Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Abstract

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is een belangrijk onderdeel in de base excisie reparatie route voor de correctie van uracil gevormd door hydrolytische deaminering van cytosine. Het is dus cruciaal voor het behoud van de genoomintegriteit. Een zeer specifieke, niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode werd ontwikkeld om UDG-activiteit te meten. Een synthetische DNA-duplex met een site-specific uracil werd gesplitst door UDG en vervolgens onderworpen aan Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analyse. Er werd een protocol opgesteld om het apurine/apyrimidinische site (AP) product in DNA te bewaren zonder strengbreuk. De verandering in de m/z-waarde van het substraat naar het product werd gebruikt om uracilhydrolyse door UDG te evalueren. Een G:U-substraat werd gebruikt voor UDG-kinetische analyse die de Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s en Kcat = 9,31 s-1 opleverde. Toepassing van deze methode op een uracilglycosylaseremmer (UGI)-test leverde een IC50-waarde van 7,6 pM op. De UDG-specificiteit met behulp van uracil op verschillende posities binnen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA-substraten toonde verschillende splitsingsefficiënties. Deze eenvoudige, snelle en veelzijdige MALDI-TOF MS-methode zou dus een uitstekende referentiemethode kunnen zijn voor verschillende monofunctionele DNA-glycosylasen. Het heeft ook het potentieel als een hulpmiddel voor DNA-glycosylaseremmer screening.

Introduction

Hoewel uracil een normale base is in RNA, is het een veel voorkomende en zeer mutagene laesie in genomisch DNA. Uracil kan ontstaan door spontane/enzymatische hydrolytische deaminering van een deoxycytidine. In elke levende cel vindt deze deaminering 100-500 keer per dag plaats onder fysiologische omstandigheden1,2. Als deze veranderingen niet worden gerepareerd, kan er een verandering in de samenstelling van de DNA-sequentie optreden, waardoor mutatie ontstaat. Omdat uracil in DNA de voorkeur geeft aan paring met dATP tijdens replicatie, als cytosine deaminateert naar uracil, in twee replicatiegebeurtenissen, zal er een nieuwe G: C naar A: T overgangsmutatie zijn in de helft van het nageslacht DNA3.

Onder de cellulaire strategieën om de genetische stabiliteit te behouden, is base excision repair (BER) een essentieel mechanisme dat beschadigde basen, zoals uracil, in DNA4 herstelt. BER is een zeer evolutionair geconserveerd proces. Er zijn twee algemene BER-routes: de korte-patch pathway die leidt naar een reparatiekanaal van een enkel nucleotide en de long-patch pathway die een repair tract van ten minste twee nucleotiden produceert5. BER is een gecoördineerd mechanisme dat in verschillende stappen plaatsvindt. De eerste stap in BER is de enzymatische hydrolyse van de beschadigde nucleotidebasis door een schadespecifiek DNA-glycosylase om een apurine / apyrimidinische (AP) tussenliggende plaats te genereren6. Dit wordt gevolgd door de splitsing van de suiker-fosfaat ruggengraat op de AP-site door een endonuclease, opschoning van de DNA-uiteinden door een lyase, gap-vulling door een DNA-polymerase en het afdichten van de laatste nick door een ligase5.

Uracil-DNA glycosylase (UDG) hydrolyseert het uracil uit uracil-bevattend DNA voor BER in Escherichia coli. Conventionele UDG-testen met behulp van radioactief gelabeld DNA met verschillende scheidingstechnieken6,7,8,9,10,11,12,13 zijn meestal tijdrovend, arbeidsintensief, met dure etiketteringsreagentia, gecompliceerde procedures en vereisen intensieve training en oefening om de risico's van blootstelling aan radioactieve materialen te verminderen. Fluorometrische oligonucleotide assays zijn ontwikkeld als vervanging voor radio-isotoop labeling14, naast moleculaire bakens en Förster resonantie energieoverdracht technologie15,16,17,18,19,20. Voor alle bovengenoemde methoden is echter specifieke etikettering vereist. Onlangs zijn labelvrije biosensoren getest21,22,23 en colorimetrische methoden op basis van de vorming van een G-quadruplex24,25,26. Meerdere A: U-paren of speciaal ontworpen sequenties in de sondes bemoeilijken echter de definitie van enzymeenheden.

MALDI-TOF MS is een technologie die van groot nut kan zijn bij DNA-analyse. Ontwikkelde toepassingen omvatten single-nucleotide polymorfisme genotypering27,28, gemodificeerde nucleotideanalyse29 en DNA-reparatie intermediaire identificatie30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS moet gemakkelijk worden gebruikt voor DNA-glycosylaseanalyse om AP-site-bevattende DNA-producten te detecteren. AP-sites in DNA zijn echter gevoelig voor strengbreuk onder veel experimentele omstandigheden33. Een UDG-test wordt hier gepresenteerd met behulp van MALDI-TOF MS om de productie van AP-locaties rechtstreeks te meten zonder significant strengbreukgeluid. Deze labelvrije methode is gemakkelijk om mee te werken en heeft een hoog potentieel voor de farmaceutische toepassing van DNA-glycosylaseremmerscreening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van substraat/sjabloon

  1. Ontwerp uracil substraat/sjabloon duplex met een gebalanceerd G+C gehalte van ~50 ± 10% en minimale smelttemperatuur van 50 °C voor het duplexgebied.
    OPMERKING: Eén nucleotideverschil tussen 18 nt substraten en 19 nt sjablonen (tabel 1 en figuur 1) helpt een betere ms-signaalinterpretatie en de juiste gloeiing. De sjabloonstreng dient als aanvullend DNA om A-U- of G-U-mismatches te genereren (tabel 1), maar kan ook worden gebruikt als referentiesignaal in MS-metingen. Het gebruik van HPLC-gezuiverde synthetische oligonucleotiden is bevredigend voor deze studie.
  2. Los DNA op in 1 mM EDTA en 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C) (TE) in een concentratie van 100 μmol/L als bouillon en bewaar bij -20 °C. Verdun deze voorraad van 20 μL met TE tot een eindvolume van 800 μL (25-voudige verdunning tot 4 μmol/L). Meet de absorptie van de DNA-oplossing in een UV-zichtbare spectrofotometer bij λ = 260 nm om de toegewezen concentratie van de fabrikant te garanderen. Bijvoorbeeld: A260 = 0,204 voor 4 μmol/L U+9 en A260 = 0,192 voor 4 μmol/L T1 (tabel 1).
  3. Voer MALDI-TOF MS-analyse (secties 4-6) uit voor oligonucleotidekwaliteitscontrole door unieke pieksignalen te inspecteren bij aangewezen m/z-waarden en door te controleren of de signaal-ruisverhouding >100 is (figuur 1B en figuur 1D).

2. DNA-glycosylasetest

  1. Gebruik een G:U-substraat van T1/U+9 duplex (tabel 1 en figuur 1A) voor de glycosylasereactie, bijvoorbeeld in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg 70 μl H2O, 10 μl 10x UDG-reactiebuffer, 5 μl T1-voorraad en 5 μl U+9-voorraad toe (stap 1.2.).
    OPMERKING: Kies het juiste type micropipette en volg de instructies van de fabrikant om het vereiste volume te verwerken. Gebruik bijvoorbeeld een pipet van 2 μL om 0,1-2 μL vloeistof af te geven, gebruik een pipet van 10 μL om 2-10 μL vloeistof af te geven en gebruik een pipet van 100 μL om 20-100 μL vloeistof af te geven om de nauwkeurigheid en precisie van de resultaten te garanderen. Het beschreven volume van het reagensmengsel is voor 10 assays; pas het volume aan voor het gewenste aantal reacties. De 1x UDG-reactiebuffer bevat 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C). Zie de tabel met materialen voor de bron van 10x UDG-reactiebuffer.
  2. Sluit de buis veilig af; incubeer in een waterbad gedurende 30 minuten bij 65 °C, vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C en ten slotte gedurende 3 minuten op ijs om een goede gloeiing van het substraat / sjabloon duplex te garanderen.
  3. Voeg in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml 49 μl ijskoude 1x UDG-reactiebuffer en 1 μl UDG (5.000 eenheden /ml; zie de materialentabel), verdunnend tot 0,1 eenheden / μL. Maak seriële verdunningen met 1x UDG-buffer tot de gewenste enzymconcentraties van 0,05, 0,02 of 0,01 eenheden / μL. Houd de verdunde UDG altijd op ijs.
    OPMERKING: In een reactie van 10 μL kunnen 0,1 eenheden UDG in 3 minuten meer dan 30 pmol uracil uit een T1/U+9 duplex splijten.
  4. Voeg in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml 9,0 μl substraatmengsel uit stap 2.2 toe en verwarm de buis voor tot 37 °C. Voeg 1,0 μL van de verdunde UDG uit stap 2.3 toe. Gebruik een timer om de reactie te timen en veeg op de buis om de inhoud te mengen.
    OPMERKING: Voor een eenheidsdefinitietest is de incubatietijd 30 min. Gebruik voor een kinetische test een tijdsverloopanalyse van 0,5, 1, 2, 3, 5 minuten om de initiële snelheid te verkrijgen. Voor een UGI-remmingstest, time de reactie gedurende 15 minuten.
  5. Centrifugeer de buizen met het reactiemengsel gedurende 3-5 s bij 3.200 × g bij omgevingstemperatuur. Breng de reactie vervolgens onmiddellijk over op 37 °C.
  6. Beëindiging van de reactie
    1. Bereid oplossingen voor van 0,25 M HCl en 0,23 M Tris basis. Voeg in een reageerbuis van 15 ml 10 ml van een oplossing van 1 mM EDTA en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C) toe om 1x UDG-reactiebuffer na te bootsen. Verzuren met 1 ml van 0,25 M HCl en controleer met een pH-meter of de pH ~2 ± 0,5 is. Neutraliseer met 1 ml van 0,23 M Tris-basis en controleer met een pH-meter op een uiteindelijke pH van 6,5 ± 0,5.
      OPMERKING: Het gebruik van pH-teststrips is een snelle en eenvoudige manier om de pH-waarden van het reagensmengsel opnieuw te bevestigen.
    2. Voeg 1 μL van 0,25 M HCl toe om het 10 μL reactiemengsel te verzuren om het enzym te inactiveren en plaats het gedurende 6 minuten op ijs. Voeg 1 μL van 0,23 M Tris base toe om de DNA-producten te neutraliseren om te voorkomen dat de AP-site breekt door langdurige blootstelling aan zuur. Voeg 13 μL TE toe om het volume van het productmengsel te vergroten voor matrixchipoverdracht en plaats het vervolgens op ijs.
      OPMERKING: Het AP-product is chemisch instabiel en moet binnen 2 dagen door MALDI-TOF MS worden geanalyseerd. Na langdurige opslag gedurende meer dan een week treedt de accumulatie van een aanzienlijk deel van de strengbreuken op als gevolg van β/δ eliminatiereacties van de AP-producten (figuur 1D-G).
  7. Breng alle 25 μL UDG-reactieproducten over van microcentrifugebuizen naar een 384-well microtiterplaat.
    OPMERKING: Hoge concentraties kationen, zoals natrium of kalium in buffers, veroorzaken interferentie in de MALDI-TOF MS-analyse en vereisen dus ontzouting. Omdat E. coli UDG-reactiebuffer zeer lage concentraties kationen bevat, is ontzouting niet nodig. Wijzig dit protocol echter om andere DNA-glycosylasereacties te meten die metaalkationen bevatten die ontzouting vereisen zoals eerder beschreven35.

3. Breng UDG-reactieproducten over naar een matrixchip

  1. Open de deur van de nanoliterdispenser (zie de tabel met materialen) en laad de 384-well microtiterplaat vanaf stap 2.7 op de plaathouder van het dek.
  2. Plaats de matrixchiparray in de overeenkomstige verkennerplaatpositie. Plaats de geladen scoutingplaat op het verwerkingsdek van de nanoliterdispenser en sluit de deur.
  3. Raak de run-knop op het overdrachtsscherm aan en wacht tot het instrument begint met het doseren van monsters van de 384-well microtiterplaat naar de matrixchip.
  4. Gebruik de tabbladoptie Vision om het beeld van de chip en de doseervolumes voor elke plek tijdens het doseren weer te geven. Zorg ervoor dat het gevlekte volume op de chip in het bereik van 5-10 nL ligt.

4. Stel de testparameters in op de massaspectrometer

  1. Gebruik het toepassingsprogramma (zie de tabel met materialen) om een .xlsx bestand met de voorspelde signaal m/z-waarde voor te bereiden voor het importeren.
    OPMERKING: De instellingen in FILE I.xlsx (tabel 2) zijn voorbeeldinstellingen voor de UDG-assay van G:U-substraat in sectie 2.
  2. Gebruik het toepassingsprogramma om een nieuwe UDG-test te maken en te definiëren door met de rechtermuisknop op de optie Import Assay Group in Designer Format te klikken en het .xlsx bestand te selecteren in de vervolgkeuzelijst (bijvoorbeeld FILE I.xlsx uit stap 4.1).
  3. Klik met de rechtermuisknop op de knop Klant:Project:Plaat en klik bovenaan de vervolgkeuzelijst om een nieuwe testplaat vast te stellen. Typ in het dialoogvenster een bestandsnaam (bijvoorbeeld CTT20210620 voor de labcode en testdatum) en selecteer in de vervolgkeuzelijst plaattype het type plaat met 384 bronnen en druk op OK. Zoek naar een lege plaat aan de rechterkant van het scherm.
  4. Klik op de optie Assay ; selecteer de test (bijvoorbeeld FILE I.xlsx) in de vervolgkeuzelijst.
  5. Als u de geselecteerde test (bijvoorbeeld FILE I.xlsx) wilt toewijzen aan elke positie van de monstervlek op de plaat, verplaatst u de cursor naar elke positie van de lege plaat, klikt u om het putje te markeren en klikt u met de rechtermuisknop om Plex toevoegen te selecteren.
  6. Gebruik een desktop- of laptopcomputer om een werklijst op te stellen in .xlsx indeling zonder koptekst (bijvoorbeeld 0620.xlsx van tabel 3) voor alle voorbeelden op de chip uit stap 2.7. Klik op de knop Nieuw voorbeeldproject toevoegen ; selecteer het bestand (bijvoorbeeld 0620.xlsx) in de vervolgkeuzelijst om de werklijst te importeren.
  7. Zoek naar alle testvoorbeeldcodes in de werklijst (bijvoorbeeld van 0620.xlsx) aan de linkerkant van het scherm. Klik op de voorbeeldcode in de werklijst en klik met de rechtermuisknop op de overeenkomstige positie van de plaat om de tests aan elke positie te koppelen.

5. Werking van de massaspectrometer

  1. Gebruik het toepassingsprogramma om de massaspectrometer (zie de tabel met materialen) te koppelen aan de monsterchip (uit sectie 3) die moet worden geanalyseerd.
  2. Klik op de standaardinstelling. Typ in het dialoogvenster een bestandsnaam uit stap 4.3 (bijvoorbeeld CTT20210620); in de experimentnaam, typ de chip-id in de chipcode en sla de instellingen op.
  3. Start het besturingsprogramma van de massaspectrometer (zie de tabel met materialen).
  4. Druk op de in/uit-knop van de massaspectrometer en laat het dek uitschuiven. Haal de chiphouder eruit en steek de monsterchip uit stap 3.4 in de chiphouder. Plaats de geladen spaanhouder op het verlengde dek en druk op de in/uit-knop om de samplechip in het instrument te laten komen.
  5. Dubbelklik op het pictogram Aanschaffen van het toepassingsprogramma. Klik in het venster Acquire op het tabblad Auto Run om het instrument te starten en massaspectra te verkrijgen van de monsters op de chip.

6. Massaspectra bekijken en de gegevens analyseren

  1. Voer het data-analyseprogramma uit (zie de tabel met materialen).
  2. Blader door de databasestructuur en selecteer de chip-id uit stap 5.2. Klik om een doelput op de chip te markeren en klik op het spectrumpictogram om het massaspectrum weer te geven.
  3. Klik met de rechtermuisknop om Aanpassingsdialoogvenster te kiezen om een specifiek spectrumbereik bij te snijden in een nieuw venster. Klik op de X-as om de boven- en ondergrens van m/z in te voeren en druk op OK om het opgegeven bereikspectrum weer te geven, inclusief de signalen van belang.
    OPMERKING: De hoeveelheid DNA is evenredig met de piekintensiteit bij elke m/z-waarde-eenheid.
  4. Meet de piekhoogte van de m/z-waarden van de signalen die overeenkomen met U-substraat, AP-product en sjabloon. Klik op de piek en bekijk de piekhoogte in de linkerbovenhoek van het scherm.
    OPMERKING: Een spectrum van 1.600 breedte / 1.200 eenheden is een redelijke afmeting voor inspectie op een computerscherm en voor het bijhouden van gegevens.
  5. Als u het spectrum wilt opslaan voor archivering, klikt u met de rechtermuisknop op Exporteren en selecteert u JPEG-bestandstype in de vervolgkeuzelijst. Klik op Bestemming en Bladerschijf om het opslagapparaat in de vervolgkeuzelijst te selecteren (bijv. Flash disc E:). Typ de bestandsnaam (bijvoorbeeld 0620_1-2.jpg) en klik op Exporteren.
  6. Druk indien nodig een geëxporteerd JPEG-bestand af en meet de piekhoogte handmatig met een liniaal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sjablonen en substraten
Met synthetische oligonucleotiden met U in het midden (U+9) in combinatie met een G-sjabloon als voorbeeld (figuur 1A), kan een blanco controle van equimolaire hoeveelheden sjabloon- en uracilbevattend substraat worden gebruikt voor kwaliteitscontrole van synthetische oligonucleotidezuiverheid (figuur 1B; de signalen komen overeen met de aangewezen m /z en de lage achtergrondruis). Voor de MS-data-analyse zijn de piekhoogtes gemeten (figuur 2). Verwacht werd dat het 19 nt-sjabloon-DNA onveranderd zou blijven na glycosylasehydrolyse; daarom zou het signaal als referentie kunnen dienen voor de kwantificering van het AP-product (figuur 1C).

Reactieconditie en massaspectra
Deze DNA-glycosylasetest is eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren met behulp van een niet-gelabeld oligonucleotide voor een standaardreactie om schone en betrouwbare resultaten te verkrijgen (figuur 1). Het bereik van MS-spectra moet alle signalen omvatten die worden gegenereerd door substraten, sjablonen en reactieproducten (figuur 1B). Het verschil van 1 nt tussen het substraat en het bijbehorende sjabloon leverde een goed gescheiden signaalprofiel op voor zowel het sjabloon als het substraat (figuur 1B). De equimolaire primers U+9 en T1 vertoonden vergelijkbare piekintensiteiten zonder significante verschillen. Uitgebreide vertering van UDG (0,5 eenheden voor een reactie van 30 minuten) toonde volledige uracildecolleté. Het signaal van het AP-product was ook goed gescheiden van dat van het uracil-bevattende substraat (figuur 1C d+9 AP-product m/z = 5447,6 versus figuur 1B U+9 substraat m/z = 5541,6). De relatief milde MALDI-ionisatietechniek36 die in deze studie werd gebruikt, minimaliseerde de signalen geassocieerd met strengbreuken geïnduceerd door β-eliminatiereactie op AP-locaties37, die niet significant waren in de massaspectra. Over het algemeen is de reactie-achtergrond zeer schoon zonder merkbare ruis (figuur 1C).

Onder equimolaire omstandigheden was de relatieve signaalintensiteit van het AP-product vergelijkbaar met die van het U-substraat met als referentie het T1-sjabloon (figuur 1B, U+9/T1 versus d+9/T1). De berekening van de UDG-activiteit is dus gebaseerd op de exacte invoer van het U-bevattende substraat (50 pmol of 20 pmol) volgens Eq (1).

UDG-activiteit = (signaal van AP-product) / (Signaal van U-substraat + signaal van AP-product) × [U] (1)

UDG kinetische parameters bepaald door MALDI-TOF MS assay
Zoals te zien is in figuur 2, vertoonden UDG-reacties van 0,01 eenheden tot 0,1 eenheden gedurende de 3 minuten-reactie zowel dosis- als tijdsafhankelijkheid. Een concentratie van 3,2 pM (0,1 eenheden per 100 μL reactie) werd gebruikt voor de bepaling van de kinetische parameters, Km en kcat, voor een G:U substraat (tabel 1). De aliquots van de UDG-reactie werden verwijderd en geblust gedurende 30 s en 60 s. Kinetische gegevens werden verkregen onder omstandigheden waarin het uracil-bevattende substraat minder dan 50% verteerd was en vijf substraatconcentraties variërend van 10 tot 200 nM werden onderworpen aan analyse. Het presteady-state tijdsverloop vertoonde een uitstekende lineariteit voor snelheidsanalyse. Een voorbeeld van een reactiesnelheidsdiagram is weergegeven in figuur 3A, waar de relatieve MS-signaalintensiteiten van het product en substraat worden omgezet in concentratie (nM). De UDG-reactiesnelheid (v) wordt gepresenteerd als nM van de AP-site die per seconde wordt geproduceerd. De Km en Vmax werden berekend op basis van een Lineweaver-Burk plot (Figuur 3B). De UDG-kinetische parameters afgeleid van de MALDI-TOF MS-test werden dus bepaald op Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1 en Kcat = 9,31 s-1. De waarden zijn vergelijkbaar met de resultaten van eerdere 3H-uracil releasing assays waarbij de Km = 40 nM en Kcat = 13,3 s-138. 

De G:U+9 duplex werd onderworpen aan UDG gevoeligheidstests. De eenheid gemeten door MALDI-TOF MS-assay werd uitgezet tegen de door de fabrikant gedefinieerde eenheid met behulp van een conventionele 3H-uracil-releasemethode38. Zoals weergegeven in figuur 3C, was de MALDI-TOF MS-gemeten eenheid evenredig met de gedefinieerde eenheid van 0,001 eenheden tot 0,02 eenheden met de correlatievergelijking van y = 0,933x + 0,0003 en de bepalingscoëfficiënt R2 = 0,9974. De detectiegrens is 0,001 eenheden als de variatiecoëfficiënt = 9,2%, ~ 5 keer de signaal-ruisverhouding. Deze MALDI-TOF MS-test biedt dus voldoende gevoeligheid omdat UDG meestal op eenheidsniveau wordt gebruikt39.

Substraatspecificiteit van UDG
Een van de karakteristieke kenmerken van deze UDG MALDI-TOF MS-test is dat deze labelvrij is, wat een hoge veelzijdigheid biedt voor substraatontwerp. Deze functie is erg handig voor het analyseren van de substraatspecificiteit van UDG. Zoals aangetoond in tabel 1, kan uracil op elke plaats in de buurt van het 5'- of 3'-uiteinde van enkelstrengs of dubbelstrengs DNA worden ingebracht voor een specificiteitstest. Voor substraatspecificiteit is het bekend dat UDG zeer actief is in het verwijderen van uracil uit enkelstrengs DNA38. Inderdaad, zoals weergegeven in tabel 1, was uracilexcisie van het enkelstrengs substraat (ssU) 3,7-voudig afgenomen wanneer gegloeid tot de complementaire DNA-streng, waardoor G:U-duplex werd gevormd. Voor de veelgebruikte A:U duplex6,7,8 werd de reactiesnelheid verder verlaagd met bijna 10-voudig ten opzichte van ssU. De UDG werkte niet op U bij het DNA-eindpunt (tabel 1 substraten van G:U+1, G:U-1 en G:U-2), wat consistent is met eerdere studies40,41. Interessant is dat U op de 2e en 3e positie vanaf het 5'-eindpunt een hogere UDG-katalytische snelheid vertoonde dan de U in het midden met respectievelijk 2-voudig en 1,5-voudig (tabel 1, G: U + 2 en G: U + 3 versus G: U). UDG schrapte U 3-nt uit het 3'-uiteinde met 8% minder activiteit dan de U in het midden (tabel 1, G:U-3 versus G:U).

Uracil glycosylaseremmer remming van de UDG-reactie
Uracil glycosylaseremmer (UGI) is een bacteriofaag eiwit, dat E. coli UDG remt door omkeerbare eiwitbinding met een stoichiometrie van 1:142. De remming van UDG-activiteit door UGI is weergegeven in figuur 4. In aanwezigheid van 0,05 eenheden (100 pM) UGI werd de activiteit van 0,05 eenheden UDG (8 pM) geremd tot een niet-detecteerbaar niveau. De IC50 was 7,6 pM. Zo kan de UDG MALDI-TOF MS-assay gemakkelijk worden gewijzigd in een massascreeningstest voor de ontdekking van remmers van andere DNA-glycosylasen.

Figure 1
Figuur 1: Modelsysteem voor een DNA-glycosylasetest. (A) Laesiesliert met een enkele uridine (U +9) werd gegloeid tot een sjabloon (T1), waardoor een G: U-mismatch (vetgedrukt) werd gevormd. Uracil-DNA glycosylase detecteert en verwijdert het uracil en vormt een AP-site (d). Bij blootstelling aan MALDI-TOF MS kan het verschil in m/z-waarden tussen U-bevattend DNA en AP-producten worden opgelost zoals weergegeven in B. (B) Een 18 nt DNA met een enkel uridine (U+9) gegloeid volgens een 19 nt template (T1) (tabel 1) werd getest als een enzym blanco van 50 pmol substraat in 40 μL reactiebuffer en onderworpen aan MS-analyse. (C) Een bijna volledige enzymvertering van 50 pmol substraat in een 10 μL-reactie met behulp van 0,5 eenheden UDG bij 37 °C gedurende 30 minuten. (D) Een 18 nt DNA met een enkel uridine (U+3) gegloeid tot T1 enzym blanco van 50 pmol substraat in 40 μL reactiebuffer werd onderworpen aan MS-analyse. (E) Een bijna volledige enzymvertering van 50 pmol U+3-substraat in een reactie van 10 μL met 0,5 eenheden UDG bij 37 °C gedurende 30 minuten om d+3 te produceren en binnen 30 uur aan MS-analyse te onderwerpen. (F) De reactieconditie was hetzelfde als in E , behalve dat het d+3-product gedurende 30 minuten in 0,1 M NaOH bij 95 °C was om een bèta-eliminatiereactie te veroorzaken die B15-gefragmenteerd product produceerde en onderworpen aan een MS-analyse. (G) De reactieconditie was dezelfde als in E , behalve dat het d+3-product langer dan 7 dagen bij -20 °C werd bewaard; een fractie van d+3 omgezet in B15 gefragmenteerde producten. Dit cijfer is gewijzigd van 43. Afkortingen: nt = nucleotide; MS = massaspectrometrie; MALDI-TOF MS = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight MS; AP = apurinoir/apyrimidinisch; UDG = Uracil-DNA glycosylase; T1 = 19 nt G-bevattende sjabloon; U+9 = 18 nt U-bevattend substraat; d+9 = 18 nt AP site-bevattend product; U+3 = 18 nt U-bevattend substraat; d+3 = 18 nt AP site-bevattend product; B15 = 15 nt bèta-eliminatie gefragmenteerd product. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Tijdsbehandeling voor UDG-activiteit bij verschillende enzymconcentraties. Substraat-DNA, 50 pmol, met een G:U-laesie werd geïncubeerd met 0,01, 0,02, 0,05 en 0,1 eenheden UDG bij 37 °C. Aliquots (10 μL) werden uit het reactiemengsel genomen op 0, 0,5, 1, 2 en 3 min en geblust met een gelijk volume fenol/chloroform. (A) MALDI-TOF-massaspectra die de concentratieafhankelijkheid van de verwerking van G:U-substraten door UDG illustreren. (B) De hoeveelheid product werd uitgezet als functie van de tijd. UDG: 0,01 (gesloten driehoeken met ononderbroken lijn), 0,02 (open driehoek met stippellijn), 0,05 (gesloten cirkel met ononderbroken lijn) en 0,1 eenheden (open cirkels met ononderbroken lijn). De gegevens zijn de gemiddelden van drie onafhankelijke bepalingen en de foutbalken vertegenwoordigen 1 SD. Dit cijfer is gewijzigd van 43. Afkortingen: nt = nucleotide; MALDI-TOF = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight; AP = apurinoir/apyrimidinisch; UDG = Uracil-DNA glycosylase; T = 19 nt G-bevattend sjabloon; U = 18 nt U-bevattend substraat; AP = 18 nt AP site-bevattend product. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Bepaling van kinetische parameters van UDG met behulp van MALDI-TOF-analyse. Michaelis-Menten curve en Lineweaver-Burk complotten om de Km en kcat te bepalen voor UDG enzym-gekatalyseerde excisie van Uracil uit DNA. DNA-glycosylase MALDI-TOF MS-test werd uitgevoerd met behulp van 0,1 eenheden UDG en verschillende concentraties (10, 30, 60, 100, 200 nM) substraten in 100 μL-reactie gedurende 30 s en 60 s. (A) Michaelis-Menten-curve gegenereerd uit drie onafhankelijke experimenten. De foutbalken vertegenwoordigen 1 SD. (B) Lineweaver-Burk plot voor de assay; de aangegeven onderscheppingen maken berekening Km en Vmax mogelijk. (C) UDG-test door MALDI-TOF MS-analyse in vergelijking met de door de fabrikant toegewezen eenheid. Enzymactiviteit werd gemeten door uracilverwijdering die AP-site vormde in een 10 μL-reactie die 50 pmol (0,56 μg) G:U bevatte binnen een 18/19 nt DNA-duplex gedurende 30 minuten bij 37 °C. De UDG werd verdund met buffer [50% glycerol, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] op ijs. Een eenheid werd gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die de afgifte van 60 pmol uracil per minuut katalyseerde. Foutbalken tonen de standaarddeviatie van zes experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van 43. Afkortingen: nt = nucleotide; MALDI-TOF = Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight; UDG = Uracil-DNA glycosylase; AP = apurinoir/apyrimidinisch; V, reactiesnelheid nM/s. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: UDG-enzymremmingscurve door toevoeging van UGI. De remmingscurve werd bepaald met behulp van reacties van 20 μL met 0,05 eenheden UDG (8 pM) en 50 pmol substraat gedurende 15 minuten in aanwezigheid van UGI van 0,001 eenheden (5 pM) tot 0,1 eenheden (200 pM). Gegevens zijn de gemiddelden van drie onafhankelijke bepalingen en de foutbalken vertegenwoordigen 1 S.D. Gegevens die passen bij een online IC50-calculator (zie de tabel met materialen). Dit cijfer is gewijzigd van 43. Afkortingen: UDG = Uracil-DNA glycosylase; UGI = uracilglycosylaseremmer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DNA substraten Oligonucleotidena DNA-sequentieb Initieel tariefc K kat
(pmol/sec) (s-1)
SSU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0,560 ± 0,098 35
SSU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0,756 ± 0,083 47.3
sSU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0,448 ± 0,087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0,149 ± 0,046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
A: U T2 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0,053 ± 0,018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G: U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0,256 ± 0,044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0,567 ± 0,016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G: U5'+1 T4 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDDD ND
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0,138 ± 0,015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' ND ND
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' ND ND
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

Tabel 1: Substraatsamenstellingen en UDG-specificiteiten. Deze tabel toont het 18 nt U-bevattende DNA aangeduid door U±N. De '+' geeft het tellen van de uracilpositie vanaf het 5'-eindpunt aan en de '-' geeft het tellen van de uracilpositie vanaf het eindpunt 3' aan. U+9 is bijvoorbeeld de 9e positie vanaf het 5' eindpunt, U-3 is de 3e positie vanaf het 3' eindpunt. De complementaire 19 nt-sjabloon van T1 tot T7 zou worden gecombineerd met de U-bevattende DNA-vormende G: U- of A: U-mismatches zoals aangegeven. Uracil-bases zijn vetgedrukt. De reacties werden gebruikt met 50 pmol U-substraten, 0,05 eenheden UDG, in 10 μL zoals beschreven in protocolsectie 2. Deze tabel is gewijzigd van 43. Afkortingen: UDG = uracil DNA glycosylase; nt = nucleotide; ND, niet detecteerbaar.

2e-PCRP 1e-PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC PwArn UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_ OPROEP EXT1_ MIS
NA NA NA NA NA NA NA F 5789.8 GCCAACGTCCGGACTGGTC
NA NA NA NA NA NA NA F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

Tabel 2: BESTAND I.xlsx bestand. De instellingen werden gebruikt voor figuur 1B, C en figuur 2A; 0 min vermeldingen. Het MALDI-TOF MS-systeem dat in deze studie werd gebruikt, was specifiek ontworpen om single-nucleotide polymorfisme te analyseren door een enkele nucleotide-uitbreiding van de uitgebreide primer in het gebied van versterkte gensequentievariatie. Voor de UDG-assay werden slechts zes velden gebruikt bij het opstellen van de assaygroep FILE I. Afkortingen: WELL = het putnummer dat aan de test is toegewezen; TERMIJN = beëindigingsmix; SNP_ID = naam van de invoersequentie van het enkele nucleotidepolymorfisme; 2e-PCRP = voorwaartse ampliconprimer; 1e-PCRP = omgekeerde ampliconprimer; AMP_LEN = ampliconlengte; UP_CONF = uniplex versterkingsscore; MP_CONF = multiplex versterkingsscore; Tm = smelttemperatuur; PcGC = percentage GC-gehalte; PWARN = waarschuwingscodes voor assayontwerp; UEP_DIR = richting van de primerverlenging; UEP_MASS = ongevolgde-primermassa; UEP_SEQ = ongevolgde-primersequentie; EXT1_CALL = naam gegeven aan de analyt 1 massapiek; EXT1_MASS = massa van analyt 1.

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

Tabel 3: 0620.xlsx bestand. Deze instellingen werden gebruikt voor de UGI-remmingsreacties in figuur 4A. Afkorting: UGI = uracil glycosylase inhibitor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van een UDG MALDI-TOF MS-testmethode om AP-bevattende DNA-producten direct te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat uracil-bevattende substraten labelvrij, schaalbaar, gemakkelijk om mee te werken zijn en meer flexibiliteit bieden in substraatontwerp.

De door de leverancier aanbevolen fenol/chloroform-extractie van UDG maakt inactivatie van het enzym mogelijk om afbraak van product-DNA te voorkomen. Het fenolextractieprotocol omvat echter vervelende fasescheiding van gevaarlijke chemicaliën. Een alternatieve zuurafsluitingsmethode met HCl om de reactie-pH te verlagen tot 2 ± 0,5, inactiveerde ook effectief UDG. Daaropvolgende neutralisatie met Tris base zou DNA-schade kunnen voorkomen. Wanneer het AP-product binnen 30 uur aan MS-analyse werd onderworpen, waren er geen tekenen van baseverlies of -modificatie in de massaspectra (figuur 1E). De Tris-buffer in de reacties werd voorzien van de commerciële UDG. Verschillende amines, waaronder Tris, kunnen echter AP-sites insnijden via bèta-eliminatie, zij het bij hoge reagensconcentraties44. Sommige alternatieven, zoals HEPES en fosfaatbuffer, kunnen worden overwogen om het risico van splitsing van de AP-site door bèta-eliminatie te voorkomen.

Als een potentiële UDG-referentiemethode wordt een duplex van gecentreerd G:U-substraat (tabel 1, T1/U+9) aanbevolen als het standaardsubstraat om de volgende redenen: 1. voor fysiologische relevantie is G:U superieur aan A:U omdat deaminering van cytosine in G:C-paren resulteert in G:U-laesies. 2. Hoewel E. coli UDG een hogere specificiteit vertoont om U te hydrolyseren uit enkelstrengs DNA, is reparatie van een U-laesie in enkelstrengs DNA ongewoon. 3. Voor alle geteste G: U-substraat vertoonden G: U + 2 en G: U + 3 hogere reactiesnelheden dan G: U + 9. Een DNA-deamineringslaesie naast een strengbreuk is echter ongebruikelijk. Voor het nabootsen van inheemse laesies zou het plaatsen van een G:U in het midden van de DNA-duplex meer geschikt zijn.

Interessant is dat de MALDI-TOF MS-methode UDG-kinetische parameters genereerde en dat de enzymeenheden van de G:U-reactie (figuur 3A-C) sterk leken op conventioneel afgeleide resultaten met behulp van 3H-uracil38. Het enkele G:U-substraat in deze studie verschilt echter sterk van PBS1 bacteriofaag-DNA dat eerder is beschreven met meerdere A:U van DNA-synthesefouten38. Bovendien vertoonde UDG 3 keer hogere activiteit met G:U dan met het A:U-substraat (tabel 1, Km en Kcat van G:U versus A:U). Dit schijnbaar tegenstrijdige resultaat kan worden toegeschreven aan de DNA-sequentie van PBS1-substraat met 36% U in de vorm van meerdere A:U-laesies45 vergeleken met slechts 3% van U in de G: U-substraat (tabel 1). Ondertussen is UDG een zeer 'processief' enzym, d.w.z. een enkele eiwit-DNA-bindende gebeurtenis lokt meerdere uracilsplitsingen uit12. Het vinden van een bijna perfecte één-op-één correlatie tussen deze twee UDG-methoden maakt deze MS-methode een aantrekkelijke optie in plaats van de traditionele radio-isotooptest.

Deze aanpak is eenvoudig schaalbaar. Alle UDG-reacties in deze studie werden handmatig uitgevoerd met behulp van micropipettes en microcentrifugebuizen, met ~ 30 tests uitgevoerd op een bepaalde dag. Zo werd minder dan een tiende van de capaciteit van de 384-well plate format chip array voor het MALDI-TOF MS-systeem (zie de tabel met materialen) beschreven in secties 3-5 gebruikt. Daarentegen zou de aanpassing van een geautomatiseerd pipetteersysteem voor een 384-well microplaat de dagelijkse output van deze aanpak gemakkelijk kunnen verhogen door gebruik te maken van de zuurafsluitingsmethode. Dus 300 UDG-reacties zouden ~ 1 uur duren. Het MALDI-TOF MS-systeem (zie de tabel met materialen) kon massaspectrale gegevens produceren voor maximaal 300 reacties in 1 uur. Daarom zou een gestroomlijnd proces 2 uur nodig hebben om 300 UDG MALDI-TOF MS-testen te voltooien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

We danken de NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) en het NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan, R.O.C. [subsidienummer MOST109-2314-B-002 -186 naar K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 naar S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 naar W.-h.F.]. H.-L.C. is een ontvanger van een doctoraatsbeurs van de National Taiwan University. Financiering voor open access charge: Ministerie van Wetenschap en Technologie, R.O.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Biochemie Nummer 182 Base excisie reparatie MALDI-TOF massaspectrometrie Uracil-DNA glycosylase apurine/apyrimidinische site glycosylaseremmer
Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. … More

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. D., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Chang, S. Y., Fang, W. h. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter