt的差异为模板和基板产生了一个分离良好的信号曲线（图1B）。等摩尔引物U+9和T1表现出相似的峰强度，无显著差异。广泛消化UDG（0.5个单位反应30分钟）显示完全尿嘧啶裂解。AP产物的信号也与含尿嘧啶的底物的信号很好地分离（图1C d+ 9 AP产物m / z = 5447.6与 图1B U + 9底物m / z = 5541.6）。本研究中使用的相对温和的MALDI电离技术36 最大限度地减少了AP位点37上由β消除反应引起的链断裂相关的信号，这些信号在质谱中并不显着。总体而言，反应背景非常干净，没有明显的噪点（图1C）。
在等摩尔条件下，AP产物的相对信号强度与使用T1模板作为参考的U底物的相对信号强度相当（图1B， U + 9 / T1与d + 9 / T1）。因此，UDG活性的计算基于根据方程（1）的含U底物（50 pmol或20 pmol）的精确输入。
UDG活性=（AP产物的信号）/（U底物的信号+AP产物的信号）×[U] （1）
通过 MALDI-TOF MS 测定测定的 UDG 动力学参数
如图2所示，在整个3分钟反应过程中，从0.01个单位到0.1个单位的UDG反应显示出剂量和时间依赖性。使用3.2 pM（每100μL反应0.1单位）的浓度来确定G：U底物的动力学参数Km和kcat（表1）。除去UDG反应的等分试样并淬火30 s和60 s。在含尿嘧啶底物消化率小于50%的条件下获得动力学数据，并对5种底物浓度范围为10~200 nM的底物进行分析。稳态时间过程在速率分析中表现出优异的线性度。反应速率图的示例如图3A所示，其中产物和底物的相对MS信号强度转换为浓度（nM）。UDG反应速率（v）表示为每秒产生的AP位点的nM。Km和Vmax是根据Lineweaver-Burk图计算的（图3B）。因此，从MALDI-TOF MS测定得出的UDG动力学参数被确定为Km = 50 nM，Vmax = 0.98 nM s-1，Kcat = 9.31 s-1。这些值与先前3H-尿嘧啶释放测定的结果相当，其中Km = 40 nM，Kcat = 13.3 s-138。
G：U+9双工接受UDG灵敏度测定。通过传统的 3H-尿嘧啶释放方法将MALDI-TOF MS测定法测量的单元与制造商定义的单元进行对比图38。 如图3C所示，MALDI-TOF MS测量单位与定义的单位成比例，从0.001单位到0.02单位，相关方程y = 0.933x + 0.0003，决定系数R2 = 0.9974。检测限为0.001个单位，变异系数=9.2%，约为信噪比的5倍。因此，这种MALDI-TOF MS测定法提供了足够的灵敏度，因为UDG主要用于单位级39。
UDG 的底物特异性
这种UDG MALDI-TOF MS测定的一个特征是它是无标记的，这为底物设计提供了高度的多功能性。该特征对于分析UDG的底物特异性非常有用。如 表1所示，尿嘧啶可以插入单链或双链DNA的5'或3'端附近的任何位置进行特异性测定。对于底物特异性，众所周知，UDG在从单链DNA38中去除尿嘧啶方面具有很高的活性。事实上，如 表1所示，当退火到互补DNA链时，从单链底物（ssU）中切除尿嘧啶减少了3.7倍，形成G：U双链。对于常用的A：U双相6，7，8，反应速率相对于ssU进一步降低了近10倍。UDG在DNA末端没有作用于U（表1 G：U + 1，G：U-1和G：U-2的底物），这与先前的研究一致40，41。有趣的是，在5'末端的第 2和第 3位置，U的UDG催化速率分别比中心的U高2倍和1.5倍（表1，G：U + 2和G：U + 3与G：U）。UDG从3'端切除U 3-nt，活性比中心的U少8%（表1， G：U-3 与 G：U）。
尿嘧啶糖基化酶抑制剂抑制UGG反应
尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）是一种噬菌体蛋白，通过可逆蛋白结合和1：142的化学计量法抑制大肠杆菌UDG。UGI对UDG活性的抑制如图4所示。在0.05个单位（100 pM）的UGI存在下，0.05单位UDG（8 pM）的活性被抑制到检测不到的水平。IC50的分辨率为7.6 pM。因此，UDG MALDI-TOF MS测定可以很容易地修改为质量筛选测定，以发现其他DNA糖基化酶的抑制剂。
图1：DNA糖基化酶测定的模型系统（A）含有单个尿苷（U + 9）的病变链被退火到模板（T1），形成G：U不匹配（粗体）。尿嘧啶-DNA糖基化酶检测并去除尿嘧啶，形成AP位点（d）。当进行MALDI-TOF MS时，含U的DNA和AP产物之间的m/z值差异可以如B所示进行解析。（B）将含有单个尿苷（U + 9）的18 nt DNA退火到19 nt模板（T1）（表1）中测试为40μL反应缓冲液中50 pmol底物的酶空白并进行MS分析。（C）在10μL反应中使用0.5单位UDG在37°C下进行30分钟，对50 pmol底物的近乎完全酶消化（D）对含有单个尿苷（U + 3）的18 nt DNA进行40μL反应缓冲液中退火至50 pmol底物的T1酶空白进行MS分析。（E）在10μL反应中使用0.5单位UDG在37°C下30分钟产生d +3并在30小时内进行MS分析，在10μL反应中对50 pmol的U + 3底物进行近乎完全的酶消解。并进行MS分析。（G）反应条件与E相同，但d+3产物在-20°C下贮存7天以上;一小部分d+3转化为B15碎片化产品。此数字由43修改而来。缩写： nt = 核苷酸;MS = 质谱;MALDI-TOF MS = 基质辅助激光解吸/电离飞行时间MS;AP = 嘌呤核苷/嘧啶;UDG = 尿嘧啶-DNA 糖基化酶;T1 = 19 nt 含 G 的模板;U+9 = 18 nt 含 U 基板;d+9 = 18 nt AP 含站点产品;U+3 = 18 nt 含U基板;d+3 = 18 nt AP 含站点产品;B15 = 15 nt β-消除碎片化产物。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：不同酶浓度下UDG活性的时间过程分析。 含有G：U病变的底物DNA，50 pmol，在37°C下与0.01，0.02，0.05和0.1单位的UDG孵育。 在0，0.5，1，2和3分钟时从反应混合物中取等分试样（10μL），并用等体积的苯酚/氯仿淬灭。（A）MALDI-TOF质谱，说明了UDG处理G：U底物的浓度依赖性。（B）产品量绘制为时间的函数。UDG：0.01（带实线的闭合三角形）、0.02（带虚线的开三角形）、0.05（带实线的闭环）和 0.1 单位（带实线的开环）。数据是三个独立测定的平均值，误差线代表1 S.D。此数字由 43修改而来。缩写： nt = 核苷酸;MALDI-TOF = 基质辅助激光解吸/电离飞行时间;AP = 嘌呤核苷/嘧啶;UDG = 尿嘧啶-DNA 糖基化酶;T = 19 nt 含 G 的模板;U = 18 nt 含 U 基板;AP = 18 nt 含 AP 站点的产品。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：使用MALDI-TOF分析确定UDG的动力学参数。Michaelis-Menten曲线和Lineweaver-Burk图，以确定UDG酶催化从DNA中切除Uracil的Km和kcat。使用0.1单位的UDG和不同浓度（10，30，60，100，200 nM）的底物在100μL反应中进行DNA糖基酶MALDI-TOF MS测定30 s和60 s。误差线表示1 SD.（B）用于测定的线织布 - 伯克图;指示的截距允许计算 Km 和 Vmax。（C）通过MALDI-TOF MS分析与制造商分配的单元进行比较的UDG测定。通过在10μL反应中在18/19 nt DNA双链内在37°C下30分钟含有50 pmol（0.56μg）G：U的尿嘧啶去除形成AP位点来测量酶活性。 将UDG用缓冲液[50%甘油，20mM Tris-HCl（pH 7.5），30mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM二硫代甲状腺素]在冰上稀释。单位被定义为催化每分钟释放60 pmol尿嘧啶的酶的量。误差线显示六个实验的标准偏差。此数字由43修改而来。缩写： nt = 核苷酸;MALDI-TOF = 基质辅助激光解吸/电离飞行时间;UDG = 尿嘧啶-DNA 糖基化酶;AP = 嘌呤核苷/嘧啶;V， 反应速度 nM/s。请单击此处查看此图的放大版本。
图4：加入UGI的UDG酶抑制曲线。 使用20μL与0.05单位UDG（8 pM）和50 pmol底物在UGI存在下从0.001单位（5 pM）到0.1单位（200 pM）反应15分钟测定抑制曲线。数据是三个独立测定的平均值，误差线代表1 S.D.数据适合在线IC50 计算器（参见 材料表）。此数字由 43修改而来。缩写： UDG = 尿嘧啶-DNA 糖基化酶;UGI = 尿嘧啶糖基化酶抑制剂。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 基因底物 | 寡核苷酸 | 基因测序b | 初始费率c | k 猫 | |
| （百分点/秒） | （s-1） | ||||
| ssU+9 | U+9 | 5'-嘎嘎 | 0.560 ± 0.098 | 35 | |
| ssU+3 | U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | 0.756 ± 0.083 | 47.3 | |
| ssU-3 | U-3 | 5'-嘎嘎嘎 | 0.448 ± 0.087 | 28 | |
| G：U | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCACCG-5' | 0.149 ± 0.046 | 9.31 | |
| U+9 | 5'-嘎嘎 | ||||
| 答：U | T2 航站楼 | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0.053 ± 0.018 | 3.31 | |
| U+9 | 5'-嘎嘎 | ||||
| G：U5'+3 | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCACCG-5' | 0.256 ± 0.044 | 16 | |
| U+3 | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G：U5'+2 | T3 航站楼 | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0.567 ± 0.016 | 35.4 | |
| U+2 | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G：U5'+1 | T4 航站楼 | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 断续器 | 断续器 | |
| U+1 | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G：U3'-3 | T5 航站楼 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0.138 ± 0.015 | 8.63 | |
| U-3 | 5'-嘎嘎嘎 | ||||
| G：U3'-2 | T6 航站楼 | 3'-CTGGTCAGGCACAC-5' | 断续器 | 断续器 | |
| U-2 | 5'-嘎嘎嘎 | ||||
| G：U3'-1 | T7 航站楼 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | 断续器 | 断续器 | |
| U-1 | 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3' | ||||
表1：底物组成和UDG特异性。 该表显示了U±N指定的18个含U的DNA。“+”表示从 5' 终点开始计算尿嘧啶位置，“-” 表示从 3' 终点开始计算尿嘧啶位置。例如，U+9 是 5' 终点站的第 9 个 位置，U-3 是 3' 终点站的第 3 个 位置。T1至T7的互补19 nt模板将与含U的DNA形成G：U或A：U不匹配配对。Uracil基地以粗体显示。反应使用50 pmol的U底物，0.05单位的UDG，在10μL中，如方案第2节所述。此表是从 43 修改而来的。缩写： UDG = 尿嘧啶 DNA 糖基化酶;nt = 核苷酸;ND，不可检测。
| 第二聚氯乙烯 | 第一聚氯乙烯 | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | 断续器 | 断续器 | 普华恩 | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_呼叫 | EXT1_质量 |
| 那 | 那 | 那 | 那 | 那 | 那 | 那 | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| 那 | 那 | 那 | 那 | 那 | 那 | 那 | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
表 2：文件 I.xlsx文件。 这些设置用于 图1B，C和 图2A;0 分钟入场。本研究中使用的MALDI-TOF MS系统专门设计用于通过将扩展引物的单核苷酸延伸到扩增基因序列变异区域来分析单核苷酸多态性。对于UDG测定，在制备测定组FILE I时仅使用六个字段。缩写：WELL =分配给测定的孔号;期限 = 终止组合;SNP_ID = 单核苷酸多态性的输入序列的名称;2nd-PCRP = 正向扩增子引物;1st-PCRP = 反向扩增子引物;AMP_LEN = 扩增子长度;UP_CONF = 单工扩增评分;MP_CONF = 多重放大评分;Tm = 熔化温度;PcGC = GC 含量百分比;PWARN = 检测设计警告代码;UEP_DIR = 引物延伸方向;UEP_MASS = 未扩展的引物质量;UEP_SEQ = 未扩展的引物序列;EXT1_CALL = 分析物 1 质量峰的名称;EXT1_MASS = 分析物的质量 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
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表3：0620.xlsx文件。 这些设置用于 图4A中的UGI抑制反应。缩写：UGI = 尿嘧啶糖基化酶抑制剂。
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Discussion
本文提供了使用UDG MALDI-TOF MS测定方法直接检测含AP的DNA产物的详细程序。该方法的主要优点是含尿嘧啶的底物无需标记，可扩展，易于使用，并在基底设计中提供更大的灵活性。
UDG供应商推荐的苯酚/氯仿提取能够使酶失活，以防止产品DNA降解。然而，苯酚提取方案涉及危险化学品的繁琐相分离。另一种酸终止方法使用HCl将反应pH降低到2±0.5也有效地灭活了UDG。随后用Tris碱基中和可以防止DNA损伤。当AP产物在30小时内进行MS分析时，质谱中没有碱基损失或修饰的迹象（图1E）。反应中的Tris缓冲液与商业UDG一起提供。然而，包括Tris在内的各种胺可以通过β-消除来切开AP位点，尽管试剂浓度很高44。可以考虑一些替代品，如HEPES和磷酸盐缓冲液，以避免通过β消除来切割AP位点的风险。
作为潜在的UDG参考方法，推荐将中心G：U底物（表1，T1 / U + 9）的双链体作为标准底物，原因如下：1.出于生理相关性，G：U优于A：U，因为G：C对中胞嘧啶的脱氨导致G：U病变。2. 虽然 大肠杆菌 UDG 对单链 DNA 水解 U 表现出更高的特异性，但单链 DNA 中 U 病变的修复并不常见。3. 对于所有测试的G：U底物，G：U+2和G：U+3表现出比G：U+9更高的反应速率。然而，与链断裂相邻的 DNA 脱氨病变并不常见。为了模仿天然病变，将G：U放置在DNA双链的中心更合适。
有趣的是，MALDI-TOF MS方法生成了UDG动力学参数，并且G：U反应的酶单位（图3A-C）与使用3H-uracil38的常规衍生结果非常相似。然而，本研究中的单一G：U底物与先前描述的PBS1噬菌体DNA非常不同，这些DNA合成错误38。此外，UDG在G：U中的活性比A：U底物的活性高3倍（表1，G：U与A：U的Km和Kcat）。这一看似矛盾的结果可归因于PBS1底物的DNA序列，其中含有36%的U，以多个A：U病变的形式45，而G中只有3%的U：U底板（表1）。同时，UDG是一种非常“过程化”的酶，即单个蛋白质-DNA结合事件引发多个尿嘧啶裂解12。这两种UDG方法之间近乎完美的一对一相关性的发现使这种MS方法成为一种有吸引力的选择，而不是传统的放射性同位素测定。
此方法易于缩放。本研究中的所有UDG反应均使用微量移液器和微量离心管手动进行，并在给定日期进行了约30次测试。因此，使用的容量不到第3-5节中描述的MALDI-TOF MS系统（见 材料表）的384孔板格式芯片阵列的十分之一。相比之下，使用酸终止方法，对384孔微孔板的自动移液系统进行调整可以很容易地增加这种方法的日产量。因此，300 UDG反应将需要约1小时。MALDI-TOF MS系统（见 材料表）可以在1小时内输出多达300次反应的质谱数据。因此，简化的过程需要2小时才能完成300个UDG MALDI-TOF MS测定。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢NCFPB功能基因组学综合核心设施（台湾台北）和NRPB药物基因组学实验室（台湾台北）的技术支持。这项工作得到了台湾科学技术部的支持，R.O.C[批准号MOST109-2314-B-002 -186至K.-Y.S.，MOST 107-2320-B-002-016-MY3至S.-Y.C，MOST 110-2320-B-002-043至W.-h.F.]。H.-L.C.是国立台湾大学博士奖学金的获得者。开放获取收费资金：科学技术部，R.O.C。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
- Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
- Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
- Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
- Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
- Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
- Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
- Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
- Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
- Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
- Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
- Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
- Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
- Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
- Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
- Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
- Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
- Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
- Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
- Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
- Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
- Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
- McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
- Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
- Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
- Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
- Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
- Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
- Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
- Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
- Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
- Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
- Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
- Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
- Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
- Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
- Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
- Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
- Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
- Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
- Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
- Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
- Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
- Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).
